一種源自黃曲霉的抗草甘膦相關蛋白及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種源自黃曲霉的抗草甘麟相關蛋白及其編碼基因與應用。
【背景技術】
[0002] 草甘麟(gly地osate)是一種廣譜滅生性、內吸傳導型除草劑，具有理化性質穩定、 高效、低毒、低殘留、易被微生物分解等優點。草甘麟廣泛應用于玉米、大豆、油菜等作物的 生產，是目前使用量最大的除草劑之一。草甘麟是憐酸締醇式丙酬酸的類似物，是一種非選 擇性的除草劑，能夠與莽草酸-3-憐酸（S3PKEPSP合成酶形成EPSP-S3P-草甘麟復合體，進 而阻止PEP和EPSP合成酶結合，使莽草酸途徑中的5-締醇式莽草酸-3-憐酸合成酶化PSPS) 受到競爭性抑制，生物體內芳香族化合物的生物合成受到干擾，從而導致生物死亡。由于除 草劑對雜草和作物不具有選擇作用，常常對作物的光合作用W及一些代謝過程產生一定的 影響和毒害作用。運就限制了除草劑的應用，為此抗除草劑轉基因作物研究隨之展開。
[0003] 抗草甘麟基因是存在于某些特定物種中的括抗草甘麟功能的基因，通過阻斷草甘 麟對芳香族化合物生物合成途徑的干擾，使草甘麟失去對植物的毒害作用。采用基因工程 等手段，培育抗草甘麟作物新品種，對控制田間雜草和促進作物生產具有重要意義。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種源自黃曲霉的抗草甘麟相關蛋白及其編碼基因與應用。
[0005] 本發明提供的蛋白，獲自黃曲霉，命名為EPSI^蛋白，是如下(a)或(b):
[0006] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0007] (b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與草甘麟抗性相關的由序列1衍生的蛋白質。
[000引為了使(a)中的蛋白質便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的 蛋白質的氨基末端或簇基末端連接上如表1所示的標簽。
[0009] 表1標簽的序列
[0012]上述(b)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。 上述(b)中的蛋白質的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個
[0010]
[0011] 氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5/端和/或y端 連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
[0013] 編碼所述EPSI^蛋白的基因化PSPS基因）也屬于本發明的保護范圍。
[0014] 所述EPSI^基因是如下（1)或(2)或(3)的DNA分子：
[001引（1)編碼區如序列表中序列2所示的DNA分子；
[0016] (2)在嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼草甘麟抗性相關蛋白的DNA分 子；
[0017] (3)與（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98%或至少具 有99%同源性且編碼與草甘麟抗性相關的蛋白的DNA分子。
[001引所述嚴格條件可為如下:在6 X SSC，0.5% SDS的溶液中，在65?下雜交，然后用2 X SSC，0.1 % SDS和 1 X SSC，0.1 % SDS各洗膜一次。
[0019] 含有所述EPSI^基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的 保護化圍。
[0020] 所述重組載體具體可為將所述EPSPS基因插入PGEX-4T-1載體或pET-30a (+)載體 得到的重組質粒。所述重組載體具體可為在PGEX-4T-1載體的EcoR巧日Sail酶切位點之間插 入序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子得到的重組質粒。所述重組載體具體可為在祀T-30a (+ )載體的EcoRI和Sail酶切位點之間插入序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子得到的重組 質粒。
[0021] 所述重組菌為將W上任一所述重組載體導入宿主菌得到的重組菌。所述宿主菌可 為大腸桿菌，具體可為大腸桿菌化21 (DE3)。
[0022] 本發明還保護一種培育重組微生物的方法，包括如下步驟:將所述EPSI^基因導入 出發微生物，得到對草甘麟抗性高于所述出發微生物的重組微生物。所述EPSPS基因具體可 通過W上任一所述重組載體導入所述出發微生物。所述出發微生物可為細菌，具體可為大 腸桿菌，更具體可為大腸桿菌化21 (DE3)。
[0023] 本發明還保護所述EPSPS蛋白或所述EPSPS基因的應用，為如下（cl)、（c2)或（c3) 中的至少一種：
[0024] (cl)調控植物或微生物對草甘麟的抗性；
[0025] (c2)增加植物或微生物對草甘麟的抗性；
[0026] (c3)培育對草甘麟抗性增加的植物或微生物。
[0027] 所述微生物可為細菌，具體可為大腸桿菌，更具體可為大腸桿菌化2UDE3)。
[0028] 本發明發現了一個新的蛋白，將其編碼基因轉入大腸桿菌中表達，可提高轉基因 菌株對草甘麟的抗性。因此，本發明的基因可用于培育對草甘麟抗性增強的轉基因作物品 種或轉基因微生物，具有很高的應用價值。
【附圖說明】
[0029 ]圖1為實施例1的步驟Ξ的結果。
[0030]圖2為實施例1的步驟四的結果。
【具體實施方式】
[0031] W下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。W下實施例中的定量試驗，均設置Ξ次重復實驗，結果取平 均值。PGEX-4T-1載體：GE Healthcare公司。祀T-30a(+)載體：Novagen公司。大腸桿菌化21 (DE3):天根生化科技有限公司，產品目錄號為CB105-02。草甘麟:美國孟山都公司。
[0032] 黃曲霉TZ1985是發明人分離保存的一株抗草甘麟菌株。從黃曲霉TZ1985中發現一 個新蛋白，如序列表的序列1所示，將其命名為EPSPS蛋白。將編碼EPSI^蛋白的基因命名為 EPSPS基因，其開放閱讀框如序列表的序列2所示。
[0033] 草甘麟的結構式如下：
[0034]
[0035] 實施例UEPSPS蛋白的功能驗證
[0036] -、構建重組質粒
[0037] 1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0038] 2、W步驟1得到的雙鏈DNA分子為模板，采用EcoRTZEPF和SalTZEPR組成的引物對 進行PCR擴增，得到