Ev－vegf核酸和多肽及使用方法

專利名稱：Ev－vegf核酸和多肽及使用方法
背景技術：
內皮細胞局部微環境對血管內皮細胞的表型和生長特性有組織或器官特異性的深刻影響，但局部指令信號的性質基本上是未知的。有力的使信服的證據證明，血管內皮生長因子(VEGF)和內皮細胞特異性生長因子的血管生成素家族對于胚胎發育和各種生理和病理環境的血管生成是必需的[Ferrara和Alitalo，Nature Medicine，51359-1364(1999)；Carmeliet，Nature Medicine，6389-395(2000)]。對于內皮細胞表型和生長的局部組織特異性調節有強有力的證據[Aird等，J.Cell.Biol.，1381117-1124(1997)；Stewart和Wiley，Dev.Biol.，84183-192(1981)]。內皮細胞的形態和功能特征在不同器官之間變化很大[Simionescu和Simionescu，Cell and Tissue Biology，Urban and Schwarzenberg，Baltimore(1988)，pp.355-398]。另外，給藥的位點對新血管性質的決定程度大大超過了測試的血管生成因子的類型[Dellian等，Am.J.Pathology，14959-71(1996)；Roberts等，Am.J.Pathology，1531239-1248(1998)]。該局部微環境對于脈管系統性質的影響的分子基礎未知，但相信特殊化的間質起了主要作用[Dellian，見上]。可以理解，可包含組織特異性分泌蛋白和細胞和胞外基質組分的刺激的整合網絡，起到了確定結構和功能以及調節本固的內皮生長的作用。
因此，目前需要鑒定和確定影響內皮細胞生長和/或分化的新穎生長和分化因子的特征。除了增加我們對于脈管系統發育的知識以外，這些化合物可用于診斷和治療與脈管組織有關的病癥。
激素分泌性細胞雖然在科學和醫療中已有進展，但對于社會的內科疾病的新療法仍有需要。一種發現新療法的方法已用于研究生物體如何運作。特別是，感興趣的是信號傳遞細胞如何控制生物體的行為。例如，內分泌細胞分泌信號傳遞分子，稱為激素，其中這些激素分泌的失常可導致各種疾病。
專門分泌激素的細胞包括生殖腺細胞，分泌睪酮(睪丸的Leydig細胞)，雌激素(卵泡的卵泡內膜細胞)和黃體酮(破裂卵泡的黃體細胞)。雖然在醫學領域中有各種利用外源施用睪酮、雌激素和黃體酮的治療方法，但仍需要調節產生這些激素的細胞。
專門分泌激素的其它細胞包括腎上腺細胞和消化系統的細胞。例如，腎上腺的細胞分泌腎上腺素、去甲腎上腺素和類固醇激素，例如鹽皮質激素和糖皮質激素。特別感興趣的是皮質醇，它是腎上腺的皮質產生的，影響許多細胞類型的代謝。消化系統的細胞包括分泌胰島素的胰臟的那些細胞。胰島素是由胰島分泌的，是糖類代謝必需的。胰島素用于治療和控制糖尿病，然而對于有效治療糖尿病等疾病仍有需要。其它感興趣的腸和呼吸道激素包括血清素、內啡肽、促生長素抑制素、促胃液素、促胰液素、膽囊收縮素、胰高血糖素和蛙皮素。
有許多疾病和病癥與激素分泌性細胞有關，特別是內分泌腺體內的類固醇生成的內皮細胞。因此，需要鑒定特異性影響這些內皮細胞的生長因子。這些內皮細胞特異性生長因子可能是診斷和治療與這些細胞類型有關的疾病，和鑒定用于診斷和治療這些疾病的候選藥物的有價值的工具。
發明簡述本發明基于鑒定和表征一種新穎的組織限制生長和分化因子，它選擇性地作用于一種內皮細胞類型。該因子稱為內分泌腺衍生的血管內皮生長因子(EG-VEGF)，它被發現能誘導衍生自內分泌腺的毛細血管內皮細胞增殖、遷移和穿通。如本文詳細描述的，EG-VEGF核酸和多肽可用于許多測定，和與產激素組織有關的病況的診斷和治療。
在一方面，本發明涉及一種組合物，含有EG-VEGF多肽，或如本文所述的EG-VEGF多肽的激動劑或拮抗劑，以及藥學上可接受的載體。在一個實施例中，該組合物還含有血管內皮細胞生長因子(VEGF)或其激動劑或拮抗劑。
在另一個方面，本發明提供了一種產品，含有一種容器，容器上的標簽和裝在容器內的一種含有活性劑的組合物。活性劑選自EG-VEGF多肽、EG-VEGF多肽的激動劑和EG-VEGF多肽的拮抗劑。容器上的標簽表明組合物有效的治療與產激素內皮組織有關的病況。在本發明該方面的一個實施例中，病況與內分泌腺內的類固醇生成的內皮細胞有關。在第二個實施例中，組織是卵巢、睪丸、宮頸、腎上腺、胎盤或前列腺組織。病況優選是不育、多囊性卵巢綜合征或癌。
在另一方面，本發明提供了一種鑒定與EG-VEGF結合的化合物的方法。該方法包括將候選化合物與EG-VEGF接觸，確定候選化合物是否與EG-VEGF結合。在一個實施例中，該測定是競爭性結合測定，即測定候選化合物與已知與EG-VEGF結合的分子競爭的能力。該測定可以是例如基于細胞的測定，其中候選化合物與表達EG-VEGF編碼序列的全細胞或細胞膜部分接觸。
本發明還涉及一種鑒定調節EG-VEGF生物活性的化合物的方法。該方法包括步驟使候選化合物與EG-VEGF接觸，確定EG-VEGF的生物活性是否發生改變。在一個實施例中，化合物抑制EG-VEGF的生物活性，在另一個實施例中，化合物增強EG-VEGF的生物活性。生物活性可以是例如誘導與細胞增殖或存活有關的激酶磷酸化的能力。在一個優選例中，激酶是MAP激酶，更優選ERK1或ERK2。在其它實施例中，生物活性是細胞增殖、趨化性的誘導、血管生成、細胞分化的誘導或內皮細胞穿通的誘導。和以前一樣，該測定可以是例如基于細胞的測定，其中候選化合物與表達EG-VEGF編碼序列的全細胞或細胞膜部分接觸。在一個優選例中，細胞是工程改造的表達EG-VEGF的重組宿主細胞。另外，候選分子可以與分離的EG-VEGF接觸。在一個優選例中，EG-VEGF被固定在固相載體上。
在另一方面，本發明特別包括用上述測定之一鑒定出具有結合EG-VEGF或調節EG-VEGF生物活性的化合物。
本文還提供了一種鑒定EG-VEGF受體的方法。該方法包括將EG-VEGF和一種含有細胞膜材料的組合物混合，其中EG-VEGF與細胞膜材料上的受體復合，受體被鑒定為EG-VEGF受體。在本發明該方面的一個實施例中，EG-VEGF與受體結合，EG-VEGF與受體交聯。
本發明的另一個方面涉及一種刺激細胞或組織中生物活性的方法。這包括一種刺激細胞增殖的方法，一種誘導細胞中趨化性的方法，一種誘導產激素組織中血管生成的方法，一種誘導細胞中細胞分化的方法，和一種誘導細胞中穿通的方法。在每一種方法中，通過將細胞或組織與EG-VEGF或EG-VEGF激動劑以有效誘導所需生物活性的量接觸，或通過在細胞或組織中以有效誘導生物活性的量引入編碼EG-VEGF或EG-VEGF激動劑的核酸，刺激生物活性。細胞優選是內皮細胞，特別是產激素的內皮細胞或組織。
本發明還提供了通過細胞或產激素的組織與EG-VEGF拮抗劑以有效抑制生物活性的量接觸，或通過在細胞中引入編碼EG-VEGF的核酸，抑制所有上述生物活性的方法。
本發明的另一個方面提供了治療個體的方法。這些方法包括治療個體的與產激素的組織有關的病癥的方法，調節個體中生育的方法，治療個體中對EG-VEGF反應性的細胞中癌癥的方法，治療個體中生殖器官的癌癥的方法，和治療個體卵巢囊腫的方法。在本發明該方面的方法的一個實施例中，該方法包括對個體以有效治療病況、調節生育、治療癌癥或治療卵巢囊腫的有效量施用一種含有EG-VEGF或其激動劑或拮抗劑。在另一個實施例中，方法包括對個體以有效治療病況的量施用一種組合物，該組合物含有編碼EG-VEGF或其激動劑或拮抗劑的核酸。在一個具體實施例中，通過抑制卵泡成熟調節生育。在另一個實施例中，通過抑制排卵調節生育。在另一個實施例中，個體有或正處于具有多囊性卵巢綜合征的危險中，調節生育力以維持生育力。要治療的癌癥可以是例如卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌或子宮癌。
下文所述的優選例用于本發明的所有方面。
在一個實施例中，EG-VEGF多肽是天然序列EG-VEGF。在另一個實施例中，天然序列EG-VEGF是人的。在另一個實施例中，EG-VEGF是天然序列EG-VEGF的一個片段。在另一個實施例中，EG-VEGF是天然序列EG-VEGF的氨基酸序列變體，它優選與從約1或約20-105的圖2(SEQ ID NO2)的氨基酸殘基的序列具有至少約85％的序列同一性。在另一個實施例中，氨基酸序列變體是保守取代變體。在另一個實施例中，EG-VEGF是天然序列EG-VEGF的氨基酸序列變體的片段。在另一個實施例中，EG-VEGF作為融合蛋白存在。
上述組合物和方法可進一步涉及VEGF多肽的使用。在一個實施例中，VEGF多肽是天然序列VEGF。在另一個實施例中，天然序列VEGF是人的。在另一個實施例中，VEGF是天然序列VEGF的一個片段。在另一個實施例中，VEGF是天然序列VEGF的氨基酸序列變體。在另一個實施例中，氨基酸序列變體與天然序列的VEGF具有至少約85％的序列同一性。在另一個實施例中，氨基酸序列變體是保守取代變體。在另一個實施例中，VEGF是天然序列VEGF的氨基酸序列變體的片段。在另一個實施例中，VEGF作為融合蛋白存在。
在一個實施例中，EG-VEGF激動劑或VEGF激動劑分別是抗-EG-VEGF抗體或抗-VEGF抗體，特別包括抗體片段。在另一個實施例中，EG-VEGF或VEGF激動劑是小分子。
類似的，EG-VEGF或VEGF拮抗劑可以分別是例如抗-Eg-VEGF或抗-VEGF抗體，特別包括抗體片段。在其它實施例中，EG-VEGF或VEGF拮抗劑是小分子。
在一個實施例中，表達EG-VEGF的編碼序列的全細胞或細胞膜片段是工程改造表達EG-VEGF的重組宿主細胞。
本發明的其它實施例和變體通過下面對發明的詳細描述將變得顯而易見。
附圖簡述

圖1顯示含有編碼天然序列EG-VEGF的核苷酸序列(核苷酸91-405)的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，其中核苷酸序列(SEQ ID NO1)是本文中稱為“cDNA60621-1516”的一個克隆。粗體和下劃線分別是起始和終止密碼子的位置。
圖2顯示衍生自SEQ ID NO1的編碼序列的天然序列EG-VEGF多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。還顯示了各個其它重要多肽結構域的大致位置。
圖3A-D顯示用下述的方法測定氨基酸序列同一性百分數(圖3A-B)和核酸序列同一性百分數(圖3C-D)的假設例，使用ALIGN-2序列比較計算機程序，其中“PRO”代表感興趣的假設EG-VEGF多肽的氨基酸序列，“比較蛋白”代表與感興趣的“PRO”多肽比較的多肽的氨基酸序列，“PRO-DNA”代表感興趣的假設的EG-VEGF編碼核酸序列，“比較DNA”代表與感興趣的“PRO-DNA”核酸分子比較的核酸分子的核苷酸序列，“X”、“Y”和“Z”各代表不同的假設氨基酸殘基，“N”、“L”和“V”各代表不同的假設的核苷酸。
圖4顯示本文稱為DNA56748(SEQ ID NO3)的核苷酸序列。
圖5A-5F顯示卵巢中原位表達的EG-ECGF。圖5A和5B顯示2歲的黑猩猩卵巢，其中圖5A顯示蘇木精-曙紅染色，圖5B顯示使用FITC表達。圖5C和5D顯示鼯猴卵巢，其中圖5C顯示蘇木精-曙紅染色，圖5D顯示使用FITC的EG-ECGF表達。圖5E和5F顯示黑猩猩間質卵巢，其中5E顯示蘇木精-曙紅染色，圖5F顯示使用FITC的EG-ECGF表達。
圖6A-D顯示在冷凍和石蠟包埋的人卵巢中原位表達的肌動蛋白和EG-ECGF。圖6A顯示蘇木精-曙紅染色，圖6B顯示使用FITC的EG-ECGF表達。圖6C顯示蘇木精-曙紅染色，圖6D顯示使用FITC的EG-ECGF表達。
圖7A顯示在具有子宮脫垂的46歲婦女卵巢中原位表達的EG-ECGF的放射性自顯影圖，圖7B顯示同一卵巢的蘇木精-曙紅染色。
圖8A-D顯示腎上腺中原位表達的EG-ECGF。圖8A和8B顯示用DAPI鑒定核酸，圖8C和8D顯示使用FITC鑒定蛋白質。
圖9原位雜交研究揭示了在人睪丸中，EG-VEGF轉錄限于睪酮產生性Leydig細胞(A-D欄)。E，F)EG-VEGF信號在人卵巢間質中被描述為血管周圍(K，L)細胞中是普遍的。在黑猩猩卵巢中證明非常相似的模式(數據未顯示)。G，H)在人血體(corpus hemmorhagicum)中檢測到強信號。在人(I，J)和黑猩猩(M，N，O，P)的發育性卵泡中，在卵泡膜和粒層細胞-都是類固醇生成細胞類型，和卵丘中表達的EG-VEGF。A、C、E、G、I、K、M、O是亮視野顯像，B、D、F、H、J、L、N、P是相應的暗視野圖像。箭頭指向血管路線。
圖10A-C分別是位移圖和scatchard圖，顯示牛腎上腺皮質毛細血管內皮細胞(ACE)的125I-EG-VEGF-his配體結合分析。
圖11A-B分別是位移圖和scatchard圖，顯示MS-1，衍生自內分泌胰臟的小鼠內皮細胞系的125I-EG-VEGF-his配體結合分析。圖11C顯示人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中EG-VEGF-his配體結合分析。
圖12A-E顯示柱狀圖，表明用1nM、10nM或25nM濃度的對照、bFGF、VEGF或EG-VEGF細胞的相對增殖。圖12A顯示用周細胞的結果。圖12B顯示用人主動脈血管平滑肌細胞(HA-VSMC)的結果。圖12C顯示用幼倉鼠腎成纖維細胞(BHK21)的結果。圖12D顯示用ACE的結果。圖12E顯示用牛腦毛細血管內皮細胞(BBC)的結果。
圖13顯示EG-VEGF是特定內皮細胞的促分裂原和化學引誘物。欄a顯示在ACE培養物中，EG-VEGF誘導2nM的最大有絲分裂反應，ED50是0.2nM。欄b顯示用幾種內皮細胞類型HUVEC、HMVEC、BBC、ABAE的增殖測定的結果。欄c顯示用非內皮細胞類型人主動脈血管平滑肌細胞(VSMC)、周細胞和成纖維細胞(BHK21)和人新生兒成纖維細胞-hfb)和角化細胞的增殖測定的結果。基礎培養基作為陰性對照(Ct)；bFGF(F)、EGF(E)或VEGF(V)，分別以5.5和10ng/ml加入作為陽性對照。以1、10和100nM測定EG-VEGF。欄d顯示EG-VEGF在ACE細胞、原代狒狒腎上腺內皮細胞(BAEC)和MS-1中，而不是在HUVEC中誘導趨化性反應。各圖是代表性實驗。數據是平均值，帶有表示標準偏差的誤差條，增殖或遷移指數相對于任意定為值1的陰性對照。欄e-g說明EG-VEGF誘導腎上腺皮質衍生的毛細血管內皮細胞中的開窗(fenestration)。用2.5nM VEGF、10nMEG-VEGF或兩種因子的組合處理ACE，其在ECM上生長到匯合CM。未處理(欄e)、用VEGF處理(欄f)或EG-VEGF(欄g)的ACE細胞的電鏡照片揭示兩種分子都能誘導窗孔。箭頭表示窗孔的位置。表明了縮放比例(e和f微米，g納米)。
圖14A和14B顯示對照中相對的內皮細胞遷移，VEGF或EG-VEGF的濃度為0.2nM、0.5nM、1nM或5nM。
圖15顯示MAP激酶Erk1和2在接觸EG-VEGF后的磷酸化。
圖16A-C顯示EG-VEGF cDNA和氨基酸序列，以及與同源蛋白質的排列。圖16A顯示1.4kb人EG-VEGF cDNA序列。1.4kb人EG-VEGF cDNA編碼105個氨基酸的蛋白質，具有19個氨基酸的經典信號序列(下劃線)，和86個氨基酸的成熟蛋白質。一級蛋白質結構的驚人特征是半胱氨酸含量，形成5個二硫鍵的10個殘基。圖16B顯示人EG-VEGF、人Bv8同源物(SEQ ID NO4)和蛇VPRA(SEQ ID NO5)的序列排列。加框的殘基表示同一性。圖16C是人EG-VEGF、人dickkopf-3(hdkk3，SEQ ID NO6)、爪蟾dkk-1(xdkk1，SEQ ID NO7)和豬輔脂肪酶(col，SEQ ID NO8)的排列。排列表明形成該蛋白質結構域的特征性二硫鍵結合模式-輔脂肪酶折疊的保守半胱氨酸。EG-VEGF中的該基序有37％相同，與人dkk-3富含半胱氨酸的C-末端結構域有41％的同源性，和爪蟾dkk-1結構域有32％相同，42％同源性。數字表示各蛋白質中的氨基酸位置，加框的殘基與EG-VEGF相同。
圖17A-B說明EG-VEGF的缺氧性調節。圖17A顯示SW13(空心框)和H295(實心框)腎上腺癌細胞接觸正常氧(22％O2)對缺氧(2％O2)條件18小時RNA的Taqman分析，揭示EG-VEGF轉錄在缺氧條件下在SW13和H295R中分別增加了275％和210％，相對于VEGF中正常氧對照增加350％和252％。VEGF和EG-VEGF數據對肌動蛋白定標。圖17B顯示正常氧(空心框)對缺氧(實心框)條件下的HRE熒光素酶活性。熒光素酶報道子和載體的活性對于共轉染的Renilla熒光素酶定標。在缺氧條件下，Epo共有序列和EG-VEGF構建物的誘導比它們各自的正常氧對照高約3.4倍。Epo突變體和EG-VEGF突變體中核心序列的突變停止了對缺氧條件的反應，得到與載體對照相似的活性。
圖18顯示EG-VEGF表達的Northern印跡分析。人RNA樣品的Northern印跡分析揭示了約1.4kb的單一轉錄物。在卵巢和睪丸中表達最高，然后是腎上腺和胎盤。較長接觸后明顯的較不豐富的信號存在于前列腺中。通過與對照肌動蛋白探針雜交評估了等量的RNA荷載(數據未顯示)。印跡上方表明了泳道的含量，右方表明了大小(kb)。
圖19說明EG-VEGF體內血管生成作用的選擇性。欄a-c顯示大鼠角膜袋測定的結果。注意VEGF蛋白誘導強的血管生成反應，而EG-VEGF基本無作用。欄d-f顯示在裸鼠骨骼肌(sm)中注射adCMV-lacZ、AdCMV-VEGF164或AdCMV-EG-VEGF(5×108pfu)的結果。楔形指向標記注射位點的微球，箭頭指向新血管。注意具有大量新血管形成的血管生成反應是由VEGF誘導的，而lacZ和EG-VEGF Av都沒有明顯的作用。欄g-h顯示VEGF和EG-VEGF Av在小鼠耳中注射的結果。另外，VEGF Av導致強的血管生成反應，它不存在于用EG-VEGF Av注射的動物中(d-h的標尺是100微米)。欄i顯示在注射LacZ(ct)VEGF或EG-VEGF Av后7天卵巢(ov)的總體表現(標尺＝0.5cm)。注意VEGF和EG-VEGF組中更大的質量和淺表血管和出血區域的存在。欄j-n是注射Av載體(5×108pfu)的卵巢的顯微照片，如表明的那樣。注意j中lacZ卵巢的正常結構和形態。表明了黃體(CL)。相反，VEGF(k)和EG-VEGF(l)組顯示非常相似的改變，具有大的充液和出血囊狀區域(*)(j-l中的標尺是1毫米)。欄m-n分別是k和l中加框區域的高倍顯微照片(標尺＝33微米)。在囊性病變區域周圍有明顯的強血管生成區域。箭頭指向血管。
圖20A-Q提供了ALIGN-2序列比較計算機程序的完整源代碼。該源代碼可常規匯編用于UNIX操作系統，以提供ALIGN-2序列比較計算機程序。
優選例的詳述I.定義除非另外說明，本文所用的技術和科學術語與本發明所屬技術領域的一般技術人員通常理解的具有相同含義。見例如Singleton等，(Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology第二版)，J.Wiley & Sons(New York，NY1994)；Sambrook等，(Molecular Cloning，A Laboratory Mannual)，(Cold SpringHarbor，NY 1989)。為了本發明的目的，下文定義了以下術語。
當用于本文時，術語“EG-VEGF多肽”、“EG-VEGF蛋白”和“EG-VEGF”(和先前使用的用于描述相同多肽的“VRPA多肽”、“VRPA蛋白”和“VRPA”)包括天然序列EG-VEGF和EG-VEGF多肽變體(在本文中進一步限定)。EG-VEGF多肽可以分離自各種來源，例如人組織類型或其它來源，或通過重組和/或合成方法制備。
“天然序列EG-VEGF”含有具有作為天然衍生的EG-VEGF的相同氨基酸序列的多肽。這些天然序列EG-VEGF可分離自天然或可以通過重組和/或合成方法產生。術語“天然序列EG-VEGF”特別包括天然存在的截短或分泌的形式(例如胞外結構域序列)、天然存在的變體形式(例如另外剪切的形式)和天然存在的EG-VEGF的等位變體。在本發明的一個實施例中，天然序列EG-VEGF是成熟或全長的天然序列EG-VEGF，含有圖2的氨基酸1-105(SEQ ID NO2)。另外，雖然圖2(SEQ ID NO2)中公開的EG-VEGF多肽顯示從本文稱為氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基開始，可想像和可能圖2(SEQ ID NO2)中位于氨基酸位置1的上游或下游的另一甲硫氨酸殘基可以用作EG-VEGF多肽的起始氨基酸殘基。
“EG-VEGF變體多肽”指下文限定的活性EG-VEGF多肽，它與(a)圖2(SEQ IDNO2)中所示的EG-VEGF多肽的殘基1或約20-105，(b)圖2(SEQ ID NO2)中所示的EG-VEGF多肽的X-105(其中X是從圖2(SEQ ID NO2)的14-24的任何氨基酸殘基)，或(c)圖2(SEQ ID NO2)中所示的氨基酸序列的另一種特別衍生的片段具有至少約80％的氨基酸序列同一性。這種EG-VEGF變體多肽包括例如EG-VEGF多肽，其中在圖2(SEQ ID NO2)的序列的N和/或C末端，以及一個或多個內部結構域內，添加或缺失一個或多個氨基酸殘基。一般EG-VEGF變體多肽和(a)圖2(SEQ IDNO2)中所示的EG-VEGF多肽的殘基1或約20-105，(b)圖2(SEQ ID NO2)中所示的EG-VEGF多肽的X-105(其中X是從圖2(SEQ ID NO2)的14-24的任何氨基酸殘基)，或(c)圖2(SEQ ID NO2)中所示的氨基酸序列的另一個特別衍生的片段具有至少約80％的氨基酸序列同一性，更優選至少約81％的氨基酸序列同一性，更優選至少約82％的氨基酸序列同一性，更優選至少約83％的氨基酸序列同一性，更優選至少約84％的氨基酸序列同一性，更優選至少約85％的氨基酸序列同一性，更優選至少約86％的氨基酸序列同一性，更優選至少約87％的氨基酸序列同一性，更優選至少約88％的氨基酸序列同一性，更優選至少約89％的氨基酸序列同一性，更優選至少約90％的氨基酸序列同一性，更優選至少約91％的氨基酸序列同一性，更優選至少約92％的氨基酸序列同一性，更優選至少約93％的氨基酸序列同一性，更優選至少約94％的氨基酸序列同一性，更優選至少約95％的氨基酸序列同一性，更優選至少約96％的氨基酸序列同一性，更優選至少約97％的氨基酸序列同一性，更優選至少約98％的氨基酸序列同一性，更優選至少約99％的氨基酸序列同一性。EG-VEGf變體多肽不包括天然EG-VEGF多肽序列。一般EG-VEGF變體多肽至少長約10個氨基酸，通常長約20個氨基酸，更通常長約30個氨基酸，更通常長約40個氨基酸，更通常長約50個氨基酸，更通常長約60個氨基酸，更通常長約70個氨基酸，更通常長約80個氨基酸，更通常長約90個氨基酸，更通常長約100個氨基酸，更通常長約150個氨基酸，更通常長約200個氨基酸，更通常長約250個氨基酸，更通常長約300個氨基酸，或更長。
與本文鑒定的EG-VEGF多肽序列有關的“氨基酸序列同一性百分數(％)”定義為與EG-VEGF序列中的氨基酸殘基相同的候選序列中，在序列排列和如需要引入缺口，以實現最大的序列同一性百分數，且不考慮任何保守取代作為序列同一性的部分后得到的氨基酸殘基百分數。可用本領域技術人員能力范圍內的各種方法實現測定氨基酸序列同一性百分數的排列，例如使用公開可得到的計算機軟件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可確定合適的測定排列的參數，包括任何實現對比較的序列全長的最大排列所需的的算法。然而為了本文的目的，如下所述獲得％氨基酸序列同一性值使用序列比較計算機程序ALIGN-2，其中圖20提供了ALIGN-2程序的完整源代碼。ALIGN-2序列比較計算機程序是由Genetech，Inc.編寫的，圖20中所示的源代碼已與用戶記錄提交給了美國版權局，華盛頓哥倫比亞特區，20559，其中它注冊為美國版權登記號TXU510087。ALIGN-2程序通過Genetech Inc.，South SanFrancisco，California可公開得到，或可以從本文所提供的源代碼匯編。ALIGN-2程序應匯編用于UNIX操作系統，優選數碼UNIX V4.00。所有序列比較參數由ALIGN-2程序定，不改變。
為了本文的目的，給定氨基酸序列A與、或相對于給定氨基酸序列B(可另外比喻為給定氨基酸序列A，與或相對于氨基酸序列B具有一定的％氨基酸序列同一性)的％氨基酸序列同一性百分數計算如下X/Y×100其中X是序列排列程序ALIGN-2在該程序的A和B排列中評分為相同匹配的氨基酸殘基數，而Y是B中氨基酸殘基總數。應理解氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度，A對B的％氨基酸序列同一性不等于B對A的％氨基酸序列同一性。作為％氨基酸序列同一性計算的例子，圖3A-b表明如何計算稱為“比較蛋白”對稱為“PRO”的氨基酸序列的％氨基酸序列的同一性。
除非另外說明，本文所用的所有％氨基酸序列同一性值是如上所述用ALIGN-2序列比較計算機程序獲得的。然而％氨基酸序列同一性也可用序列比較程序NCBI-BLAST2(Altschul等，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))確定。可從http//www.ncbi.nlm.nih.gov上下載NCBI-BLAST2序列比較程序。NCBI-BLAST2使用幾種檢索參數，其中所有的檢索參數定為默認值，包括例如未遮掩＝是，鏈＝全部，期望發生＝10，最小低復雜性長度＝15/5，多通過e值＝0.01，多通過常數＝25，最終缺口排列的降低＝25，評分基準＝BLOSUM62。
在使用NCBI-BLAST2用于氨基酸序列比較的情況下，給定氨基酸序列A的％氨基酸序列同一性與，或相對于氨基酸序列B(可另外比喻為給定氨基酸序列A，與或相對于氨基酸序列B具有一定的％氨基酸序列同一性)的％氨基酸序列同一性百分數計算如下X/Y×100其中X是序列排列程序NCBI-BLAST2在該程序的A和B排列中評分為相同匹配的氨基酸殘基數，而Y是B中氨基酸殘基總數。應理解氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度，A對B的％氨基酸序列同一性不等于B對A的％序列同一性。
“EG-VEGF變體多核苷酸”或“EG-VEGF變體核苷酸序列”指下文限定的編碼活性EG-VEGF多肽的核酸分子，它與(a)編碼圖2(SEQ ID NO2)中所示的EG-VEGF多肽的殘基1或約20-105的核酸序列，(b)編碼圖2(SEQ ID NO2)中所示的EG-VEGF多肽的X-105(其中X是從圖2(SEQ ID NO2)的14-24的任何氨基酸殘基)的核酸序列，或(c)編碼圖2(SEQ ID NO2)中所示的氨基酸序列的另一種特別衍生的片段的核酸序列具有至少約80％的核酸序列同一性。一般EG-VEGF變體多核苷酸和(a)編碼圖2(SEQ ID NO2)中所示的EG-VEGF多肽的殘基1或約20-105的核酸序列，(b)編碼圖2(SEQ ID NO2)中所示的EG-VEGF多肽的X-105(其中X是圖2(SEQ IDNO2)的14-24的任何氨基酸殘基)的核酸序列，或(c)編碼圖2(SEQ ID NO2)中所示的氨基酸序列的另一個特別衍生的片段的核酸序列具有至少約80％的核酸序列同一性，更優選至少約81％的核酸序列同一性，更優選至少約82％的核酸序列同一性，更優選至少約83％的核酸序列同一性，更優選至少約84％的核酸序列同一性，更優選至少約85％的核酸序列同一性，更優選至少約86％的核酸序列同一性，更優選至少約87％的核酸序列同一性，更優選至少約88％的核酸序列同一性，更優選至少約88％的核酸序列同一性，更優選至少約89％的核酸序列同一性，更優選至少約90％的核酸序列同一性，更優選至少約91％的核酸序列同一性，更優選至少約92％的核酸序列同一性，更優選至少約93％的核酸序列同一性，更優選至少約94％的核酸序列同一性，更優選至少約95％的核酸序列同一性，更優選至少約96％的核酸序列同一性，更優選至少約97％的核酸序列同一性，更優選至少約98％的核酸序列同一性，更優選至少約99％的核酸序列同一性。EG-VEGF變體多核苷酸不包括天然EG-VEGF核苷酸序列。
一般EG-VEGF變體多核苷酸至少長約30個核苷酸，更通常至少長約60個核苷酸，更通常至少長約90個核苷酸，更通常至少長約120個核苷酸，更通常至少長約150個核苷酸，更通常至少長約180個核苷酸，更通常至少長約210個核苷酸，更通常至少長約240個核苷酸，更通常至少長約270個核苷酸，更通常至少長約300個核苷酸，更通常至少長約450個核苷酸，更通常至少長約600個氨基酸，更通常至少長約900個核苷酸，或更長。
與本文鑒定的EG-VEGF多肽編碼的核酸序列有關的“核酸序列同一性百分數(％)”定義為與EG-VEGF多肽編碼的核酸序列中的核苷酸相同的候選序列中，在序列排列和如需要引入缺口，以實現最大的序列同一性百分數后得到的核苷酸百分數。可用本領域技術人員能力范圍內的各種方法實現測定核酸序列同一性百分數的排列，例如使用公開可得到的計算機軟件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可確定合適的測定排列的參數，包括任何實現對比較的序列全長的最大排列所需的的算法。然而為了本文的目的，如下所述獲得％核酸序列同一性值使用序列比較計算機程序ALIGN-2，其中以下提供了ALIGN-2程序的完整源代碼。ALIGN-2序列比較計算機程序是由Genetech，Inc.編寫的，以下所示的源代碼已與用戶記錄提交給了美國版權局，華盛頓哥倫比亞特區，20559，其中它注冊為美國版權登記號TXU510087。ALIGN-2程序通過Genetech Inc.，South San Francisco，California可公開得到，或可以從本文所提供的源代碼匯編。ALIGN-2程序應匯編用于UNIX操作系統，優選數碼UNIX V4.00。所有序列比較參數由ALIGN-2程序定，不改變。
為了本文的目的，給定核酸序列C與、或相對于給定核酸序列D(可另外比喻為給定核酸序列C，與或相對于核酸序列D具有一定的％核酸序列同一性)的％核酸序列同一性百分數計算如下W/Z×100其中W是序列排列程序ALIGN-3在該程序的C和D排列中評分為相同匹配的核苷酸數，而Z是D中核苷酸總數。應理解核酸序列C的長度不等于核酸序列D的長度，C對D的％核酸序列同一性不等于D對C的％核酸序列同一性。作為％核酸序列同一性計算的例子，圖3C-D顯示表明計算稱為“比較DNA”的核酸序列對稱為“PRO-DNA”的核酸序列的％核酸序列同一性。
除非另外說明，本文所用的所有％核酸序列同一性值是如上所述用ALIGN-2序列比較計算機程序獲得的。然而％核酸序列同一性也可用序列比較程序NCBI-BLAST2(Altschul等，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))確定。可從http//www.ncbi.nlm.nih.gov上下載NCBI-BLAST2序列比較程序。NCBI-BLAST2使用幾種檢索參數，其中所有檢索參數定為默認值，包括例如未遮掩＝是，鏈＝全部，期望發生＝10，最小低復雜性長度＝15/5，多通過e值＝0.01，多通過常數＝25，最終缺口排列的降低＝25，評分基準＝BLOSUM62。
在使用NCBI-BLAST2用于序列比較的情況下，給定核酸序列C的％核酸序列同一性與，或相對于核酸序列D(可另外比喻為給定核酸序列C，與或相對于核酸序列D具有一定的％核酸序列同一性)的％核酸序列同一性百分數計算如下W/Z×100其中W是序列排列程序NCBI-BLAST2在該程序的C和D排列中評分為相同匹配的核苷酸數，而Z是D中核苷酸總數。應理解核酸序列C的長度不等于核酸序列D的長度，C對D的％核酸序列同一性不等于D對C的％核酸序列同一性。
在其它實施例中，EG-VEGF變體多核苷酸是編碼活性EG-VEGF多肽的核酸分子，它優選在嚴謹雜交和洗滌條件下能與編碼圖2(SEQ ID NO2)所示的全長EG-VEGF多肽的核苷酸序列雜交。EG-VEGF變體多肽可以是那些EG-VEGF變體多核苷酸編碼的。
在如上所述進行的氨基酸序列同一性比較的情況下，術語“正”包括比較的序列中不僅相同，而且具有相似性質的氨基酸殘基。對于感興趣的氨基酸殘基評分為正值的氨基酸殘基是與感興趣的氨基酸殘基相同，或是感興趣的氨基酸殘基的優選取代(如下文表1所定義的)。
為了本文的目的，給定氨基酸序列A與、或相對于給定氨基酸序列B(可另外比喻為給定氨基酸序列A，與或相對于氨基酸序列B具有一定的％正值)的％正值計算如下X/Y×100其中X是序列排列程序ALIGN-2在該程序的A和B排列中評分為正值的氨基酸殘基數，而Y是B中氨基酸殘基總數。應理解氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度，A對B的％正值不等于B對A的％正值。
當用于描述本文公開的各種多肽時，“分離的”指從天然環境中已鑒定并分離和/或回收的多肽。優選分離的多肽不與所有其天然結合的成分結合。其天然環境的污染成分是通常影響多肽的診斷或治療用途的物質，可以包括酶、激素、蛋白質或非蛋白質溶質。在優選例中，多肽可純化到(1)使用轉杯式測序儀足夠獲得N末端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，(2)用考馬斯藍或優選銀染色，在非還原或還原條件下通過SDS-PAGE到均一性。分離的多肽包括重組細胞內的原位多肽，因為EG-VEGF天然環境中的至少一個成分不存在。然而一般通過至少一個純化步驟制備分離的多肽。
“分離的”編碼EG-VEGF多肽的核酸分子是一種核酸分子，從一般在EG-VEGF編碼的核酸的天然來源中與之結合的至少一種污染的核酸分子中鑒定和分離出來。優選分離的核酸不與所有其天然結合的成分結合。分離的EG-VEGF編碼的核酸分子不是天然發現的形式或定位。因此從分離的核酸分子不同于EG-VEGF編碼的核酸分子，如其在天然細胞中存在那樣。然而，編碼EG-VEGf多肽的分離的核酸分子包括原來表達EG-VEGF的細胞中所含的EG-VEGF編碼的核酸分子，其中例如，核酸分子是處于與天然細胞不同的染色體位置上。
術語“控制序列”指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列必需的DNA序列。適合原核細胞的控制序列包括例如啟動子，可任選的操縱基因序列，和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號和增強子。
當核酸與另一種核酸序列具有功能性關系時，它“可操作性連接”。例如，前序列或分泌前導序列的DNA與多肽的DNA可操作性連接，如果它作為參與多肽分泌的前蛋白表達；啟動子或增強子與編碼序列可操作性連接，如果它影響序列的轉錄；或核糖體結合位點與編碼序列可操作性連接，如果它的定位能促進翻譯。通常“可操作性連接”意指連接的DNA序列是鄰接的，和在分泌前導序列的情況下，閱讀狀態下是鄰接的。然而增強子不必要鄰接。連接是通過在便利的限制性位點連接實現的。如果不存在這些位點，根據常規實踐用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。
術語“抗體”以最廣義使用，特別包括例如單一抗-EG-VEGF單克隆抗體(包括激動劑、拮抗劑、和中和抗體)，具有多表位特異性的抗-EG-VEGF抗體組合物，單鏈抗-EG-VEGF抗體和抗-EG-VEGF抗體的片段(見下文)。本文所用的術語“單克隆抗體”指從一群基本同源的抗體(即組成該群的單個抗體是相同的，除了可能有少量存在的天然突變)獲得的抗體。
本領域技術人員不難測定雜交反應的“嚴謹性”，通常是根據探針長度、洗滌溫度和鹽濃度的經驗計算的。一般較長的探針需要較高的溫度用于正確退火，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常依賴于在低于其解鏈溫度的環境下存在互補鏈時，變性的DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列之間所需同源性的程度越高，可使用的相對溫度越高。結果，遵循較高的相對溫度可使得反應條件更嚴謹，而較低的溫度嚴謹性較低。對于雜交反應嚴謹性的其它細節和解釋，見Ausubel等，(Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley IntersciencePublishers(1995)。
本文所限定的“嚴謹條件”或“高嚴謹條件”可定義為(1)洗滌使用低離子強度和高溫度，例如0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基磺酸鈉，50℃；(2)在雜交過程中使用變性劑，例如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液，pH6.5，具有750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，42℃；或(3)使用50％甲酰胺，5×SSC(0.75MNaCl，0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.8)，0.1％焦磷酸鈉，5×Denhardt’氏溶液，超聲處理的鮭魚精DNA(50g/ml)，0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯，42℃，42℃在0.2×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中，55℃在50％甲酰胺中，然后55℃在含有0.1×SSC的EDTA溶液中進行高嚴謹性洗滌。
如Sambrook等，(Molecular Cloning，A Laboratory Mannual)，New YorkCold Spring Harbor Press，1989所述限定“中等嚴謹條件”，包括使用比上述較不嚴謹的洗滌溶液和雜交條件(如溫度、離子強度和％SDS))。中等嚴謹條件的例子是37℃在溶液中過夜溫育，該溶液含有20％甲酰胺、5×SSC(150nM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt氏溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20mg/ml變性剪切的鮭魚精DNA，然后在約37-50℃1×SSC中洗滌濾膜。技術人員將認識到如何調節溫度、離子強度等，這是配合探針長度等因素必需的。
本文所用的術語“表位標記的”指嵌合多肽，含有與“標記多肽”融合的EG-VEGF多肽。標記多肽具有足夠的殘基，以提供可針對其制備抗體的表位，但足夠短，從而不影響與其融合的多肽的活性。標記多肽優選還相當獨特，使抗體基本不和其它表位交叉反應。合適的標記多肽通常具有至少6個氨基酸殘基，通常在約8-50個氨基酸殘基之間(優選約10-20個氨基酸殘基之間)。
本文所用的術語“免疫粘附素”指類似抗體的分子，它聯合了異源蛋白的結合特異性(“粘附素”)和免疫球蛋白恒定區的效應因子功能。結構上免疫粘附素是具有所需結合特異性(與抗原識別區和抗體結合位點不同的(即“異源”))的氨基酸序列，和免疫球蛋白恒定區序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是鄰接氨基酸序列，至少含有受體或配體的結合位點。可從任何免疫球蛋白，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM中獲得免疫粘附素中免疫球蛋白恒定區序列。
為了本文的目的，“活性的”或“活性”指EG-VEGF保留天然或天然存在的EG-VEGF的生物和/或免疫活性的形式，其中“生物”活性指天然或天然存在的EG-VEGF除了誘導針對天然或天然存在的EG-VEGF具有的抗原表位的抗體產生的能力外的其它生物學功能(抑制或刺激)，“免疫”活性指誘導產生針對天然或天然存在的EG-VEGF具有的抗原表位的抗體的能力。生物活性特別包括細胞增殖和趨化性的調節。優選的生物活性是調節內皮細胞的產生、生長、分化和/或遷移的能力。甚至更優選的，生物活性是誘導內分泌腺中的毛細血管內皮細胞，優選類固醇生成細胞增殖、遷移和/或開窗的能力。其它優選的生物活性是在內分泌腺中，尤其在內分泌腺的類固醇生成組織中促進血管生成和/或調節血管滲透性的能力。另一種優選生物活性是誘導參與細胞增殖和/或存活的信號傳遞分子，例如MAP激酶(如ERK1或ERK2)的磷酸化的能力。
術語“血管生成”以最廣義使用，特別包括從現有血管形成新血管，例如內皮祖細胞通過遷移、增殖、細胞-細胞聚集、裝配和形態發生從頭裝配成血管(也稱為“血管發生”)。
術語“拮抗劑”以最廣義使用，包括任何部分或完全阻斷、抑制或中和本文公開的天然EG-VEGF多肽的生物活性的分子。以類似方式，術語“激動劑”以最廣義使用，包括任何模仿本文公開的天然EG-VEGF多肽的生物活性的分子。合適的激動劑或拮抗劑分子特別包括激動劑或拮抗劑抗體或抗體片段，天然EG-VEGF多肽的片段或氨基酸序列變體，肽，小有機分子等。鑒定EG-VEGF多肽的激動劑或拮抗劑的方法可以包括將EG-VEGF多肽與候選激動劑或拮抗劑分子接觸，測定與EG-VEGF分子通常有關的一種或多種生物活性中可檢測的改變。
“治療”指治療性處理和預防性或防范性方法，其中目標是防止或緩解(減少)目標病況或疾病。需要治療的包括已患有疾病的，和易于患有疾病的，和要預防疾病的。例如在腫瘤(如癌癥)治療中，一種治療劑可直接減少腫瘤細胞的病原性，或使腫瘤細胞對于其它治療劑，例如輻射和/或化療的治療更敏感。
“類固醇生成的”是“類固醇生成細胞”中類固醇激素生物合成的激素誘導的、CAMP介導的急性調節，該細胞的特征是膽固醇從細胞儲藏中移動到線粒體外膜，其轉位到內膜，在那里膽固醇轉化為孕烯醇酮。
“類固醇生成組織”指通過類固醇生成的作用產生類固醇激素的組織。例子包括腎上腺、生殖器官、腸和呼吸道組織。
“慢性”給藥指相對于急性方式的連續方式給藥，從而在一段時間內維持最初的療效(活性)。“中斷的”給藥是非連續不間斷的治療，但性質通常是循環的。
為了治療目的，“哺乳動物”指任何分類為哺乳動物的動物，包括人，其它高等靈長類、家畜和農畜，和動物園、運動場或寵物動物，例如犬、貓、牛、馬、羊、豬、山羊、家兔等。優選哺乳動物是人。
本文所用的“腫瘤”指所有腫瘤性細胞生長和增殖，不論惡性還是良性，以及所有癌前細胞和癌細胞和組織。
術語“癌癥”和“癌性的”指或描述哺乳動物中通常由失控的細胞生長為特征的生理情況。本文特別感興趣的癌癥的例子包括生殖器官的癌癥，例如卵巢癌、睪丸癌、子宮癌、子宮頸癌、前列腺癌、腎上腺癌，包括腎上腺皮質癌(例如腎上腺皮質癌)和腎上腺髓質；甲狀腺癌；甲狀旁腺癌；胰腺癌；和子宮內膜癌。
疾病的“病理”包括所有影響病人健康的現象。對于癌癥，這包括但不限于異常或失控的細胞生長、轉移、影響鄰近細胞的正常功能、細胞因子或其它分泌產物以異常水平釋放、炎癥或免疫應答的抑制或強化等。
與一種或多種其它治療劑“聯合”給藥包括同時和以任何順序依次施用。
本文所用的“載體”包括藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑，它們對于與其接觸的細胞或哺乳動物在所使用的劑量和濃度下是無毒的。通常生理學上可接受的載體是水相pH緩沖溶液。生理學上可接受的載體包括磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸緩沖液；包括抗壞血酸的抗氧化劑；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清清蛋白、角蛋白或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它糖類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽的反荷離子，例如鈉；和/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
“抗體片段”包括一部分完整的抗體，優選完整抗體的抗體結合或可變區。抗體片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab)2和Fv片段；雙特異抗體；線性抗體(Zapata等，Protein Eng.8(10)1057-1062)；單鏈抗體分子；和抗體片段形成的多特異性抗體。
用木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為“Fab”片段，各具有一個抗原結合位點，和剩余的“Fc片段”，該命名反映了容易結晶的能力。木瓜蛋白酶處理得到F(ab’)2片段，它具有兩個抗原聯合位點，仍然能交聯抗原。
“Fv”是含有完整抗原識別和結合位點的最小抗體片段。該區域由緊密非共價結合的重鏈和輕鏈可變域的二聚體構成。它的構象是各可變域的三個CDR相互作用，在VH-VL二聚體的表面上形成抗原-結合位點。然而，甚至一個可變域(或Fv的一半僅含有對一個抗原特異性的三個CDR)也能識別和結合抗原，雖然比整個結合位點的親和力要低。
Fab片段還含有輕鏈的恒定區和重鏈的第一恒定區(CH1)。Fab片段與Fab’片段不同，它加入了重鏈CH1域的羧基末端的幾個殘基，其中包括來自抗體絞鏈區的一個或多個半胱氨酸。Fab’-SH在本文中的命名來自恒定區的半胱氨酸殘基攜帶一個自由巰基的Fab’。F(ab’)2抗體片段最初是作為在彼此之間存在絞鏈半胱氨酸的Fab’片段產生的。還已知抗體片段的其它化學偶聯。
任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可分為兩種完全不同的類型，稱為κ和λ，基于其恒定區的氨基酸序列。
根據其重鏈恒定區的氨基酸序列，免疫球蛋白可分為不同的類別。有五大類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，這些中的幾種還可以進一步分成亞類(同種型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。
“單鏈Fv”或“sFv”抗體片段包括抗體的VH和VL域，其中這些結構域存在于一條多肽鏈中。優選Fv多肽還在VH和VL結構域之間具有多肽接頭，使得sFv形成抗原結合所需的結構。有關sFv的綜述，見Pluckthun的(Pharmacology ofMonoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore編，Spring-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
術語“二體”(diaboies)指有兩個抗原結合位點的小抗體片段，該片段包含在同一多肽鏈(VH-VL)中與輕鏈可變區(VL)連接的重鏈可變區(VH)。通過使用短至使同一鏈上兩功能區之間無法配對的接頭，功能區被迫與另一鏈的互補區配對，并此形成兩個抗原結合位點。例如歐洲專利404,097；WO93/11161；和Hollinger等在Pro.Nat.1 Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中對二體有更為全面的論述。
“分離的”抗體是經鑒定的和分離和/或回收自其天然環境組份的抗體。其天然環境中的污染組份是指會干擾所述抗體的診斷或治療性用途的物質，可包括酶、激素和其它蛋白質或非蛋白質溶質。在優選實施方案中，抗體純化至(1)經Lowry法測定，按重量計抗體純度高于95％，最好高于99％，(2)其純度足以通過使用轉杯式測序儀獲得至少15個N末端殘基或內部氨基酸序列，或者(3)用考馬斯藍或最好用銀染色法，在還原或非還原條件下SDS-PAGE測定達到均一性。分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體，因為該抗體的天然環境的至少一種組份是不存在的。但是，通常分離的抗體是至少經一個純化步驟制備的。
詞語“標記”在此指直接或間接與抗體偶聯的可檢測化合物或組合物，以便產生“標記的”抗體。標記自身可以被檢測到(例如放射性同位素標記或熒光標記)，或者，在酶標記的情況下，它們可催化化合物或組合物底物發生可檢測的化學改變。
“固相”指本發明抗體可粘附于其上的非液態基質。固相的例子在此包括部分或完全由玻璃(例如可控多孔玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷構成的固相。在某些實施方案中，根據上下文，固相可包括測試板的孔；而在其它實施方案中，可是純化柱(例如親和層析柱)。該術語還包括分散的顆粒構成的不連續固相，如美國專利No.4,275,149中所述的。
“脂質體”是由各種脂類、磷脂和/或表面活性劑構成的小囊泡，通常被用來向哺乳動物傳遞藥物(例如EG-VEGF多肽或其抗體)。脂質體的組份通常排列成雙層結構，與生物膜的脂排列類似。
本文限定的“小分子”具有低于約500道爾頓的分子量。
本文所用的術語“血管內皮生長因子”、“VEGF”、“VEGF多肽”和“VEGF蛋白”包括天然序列VEGF和VEGF變體(在本文中進一步限定)。VEGF多肽可分離自各種來源，例如從人組織類型或來自其它來源，或通過重組和/或合成方法制備。
“天然序列-VEGF”含有作為天然衍生的VEGF的相同氨基酸序列的多肽。這種天然序列VEGF可分離自天然或可以通過重組和/或合成方法產生。術語“天然序列VEGF”特別包括天然存在的截短或分泌的形式(例如胞外結構域序列)、天然存在的變體形式(例如另外剪切的形式)和天然存在的VEGF的等位變體。在本發明的一個實施例中，天然序列VEGF是5種已知的同種型之一，分別含有121、145、165、189和206個氨基酸，例如美國專利號5,332,671和5,240,848；PCT出版號WO98/10071；Leung等，Science 2461306-1309(1989)；和Keck等，Science2461309-1312(1989)所述。
“VEGF變體多肽”意指下文所定義的一種活性VEGF多肽，與天然序列VEGF的氨基酸序列具有至少約80％，優選至少約85％，更優選至少約90％，甚至更優選至少約95％，最優選至少約98％氨基酸序列同一性。該VEGF變體多肽包括例如VEGF多肽，其中在天然序列的N-和/或C-末端和一個或多個內部結構域中添加或缺失一個或多個氨基酸。
用對EG-VEGF特別描述的相同方法確定VEGF的序列同一性(氨基酸或核酸)。類似的，對于EG-VEGF的激動劑和拮抗劑(包括但不限于抗體)提供的定義，也用于VEGF的激動劑和拮抗劑。
II.發明的組合物和方法
A.全長EG-VEGF序列本發明提供了新鑒定和分離的編碼多肽的核苷酸序列，該多肽在本申請中稱為EG-VEGF(或UNQ600)。特別是，鑒定和分離了編碼EG-VEGF多肽的cDNA，在下文實施例中進一步公開。應注意在分別表達循環中產生的蛋白質可得到不同的PRO號，但對于任何給定的DNA和編碼的蛋白質UNQ號是獨特的，不會改變。然而為了簡便起見，在本說明書中DNA60621-1516編碼的蛋白質和上述EG-VEGF定義中包括的其它天然同源物和變體都稱為“EG-VEGF”，不論其來源或制備方式。
如下文實施例公開的，本文稱作DNA606021-1516的cDNA克隆已被保存在ATCC。本領域技術人員使用本領域的常規方法，通過對保藏的克隆測序不難確定克隆的實際核苷酸序列。預測的氨基酸序列可用常規技術從核苷酸序列確定。對于本文所述的EG-VEGF多肽和編碼核酸，申請人鑒定了據信用目前可獲得的序列信息能最好鑒定出的閱讀框。
用上述ALIGN-2序列排列計算機程序，發現全長天然序列EG-VEGF(圖2和SEQID NO2所示)具有與EG-VEGF_DENPO，一種來自黑樹眼鏡蛇(mambo venom)蛋白的某些氨基酸序列同一性。然而未揭示與任何已知哺乳動物蛋白的顯著序列相同性。
B.EG-VEGF變體除了本文所述的全長天然序列EG-VEGF多肽，考慮可制備EG-VEGF變體。通過在EG-VEGF DNA中引入合適的核苷酸改變，和/或通過合成所需的EG-VEGF多肽可制備EG-VEGF變體。本領域技術人員應理解氨基酸變動可改變EG-VEGF的翻譯后過程，例如改變糖基化位點的數量或位置，或改變膜錨定特征。
在天然全長序列EG-VEGF或在本文所述的EG-VEGF的各結構域中的變異，可用例如任何列出的保守和非保守突變的技術和指導(例如美國專利號5,364,934)制備。變異可以是取代、缺失或插入一個或多個編碼EG-VEGF的密碼子，導致EG-VEGF的氨基酸序列與天然序列EG-VEGF相比有改變。可任選的，變異是通過在EG-VEGF的一個或多個結構域中用任何其它氨基酸取代至少一個氨基酸。通過比較EG-VEGF的序列和同源已知蛋白分子的序列，并將高度同源區中產生的氨基酸序列改變數減到最少，可得到確定插入、取代或缺失哪種氨基酸殘基，而不影響所需的活性的指導。氨基酸取代可以是用另一種具有相似結構和/或化學性質的氨基酸取代一種氨基酸，例如用絲氨酸取代亮氨酸，即保守氨基酸置換的結果。插入或缺失可任選的在約1-5個氨基酸的范圍內。可通過在序列中系統地產生插入、缺失或取代氨基酸，并測試得到的變體的全長或成熟天然序列顯示的活性，可確定允許的變異。
本文提供了EG-VEGF多肽片段。例如，當與全長天然蛋白比較時，可在N-末端或C-末端截短這些片段，或缺少內部殘基。一些片段缺少對于EG-VEGF多肽的所需生物活性不必需的氨基酸殘基。
可用許多常規技術的任一制備EG-VEGF片段。可化學合成所需的肽片段。另一種方法涉及通過酶消化，例如通過用已知在特定氨基酸確定的位點切割蛋白質的酶處理蛋白質，或通過用合適的限制性酶消化DNA，并分離所需的片段，產生EG-VEGF片段。另一種合適的技術涉及通過聚合酶鏈式反應(PCR)分離和擴增編碼所需多肽片段的DNA片段。在PCR中，在5′和3′引物處使用確定DNA片段所需末端的寡核苷酸。優選EG-VEGF多肽片段與圖2(SEQ ID NO2)所示的天然EG-VEGF多肽具有至少一種生物和/或免疫活性。
在具體實施例中，表1中顯示感興趣的保守取代，題為優選取代。如果這種取代導致生物活性的改變，那么可引入更顯著的變化，即表1中指出的“示范性的取代”、或進一步按下面氨基酸類型引入取代，然后篩選產物。
表1
對EG-VEGF的功能或免疫同一性的基本修飾，可以通過選擇在下列方面的效應上差別明顯的取代而實現(a)維持取代區域中多肽骨架的結構，例如折疊或螺旋構象，(b)維持靶位置處分子的電荷或疏水性，或(c)側鏈體積。根據共同的側鏈特性，天然存在的殘基被分成下列幾類(1)疏水的正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性親水的cys，ser，thr；(3)酸性的asp，glu；(4)堿性的asn，gln，his，lys，arg；(5)影響鏈取向的殘基gly，pro；和(6)芳香類的trp，tyr，phe非保守取代需要用這些類別中一類的某種氨基酸替換另一類的某種氨基酸。這些取代的殘基也可被引入保守取代位點，或更優選的，引入剩余(非保守)位點。
可用本領域已知的方法，例如寡核苷酸介導的(定點)誘變、丙氨酸掃描，和PCR誘變產生變異。定點誘變[Carter等，Nucl.Acids.Res.134331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids.Res.106487(1987)]，盒式誘變[Wells等，Gene，34315(1985)]，限制性選擇誘變[Wells等，Trans.R.Soc.London SerA，317415(1986)]或其它已知的技術可在克隆的DNA上進行，以產生EG-VEGF變體DNA。
也可用掃描氨基酸分析鑒定沿鄰接序列的一個或多個氨基酸。在優選的掃描氨基酸中有較小、中性的氨基酸。這些氨基酸包括丙氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是該組中優選的掃描氨基酸，因為它消除了β-碳外的側鏈，較難改變變體的主鏈構象[Cunningham和Wells，Science，2441081-1085(1989)]。丙氨酸通常也是優選的，因為它是最常見的氨基酸。另外，它常常在包埋和暴露的位置被發現[Creighton，The Proteins，(W.H.Freeman & Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，1501(1976)]。如果丙氨酸取代不產生足夠數量的變體，可使用等排的(isosteric)氨基酸。
C.EG-VEGF的修飾在本發明的范圍內包括EG-VEGF的共價修飾。一種共價修飾包括使EG-VEGF多肽的靶氨基酸殘基與有機衍生劑反應，該衍生劑能夠與EG-VEGF所選的側鏈或N-或C-末端殘基反應。用雙功能劑衍生用于例如，將EG-VEGF與水不溶性載體基質或表面交聯，用于純化抗-EG-VEGF抗體的方法，反之亦然。常用的交聯劑包括例如1，1-二(二偶氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀酰胺酯，例如與4-偶氮水楊酸形成的酯，同雙功能亞氨酸酯，包括二琥珀酰亞胺酯，例如3，3′-二硫代二(琥珀酰亞胺丙酸鹽)，雙功能馬來酰亞胺，例如二-N-馬來酰亞氨基-1，8-辛烷，和試劑，例如甲基-3-[(對疊氮苯基)二硫代]丙酰亞胺酸鹽。
其它修飾包括谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基殘基的脫氨，分別形成相應的谷氨酰基和天冬氨酰基殘基，脯氨酸和賴氨酸的羥化，絲氨酰基或蘇氨酰基殘基的羥基磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈-氨基的甲基化[T.E.Creighton，(ProteinsStructure and Molecular Properties)，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，pp.79-86(1983)]，N-末端胺的乙酰化和任何C-末端羧基的酰胺化。
包括在本發明范圍內的EG-VEGF多肽的共價修飾的另一種類型包括改變多肽的天然糖基化模式。“改變天然糖基化模式”在本文中意指去除天然序列EG-VEGF中發現的一個或多個糖類部分(通過除去下面的糖基化位點或通過用化學和/或酶方法去除糖基化)，和/或添加一個或多個在天然序列EG-VEGF中不存在的糖基化位點。另外，詞組包括天然蛋白質糖基化中的定量改變，涉及存在的各種糖類部分中性質和比例的改變。
在EG-VEGF多肽中添加糖基化位點，通常可通過改變氨基酸序列實現。可通過例如在天然序列EG-VEGF中添加或取代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基而實現改變(對于O-連接的糖基化位點而言)。可通過DNA水平的改變，特別是通過使編碼EG-VEGF多肽的DNA在預選的堿基處突變，以致產生的密碼子將翻譯成所需氨基酸，可任選的改變EG-VEGF氨基酸序列。
另一種增加EG-VEGF多肽上的糖類部分的數目的方法是通過將糖苷與多肽化學或酶偶聯。這些方法在領域中有所描述，例如在WO87/05330(1987年9月11日出版)和Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306中。
可通過化學方法或酶方法，或通過突變取代編碼作為糖基化目標的氨基酸殘基的密碼子，實現除去EG-VEGF多肽上存在的糖類部分。化學去糖基化技術是本領域已知的，并且如Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.，25952(1987)和Edge等，Anal.Biochem.，118131(1981)所述。對多肽上糖類部分的酶切割可用各種內切和外切糖苷酶實現，如Thotakura等，Meth.Enzymol.，138350(1987)所述。
另一種類型的EG-VEGF共價修飾包括將EG-VEGF多肽與各種非蛋白聚合物之一偶聯，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙烯二醇或聚氧化亞烷基，其方法描述于美國專利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337中。
本發明的EG-VEGF還可以通過形成嵌合分子來修飾，嵌合分子包括與另一種異源多肽或氨基酸序列融合的EG-VEGF。
在一個實施例中，這種嵌合分子包括EG-VEGF與標記多肽的融合體。標記多肽提供了抗-標記抗體可選擇性結合的表位。表位標記通常置于EG-VEGF的氨基末端或羧基末端。可用針對標記多肽的抗體檢測該EG-VEGF表位標記形成的存在。另外，提供表位標記使得易于通過使用抗-標記抗體或其它類型的與表位標記結合的親和基質，通過親和純化來純化EG-VEGF。各種標記多肽及其相應的抗體是本領域已知的。例子包括聚-組氨酸(poly-his)或聚-組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標記；flu HA標記多肽及其抗體12CA5(Field等，Mol.Cell.Biol.82159-2165(1988))；c-myc標記及其抗體8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10(Evan等，Mol.Cell.Biol.53610-3616(1985))；和單純性皰疹病毒糖蛋白D(gD)標記及其抗體(Paborsky等，Protein Engineering 3(6)547-553(1990))。其它標記多肽包括Flag-肽[Hopp等，Biotechnology，61204-1210(1988)]；KT3表位肽[Martin等，Science，255192-194(1992)]；微管蛋白表位肽[Skinner等，J.Biol.Chem.，26615163-15166(1991)]；和T7基因10蛋白肽標記[Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876393-6397(1990)]。
在另一個實施例中，嵌合分子可包括EG-VEGF與免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定區域的融合體。對于嵌合分子的二價形式(也稱為“免疫粘附素”)，該融合體可以是IgG分子的Fc區域。Ig融合體優選包括用EG-VEGF多肽的可溶性形式(跨膜結構域缺失或滅活的)取代Ig分子內的至少一個可變區。在特定優選例中，免疫球蛋白融合體包括絞鏈、CH2和CH3，或IgG1分子的絞鏈、CH1、CH2和CH3區。對于免疫球蛋白融合體的產生，另見1995年6月27日提交的美國專利號5,428,130。
D.EG-VEGF的制備下文所述主要涉及通過培養用含有EG-VEGF核酸的載體轉化或轉染的細胞產生EG-VEGF。當然，考慮本領域熟知的其它方法也可用于制備EG-VEGF。例如，EG-VEGF序列或其部分，可通過用固相技術直接肽合成產生[見例如Stewart等，Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149-2154(1963)]。可用手工技術或自動化進行體外蛋白質合成。可用Applied Biosystems肽合成儀(Foster City，CA)，根據廠商說明書實現自動化合成。可分別化學合成EG-VEGF的各部分，然后用化學或酶方法聯合，以產生全長EG-VEGF。
1.編碼EG-VEGF的DNA的分離可從認為具有EG-VEGF mRNA，并以可檢測水平表達的組織制備的cDNA文庫中獲得編碼EG-VEGF的DNA。因此，可方便地從人組織制備的cDNA文庫中獲得人EG-VEGF DNA，如實施例中所述。還可從基因組文庫或通過已知合成方法(例如自動化核酸合成)獲得編碼EG-VEGF的基因。
可用設計鑒定感興趣的基因或其編碼的蛋白質的探針(例如EG-VEGF的抗體或至少約20-80個堿基的寡核苷酸)篩選文庫。可用標準方法，例如Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)所述的用所選探針篩選cDNA或基因組文庫。另一種分離編碼EG-VEGF的基因的方法是使用PCR法[Sambrook，見上；Dieffenbach等，PCR PrimerA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995)]。
下面的例子描述了篩選cDNA文庫的技術。選擇作為探針的寡核苷酸序列應該足夠長，足夠明顯，使假陽性最小化。優選標記的寡核苷酸，從而在與篩選的文庫中的DNA雜交后能被檢測。標記方法是本領域熟知的，包括使用放射性標記，例如32P-標記的ATP、生物素酰化或酶標記。Sambrook等，見上中提供了雜交條件，包括中等嚴謹性和高嚴謹性。
在這些文庫篩選方法中鑒定的序列可與保藏并在公眾數據庫，例如GenBank或其它私人序列數據庫中可得的其它已知序列比較和排列。可用本領域已知和本文所述的方法確定分子限定區域內或跨越全長序列上的序列同一性(在氨基酸或核苷酸水平)。
可通過用本文推測的氨基酸序列首先篩選所選的cDNA或基因組文庫，然后如需要，用Sambrook等，見上所述的常規引物延伸法檢測前體和未反轉錄成cDNA的mRNA加工中間物獲得具有蛋白質編碼序列的核酸。
2.宿主細胞的選擇和轉化用為了EG-VEGF生產的本文所述的表達和克隆載體轉染或轉化宿主細胞，并在為了適合誘導啟動子、選擇轉化子、或擴增編碼所需序列的基因改變的常規營養培養基中培養。本領域技術人員不需要過度實驗就能選擇培養條件，例如培養基、溫度、pH等。一般使細胞培養物的生產率最大化的原理、方案和實踐技術可在Mammalian Cell Biotechnologya Practical Approach，M.Butler編(IRL Press，1991)和Sambrook，見上中發現。
對于本領域一般技術人員來說，真核細胞轉染和原核細胞轉化的方法是已知的，例如CaCl2、CaPO4、脂質體介導和電穿孔。由所用的宿主細胞而定，采用對這些細胞合適的標準技術進行轉化。使用氯化鈣的鈣處理，如Sambrook等，見上，或電穿孔通常用于原核細胞。用根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)感染用于轉化一些植物細胞，如Shaw等，Gene，23315(1983)和1989年6月29日公開的WO89/05589所述。對于沒有這些細胞壁的哺乳動物細胞，可使用Graham和van der Eb，Virology 52456-457(1978)的磷酸鈣沉淀法。哺乳動物細胞宿主系統轉染的一般方面在美國專利號4,399,216中已有描述。通常根據Van Solingen等，J.Bact.，130946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 763829(1979)的方法進行酵母的轉化。然而，可使用其它將DNA引入細胞的方法，例如核顯微注射、電穿孔、細菌原生質體與完整細胞融合，或聚陽離子，例如聚凝胺、聚鳥氨酸。對于轉化哺乳動物細胞的各種技術，見Keown等，Methods in Enzymology，185527-537(1990)和Mansour等，Nature，336348-352(1988)。
在本文的載體中克隆或表達DNA的合適宿主細胞包括原核細胞、酵母或高等真核細胞。合適的原核細胞包括但不限于真細菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如腸細菌如大腸桿菌。各種大腸桿菌菌株是公開可得的，例如大腸桿菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)；大腸桿菌W3110(ATCC27,325)和K5 772(ATCC 53,635)。其它合適的原核宿主細胞包括腸細菌，例如如埃希氏桿菌屬(Escheriachia)(如大腸桿菌)、腸桿菌屬、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌屬如粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、和志賀氏菌屬(Shigella)，以及芽胞桿菌屬如枯草桿菌和地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)(如1989年4月12日出版的DD 266,710中所公開的地衣芽胞桿菌41P)、假單胞菌屬如綠膿假單胞菌(P.aeruginosa)和鏈霉菌屬。這些例子僅僅是闡述性的，并不起限制作用。菌株W3110是一種特別優選的宿主或親本宿主，因為它是重組DNA生產發酵的常用宿主菌株。優選宿主細胞分泌最小量的蛋白酶。例如，菌株W3110可改變成影響編碼對宿主內源的蛋白質的基因中的基因突變，這些宿主的例子是大腸桿菌W3110菌株1A2，它具有完整的基因型tonA；大腸桿菌W3110菌株9E4，具有完整的基因型tonA ptr3；大腸桿菌W3110菌株27C7(ATCC 55,244)，具有完整的基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degPompT karl；大腸桿菌W3110菌株37D6，具有完整的基因型tonA ptr3phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG；大腸桿菌W3110菌株40B4，是具有非卡那霉素抗性degP缺失突變的菌株37D6；和1990年8月7日提交的美國專利號4,946,783中公開的具有突變周質蛋白酶的大腸桿菌菌株。另外，克隆的體外方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反應是合適的。
除了原核細胞，真核微生物，例如絲狀真菌或酵母也是適用于EG-VEGF編碼載體的克隆或表達宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是低級真核宿主微生物中常用的。其他包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，Nature，290140；EP 139，383，1985年5月2日出版)；克魯維酵母屬宿主(美國專利號4,943,529；Fleer等，Bio/Technology，9968-975(1991))，如乳酸克魯維酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt等，J.Bacteriol.，154(2)737-742)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、沃爾特氏克魯維酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906；Van den Berg等，Bio/Technology，8135(1990))、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)；耶羅威亞酵母屬(yarrowia)(EP 402,226)；巴士德畢赤氏酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.，28265-278)；假絲酵母屬；里西亞木霉；(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，765259-5263)；許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)，如西方許旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)(EP394,538，1990年10月31日出版)；和絲狀真菌如鏈孢霉屬(Neurospora)、青霉菌屬(penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)(WO91/00357，1991年1月10日出版)和曲霉屬(Aspergillus)宿主如構巢曲霉(A.nidulans)(Balance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112284-289；Tilburn等，Gene，26205-221；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，811470-1474)和黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes，EMBO J.4475-479)。嗜甲基酵母在本文中是合適的，包括但不限于能在甲醇上生長的酵母，選自漢遜酵母屬、假絲酵母屬、克勒克酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、球擬酵母屬和紅酵母屬。該類酵母中示范性的特定物種的一覽表可在C.Anthony，The Biochemistry of Methylotrophs，269(1982)中找到。
表達糖基化EG-VEGF的合適宿主細胞衍生自多細胞生物。無脊椎動物細胞的例子包括昆蟲細胞，例如果蠅S2和夜蛾Sf9以及植物細胞。有用的哺乳動物宿主細胞系的例子包括中國倉鼠卵巢(CHO)和COS細胞。更具體的例子包括被SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細胞系(293細胞或亞克隆的懸浮培養生長的293細胞，Graham等，J.Gen Virol.3659)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Pro.Nat.Acad.Sci.USA，774216)；小鼠Sertoli細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251)；人肺細胞(W138，ATCCCCL75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；和小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCCCCL51)。合適的宿主細胞的選擇被認為在本領域技術人員能力范圍內。
3.可復制的載體的選擇和用途編碼EG-VEGF的核酸(例如cDNA或基因組DNA)可插入可復制的載體用于克隆(擴增DNA)或用于表達。各種載體是公開可得的。載體可以是例如質粒、粘粒、病毒顆粒或噬菌體的形式。合適的核酸序列可用各種方法插入載體。一般用本領域已知的技術將DNA插入合適的限制性內切核酸酶位點。載體成分通常包括但不限于一個或多個信號序列、復制起始點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。含有一個或多個這些成分的合適的載體構建使用本領域技術人員已知的標準連接技術。
可重組但不直接，而是作為與異源多肽的融合多肽產生EG-VEGF，該異源多肽可以是信號序列或其它在成熟蛋白或多肽的N-末端具有特異性切割位點的多肽。一般信號序列可以是載體的一個組分，或可以是插入載體的編碼EG-VEGF的DNA的一部分。信號序列可以是原核信號序列，選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp或熱穩定的腸毒素II前導序列。對于酵母分泌，信號序列可以是例如酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列(包括釀酒酵母和克魯維酵母-因子前導序列，后者在美國專利號5,010,182中有所描述)、或酸性磷酸酶前導序列、白假絲酵母(C.albicans)葡糖淀粉酶前導序列(EP 362,179，1990年4月4日出版)、或WO90/13646，1990年11月15日出版所述的信號。在哺乳動物細胞表達中，哺乳動物信號序列可用于直接分泌蛋白質，例如來自相同或相關物種的分泌多肽的信號序列，以及病毒的分泌性前導序列。
表達和克隆載體都含有能使載體在一個或多個所選的宿主細胞中復制的核酸序列。對于許多細菌、酵母和病毒這些序列是熟知的。質粒pBR322的復制起始點適合大多數革蘭氏陰性細菌，2質粒起始點適合酵母，各種病毒起始點(SV40、多瘤、腺病毒、VSV或BPV)用于在哺乳動物細胞中克隆載體。
表達和克隆載體通常含有選擇基因，也稱為可選擇的標記。通常選擇基因編碼的蛋白質(a)賦予對抗生素或其它毒素，例如氨芐青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四環素的抗性，(b)補體營養缺陷的缺失，或(c)提供復合培養基不能提供的關鍵營養，例如桿菌屬的編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。
哺乳動物細胞合適的可選擇標記的例子是那些能鑒定有能力攝取編碼EG-VEGF的核酸的細胞的標記，例如DHFR或胸腺嘧啶激酶。當使用野生型DHFR時，合適的宿主細胞是DHFR活性缺陷的CHO細胞系，如Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980)所述制備和增殖。用于酵母的合適的選擇基因是存在于酵母質粒YRp7中的trpl基因[Stinghcomb等，Nature，28239(1979)；Kingsman等，Gene，7141(1979)；Tschemper等，Gene，10157(1980)]。trpl基因提供了不能在色氨酸中生長的酵母突變株，例如ATCC No.44076或PEP4-1[Johns，Genetics，85-12(1977)]的選擇標記。
表達和克隆載體通常含有與EG-VEGF編碼的核酸序列可操作性連接的啟動子，以指導mRNA合成。被許多可能的宿主細胞識別的啟動子是熟知的。適用于原核宿主的啟動子包括內酰胺酶和乳糖啟動子系統[Chang等，Nature，275615(1978)；Goeddel等，Nature，281544(1979)]、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統[Goeddel，Nucleic Acids Res，84057(1980)；EP 36,776]和雜交啟動子，例如tac啟動子[deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25(1983)]。用于細菌系統的啟動子還可以含有與編碼EG-VEGF的DNA可操作性連接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
與酵母宿主一起使用的合適的啟動序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶[Hitzeman等，J.Biol.Chem.2552073(1980)]或其它糖酵解酶[Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.，7149(1968)；Holland，Biochemistry，174900(1978)]，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構酶、磷酸葡萄糖異構酶和葡糖激酶的啟動子、其它酵母啟動子是對于生長條件控制的轉錄具有其它優點的可誘導啟動子，它們是醇脫氫酶2、同細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關的降解性酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區。在EP 73,657中進一步描述了用于酵母表達的合適載體和啟動子。
在哺乳動物宿主細胞中從載體轉錄EG-VEGF受到例如，從病毒，例如多瘤病毒、禽痘病毒(UK 2,211,504，1989年7月5日出版)、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙肝病毒和猿病毒40(SV40)的基因組，從異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子，或從熱休克啟動子獲得的啟動子的控制，條件是這些啟動子能與宿主細胞系統相容。
可通過在載體中插入增強子序列提高高等真核細胞對編碼EG-VEGF的DNA的轉錄。增強子是DNA的順式激活元件，通常是約10-300bp，它作用于啟動子以提高其轉錄。現在來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白甲胎蛋白和胰島素)的許多啟動子是已知的。然而一般會使用真核細胞病毒的增強子。例子包括在復制起始點的晚期一側(bp100-270)上的SV40增強子、巨細胞早的啟動子增強子、復制起始點的晚期一側上的多瘤增強子和腺病毒增強子。增強子可剪接入載體EG-VEGF編碼序列的5′或3′位置，但優選位于啟動子的5′部位。
用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物的有核細胞)的表達載體也可含有終止轉錄和穩定mRNA所需的序列。這些序列通常來自真核或病毒DNA或cDNA的5′，偶爾3′非翻譯區。這些區域含有在編碼EG-VEGF的mRNA的未翻譯部分中轉錄為聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。
Gething等，Nature，293620-625(1981)；Mantei等，Nature，28140-46(1979)；EP 117,060；和EP 117,058中描述了適合改變成在重組脊椎動物細胞培養物中合成EG-VEGF的其它方法、載體和宿主細胞。
4.檢測基因擴增/表達可在樣品中直接，例如通過常規Southern印跡、Northern印跡定量mRNA的轉錄[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205(1980)]，斑點印跡(DNA分析)或原位雜交，使用合適的標記探針，基于本文提供的序列來測定基因擴增和/或表達。另外，可使用能識別特定雙鏈體，包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNA-RNA雜交雙鏈體或DNA-蛋白雙鏈體的抗體。抗體反過來可以被標記，并可進行試驗，其中雙鏈體與表面結合，從而在表面上形成雙鏈體質，可檢測與雙鏈體結合的抗體的存在。
另外，可用免疫學方法，例如免疫組織化學染色細胞或組織切片，和細胞培養物或體液的試驗，來直接定量基因產物的表達，從而測定基因表達。用于免疫組織化學染色和/或樣品液試驗的抗體可以是單克隆或多克隆的抗體，可在任何哺乳動物中制備。方便的，可針對天然序列EG-VEGF多肽，或針對基于本文提供的DNA序列的合成肽，或針對與EG-VEGF DNA融合并編碼特定的抗體表位的外源序列制備抗體。
5.多肽的純化可從培養基或從宿主細胞裂解物中回收EG-VEGF形式。如果是膜結合的，可用合適的去污劑溶液(例如Triton-X 100)或通過酶切割從膜釋放。可通過各種物理或化學方法，例如凍融循環、超聲、機械破裂或細胞裂解劑破裂用于表達EG-VEGF的細胞。
可能需要從重組細胞蛋白或多肽純化EG-VEGF。下列方法是合適的純化方法的例子通過在離子交換柱上分級分離；乙醇沉淀；反相HPLC；在二氧化硅或陽離子交換樹脂，例如DEAE上層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝膠過濾；蛋白A Sepharose柱，用于除去IgG等污染物；和金屬螯合柱，以結合EG-VEGF的表位標記形式。可使用蛋白質純化的各種方法，這些方法在本領域是已知的，在例如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein PurificationPrinciples and Practice，Springer-Verlag，New York(1982)。所選的純化步驟根據例如所用的生產方法的性質和產生的具體EG-VEGF而定。
E.EG-VEGF的用途編碼EG-VEGF的核苷酸序列(或其互補序列)在分子生物學領域中具有許多用途，包括在染色體和基因作圖和產生反義RNA和DNA中用作雜交探針。EG-VEGF核酸還可用于通過本文所述的重組技術制備EG-VEGF多肽。
全長天然序列EG-VEGF基因(SEQ ID NO1)或其部分可用作cDNA文庫的雜交探針，分離全長EG-VEGF cDNA或分離其它與圖1(SEQ ID NO1)中所述的EG-VEGF序列具有所需的序列同一性的cDNA(例如，那些編碼天然存在的EG-VEGF或其它物種的EG-VEGF的變體的cDNA)。可任選的，探針長度約20-50個堿基。雜交探針可衍生自SEQ ID NO1的核苷酸序列的至少部分新區域，其中那些區域可以不經過度實驗，或從包括天然序列EG-VEGF的啟動子、增強子元件和內含子的基因組序列確定。例如，篩選方法可包括用已知的DNA序列分離EG-VEGF基因的編碼區，合成約40個堿基的所選的探針。雜交探針可以用各種標記的標記，包括放射性核的酸例如32P或35S，或酶標記，例如與探針通過親和素/生物素偶聯系統偶聯的堿性磷酸酶。具有與本發明的EG-VEGF基因互補的序列的標記的探針可用于篩選人DNA、基因組DNA或mRNA，以確定探針與這些文庫中的哪個成員雜交。在下文實施例中更詳細的描述了雜交技術。
本申請中公開的任何EST序列可類似地用作探針，使用本發明公開的方法。
其它有用的EG-VEGF核酸的片段包括反義或有義寡核苷酸，包括單鏈核酸序列(RNA或DNA)，能與靶EG-VEGF mRNA(有義)或EG-VEGF DNA(反義)序列結合。根據本發明，反義或有義寡核苷酸包括EG-VEGF DNA的編碼區片段。該片段通常含有至少約14個核苷酸，優選約14-30個核苷酸。在例如Stein和Cohen(Cancer Res.482659，1988)和van der Krol等(Bio/Technologies 6958，1988)中描述了基于編碼給定蛋白質的cDNA序列衍生反義或有義寡核苷酸的能力。
反義或有義寡核苷酸與靶核酸序列結合導致形成雙鏈體，該雙鏈體通過一種或多種途徑，包括增強雙鏈體的降解、轉錄或翻譯的提前終止，或通過其它途徑阻斷靶序列的轉錄或翻譯。因此反義寡核苷酸可用于阻斷EG-VEGF蛋白的表達。反義或有義寡核苷酸進一步包括具有修飾的糖-磷酸二酯骨架(或其它糖鍵，例如WO91/06629中所述的)的寡核苷酸，其中這些糖鍵對于內源核酸酶是有抗性的。這些具有抗性糖鍵的寡核苷酸在體內是穩定的(即能抵抗酶降解)，但保留能與靶核苷酸序列結合的序列專一性。
其它有義或反義寡核苷酸的例子包括與有機部分(例如WO90/10048所述的)共價連接的寡核苷酸，和其它提高對靶核酸序列的寡核苷酸的親和力的部分，例如聚-(L-賴氨酸)。另外，嵌合劑，例如橢圓玫瑰樹堿，和烷基化試劑或金屬復合物可以與有義或反義寡核苷酸結合，以改變反義或有義寡核苷酸對靶核苷酸序列的結合特異性。
反義或有義寡核苷酸可通過任何基因轉移方法，包括例如CaPO4-介導的DNA轉染、電穿孔，或通過使用例如EB病毒等基因轉移載體引入含有靶核酸序列的細胞。在優選方法中，反義或有義寡核苷酸被插入合適的逆轉錄病毒載體。含有靶核酸序列的細胞與重組逆轉錄病毒載體在體內或體外接觸。合適的逆轉錄病毒載體包括但不限于衍生自鼠逆轉錄病毒M-MuLV，N2(衍生自M-MuLV的逆轉錄病毒)或雙拷貝載體，稱為DCTSA、DCT5B和DCT5C(見WO90/13641)。
有義或反義寡核苷酸還可以通過與配體結合分子形成綴合物(如WO91/04753所述)引入含有靶核苷酸序列的細胞。合適的配體結合分子包括但不限于細胞表面受體、生長因子、其它細胞因子、或其它與細胞表面受體結合的配體。優選的配體結合分子的綴合基本不影響配體結合分子與其對應的分子或受體結合的能力，或阻斷有義或反義寡核苷酸或其綴合形式進入細胞。
另外，有義或反義寡核苷酸可通過形成寡核苷酸-脂質復合物(如WO90/10448所述)引入含有靶核酸序列的細胞。有義和反義寡核苷酸-脂質復合物優選在細胞內通過內源脂肪酶解離。
還可在PCR技術中使用探針，以產生序列庫用于鑒定密切相關的EG-VEGF編碼序列。
還可用編碼EG-VEGF的核苷酸序列構建雜交探針，用于編碼EG-VEGF的基因作圖，和具有遺傳疾病的個體的基因分析。本文提供的核苷酸序列可對染色體和染色體的特定區域，使用已知技術，例如原位雜交、針對已知染色體標記的連鎖分析，和與文庫雜交篩選作圖。
本發明還提供了在試驗中使用EG-VEGF的方法，以鑒定可與EG-VEGF蛋白結合的其它蛋白質或分子。通過這些方法，可鑒定受體/配體結合相互作用的抑制劑。參與這些結合相互作用的蛋白還可用于篩選肽或結合相互作用的小分子抑制劑或激動劑。另外，受體EG-VEGF可用于分離相關的配體。可設計篩選試驗以尋找模擬天然EG-VEGF或EG-VEGF受體的前導化合物。這些篩選試驗可包括適合高通量篩選化學文庫的試驗，尤其特別適用于鑒定小分子藥物候選物。考慮的小分子包括合成的有機或無機化合物。可以各種形式，例如蛋白-蛋白結合試驗、生物化學篩選試驗、免疫試驗和基于細胞的試驗進行試驗，它們在本領域中有明確描述。
編碼EG-VEGF或其修改的形式的核酸還可用于產生轉基因動物或“基因剔除”動物，這些動物可用于開發和篩選治療上有用的試劑。轉基因動物(例如小鼠或大鼠)是一種具有含轉基因的細胞的動物，這些轉基因在出生前，例如胚胎階段被引入動物或動物的祖先。轉基因是一種整合入細胞基因組的DNA，從該細胞產生轉基因動物。在一個實施例中，可用編碼EG-VEGF的cDNA根據建立的技術和用于產生含表達編碼EG-VEGF的DNA的細胞的轉基因動物的基因組序列，克隆編碼EG-VEGF的基因組DNA。產生轉基因動物，特別是小鼠或大鼠動物的方法是本領域常規的，在美國專利號4,736,866和4,870,009中有所描述。可用在胚胎階段有編碼EG-VEGF的轉基因拷貝引入動物的生殖系的轉基因動物檢測提高編碼EG-VEGF表達的作用。可用這些動物作為測交動物來檢測認為賦予對例如與其超表達有關的病理情況有保護的試劑。根據本發明的該方面，用試劑處理動物，與攜帶該轉基因的未處理的動物相比，病理情況發病率降低，表明對病理情況的可能治療干預。
另外，可用EG-VEGF的非人同源物構建EG-VEGF“基因剔除”動物，由于編碼EG-VEGF的內源基因和引入動物的胚胎干細胞中的編碼EG-VEGF的改變的基因組DNA之間同源重組，它具有缺陷或改變的編碼EG-VEGF的基因。例如，編碼EG-VEGF的cDNA可用于根據建立的技術克隆編碼EG-VEGF的基因組DNA。一部分編碼EG-VEGF的基因組DNA可缺失或用另一種基因取代，例如編碼可用于檢測整合的可選擇標記的基因。通常，在載體中包括幾種千堿基的未改變的旁側DNA(均在5′和3′端)[見例如Thomas和Capecchi，Cell，51503(1987)對于同源重組載體的描述]。載體被引入胚胎肝細胞系(例如通過電穿孔)，選擇其中引入的DNA與內源DNA同源重組的細胞[見例如Li等，Cell，69915(1992)]。所選的細胞然后被注射入動物(例如小鼠或大鼠)的胚泡，形成聚集嵌合體(見例如Bradley，于Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA Practical Approach，E.J.Robertson，編(IRL，Oxford，1978)，pp.113-152)。然后嵌合胚胎可植入合適的假懷孕雌性代孕動物，胚胎產生“基因剔除”動物。可用標準技術鑒定在其生殖細胞中攜帶同源重組DNA的子代，并用于繁殖動物，在這些動物的所有細胞中含有同源重組DNA。基因剔敲除動物可以通過例如，其抵抗一些病理情況和由于不存在EG-VEGF多肽發生病理情況的能力來確定特征。
還可在基因治療中使用編碼EG-VEGF多肽的核酸。在基因治療應用中，基因被引入細胞，以實現體內合成治療有效的基因產物，例如用于替換缺陷基因。“基因治療”包括常規基因治療方法，其中通過一次治療獲得持續的作用，和施用基因治療劑，包括一次或重復施用治療有效的DNA或mRNA。反義RNA和DNA可用作治療劑，用于阻斷體內一些基因的表達。還已經顯示可在細胞中引入短的反義寡核苷酸，它們起抑制劑的作用，盡管細胞膜有限的吸收導致其它們的低胞內濃度(Zamecnik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834143-4146)。可修飾寡核苷酸以增強其攝取，例如通過用不帶電的基團取代其帶負電的磷酸二酯。
有許多技術能將核酸引入活細胞。根據在預期的宿主的細胞中，核酸是否轉移入體外或體內培養的細胞來改變技術。適合將核酸轉移入體外哺乳動物細胞的技術包括使用脂質體、電穿孔、顯微注射、細胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸鈣沉淀法等。目前優選的體內基因轉移技術包括用病毒(通常是逆轉錄病毒)載體轉染和病毒外被蛋白-脂質體介導的轉染(Dzau等，Trends in Biotechnology 11，205-210)。在一些情況下，需要提供核酸來源和針對靶細胞的試劑，例如對細胞表面膜蛋白或靶細胞特異性的抗體，靶細胞上受體的配體等。當使用脂質體時，與胞吞作用有關的結合細胞表面膜蛋白的蛋白可用于靶向和/或促進攝取，例如，對于特定細胞類型嗜性的衣殼蛋白或其片段，對于在周期中經過內化作用的蛋白質的抗體，靶向胞內定位和增強胞內半衰期的蛋白質。Wu等，J.Biol.Chem.262，4429-4432(1987)；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3410-3414(1990)等描述了受體介導的胞吞作用的技術。對于基因標記和基因治療方案的綜述見Anderson等，Science，256，808-813(1992)。
本文所述的EG-VEGF多肽可用作蛋白質電泳的分子量標記。
編碼本文所述的EG-VEGF多肽或其片段的核酸分子用于染色體鑒定。在這方面，對于鑒定新染色體標記存在持續的需要，因為目前得到的基于實際序列數據的染色體標記試劑很少。本發明的各EG-VEGF核酸分子可用作染色體標記。
本發明的EG-VEGF多肽和核酸分子還可用于組織定型，其中本發明的EG-VEGF多肽可在一種組織中有區別地表達。EG-VEGF核酸分子可用于產生PCR、Northern分析、Southern分析和Western分析的探針。
本文所述的EG-VEGF多肽和其調節劑還可用作治療劑。本發明的EG-VEGF多肽和EG-VEGF調節劑可根據已知方法配制，用于制備藥學上有用的組合物，其中EG-VEGF產物與藥學上可接受的載體混合。通過將具有所需純度的活性成分與可任選的生理學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑(Remington′s PharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.編(1980))以凍干制劑或水溶液的形式混合，制備治療制劑。可接受的載體、賦形劑或穩定劑的使用劑量和濃度對接受者是無毒的，包括例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸的緩沖液；包括維生素C的抗氧化劑；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖或其它糖類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽的反荷離子，例如鈉；和/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM、PluronicsTM或PEG。
用于體內給藥的制劑必須是無菌的。這通過在凍干和重建之前或之后濾過無菌濾膜不難實現。
本文中的治療組合物通常置于具有無菌進口的容器中，例如一個有塞子的靜脈輸液袋或小瓶，該塞子可用皮下注射針頭穿透。
給藥途徑根據已知方法，例如通過靜脈內、腹腔內、腦內、肌肉內、眼內、動脈內或病灶內的途徑、局部給藥或通過緩釋系統。
本發明藥物組合物的劑量和所需藥物濃度可根據體現的特別用途改變。確定合適的劑量或給藥途徑在普通醫生的能力范圍內。動物實驗提供了確定人治療有效劑量的可靠指導。有效劑量的種間定標可用Mordenti，J.和Chappell，W.“種間定標在毒物動力學中的用途”于Toxicokinetics and New Drug Development，Yacobi編，Pergamon Press，New York 1989，pp.42-96制定的原理進行。
當體內施用EG-VEGF多肽或使用其激動劑或拮抗劑時，正常劑量可從約10ng/kg最多到100mg/kg哺乳動物體重或更大/天，優選約1g/kg/天-10mg/kg/天，視給藥途徑而定。在文獻中提供了傳遞的特定劑量和方法的指南；見例如美國專利號4,657,760；5,206,344；或5,225,212。可以預料不同配方對于不同治療化合物和不同疾病是有效的，例如針對一種器官或組織的給藥可能需要不同的方式。
在適合需要施用EG-VEGF多肽治療任何疾病或病況的、具有緩釋特征的制劑中，需要EG-VEGF多肽或調節劑的緩釋給藥，可考慮EG-VEGF多肽的微膠囊化。用人生長激素(rhGH)、干擾素(rhIFN-)、白細胞介素-2和MN rgp120已成功地進行緩釋重組蛋白的微膠囊化。Johnson等，Nat.Med.2795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，271221-1223(1993)；Hora等，Bio/Technology，8755-758(1990)；Cleland，“使用聚交酯聚乙交酯微球體系統設計和生產單免疫疫苗”，于Vaccine DesignThe Subunit and Adjuvant Approach，Powell and Newman編(Plenum PressNew York，1995)，pp.439-462；WO97/03692，WO96/40072，WO96/07399；和美國專利號5,654,010。
用聚-乳酸-共乙醇酸(PLGA)聚合物開發這些蛋白質的緩釋制劑，因為其生物相容性且具有廣范圍的生物可降解特性。PLGA的降解產物乳酸和乙醇酸在人體內可迅速地清除。另外，可根據其分子量和組合物從幾個月到幾年的范圍內調節該聚合物的可降解性。Lewis，“從交酯/乙交酯聚合物控釋生物活性劑”，于M.Chasinand R.Langer(編)，Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(MarcelDekkerNew York，1990)，pp.1-41。
可在許多治療中使用本文提供的治療劑。治療包括治療患有與產激素組織或內分泌腺有關的病況的個體。在一個方面，對需要治療的個體施用治療病況的有效量的EG-VEGF或EG-VEGF激動劑。可以多肽或核酸形式施用EG-VEGF。優選，病況是需要增加產生特定激素的細胞數量的病況。該病況的例子包括糖尿病。其它病況包括那些需要增加生殖器官，例如卵巢、睪丸、子宮、前列腺和胎盤中細胞數量的病況。
優選，對患有與產激素組織或內分泌腺有關的病況的個體施用EG-VEGF拮抗劑。當施用EG-VEGF拮抗劑時，優選病況是需要減少產生特定激素的數量或減少細胞增殖的病況。例如，本文提供了一種調節個體生育的方法，包括對個體施用調節生育的有效量的EG-VEGF拮抗劑。在一個實施例中，通過抑制卵泡成熟和/或排卵調節生育。另外，當個體具有或有危險患多囊性卵巢綜合征時，對個體施用EG-VEGF拮抗劑，使個體維持生育力，防止由于不治療該綜合征通常導致的不育。如果該病況是先天性的，在家族中常見，或具有病況的早期癥狀，個體有患該病況的危險。還可施用EG-VEGF拮抗劑，以治療囊腫和其它與產激素組織中過度增殖、炎癥和過度血管生成有關的病況。
可用本發明的組合物和方法克服的類固醇激素依賴性疾病還包括先天性類脂的腎上腺增生、不育、性成熟、雄激素依賴性腫瘤、性早熟、McCune-Albright綜合征、先天性腎上腺發育不全、或低促性腺素性功能減退。
可用本文提供的藥物和組合物治療的特定病況是癌癥，特別是類固醇-，例如雄激素依賴性癌。如本文提供的治療癌癥的優選方法包括對患有或有危險患癌癥的個體以治療癌癥的有效量施用EG-VEGF拮抗劑。在一個實施例中，癌癥是選自卵巢、睪丸、前列腺和子宮的組織。
應理解可在體內或體外進行細胞增殖、細胞增殖抑制、趨化性的方法，和抑制趨化性的方法。在一些情況下，最理想的是在體外在細胞樣品中加入EG-VEGF，從而刺激特定細胞類型的增殖。然后可在篩選試驗中使用EG-VEGF處理的樣品，或移植到需要治療的個體或動物模型中。
本發明還包括篩選化合物，鑒定模擬或增強EG-VEGF多肽(激動劑)或防止EG-VEGF多肽(拮抗劑)的作用的化合物的方法。EG-VEGF激動劑和拮抗劑在本文中還稱為EG-VEGF調節劑。設計了拮抗劑候選藥物的篩選試驗以鑒定與基因編碼的EG-VEGF多肽結合或復合，或影響編碼的多肽與其它細胞蛋白相互作用的化合物。本文提供的篩選實驗包括適合高通量篩選化合物文庫，使其特別適用于鑒定小分子候選藥物的試驗。通常，提供了結合試驗和活性試驗。
可用各種形式進行試驗，包括蛋白-蛋白結合試驗、生物化學篩選試驗、免疫試驗和基于細胞的試驗，它們是本領域中特征明確的。
所有拮抗劑試驗的相同之處在于它們都需要將候選藥物與本文鑒定的核酸編碼的EG-VEGF多肽接觸一段足夠的時間，使這兩種成分相互作用。
在結合試驗中，相互作用是結合，形成的復合物可分離或在反應混合物中被檢測。在一個具體實施例中，本文鑒定的基因編碼的EG-VEGF多肽或候選藥物通過共價或非共價結合固定在固相，例如在微量滴定板上。非共價結合通常是通過用EG-VEGF多肽的溶液包涂固體表面并干燥實現的。另外，可用對于要固定化的EG-VEGF多肽特異性的固定化抗體，例如單克隆抗體將其錨定在固相表面上。通過在固定化成分，例如含有錨定的成分的包涂的表面添加非固定化成分，它可能被可檢測的標記物標記。當反應完成時，通過例如洗滌除去非反應成分，檢測錨定在固相表面的復合物。當最初非固定化成分攜帶可檢測標記時，檢測固定在表面上的標記表明發生復合。當最初非固定化成分不攜帶標記時，可通過使用與固定化復合物特異性結合的標記的抗體檢測復合。
如果候選化合物與本文所鑒定的基因編碼的特定EG-VEGF相互作用，但不結合，可通過對于檢測蛋白-蛋白相互作用熟知的方法檢測其與多肽的相互作用。這些試驗包括傳統方法，例如交聯、共免疫沉淀、和通過梯度或層析柱共純化。另外，可用Fields和同事(Fields和Song，Nature(London)，340245-246(1989)；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，889578-9582(1991))所述的，如Chevray和Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895789-5793(1991)所述的基于酵母的遺傳系統監測蛋白-蛋白相互作用。許多轉錄激活物，例如酵母GAL4由兩個物理上不同的組件區域構成，一個作為DNA-結合域，另一個作為轉錄-激活域。在上述出版物中描述的酵母表達系統(一般指”二雜交系統“)利用此特性，并使用二個雜交蛋白，在一個中靶蛋白與GAL4的DNA-結合域融合，在另一個中候選激活蛋白與激活域融合。GAL1-lacZ報道基因在GAL4-激活的啟動子控制下的表達依賴于通過蛋白-蛋白相互作用重建GAL4活性。用半乳糖苷酶的顯色底物檢測含有相互作用的多肽的集落。從Clontech購得使用二雜交技術鑒定兩種特定蛋白質的蛋白-蛋白相互作用的完整試劑盒(MATCHMAKERTM)。該系統還可以延伸到繪制與特定蛋白質相互作用有關的蛋白域，和對于這些相互作用關鍵的極精確的氨基酸殘基。
可如下檢測影響編碼本文所述的EG-VEGF多肽的基因與其它胞內或胞外成分的化合物在允許兩種產物相互作用和結合的條件和時間下，通常制備一種反應混合物，它含有基因產物和胞內或胞外成分。為了檢測候選化合物抑制結合的能力，該反應在測試化合物存在或不存在的情況下進行。另外，可在第三種反應混合物中加入安慰劑，作為陽性對照。如上所述監測測試化合物和胞內或胞外成分之間的結合(復合物形成)。在對照反應而不是在含有測試化合物的反應混合物中復合物的形成表明測試化合物影響測試化合物及其反應配偶體的相互作用。
為了測試激動劑和拮抗劑，可在細胞中加入EG-VEGF多肽和要篩選的化合物。觀察到已知由EG-VEGF調節的特定活性，和化合物在EG-VEGF多肽存在下增強或抑制該活性的能力，表明化合物分別是EG-VEGF多肽的激動劑或拮抗劑。另外，可通過將EG-VEGF多肽與候選化合物以及膜結合的EG-VEGF多肽受體或重組受體在競爭性抑制試驗的合適條件下混合，檢測激動劑或拮抗劑。可用放射性標記EG-VEGF多肽，這樣與受體結合的EG-VEGF多肽分子的數量可用于測定可能的激動劑或拮抗劑的效力。
可用本領域技術人員已知的許多方法鑒定編碼EG-VEGF受體的基因，例如配體淘選和FACS分揀。Coligan等，Current Protocols in Immun.，1(2)第5章(1991)。優選使用表達克隆，其中從響應EG-VEGF多肽的細胞制備聚腺苷酸化RNA，將從該RNA產生的cDNA文庫分成庫，用于轉染COS細胞或其它不響應EG-VEGF多肽的細胞。在載玻片上生長的轉染的細胞與標記的EG-VEGF多肽接觸。可用各種方法，包括碘化或包含位點專一的蛋白質激酶的識別位點，標記EG-VEGF多肽。在固定和培育后，對載玻片進行放射性白顯影分析。鑒定陽性庫并制備亞庫，用相互作用的再合并和重新篩選法，最終得到編碼推定受體的單個克隆。
作為另一種鑒定受體的方法，可將標記的EG-VEGF多肽與細胞膜或表達受體分子的抽提制備物光親和連接。用PAGE分解交聯材料，并在X光膠片上曝光。可切下含有受體的標記復合物，分解成肽片段，并進行蛋白質微測序。從微測序獲得的氨基酸序列可用于設計一套簡并寡核苷酸探針，以篩選DNA文庫來鑒定編碼推定受體的基因。
在拮抗劑的另一個試驗中，可在候選化合物的存在下培育表達受體的哺乳動物細胞或膜制備物以及標記的EG-VEGF多肽。然后可測定化合物增強或阻斷相互作用的能力。
可能的拮抗劑的更具體的例子包括與免疫球蛋白和EG-VEGF多肽的融合物結合的寡核苷酸，更具體的，抗體包括但不限于多和單克隆抗體和抗體片段、單鏈抗體、抗-獨特型抗體、和這些抗體的嵌合或人源化的形式或片段，以及人抗體和抗體片段。另外，可能的拮抗劑可以是緊密相關的蛋白質，例如識別受體但無作用的EG-VEGF多肽的突變形式，從而競爭性抑制EG-VEGF多肽的作用。
另一種可能的EG-VEGF多肽拮抗劑是用反義技術制備的反義RNA或DNA構建物，其中例如反義RNA或DNA分子通過與靶mRNA雜交并阻止蛋白質翻譯起到直接阻斷mRNA翻譯的作用。可用反義技術控制通過三股螺旋形成或反義DNA或RNA的基因表達，這兩種方法都基于多核苷酸與DNA或RNA的結合。例如，多核苷酸序列的5′編碼部分(在本文中編碼成熟EG-VEGF多肽)用于設計長約10-40個堿基對的反義RNA寡核苷酸。設計DNA寡核苷酸與轉錄有關的基因區域互補(三股螺旋-見例如Nucl.Acids.Res.，63073(1979)；Cooney等，Science，241456(1988)；Dervan等，Science，2511360(1991))，從而防止轉錄和產生EG-VEGF多肽。反義RNA寡核苷酸與mRNA在體內雜交，阻斷mRNA分子翻譯成EG-VEGF多肽(反義-Okano，Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as AntisenseInhibitors of Gene Expression(CRC PressBoca Raton，FL，1988))。上述寡核苷酸也可被傳遞到細胞，使體內可表達反義RNA或DNA，以抑制EG-VEGF多肽的產生。當使用反義DNA時，優選衍生自翻譯起始位點的寡脫氧核糖核苷酸，例如靶基因核苷酸序列的約-10到+10位置。
可能的拮抗劑包括EG-VEGF多肽與活性位點結合的小分子、受體結合位點或生長因子或其它相關結合位點，從而阻斷EG-VEGF多肽的正常生物活性。小分子的例子包括但不限于小肽或肽樣分子，優選可溶性肽，和合成的非肽基有機或無機化合物。
在另一個實施例中，當活性受到正反饋調節時，激動劑的超表達可作為拮抗劑。
核酶是能催化RNA特定切割的酶性RNA分子。核酶通過與互補的靶RNA序列特異性雜交，然后內切核酸酶解切割起作用。可用已知的技術鑒定在可能的RNA靶內的特定核酶切割位點。進一步的詳述見例如Rossi，Current Biology，4469-471(1994)，和PCT出版號WO97/33551(1997年9月18日出版)。
用于抑制轉錄的三股螺旋形成中的核酸分子應該是單鏈，由脫氧核苷酸組成。設計的這些寡核苷酸的堿基組成使它通過Hoogsteen堿基配對原則促進三股螺旋形成，一般在螺旋的一條鏈上需要嘌呤或嘧啶的大小相當的一段序列。進一步的細節見例如PCT出版號WO97/33551，見上。
可通過本文所述的一種或多種篩選試驗和/或通過本領域技術人員熟知的任何其它篩選技術鑒定這些小分子。
應理解本文提供的所有試驗可用于篩選各種候選生物活性劑。術語“候選生物活性劑”、“候選試劑”或“候選藥物”或本文所用的語法上的對應詞描述了要測試能直接或間接改變細胞活性表型或EG-VEGF序列，包括核酸序列或蛋白質序列表達的生物活性劑的任何分子，例如蛋白質、寡肽、小有機分子、多糖、多核苷酸、嘌呤類似物等。
候選試劑可包括許多化合物種類，雖然通常它們是有機分子，優選分子量大于100小于2,500道爾頓的小有機化合物。本文進一步將小分子限定為具有50kD-2000kD之間的分子量。在另一個實施例中，小分子具有小于1500，或小于1200，或小于1000，或小于750，或小于500kD的分子量。在一個實施例中，本文所用的小分子具有約100-200kD的分子量。候選試劑包括與蛋白質結構相互作用，特別是氫鍵必需的官能團，通常包括至少胺、羰基、羥基或羧基，優選至少兩種功能性化學基團。候選試劑通常含有被一個或多個上述官能團取代的環狀碳和雜環結構和/或芳族或多芳族結構。還在生物分子，包括肽、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、吡啶、衍生物、結構類似物或其組合之中發現了候選試劑。特別優選的是肽。
從各種來源，包括合成或天然化合物的文庫獲得了候選試劑。例如，有許多方法可用于隨機和定向合成各種有機化合物和生物分子，包括表達隨機的寡核苷酸。另外，可得到或不難產生細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫。另外，通過常規化學、物理和生物化學方法容易改變天然或合成產生的文庫和化合物。已知的藥劑可進行定向或隨機化學修飾，例如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化以產生結構類似物。
在優選例中，候選生物活性劑是蛋白質。本文中的“蛋白質”意指至少兩個共價結合的氨基酸，包括蛋白質、多肽、寡肽和肽。蛋白質可由天然存在的氨基酸和肽鍵，或合成的擬肽結構構成。因此本文所用的“氨基酸”或“肽殘基”意指天然存在和合成的氨基酸。例如，同苯丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被認為是用于本發明目的的氨基酸。“氨基酸”還包括亞氨基酸殘基如脯氨酸和羥脯氨酸。側鏈可以是(R)或(S)構象。在優選例中，氨基酸是(S)或L-構象。如果用非天然存在的側鏈，可用非氨基酸取代基，例如防止或推遲體內降解。
在優選例中，候選生物活性劑是天然存在的蛋白質或天然存在的蛋白質片段。因此例如，可使用含有蛋白質、或蛋白性細胞提取物的隨機或定向消化物的細胞提取物。用這種方法可制備原核和真核蛋白質文庫，用于本發明的篩選方法。該實施例中特別優選的是細菌、真菌、病毒和哺乳動物蛋白質文庫，后者是優選的，人蛋白質是特別優選的。
在一個優選例中，候選生物活性劑是約5-30個氨基酸，優選約5-20個氨基酸，特別優選約7-15個氨基酸的肽。肽可以是如上所述的天然存在的蛋白質的消化物，隨機肽或“偏差的”隨機肽。本文“隨機化”或語法上的對應詞意指各核酸和肽分別由隨機核苷酸和氨基酸構成。由于這些隨機肽(或核酸(如下所述))通常是化學合成的，它們可以在任何位置摻入任何核苷酸或氨基酸。可設計合成方法以產生隨機化蛋白質或核酸，以在整個序列長度上形成所有或大部分可能的組合，從而形成隨機化候選生物活性蛋白質制劑的文庫。
在一個實施例中，文庫是完全隨機的，在任何位置沒有序列偏愛或常量。在一個優選例中，文庫是偏向的。即序列內的一些位置保持不變，或選自有限數量的可能性。例如，在一個優選例中，在限定的類別內，例如疏水性氨基酸、親水性殘基、立體偏向(小或大)殘基、對核酸結合域建立、半胱氨酸形成、交聯、SH-3結構域的脯氨酸、磷酸化位點的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或組氨酸等、或嘌呤等隨機化核苷酸或氨基酸殘基。
在一個優選例中，候選生物活性劑是核酸。本文中的“核酸”或“寡核苷酸”或語法上的對應詞意指至少兩種核苷酸共價連接在一起。本發明的核酸通常含有磷酸二酯鍵，雖然在一些情況下，如下文所述，可以包括具有交替骨架的核酸類似物，包括磷酰胺(Beaucage等，Tetrahedron 49(10)1925(1993)和其中的參考文獻；Letsinger，J.Org.Chem.353800(1970)；Sprinzl等，Eur.J.Biocham.81579(1977)；Letsinger等，Nul.Acids Res.143487(1986)；Sawai等，Chem.Lett.805(1984)，Letsinger等，J.Am.Chem.Soc.1104470(1988)；和Pauwels等，Chemica Scripta 26141(1986))，硫代磷酸酯(Mag等，Nucleic AcidRes.191437(1991)；和美國專利號5,644,048)，二硫代磷酸酯(Briu等，J.Am.Chem.Soc.1112321(1989))，O-甲基氨基磷酸酯鍵合(見Eckstein，Oligonucleotides andAnaloguesA Practical Approach，Oxford University Press)，和肽核酸骨架和鍵合(見Egholm，J.Am.Chem.Soc.1141895(1992)；Meier等，Chem.Int.Ed.Engl.311008(1992)；Nielsen，Nature，365566(1993)；Carlsson等，Nature 380207(1996)，所有在此引入以供參考)。其它類似核酸包括具有正骨架(Denpcy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 926097(1995))；非離子骨架(美國專利號5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863；Kiedrowshi等，Angew.Chem.Intl.Ed.English30423(1991)；Letsinger等，J.Am.Chem.Soc.1104470(1988)；Letsinger等，Nucleoside & Nucleotide 131597(1994)；第二和三章，ASC Symposium Series 580，“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”，Ed.Y.S.Sanghui和P.DanCook；Mesmaeker等，Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.4395(1994)；Jeffs等，Biomolecular NMR 3417(1994)；Tetrahedron Lett.37743(1996))和非核糖骨架，包括美國專利號5,235,033和5,034,506，和第6和7章，ASC Symposium Series 580，“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”，Ed.Y.S.Sanghui和P.DanCook中描述的。含有一個或多個碳環化糖的核酸也包括在核酸的定義內(見Jenkins等，Chem.Soc.Rev.(1995)pp169-176)。在Rawls，C&E News June 2，1997，p.35中描述了幾種核酸類似物。所有這些文獻在此引入以供參考。可進行核糖-磷酸骨架的這些修飾便于添加其它的部分，例如標記，或增加這些分子在生理環境中的穩定性和半衰期。另外，可制備天然存在的模酸和類似物的混合物。另外，可制備不同核酸類似物的混合物和天然存在的核酸和類似物的混合物。核酸可以是單鏈或雙鏈，如所述的，或含有雙鏈或單鏈序列的部分。核酸可以是DNA，基因組和cDNA，RNA或雜交體，其中核酸含有任何脫氧核糖和核糖核苷酸的組合，和任何堿基的組合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶、異鳥嘌呤等。
如上對于蛋白質一般所述的，核酸候選生物活性劑可以是天然存在的核酸，隨機核酸或“偏向的”隨機核酸。例如，可如上對于蛋白質所述使用原核或真核基因組的消化物。
在優選例中，候選生物活性劑是各種文獻中可得到的有機化學部分。
在優選例中，如上所述，可對各個基因和基因產物(蛋白質)進行篩選。在優選例中，可如下在實施例中鑒定基因或蛋白質，作為與特定組織有關的差異表達的基因，和與這些組織相關的病況。因此，在一個實施例中，設計篩選用于首先尋找能與EG-VEGF結合的候選試劑，然后這些試劑可用于評估候選試劑調節EG-VEGF活性的能力的試驗。因此，如本領域技術人員應理解的，可進行許多不同試驗。
在一個實施例中，EG-VEGF優選固定在固相載體上，與多種候選生物活性劑接觸，選擇與EG-VEGF結合的候選活性劑用于進一步研究。如果標記了候選生物活性劑，可直接測定候選生物活性劑的結合。候選生物活性劑可優選用放射活性標記。另外，可以用熒光標記。如果候選生物活性劑未被標記，可基于測定的對結合的反應間接測定結合。另外，可基于候選生物活性化合物抑制已知的標記配體的結合的能力，評估與候選生物活性化合物的相互作用。
還可以進行調節EG-VEGF活性的試劑的篩選。在優選例中，篩選能調節EG-VEGF活性的生物活性劑的方法包括步驟在EG-VEGF樣品中加入候選生物活性劑，并確定EG-VEGF生物活性的改變。“調節EG-VEGF活性”包括活性增加、活性下降、或存在的活性類型或種類的變化。因此在該實施例中，候選試劑應與EG-VEGF(結合雖然這可能不是必需的)并改變其本文所述的生物或生物化學活性。方法包括體外篩選方法，如上面描述的，和體內篩選細胞用于改變EG-VEGF的存在、分布、活性或數量。
因此在該實施例中，方法包括合并樣品和候選生物活性劑，并評估對EG-VEGF活性的作用。通過“EG-VEGF蛋白活性”或本文中語法上的對應詞意指EG-VEGF蛋白的生物活性中的至少一種包括但不限于細胞增殖、趨化性/遷移活性、血管生成、細胞分化和細胞開窗。這些活性優選專門存在于產激素的組織和細胞中，更優選存在于產類固醇細胞中。優選特異性活性的細胞類型包括那些生殖系統如卵巢、睪丸、前列腺、子宮和胎盤的細胞。特別優選的細胞類型包括卵巢的基質和卵泡膜內層，以及睪丸的Leydig細胞。還優選胰臟和前列腺皮質的細胞。EG-VEGF活性的抑制劑抑制任何一種或多種EG-VEGF蛋白活性。
在一個優選例中，提高EG-VEGF蛋白的活性；在另一個優選例中，降低EG-VEGF蛋白的活性。因此，作為拮抗劑的生物活性劑在一些實施例中是優選的，作為激動劑的生物活性劑在其它實施例中是優選的。
在本發明的一個方面，含有EG-VEGF序列的細胞通過評估候選藥物對EG-VEGF的作用用于藥物篩選試驗。細胞類型包括正常細胞，和更優選具有異常增殖速度的細胞，包括腫瘤細胞，最優選人腫瘤細胞。
評估EG-VEGF活性的方法是本領域已知的，包括用培養或原代細胞的生長和存活率試驗。在這些試驗中，通常在一段時間內監測細胞群的生長和/或存活率，并比較在生物活性劑的不同濃度下或沒有生物活性劑下培育的樣品。可用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓(MTS)[美國專利號5,185,450]和Alamar Blue等試劑定量計算細胞數，這些試劑在代謝活性的細胞存在下轉變成顯色或熒光化合物。另外，可用結合細胞蛋白的染料(例如硫代羅丹明B(SRB)或結晶紫)定量細胞數量。另外，可用顆粒計數器，例如Beckham Coulter制造的Coulter CounterTM直接計數細胞，或用顯微鏡計數觀察血細胞計數器上的細胞。優選在臺盼藍溶液中觀察用血細胞計數器計數的細胞，以區別活的和死細胞。其它定量細胞數目的方法對于本領域技術人員是已知的。這些試驗可在任何細胞，包括那些壞死狀態下的細胞上進行。
一種蛋白質對特定細胞群具有趨化活性，如果它可以直接或間接的刺激細胞群的定向取向或運動。優選蛋白質能直接刺激細胞的定向運動。如下所述，EG-VEGF具有趨化性。EG-VEGF的趨化活性不難通過使用細胞趨化性的已知實驗(例如下文實施例中所述的遷移試驗)確定。
在一個優選例中，方法包括在含有EG-VEGF的細胞中加入如上所述的候選生物活性劑。優選細胞類型包括幾乎任何細胞。細胞含有編碼EG-VEGF蛋白的核酸(優選重組的)。在一個優選例中，在多種細胞上測試候選試劑的文庫。
在一個方面，在存在或不存在或先前或隨后接觸生理信號(例如激素、抗體、肽、抗原、細胞因子、生長因子、動作電位、藥劑，包括化療劑、輻射、致癌物、或其它細胞(即細胞-細胞接觸))下評估試驗。在另一個實施例中，在細胞周期過程的不同階段進行測定。
本文提供的EG-VEGF序列還可用于診斷方法。EG-VEGF的超表達可表明生殖器官中的囊腫或癌。另外，可分析來自病人樣品的突變或功能異常的EG-VEGF。通常，這些方法包括比較來自病人的樣品和與對照比較EG-VEGF表達。
F.抗EG-VEGF抗體本發明還提供了抗EG-VEGF抗體。示范性抗體包括多克隆、單克隆、人源化、雙特異性和異綴合抗體。
1.多克隆抗體抗-EG-VEGF抗體可含有多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法是技術人員已知的。可在哺乳動物中，例如通過一次或多次注射免疫劑和如需要，一種佐劑產生多克隆抗體。通常免疫劑和/或佐劑通過多次皮下或腹膜內注射到哺乳動物中。免疫劑包括EG-VEGF多肽或其融合蛋白。可用于將免疫劑與已知在被免疫的哺乳動物中免疫原性的蛋白質偶聯。這些免疫原性蛋白質的例子包括但不限于匙孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。可使用的佐劑的例子包括弗式完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷酰脂質A，合成的二霉菌酸海藻糖)。免疫方案可由本領域技術人員不經過度實驗選擇。
2.單克隆抗體抗EG-VEGF抗體另外還可以是單克隆抗體。單克隆抗體可以用Kohler等人，Nature 256495(1975)描述的雜交瘤方法制得。在雜交瘤方法中，小鼠倉鼠或其它合適的宿主動物，通常用免疫劑免疫以引發產生或能夠產生特異性結合免疫劑的抗體的淋巴細胞。或者，可以體外免疫淋巴細胞。
免疫劑通常包括EG-VEGF多肽或其融合蛋白。通常用外周血淋巴細胞(“PBL”)，如果需要人來源的細胞，或用脾臟細胞或淋巴結細胞，如果需要非人哺乳動物來源。然后用合適的融合劑，例如聚乙二醇融合淋巴細胞和無限增殖的細胞系，以形成雜交瘤細胞[Goding，《單克隆抗體理論與實踐》(MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practic)，pp.59-103(Academic Press，1986)]。無限增殖細胞系通常是轉化的哺乳動物細胞，特別是嚙齒類、牛和人來源的骨髓瘤細胞。通常使用大鼠或小鼠的骨髓瘤細胞系。將雜交瘤細胞培養在合適的培養基中，培養基中最好含有一種或多種抑制非融合的無限增殖細胞生長或存活的物質。例如，如果親代細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養基中一般含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷這些阻止HGPRT缺陷型細胞生長的物質(HAT培養基)。
優選的無限增殖細胞是那些融合效率高、支持選定的抗體產生細胞穩定且高水平表達抗體、而且對諸如HAT培養基敏感的細胞。更優選的無限增殖細胞系是小鼠骨髓瘤細胞系，例如從Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California USA和美國典型培養物保藏中心，Rockville，Maryland USA獲得的。也有用人骨髓瘤細胞和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系來生產人單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol.1333001(1984)；Brodeur等，《單克隆抗體的生產技術和應用》(MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications)，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1987)。
然后可對生長有雜交瘤細胞的培養液進行分析，檢測針對EG-VEGF的單克隆抗體的存在。優選用免疫沉淀法或例如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA)的體外結合分析法，來測定由雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的結合特異性。這些技術和測定法在本領域是已知的。例如，單克隆抗體的結合親和性可以用Scatchard分析(Munson等，Anal.Biochem.107220(1980))來測定。
在鑒定所需的雜交瘤細胞后，可以用有限稀釋程序將克隆亞克隆化，并用標準方法培養(Goding，見上)。就此目的而言，合適的培養基包括例如Dulbecco氏改良的Eagles氏培養基和RPMI-1640培養基。此外，雜交瘤細胞可以腹水瘤的形式在哺乳動物體內生長。
利用常規免疫球蛋白純化技術，例如A蛋白-瓊脂糖凝膠柱(protein A-Sepharose)、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，可從培養液、腹水液中分離或純化由亞克隆分泌的單克隆抗體。
通過重組DNA方法，例如美國專利號4,816,567中所述可制備單克隆抗體。使用常規方法，可以方便地分離出編碼單克隆抗體的DNA并進行測序(例如，使用能與編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。本發明的雜交瘤細胞是作為DNA的優選來源。一旦被分離，可以將DNA置于表達載體中，表達載體然后被轉染到例如、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞等并不產生免疫球蛋白的宿主細胞內，從而在重組宿主細胞內獲得合成的單克隆抗體。可通過用人重鏈和輕鏈恒定區的編碼序列取代同源鼠序列[美國專利號4,816,567；Morrison等，見上]，或通過將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列共價連接來修飾DNA。可用非免疫球蛋白多肽取代本發明抗體的恒定區，或可取代本發明抗體的一個抗體的抗原結合位點的可變區，以建立嵌合二價抗體。
抗體可以是單價抗體。制備單價抗體的方法是本領域熟知的。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和修飾的重鏈的重組表達。重鏈通常在Fc區域的任何點被截短，從而防止重鏈交聯。另外，用另一種氨基酸殘基取代相關的半胱氨酸殘基，或除去半胱氨酸殘基，以防止交聯。
體外方法也適合制備單價抗體。可用本領域已知的常規技術完成抗體的消化產生其片段，特別是Fab片段。
3.人和人源化抗體本發明的抗EG-VEGF抗體還包括人源化抗體或人抗體。非人(例如鼠)的抗體的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab)2)或其它抗體的抗原結合序列，它含有極小量衍生自非人免疫球蛋白的序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的互補決定區(CDR)的殘基被來自非人物種(供體抗體)，例如小鼠、大鼠或家兔的具有所需特異性、親和力和能力的CDR的殘基取代。在有些例子中，人免疫球蛋白的Fv構架殘基被相應的非人殘基取代。人源化抗體還包括含有既不在受體抗體也不在輸入的CDR或框架序列中發現的殘基。一般人源化抗體基本包含至少一個，通常兩個可變區的全部，其中全部或基本全部CDR區域對應于非人免疫球蛋白的區域，全部或基本全部FR區域是人免疫球蛋白共有序列。人源化抗體還任選含有至少一部分免疫球蛋白恒定區(Fc)，通常是人免疫球蛋白[Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)]。
人源化非人抗體的方法是本領域已知的。通常人源化抗體具有一個或多個氨基酸殘基，從非人來源引入。這些非人氨基酸殘基通常稱作“輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變區。人源化基本可用Winter和同事的方法進行[Jones等，Nature，321522-525(1986)；Reichmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988)]，通過用嚙齒類動物CDR或CDR序列取代人抗體的相應序列。因此，這種“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利號4,816,567)，其中基本小于完整人可變區被相應的來自非人物種的序列取代。在實踐中，人源化抗體通常是人抗體，其中一些CDR殘基和可能一些FR殘基被嚙齒類動物抗體中類似位點的殘基取代。
也可用各種本領域已知的技術制備人抗體，包括噬菌體展示文庫[Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581(1991)]。Cole等和Boerner等的技術也可用于制備人單克隆抗體(Cole等，Monoclonal Anitbodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)和Boerner等，J.Immunol.，147(1)86-95(1991))。類似的，可通過在轉基因動物，例如小鼠中引入人免疫球蛋白基因座制備人抗體，其中內源免疫球蛋白基因被部分或完全滅活。在攻擊后，觀察到人抗體產生，它在所有方面都非常像在人中所見到的，包括基因重排、裝配和抗體所有組成成分。在例如美國專利號5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和下列科學出版物中Marks等，Bio/Technology 10，779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368 856-859(1994)；Morrison，Nature 368，812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14,826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)中描述了該方法。
4.雙特異性抗體雙特異性抗體是單克隆，優選人或人源化抗體，它具有至少兩種不同抗原的結合特異性。在目前的情況下，結合特異性之一是EG-VEGF，另一種是任何其它抗原，優選是細胞-表面蛋白或受體或受體亞基。
制備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。傳統上雙特異性抗體的重組產生基于兩條免疫球蛋白重鏈/輕鏈配對的共表達，其中兩條重鏈具有不同的特異性[Milstein和Cuello，Nature，305537-539(1983)]。由于免疫球蛋白重和輕鏈的隨機分類，這些雜交瘤guadroma產生10種不同抗體分子的可能混合物，其中僅1種有正確的雙特異性結構。正確分子的純化通常通過親和層析步驟完成。類似的方法在WO93/08829，1993年5月13日出版和Traunecker等，EMBO J.，103655-3659(1991)中公開。
具有所需結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變域可與免疫球蛋白恒定區序列融合。融合優選是和免疫球蛋白重鏈恒定區，包括至少一部分絞鏈、CH2和CH3區域。優選具有第一個重鏈恒定區(CH1)，含有存在于至少一種融合體中的輕鏈結合必需的位點。編碼免疫球蛋白重鏈融合體的DNA和如需要，免疫球蛋白輕鏈被插入分離的表達載體，在合適宿主生物中共轉染。對于產生雙特異性抗體的進一步細節見例如Suresh等，Methods in Enzymology，121210(1986)。
根據在WO96/27011中描述的另一種方法，可在一對抗體分子之間的界面進行工程改造，使從重組細胞培養物中回收的異二聚體的百分比最大化。優選的界面含有抗體恒定區的至少一部分CH3區。在該方法中，第一抗體分子的界面上的一個或多個小氨基酸側鏈用較大的側鏈(如酪氨酸或色氨酸)替換。與大側鏈大小相同或相似的、補償性的“空穴”可在第二抗體分子的界面上形成，即將大的氨基酸側鏈用較小的側鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)替換。這提供了一種機理，提高了異二聚體的產量超過不需要的終產物(如同二聚體)。
可作為全長抗體或抗體片段(例如F(ab)2雙特異性抗體)制備雙特異性抗體。文獻中已記載了從抗體片段產生雙特異性抗體的技術。例如，雙特異性抗體可用化學鍵合方法制備。Brennan等，Science22981(1985)描述了一種方法，其中完整的抗體被蛋白酶解切開，產生F(ab′)2片段。這些片段在二硫酚絡合劑亞砷酸鈉存在下被還原，從而穩定了連位的二硫酚并防止形成分子間的二硫鍵。產生的Fab′片段然而被轉變成硫代硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。Fab′-TNB衍生物中的一種然后通過用巰基乙胺還原而被再轉變成Fab′-巰基，再與等摩爾量的另一種Fab′-TNB衍生物混合，從而形成雙特異性抗體。產生的雙特異性抗體可用作選擇性固定酶的試劑。
從大腸桿菌中直接回收Fab′片段，并化學偶聯形成雙特異性抗體。Shalaby等，J.Exp.Med.，175217-225(1992)描述了完全人源化的雙特異性抗體F(ab′)2分子的產生。分別從大腸桿菌分泌各Fab′片段，進行體外定向化學偶聯，形成雙特異性抗體。因此，形成的雙特異性抗體能夠與超表達ErbB2受體的細胞和正常人T細胞結合，并觸發人細胞毒性淋巴細胞針對人乳房腫瘤靶標的裂解作用。
各種直接從重組細胞培養物制備和分離雙特異性抗體片段的技術已有描述。例如，已用亮氨酸拉鏈產生了雙特異性抗體。Kostelny等，J.Immunol.148(5)1547-1553(1992)。來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩個不同抗體的Fab′部分連接。該抗體同二聚體在絞鏈區被還原形成單體，然后重新氧化成抗體異二聚體。該方法還可以用來產生抗體同二聚體。Hollinger等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993)中所述的“雙特異抗體”技術，提供了另一種制備雙特異性抗體片段的機制。所述片段包含通過接頭而連接在一起的輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，接頭很短以致于同一鏈上的兩個功能區之間無法配對。所以，一個片段的VH和VL功能區被迫與其它片段的互補性VL和VH功能區配對，由此形成兩個抗原結合位點。利用單鏈Fv(sFv)二聚體制備雙特異性抗體片段的其它方法也已有報道。參見Gruber等，J.Immunol.1525368(1994)。考慮了具有多于二價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等，J.Immunol.14760(1991)。
示范性雙特異性抗體可與本文的給定EG-VEGF多肽上的兩個不同表位結合。另外，抗EG-VEGF多肽臂可與一條臂結合，它與白細胞上的觸發性分子，例如T-細胞受體分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)，或IgG的Fc受體(Fc R)，例如Fc RI(CD64)、Fc RII(CD32)和Fc RIII(CD16)結合，從而將細胞防御機制集中于表達特定EG-VEGF多肽的細胞。還可用雙特異性抗體將細胞毒性劑定位到表達特定EG-VEGF多肽的細胞上。這些抗體具有EG-VEGF結合臂和一條臂，它結合細胞毒性劑或反射性核素螯合劑，例如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA。感興趣的另一種雙特異性抗體與EG-VEGF多肽結合，還與組織因子(TF)結合。
5.異偶聯抗體(heteroconjugate)異偶聯抗體也在本發明范圍內。異偶聯抗體由兩個共價結合的抗體組成。例如這些抗體能將免疫系統細胞靶向到不需要的細胞[美國專利No.4,676,980]，治療HIV感染[WO91/00360；WO92/00373；EP03089]。考慮到抗體可用合成蛋白質化學中已知的方法體外制備，包括那些涉及交聯劑的方法。例如毒素可以用二硫鍵交換反應或通過形成硫醚鍵制備。用于該目的的合適試劑的例子包括亞氨硫醇鹽和甲基-4-巰基丁酰亞胺酸鹽，和例如美國專利號4,676,980中公開的。
6.效應子功能設計根據效應子功能需要對本發明抗體進行修飾，從而增強抗體在例如治療癌癥中的效果。例如，可在Fc區內引入半胱氨酸殘基，由此允許在該區形成鏈間二硫鍵。由此形成的同源二聚體抗體可以具有改善的內化能力和/或提高的補體介導的細胞殺傷性和抗體依賴性細胞毒性(ADDC)。參見Caron等，J.Exp.Med1761191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.1482918-2922(1992)。抗腫瘤活性增強的同源二聚體抗體還可以如Wolff等在Cancer Research532560-2565(1993)中所述使用異雙功能交聯劑來制備。或者，抗體可以經工程改造后具有兩個Fc區，并由此加強補體裂解和ADCC能力。參見Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design3219-230(1989)。
7.免疫偶聯物本發明還涉及包含與細胞毒劑偶聯的所述抗體的免疫偶聯物，細胞毒劑例如化療劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性偶聯物)。
用于產生所述免疫偶聯物的化療劑已在前文論述過。可以使用的酶活性毒素或其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α八疊球菌素(α-sarcin)、油桐蛋白、石竹素蛋白、美商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制物、麻風樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制物、臼樹毒素、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊諾霉素和單端孢菌素(tricothecenes)。有多種放射性核素可用產生成放射性偶聯的抗體。例子包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
抗體與細胞毒劑的偶聯物可用各種不同雙官能蛋白偶合劑制備的，例如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫代烷(IT)、亞胺酯的雙官能衍生物(例如二甲基己二酰亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活潑酯(例如二琥珀酰亞胺辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、二疊氮基化合物(例如二(對疊氮基苯甲酰)己二胺)、二重氮衍生物(例如二-(對重氮苯甲酰)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2，6-二異氰酸酯)和二活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以如Vitetta等在Science 2381098(1987)中所述的方法來制備。碳14標記的1-異硫氰酰芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是一種代表性的用于將放射性核素與抗體偶聯的螯合劑。參見WO94/11026。
在另一實施方案中，為了用于腫瘤預導向，抗體可以與“受體”(例如鏈霉親和素)偶聯，并給患者施用抗體-受體偶聯物，接著用清除劑去除循環系統中未結合的偶聯物，然后施用與細胞毒劑(例如放射性核素)偶聯的“配體”(例如親和素)。
8.免疫脂質體本處所述的抗VEGF抗體還可以制成免疫脂質體。含有抗體的脂質體是用本領域已知方法制備的，例如以下所述Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774030(1980)；和美國專利4,485,045和4,544,545。美國專利5,013,556公開了具有增加循環時間的脂質體。
特別有用的脂質體可以通過含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物，用反相蒸發法生成。將脂質體擠壓通過一定孔徑的濾器形成具有所需直徑的脂質體。如Martin等在J.Biol.Chem.257286-288(1982)中所述，可通過二硫鍵互換反應將本發明的抗體的Fab′片段與脂質體偶聯。脂質體內可以任選地包含化療劑(例如阿霉素)。參見Gabizon等，J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
9.抗體的藥物組合物可施用與本文所述的EG-VEGF多肽，或通過本文之前公開的篩選試驗鑒定的其它分子特異性結合的抗體，以藥物組合物形式的治療各種疾病。
如果在胞內靶向EG-VEGF多肽，而且全抗體用作抑制劑，優選內化抗體。然而也可用脂轉染或脂質體將抗體或抗體片段傳遞到細胞內。當使用抗體片段時，優選與靶蛋白的結合域特異性結合的最小抑制性片段。例如，基于抗體的可變區序列，可設計肽分子，它保留與靶蛋白序列結合的能力。這些肽可化學合成和/或通過重組DNA技術產生。見例如Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907889-7893(1993)。本發明制劑還可以包含一種以上治療特殊狀況所需的活性混合物，它們最好具有互補的活性但不相互產生不利影響。另選或另外，組合物可含有增強其功能的制劑，例如細胞毒性劑、細胞因子、化療劑、或生長抑制劑。所述分子以適合各自預定目的所需的有效量相互組合。
活性成份還可以包載在分別通過凝聚法或界面聚合法制備的例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。亦可包載膠態藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、毫微顆粒和毫微膠囊)或粗乳狀液。在Remington′sPharmaceutical Sciences(見上)中敘述了此類技術。
用于體內施用的制劑必須是無菌的。通過滅菌濾膜過濾可以方便地做到這一點。
可以制備緩釋制劑。合適的緩釋制劑包括例如包含所述抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質體，所述的基質體是有形的物體，例如膜或微膠囊。合適的緩釋基質體包括例如聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-丙烯酸甲酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美國專利3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物、非降解性乙烯-乙酸乙烯、諸如Lupron DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林組成的可注射微球體)的可降解乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。諸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能夠使分子釋放100天以上，有些水凝膠可在較短時間內釋放蛋白質。當膠囊化的抗體在體內保留長時間時，它們可能會因為在37℃接觸水分而變性或凝聚，導致生物活性喪失并可能造成免疫原性改變。根據有關的機制可以設計出合理的穩定化策略。例如，如果發現凝聚機制是通過硫-二硫鍵互換而形成分子間的S-S鍵，可以通過修飾巰基殘基、凍干酸性溶液、控制含水量、使用合適的添加劑和設計特殊的聚合基質組合物達到穩定化。
G.抗EG-VEGF抗體的使用本發明的抗-EG-VEGF抗體具有許多用途。例如，抗EG-VEGF抗體可用于EG-VEGF的診斷試驗，例如檢測其在特定細胞、組織或血清中的表達。可使用本領域已知的各種診斷試驗技術，例如競爭性結合試驗，在異源或同源階段中進行直接或間接夾層試驗和免疫沉淀試驗[Zola，Monoclone AntibodiesA Manual ofTechniques，PP.147-158(CRC Press，Inc.，1987)]。可用可檢測組成成分標記用于診斷試驗的抗體。可檢測組成成分應能直接或間接產生可檢測信號。例如，可檢測組成成分可以是放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S、或125I，熒光或化學發光化合物，例如異硫氰酸熒光素、羅丹明或熒光素，或酶，例如堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶。可使用任何本領域已知的方法將抗體與可檢測組成成分偶聯，包括Hunter等，Nature，144945(1962)；David等，Biochemistry，131014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth.，40219(1981)；和Nygren，J.Histochemand Cytochem，30407(1982)所述的方法。
抗EG-VEGF抗體還用于從重組細胞培養物或天然來源親和純化EG-VEGF。在該過程中，用本領域熟知的方法將針對EG-VEGF的抗體固定在合適的載體上，例如Sephadex樹脂或濾紙上。然后使固定化抗體與含有要純化的EG-VEGF的樣品接觸，然后用合適的溶劑洗滌載體，基本上除去樣品中的所有物質，除了EG-VEGF，它與固定化抗體結合。最后，用從抗體釋放EG-VEGF的另一種合適溶劑洗滌載體。另外，抗EG-VEGF抗體用作治療和診斷試劑，可用于治療和/或診斷先前關于EG-VEGF和EG-VEGF拮抗劑討論的病況。
提供下列實施例僅為了說明，而不是要以任何形式限制本發明的范圍。
本說明書所引用的全部專利和文獻在此完整引入以供參考。
實施例除非另外說明，根據廠商說明書使用實施例中所提到的市售試劑。在下列實施例和整篇說明書中，用ATCC登錄號鑒別的細胞的來源是美國典型培養物保藏中心，Manassas，VA。
實施例1編碼人EG-VEGF的cDNA克隆的分離用Genetech，Inc.(South San Francisco，CA)開發的專利信號序列搜尋算法(圖20A-Q)根據公眾(例如GenBank)和/或私人(LIFESEQTM，IncytePharmaceuticals，Inc.，Palo Alto，CA)數據庫的EST和成簇和裝配型EST片段鑒定DNA60621-1516。信號序列算法根據圍繞考慮中的序列或序列片段5’末端的第一或任選的第二個甲硫氨酸密碼子(ATG)的DNA核苷酸的特征，計算出分泌信號評分。在第一個ATG后的核苷酸必須編碼至少35個非多義的氨基酸，而沒有任何終止密碼子。如果第一個ATG是必需的氨基酸，就不檢測第二個。如果都不符合要求，就不對候選序列評分。為了確定EST序列是否含有真信號序列，用一組7個已知與分泌信號有關的傳感器(評估參數)對圍繞ATG密碼子的DNA和相應氨基酸序列評分。
上述信號序列算法的使用鑒定出來自LIFESEQTM數據庫，IncytePharmaceuticals，Palo Alto的EST簇序列，本文中稱為DNA157032。然后將EST簇序列與各種表達序列標記(EST)數據庫比較，其中包括EST數據庫(例如GenBank)和專利EST DNA數據庫(LIFESEQTM，Incvte Pharmaceuticals，Palo Alto，CA)以鑒定現存的同源性。用計算機程序BLAST或BLAST2(Altshul等，Methods inEnzymology 266460-480(1996))進行同源檢索。在BLAST評分中得到70(有時90)或更高的比較不編碼已知的蛋白質，它們用程序“phrap”(Phil Green，Universityof Washiongton，Seattle，Washington)成簇并裝配成一條共有DNA序列。從其中得到的共有序列如圖4(SEQ ID NO3)所述，其中本文中的共有序列被稱為DNA56748。
根據DNA56748序列和Incyte數據庫的克隆號347692中包含的EST序列之間觀察到的序列同源性，購買克隆號3476792，得到cDNA插入物并測序。從卵巢組織文庫中分離到克隆號3476792。組織切片發現后漿膜含有子宮內膜異位癥的病灶。相關腫瘤組織的病理學顯示大小不等的多個平滑肌瘤。本文發現cDNA插入物編碼全長蛋白。cDNA插入物的序列如圖1所示，在本文中稱為DNA60621-1516。
克隆DNA60621-1516含有一個開放閱讀框，它在核苷酸91-93位具有明顯的翻譯起始位點，在核苷酸406-408位的終止密碼子終止(圖1)。預測的多核苷酸前體長105個氨基酸(圖2)。圖2所示的全長EG-VEGF蛋白具有約11715道爾頓的估計分子量，和約9.05的pI。成熟EG-VEGF是8600道爾頓的蛋白質，由從人卵巢文庫克隆的cDNA編碼。1.4kb cDNA編碼具有明確的信號序列的105個氨基酸的蛋白質。EG-VEGF是富含半胱氨酸的蛋白質，它由共脂肪酶折疊基序構成。在成熟蛋白質預期的86個氨基酸中，10個是半胱氨酸(圖15a和b)。蛋白質含有一系列具有大連接環的短β鏈，它們通過二硫鍵結合在一起，得到具有指狀突起的平面折疊，作為相互作用的表面。圖2(SEQ ID NO2)所示的全長EG-VEGF序列的分析證明如圖2所示存在各種重要的多肽結構域，其中這些重要多肽結構域提供的位置大約是如上所述的。克隆DNA60621-1516與1998年8月4日保藏在ATCC，指定的ATCC保藏號203091。
用ALIGN-2序列排列分析圖2(SEQ ID NO2)所示的全長序列分析Dayhoff數據庫(35.45版，SwissProt 35)，證明EG-VEGF氨基酸序列和下列Dayhoff序列之間的序列同一性VRPA_DENPO、LFE4_CHICK、AF034208_1、AFD30433_1、A55035、COL_RABIT、CELB0507_9、S67826_1、S34665和CRU73817_1。
值得注意的是，EG-VEGF與從黑樹眼鏡蛇(Dendroaspis polylepis)純化的無毒的蛋白，稱為毒液蛋白A(VRPA)[Joubert和Strydom，Hoppe-Seylers Zeitschrift furPhys.Chemie，3611787-1794(1980)]顯示高度的同源性(80％)和同一性(63％)，和與鈴蟾(Bombina variegata)分離的肽密切相關的人分子，稱為“Bv8”[Wechselberger等，FEBS Lett.，462177-181(1999)]具有高度同源性(76％)和相同性(58％)。圖15b說明了該同源性。在圖15b中，加框的殘基表示同一性，標出了人EG-VEGF、蛇VPRA和人BV8同系物(Bv8 hom)氨基酸序列。應注意的是，EG-VEGF的半胱氨酸的數量和間距是完全保守的。因此EG-VEGF是VRPA和Bv8的人直向同系物或密切相關的同系物。EG-VEGF顯示與爪蟾(Xenopus)頭部形成體dickopf，(一種wnt信號傳遞的抑制劑)的富含半胱氨酸的羧基序列和共脂肪酶具有更有限但重要的同源性，如圖15c所見[Glinka等，Nature，391357-362；Aravind和Koonin，Curr.Biology，8477-478(1998)]。圖15c是人EG-VEGF、人dickkopf-3(hdkk3)[Krupnik等，Gene，238301-313(1999)]、爪蟾dkk-1(xdkk1)[Glinka等，Nature，391357-362(1998)]和豬共脂肪酶(col)的序列對比。這說明保守的半胱氨酸形成共脂肪酶折疊域的特征性二硫鍵鍵合模式[van Tilbeurgh等，Nature，359159-162(1992)]。EG-VEGF中的該基序與人dkk-3的富含半胱氨酸的C-末端結構域具有37％相同性和41％同源性，與爪蟾dkk-1結構域具有42％同源性。數字表示各蛋白中的氨基酸位置，加框的殘基與EG-VEGF相同。
實施例2用EG-VEGF作為雜交探針下列方法描述了用編碼EG-VEGF的核苷酸序列作為雜交探針。
用含有全長或成熟EG-VEGF的編碼序列的DNA作為探針篩選人組織cDNA文庫中或人組織基因組文庫中的同源DNA(例如那些編碼EG-VEGF的天然存在的變體)。
在下列高嚴謹條件下進行含有各文庫DNA的雜交和濾膜洗滌。在50％甲酰胺、5×SSC、0.1％SDS、0.1％焦磷酸鈉、50mM磷酸鈉、pH6.8、2×Denhardt氏溶液和10％葡聚糖硫酸酯，42℃將放射性標記的EG-VEGF衍生的探針與濾膜雜交10分鐘。在42℃，在0.1×SSC和0.1％SDS的水溶液中洗滌濾膜。
然后可用本領域已知的標準技術鑒定與編碼全長天然序列EG-VEGF的DNA具有所需序列同一性的DNA。
實施例3大腸桿菌中EG-VEGF的表達該實施例說明在大腸桿菌中通過重組表達制備非糖基化形式的EG-VEGF。
用所選的PCR引物最初擴增了編碼EG-VEGF的DNA序列。引物應該含有限制性酶位點，它們對應于所選表達載體上的限制性酶位點。可使用各種表達載體。合適的載體的例子是pBR322(衍生自大腸桿菌，見Bolivar等，Gene，295(1977))，它含有氨芐青霉素和四環素抗性的基因。用限制性酶消化載體并去磷酸化。然后將PCR擴增的序列連接入載體。載體優選包括編碼抗生素抗性基因、trp啟動子、polyhis前導序列(包括開始的6個STII密碼子、polyhis序列和腸激酶切割位點)的序列，EG-VEGF編碼區，λ轉錄終止子和argU基因。
然后使用Sambrook所述的方法(見上)，用連接混合物轉化所選的大腸桿菌菌株。通過其在LB平板上生長的能力鑒定轉化子，然后選擇抗生素抗性菌落。可分離質粒DNA并用限制性分析和DNA測序確定。
所選的克隆在液體培養基(例如補加抗生素的LB肉湯)中培養過夜。然后用過夜培養物接種大量的培養物。然后使細胞長到所需的光密度，在這段時間中表達啟動子被啟動。
再培養細胞數小時后，可離心收集細胞。用本領域已知的各種試劑溶解離心獲得的細胞沉淀，用金屬鰲合柱在使蛋白質緊密結合的條件下純化溶解的EG-VEGF蛋白。
可在大腸桿菌中以poly-His標記的形式用下列方法表達EG-VEGF。用所選的PCR引物最初擴增編碼EG-VEGF的DNA。引物含有限制性酶位點(對應于所選表達載體上的限制性酶位點)，和其它有用的序列用于引發有效和可靠的翻譯，在金屬鰲合柱上快速純化，和用腸激酶蛋白水解去除。PCR擴增的poly-his標記的序列然后連接入表達載體，用于轉化基于菌株52的大腸桿菌宿主(W3110fuhA(tonA)lon galE rpoHts(htpRts)clpP(lacIq))。轉化株首先在含有50mg/ml羧芐青霉素的LB中30℃振搖培養，直到達到3-5的OD600。然后在CRAP培養基(在500ml水中混合3.57g(NH4)2SO4、0.71g檸檬酸鈉·2H2O、1.07g KCl、5.36g Difco酵母提取物、5.36g Sheffield hycase SF和110mM MPOS，pH7.3，0.55％(w/v)葡萄糖和7mM MgSO4制備)中將培養物稀釋50-100倍，并在30℃振搖培養約20-30小時。移去樣品用SDS-PAGE分析驗證表達，離心全部培養物沉淀細胞。冷凍細胞沉淀直到純化和重折疊。
將0.5-1L發酵的大腸桿菌漿(6-10g沉淀)重懸浮于10體積(w/v)的7M胍，20mMTris，pH8緩沖液中。加入固體硫酸鈉和連四硫酸鈉分別使最終濃度為0.1M和0.2M，4℃攪拌溶液過夜。此步驟導致由亞硫酸鹽化阻斷具有半胱氨酸殘基的變性蛋白質。在Beckman Ultracentifuge中40,000rpm離心溶液30分鐘。用3-5體積金屬鰲合柱緩沖液(6M 胍，20mM Tris，pH7.4)稀釋上清液，并濾過0.22微米濾膜以澄清。將澄清的提取物加到用金屬螯合柱緩沖液平衡的5毫升Qiagen Ni-NTA金屬螯合柱上。用含有50mM咪唑(Calbiochem，Utrol grade)，pH7.4的其它緩沖洗滌柱。用含有250mM咪唑的緩沖液洗脫蛋白質。合并含所需蛋白的組分并在4℃儲藏。用根據其氨基酸序列計算的消光系數，用其在280nm的吸光度估計蛋白質濃度。
通過緩慢地將樣品稀釋入新鮮制備的重折疊緩沖液(含有20mM Tris，pH8.6，0.3M NaCl，2.5M脲、5mM半胱氨酸、20mM甘氨酸和1mM EDTA)重新折疊蛋白質。選擇重折疊體積使最終蛋白濃度在50-100微克/毫升之間。在4℃溫和攪拌重折疊溶液12-36小時。加入最終濃度為0.4％(pH約3)的TFA以淬滅重折疊反應。在進一步純化蛋白質之前，溶液濾過0.22微米濾膜，并加入最終濃度為2-10％的乙腈。在Poros R1/H反相柱上用流動緩沖液0.1％TFA層析重折疊的蛋白質，用10-80％的乙腈梯度洗脫。在SDS聚丙烯酰胺凝膠上分析具有A280吸光度的餾份等份，合并含有同源重折疊的蛋白質的餾份。通常在最低濃度的乙腈洗脫出大部分正確重折疊的蛋白質，因為這些物質最緊密，其疏水的內部不與反相層析樹脂相互作用。在較高的乙腈濃度通常洗脫出聚集物質。除了將錯誤折疊形式的蛋白質與所需形式分開，反相步驟還從樣品中除去了內毒素。
合并含有所需折疊的EG-VEGF多肽的餾分，對溶液通溫和氮氣流除去乙腈。蛋白質通過透析或通過凝膠過濾，用在制劑緩沖液中平衡的和無菌過濾的G25Superfine(Pharmacia)樹脂配制在20mM Hepes，pH6.8和0.14M氯化鈉和4％甘露醇中。
實施例4EG-VEGF在哺乳動物細胞中的表達該實施例說明用哺乳動物細胞中的重組表達制備可能糖基化形式的EG-VEGF。
用載體pRK5(見EP307,247，1989年3月15日出版)作為表達載體。可任選的，用所選限制性酶將EG-VEGF DNA連接入pRK5，用Sambrook等，見上所述的連接方法插入EG-VEGF DNA。得到的載體稱為pRK5-EG-VEGF。
在一個實施例中，所需的宿主細胞可以是293細胞。人293細胞(ATCC CCL1573)在組織培養皿中的培養基(例如補充胎牛血清和可任選的營養成分和/或抗生素的DMEM)中生長至匯合。將約10g pRK5-EG-VEGF DNA與約1g編碼VA RNA基因的DNA[Thimmappaya等，Cell，31543(1982)]并溶于500升1mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、0.227M CaCl2中。在混合物中滴加500升50mM HEPES(pH7.35)、280mM NaCl、1.5mM NaPO4，在25℃形成沉淀10分鐘。懸浮沉淀物并加到293細胞中，37℃放置約4小時。吸去培養液，在30秒內加入2mL20％甘油的PBS溶液。然后用無血清培養液洗滌293細胞，加入新鮮培養液，培養細胞約5天。
轉染后約24小時，移去培養基，并用培養基(單獨)或含有200Ci/ml35S-半胱氨酸和200Ci/ml35S-甲硫氨酸替換。培養12小時后，收集條件培養基，在旋轉濾器上濃縮，并加到15％SDS凝膠上。處理的凝膠可以被干燥并接觸薄膜一段時間，以揭示EG-VEGF多肽的存在。含有轉染細胞的培養物可經過進一步培養(在無血清培養基中)，在所選的生物測定中測試培養基。
在另一種技術中，EG-VEGF可以用Somparyrac等，Proc.Natl.Acad.Sci.，127575(1981)所述的葡聚糖硫酸酯方法瞬時引入293細胞。293細胞在旋轉燒瓶中生長到最大密度，加入700克pRK5-EG-VEGF DNA。首先通過離心從旋轉燒瓶濃縮細胞，并用PBS洗滌。在細胞沉淀上培養DNA-葡聚糖沉淀物4小時。用20％甘油處理細胞90秒鐘，用組織培養基洗滌，重新引入含有組織培養基、5g/ml牛胰島素和0.1g/ml牛轉鐵蛋白的旋轉燒瓶。約4天后，離心條件培養基并過濾除去細胞和碎片。然后濃縮含有表達的EG-VEGF的樣品，用任何所選的方法，例如透析和/或柱層析純化。
在另一個實施例中，可以在CHO細胞中表達EG-VEGF。可用已知試劑，例如CaPO4或DEAE-葡聚糖將pRK5-EG-VEGF轉染入CHO細胞。如上所述，可培養細胞培養物，用培養基(單獨)或含有放射性標記，例如35S-甲硫氨酸的培養基替換培養基。在確定EG-VEGF多肽的存在后，用無血清培養基替換培養基。優選培養培養物約6天，然后收集條件培養基。可用任何所選的方法濃縮并純化含有表達的EG-VEGF的培養基。
還可在宿主CHO細胞中表達表位標記的EG-VEGF。EG-VEGF可從pRK5載體中亞克隆出。亞克隆插入可經過PRC，在閱讀框中與所選表位標記，例如poly-his標記融合入桿狀病毒表達載體。然后可將poly-his標記的EG-VEGF插入物亞克隆入含有選擇標記(例如DHFR)的SV40驅動載體，用于選擇穩定的克隆。最后可用SV40驅動載體轉染CHO細胞(如上所述)。可如上所述進行標記以證實表達。然后可用任何所選方法，例如用Ni2+-螯合親和層析，濃縮并純化含表達的poly-His標記的EG-VEGF的培養基。
可通過瞬時表達方法在CHO和/或COS細胞中，或用其它穩定的表達方法在CHO細胞中表達EG-VEGF。
用下列程序進行CHO細胞的穩定表達。蛋白質是作為IgG構建體(免疫粘附素)表達的，其中各蛋白質的可溶性形式(例如胞外結構域)的編碼序列可以與含有絞鏈區、CH2和CH2結構域的IgG1恒定區序列融合和/或是poly-His標記的形式。
PCR擴增后，用Ausubel等，Current Protocols of Molecular Biology，Unit3.16，John Wiley & Sons，(1997)所述的標準技術將各DNA亞克隆在CHO表達載體中。構建CHO表達載體，使感興趣的DNA的5’和3’具有相容的限制性位點，從而使cDNA能方便的穿梭。用于CHO細胞中表達的載體如Lucas等，Nucl.Acids.Res.249(1774-1779(1996))所述，用SV40早啟動子/增強子驅動感興趣的cDNA和二氫葉酸還原酶(DHFR)的表達。DHFR表達允許在轉染后選擇質粒的穩定維持。
用市售轉染試劑SuperfectTM(Qiagen)、DosperTM或FugeneTM(BoehringerMannheim)將12微克所需質粒DNA引入約10×106CHO細胞。細胞如Lucas等所述(見上)生長。在安瓿中冷凍約3×10-7細胞，如下所述進一步生長并生產。
通過置于水浴并旋轉混合融化含有質粒DNA的安瓿。將內含物吸移到含有10ml培養基的離心試管中，1000rpm離心5分鐘。吸取上清液，將細胞重懸浮在10ml選擇性培養基(0.2μM濾過的PS2O和5％0.2μm滲濾的胎牛血清)中。然后將細胞分成等份，置于含有90ml選擇性培養基的100ml旋轉器中。1-2天后，將細胞轉移到250ml的旋轉器中，其中裝有150ml選擇性培養基，在37℃培養。再過2-3天后，用3×105細胞/毫升接種250ml、500ml和2000ml旋轉器。通過離心和重懸浮在生產培養基中用新鮮培養基替換細胞培養基。雖然可使用任何合適的CHO培養基，實際可使用1992年6月16日提交的美國專利號5,122,469所述的生產培養基。以1.2×106細胞/ml接種3L生產旋轉器。在第0天，確定細胞數量pH。在第1天，對旋轉器采樣，開始用濾過的空氣攪動。在第2天，對旋轉器采樣，將溫度切換到33℃，加入30ml 500g/L葡萄糖和0.6ml 10％消泡劑(例如35％聚二甲基硅氧烷乳液，Dow Corning 365醫用級乳液)。在整個生產過程中，必需調節pH至約7.2。在10天后，或直到存活率跌到70％以下，離心收集細胞培養物并濾過0.22微米濾膜。將濾液儲藏在4℃或直接上柱純化。
對于poly-His標記的構建體，用Ni-NTA柱(Qiagen)純化蛋白質。在純化前，在條件培養基中加入咪唑至濃度為5mM。將條件培養基泵送至用20mM Hepes平衡的6ml Ni-NTA柱上，pH7.4，緩沖液含有0.3M NaCl和5mM咪唑，流速為4-5ml/min，4℃。上樣后，用額外的平衡緩沖液洗滌柱，用含有0.25M咪唑的緩沖液洗脫蛋白質。高度純化的蛋白質隨后用25ml G25 Superfine(Pharmacia)柱脫鹽入含有10mMHepes、0.14M NaCl和4％甘露醇，pH6.8的緩沖液中，儲藏在-80℃。
如下從條件培養基純化免疫粘附素(含Fc)的構建體。將條件培養基泵送入5ml蛋白質A柱(Pharmacia)，它已用20mM磷酸鈉緩沖液，pH6.8平衡。在上樣后，在用100mM檸檬酸(pH3.5)洗脫前用平衡緩沖液充分洗滌柱。洗脫的蛋白質立即通過將1ml餾分收集入含有275升1M Tris緩沖液，pH9的試管中中和。隨后如上對于poly-His標記的蛋白質所述，將高度純化的蛋白質脫鹽入儲藏緩沖液中。通過SDS聚丙烯酰胺凝膠評估同源性，用Edman降解對N-末端氨基酸測序。
實施例5EG-VEGF在酵母中的表達下列方法描述了EG-VEGF在酵母中的重組表達。
首先，構建酵母表達載體用于胞內產生和分泌來自ADH2/GAPDH啟動子的EG-VEGF。編碼EG-VEGF的DNA和啟動子被插入所選質粒中合適的限制性酶位點，以指導EG-VEGF的胞內表達。為了分泌，編碼EG-VEGF的DNA可與編碼ADH2/GAPDH啟動子的DNA、天然EG-VEGF信號肽或其它哺乳動物信號肽，或例如酵母α因子或轉化酶分泌信號/前導序列、或接頭序列(如需要)克隆入所選質粒，用于表達EG-VEGF。
然后可用上述表達質粒轉化酵母細胞，例如酵母菌株AB110，并在所選的發酵培養基中培養。可通過用10％三氯乙酸沉淀并用SDS-PAGE分離，然后用考馬斯藍染色凝膠，分析轉化的酵母上清液。
然后通過離心從發酵培養基除去酵母細胞，然后用所選的過濾筒濃縮培養基，從而分離和純化重組EG-VEGF。可用所選的柱層析樹脂進一步純化含有EG-VEGF的濃縮液。
實施例6EG-VEGF在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中的表達。
下列方法描述了EG-VEGF在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中的表達。
編碼EG-VEGF的序列融合于桿狀病毒表達載體中所含表位標記的上游。這些表位標記包括poly-His標記和免疫球蛋白標記(例如IgG的Fc區域)。可使用各種質粒，包括衍生自市售質粒，例如pVL1393(PharMingen)的質粒。簡單地說，用與5’和3’區域互補的引物PCR擴增編碼EG-VEGF的序列或EG-VEGF編碼序列的所需部分，例如編碼跨膜蛋白的胞外域的序列，或編碼成熟蛋白的序列(如果蛋白質是胞外)。5’引物可以摻入旁側(所選)的限制性酶位點。然后用那些所選的限制性酶消化產物，并亞克隆入表達載體。
例如，用PCR擴增人EG-VEGF的編碼序列，并亞克隆入pBPH.IgG的EcoRI和StuI位點，產生與人OgG1的Fc區域的C-末端融合體，或將其亞克隆入pBPH.His.c的EcoRI和SmalI位點，產生C-末端GHHHHHHHH標記。載體pBPH.IgG和pBPH.His.c是桿狀病毒表達載體PVL1393(Pharmingen)的衍生物。
通過將上述質粒和BaculoGoldTM病毒DNA(Pharmingen)用lipofectin(購自GIBCO-BRL)共轉染入草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(“Sf9”)細胞(ATCC CRL1711)中。28℃培養2-4天后，收集釋放的病毒并用于進一步擴增。如O’Reilley等，Baculovirus Expression VectorsA Laboratory Mannual，OxfordOxfordUniversity Press(1994)所述進行病毒感染和蛋白質表達。
然后通過用于Fc融合蛋白的蛋白A-Sepharose珠(Pharmacia)或用于His-標記蛋白的Ni-NTA瓊脂糖珠(Qiagen)純化表達的poly-his標記的EG-VEGF。對于His-標記的蛋白質，如Rupert等，Nature，362175-179(1993)所述從重組病毒感染的Sf9細胞中制備提取物。簡單地說，洗滌Sf9細胞，重懸浮在超聲緩沖液(25mLHepes，pH7.9；12.5mM MgCl2；0.1mM EDTA；10％甘油；0.1％NP-40；0.4M KCl)中，并在冰上超聲20秒兩次。離心澄清超聲處理產物，用加樣緩沖液(50mM磷酸鹽、300mM NaCl、10％甘油，pH7.8)稀釋上清液50倍，并濾過0.45米濾膜。制備床體積為5mL的Ni2+-NTA瓊脂糖柱(購自Qiagen)，用25mL水洗滌，并用25mL加樣緩沖液平衡。將濾過的細胞提取物以每分鐘0.5ml加到柱上。用加樣緩沖液將柱洗到A280的基線，此時開始收集餾分。接著，用第二種洗滌緩沖液(50mM磷酸鹽、300mM NaCl、10％甘油，pH6.0)洗滌柱，它洗脫非特異性結合的蛋白質。在再次達到A280基線時，用0-500mM咪唑在第二種洗滌緩沖液中梯度展開柱。收集一毫升餾分并用SDS和銀染色，或用與堿性磷酸酶(Qiagen)偶聯的Ni2+-NTA的Western印跡分析。合并含有洗脫的His10-標記的EG-VEGF的餾分，并對加樣緩沖液透析。
另外，可用已知的層析技術，包括例如蛋白質A或蛋白質G柱層析進行IgG標記(或Fc標記)的EG-VEGF的純化。
為了檢測蛋白質表達，在親和純化的重組蛋白質上，在非還原和還原條件下進行SDS/PAGE分析，然后染色。蛋白質常規進行N-末端測序和內毒素檢測，低于1eu/mg。
實施例7制備與EG-VEGF結合的抗體該實施例說明可與EG-VEGF特異性結合的單克隆抗體的制備。
產生單克隆抗體的技術是本領域已知的，如Goding，見上中所述。可使用的免疫原包括純化的EG-VEGF、含有EG-VEGF的融合蛋白、和在細胞表面上表達重組EG-VEGF的細胞。本領域技術人員可不經過度的實驗即可選擇免疫原。
用在完全弗氏佐劑中乳化的EG-VEGF免疫原免疫接種小鼠，例如Balb/c，以1-100微克的量在皮下或腹膜內注射。另外，將免疫原乳化在MPL-TDM佐劑(RibiImmunochemical Research，Hamilton，MT)，并注射入動物的后腳掌。然后在10-12天后用在所選佐劑中乳化的另一種免疫原增強免疫的小鼠。此后幾周，可用額外的免疫注射加強小鼠。可通過眼眶后出血從小鼠定期獲得血清樣品，用于在ELISA測定中檢測抗-EG-VEGF抗體。
在檢測合適的抗體滴度后，可用EG-VEGF最后一次靜脈注射給對抗體“陽性”的動物。3-4天后，殺死小鼠，收集脾細胞。然后將脾細胞與所選的鼠骨髓瘤細胞系(例如得自ATCC號CRL1597的P3X63AgU.1)融合(使用35％聚乙二醇)。融合物產生雜交瘤細胞，它然后可以被鋪在含有HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶)培養基的96孔組織培養板上，以抑制未融合細胞、骨髓瘤雜交體和脾細胞雜交體的增殖。
可在ELISA測定中篩選雜交瘤細胞抵抗EG-VEGF的反應性。確定分泌所需的針對EG-VEGF的單克隆抗體的“陽性”雜交瘤細胞是在本領域技術人員的能力范圍內。
可將陽性雜交瘤細胞腹膜內注射給同系的Balb/c小鼠，以產生含有抗EG-VEGF單克隆抗體的腹水。另外，可在組織培養瓶或轉瓶中培養雜交瘤細胞。用硫酸銨沉淀純化在腹水中產生的單克隆抗體然后用凝膠排阻層析純化在腹水中產生的單克隆抗體。另外，可使用基于抗體與蛋白質A或蛋白質G結合的親和層析。
實施例8用特異性抗體純化EG-VEGF多肽可用蛋白質純化領域中的各種標準技術純化天然或重組的EG-VEGF。例如，用對于感興趣的EG-VEGF多肽特異性的抗體通過免疫親和層析純化原-EG-VEGF多肽、成熟EG-VEGF多肽或前-EG-VEGF多肽。通常，通過將抗EG-VEGF多肽抗體與活化的層析樹脂共價偶聯構建免疫親和柱。
通過用硫酸銨沉淀，或通過在固定化的蛋白質A(Pharmacia LKBBiotechnology，Piscataway，N.J.)純化，從免疫血清制備多克隆免疫球蛋白。類似的，通過硫酸銨沉淀或在固定化的蛋白A上層析，從小鼠腹水制備單克隆抗體。部分純化的免疫球蛋白與層析柱，例如CnBr-活化的SEPHAROSETM(PharmaciaLKB Biotechnology)共價結合。將抗體與樹脂偶聯，封閉樹脂，根據廠商說明書洗滌衍生的樹脂。
利用這樣的免疫親和柱純化EG-VEGF多肽，該多肽是制備從含有可溶性形式的EG-VEGF多肽的細胞分產生的。通過溶解全細胞或溶解加入去污劑或其它本領域熟知的方法差示離心獲得的亞細胞組分，衍生該制備物。另外，含有信號序列的可溶性EG-VEGF多肽可以有用量分泌入細胞生長的培養基中。
含有可溶性EG-VEGF多肽的制備物通過親和層析柱，在允許EG-VEGF多肽擇優吸光度的條件下(例如去污劑存在下高離子強度緩沖液)洗滌柱。然后在中斷抗體/EG-VEGF多肽結合的條件下(例如低pH緩沖液，例如約pH2-3，或高濃度的離液劑，例如脲或硫氫酸離子)洗脫柱，收集EG-VEGF多肽。
實施例9藥物篩選本發明特別用于在任一的各種藥物篩選技術中通過EG-VEGF多肽或其結合片段篩選化合物。該測試中使用的EG-VEGF多肽或片段可以是溶液中游離的，固定在固相載體上的，細胞表面攜帶的，位于胞內的。一種藥物篩選方法利用真核或原核宿主細胞，它被表達EG-VEGF多肽或片段的重組核酸穩定地轉化。在競爭性結合測定中篩選這種轉化細胞的藥物。這些細胞(以活的或固定形式)可用于標準結合試驗。可以測定例如EG-VEGF多肽或片段與測試的試劑之間復合物的形成。另外，可檢測EG-VEGF多肽與其靶細胞或靶受體之間由測試的試劑導致的復合物形成的減少。
因此，本發明提供了篩選藥物或任何其它能影響EG-VEGF多肽有關疾病或障礙的試劑。這些方法包括將所述試劑與EG-VEGF多肽或其片段接觸，并用本領域熟知的方法檢測(I)試劑與EG-VEGF多肽或片段之間復合物的存在，或(ii)EG-VEGF多肽或片段與細胞之間復合物的存在。在該競爭性結合測定中，通常標記EG-VEGF多肽或片段。在合適溫育后，將游離的EG-VEGF多肽或片段與以結合形式存在的分開，游離或未復合標記的量是特定試劑與EG-VEGF多肽結合，或影響EG-VEGF多肽/細胞復合物能力的量度。
藥物篩選的另一種技術提供了具有對多肽合適的結合親和力的化合物的高通量篩選，在1984年9月13日出版的WO84/03564中詳述。簡單地說，在固相底物上，例如塑料針或一些其它表面上合成大量不同的小肽測試化合物。如應用于EG-VEGF多肽那樣，肽測試化合物與EG-VEGF多肽反應并洗滌。用本領域熟知的方法檢測結合的EG-VEGF多肽。還可直接在平板上包涂純化的EG-VEGF多肽，用于上述藥物篩選技術。另外，可用未中和的抗體捕獲肽并將其固定在固相載體上。
本發明還考慮藥物篩選試驗的用途，其中能結合EG-VEGF多肽的中和性抗體與測試化合物特異性競爭與EG-VEGF多肽或其片段結合。這樣法，可用抗體檢測與EG-VEGF多肽共有一個或多個抗原性定簇的任何肽的存在。
本發明還提供了篩選能調節EG-VEGF活性的生物活性劑的方法。在這些方法中，在EG-VEGF樣品中加入候選生物活性劑，確定是否在EG-VEGF導致的生物活性中有所改變。這些改變可能是EG-VEGF刺激細胞增殖，誘導趨化性，刺激血管生成，誘導細胞分化或磷酸化ERK1和ERK2的能力。
實施例10合理的藥物設計合理的藥物設計的目標是產生感興趣的生物活性多肽(例如EG-VEGF多肽)，或與其相互作用的小分子(例如激動劑、拮抗劑或抑制劑)的結構類似物。可用這些例子的任何一個制備藥物，這些藥物是EG-VEGF多肽的更活躍或更穩定形式，或增強或影響EG-VEGF多肽體內功能(參見Hodgson，Bio/Technology，919-21(1991))。
在一種方法中，通過x光晶體照像術，計算機建模，或更典型的，通過這兩種方法的組合確定EG-VEGF多肽或EG-VEGF多肽-抑制劑復合物的三維結構。必須確定EG-VEGF多肽的形狀和電荷，以闡明結構并確定分子的活性位點。較少見的，可通過基于同源蛋白結構建模獲得與EG-VEGF多肽的結構有關的有用信息。在這兩種情況下，用相關結構信息設計同源EG-VEGF多肽樣分子，或鑒定有效抑制劑。合理的藥物設計的有用例子可包括如Braxton和Wells，Biochemistry，317796-7801(1992)所述的具有改善的活性或穩定性的分子，或如Athauda等，J.Biochem.，113742-746(1993)所述作為天然肽的抑制劑、激動劑或拮抗劑的分子。
還可以如上所述分離用功能性試驗篩選的靶特異性抗體，然后分辨其晶體結構。該方法原則上產生藥物核心，隨后可以藥物設計為根據。可通過產生對功能性藥物活性抗體的抗-獨特型抗體(抗-id)來繞過蛋白質晶體照像術。作為鏡像的鏡像，抗-id的結合位點預期是原始受體的類似物。然后可用抗-id從化學或生物學產生的肽的庫中鑒定和分離肽。然后分離的肽用于藥物核心。
根據本發明，可得到足量的EG-VEGF多肽以進行分析研究，例如X光晶體照像術。另外，本文提供的EG-VEGF多肽氨基酸序列的知識將對使用計算機建模技術代替或補充X光晶體照像術的方法提供指導。
實施例11Northern印跡分析為了闡明EG-VEGF的表達模式，用來自各種人組織的RNA進行Northern印跡分析。將人RNA印跡與基于EG-VEGF cDNA的32P-標記的DNA探針雜交。人多組織polyA+RNA陣列和人polyA+RNA多組織Northern印跡購自Clontech。其它所用的Northern印跡包括人胎RNA印跡MTN(Clontech)和人成人RNA印跡MTN-II(Clontech)。
根據本領域熟知的方法進行Northern印跡分析。例如，用30-50ng人或小鼠cDNA片段和Redi-Prime II試劑盒(Amersham)，使用32P-dCTP3000Ci/mmol(Amersham)制備cDNA探針。在Sephadex G50自旋柱(Pharmacia)上純化探針，并在68℃，在ExpressHyb雜交溶液(Stratagene)中進行雜交。在另一個例子中，在雜交緩沖液中(5XSSPE；2X DenHardt氏溶液；100mg/ml變性剪切的鮭精DNA；50％甲酰胺；2％SDS)中42℃溫育印跡和探針60小時。印跡在2×SSC；0.05％SDS中在室溫1小時內洗滌數次，然后在0.1×SSC；0.1％SDS中50℃洗滌30分鐘。印跡用磷酸圖像儀分析(Fuji)過夜曝光后顯影。通過與對照肌動蛋白探針雜交評估等量RNA負荷。
檢測EG-VEGFmRNA轉錄物。圖18顯示在幾個獨立實驗中，按照強度下降的順序，在卵巢、睪丸、腎上腺和胎盤中表達了1.4kb的一條mRNA。在任何其它組織中沒有檢測到表達，除了在前列腺中長時間接觸后有非常弱的信號(圖18)。通過在人多組織列陣中原位雜交獲得類似發現(數據未顯示)。這些發現表明產類固醇內分泌腺是EG-VEGF mRNA表達的主要位點。
實施例12原位配體結合為了鑒定表達EG-VEGF的細胞類型，用一系列來自人和其它靈長類動物的睪丸和卵巢標本進行原位雜交研究。進行了幾組實驗，一組用熒光，一組用標記的探針。
在第一組實驗中，將包埋在OCT中的未固定的新鮮組織切成10微米，儲藏在-20℃4天不用干燥劑。所有步驟在室溫進行，除了固定在4℃進行。切片在35mM乙酸(pH3.5)、3mM CaCl2、3mM MgSO4、5mM KCl、1M NaCl中溫育4分鐘。用加了陽離子緩沖液(25mM Hepes(pH7.2)、150mM NaCl、3mM CaCl2、3mM MgSO4、5mM KCl和32mM蔗糖)的HEPES緩沖鹽洗滌載玻片3次，然后用HBS-C的蛋白酶抑制劑(Boehringer Manneheim)中的1.5％小鼠血清封閉20分鐘。用來自VectorLaboratories的親和素/生物素封閉試劑盒進一步封閉。最初實驗使用從成年大鼠制備的肝臟、腎上腺和卵巢。如下所述，分析了其它組織。這些切片與配體(0-1.5nM EG-VEGF-Fc)溫育60分鐘。用過量EG-VEGF-his標記的蛋白質實現替換。用HBS-C和0.1％BSA洗滌切片3次，并在4％多聚甲醛中固定10分鐘。在切片中加入1∶4000稀釋的二抗、生物素化的山羊抗人Fc(jackson Laboratories)和HBS-C中的1.5％小鼠血清30分鐘。洗滌后，切片再在多聚甲醛中固定10分鐘。用TBS(100mM Tris-HCl(pH8.0)、150mMNaCl)洗滌載玻片兩次，然后用3％H2O2的TBS處理10分鐘。在用TBS洗滌后，切片與Dupond TSA試劑盒組分HRP-鏈霉親和素以1∶1000，和生物素化的酪酰胺以1∶50在擴增稀釋劑中反應。最后，FITC-偶聯的鏈霉親和素(DAKO)(在TBS中1∶1000稀釋)反應30分鐘。在含有0.05％Tween-20的TBS中充分洗滌后，用Vectashield封固劑涂用蓋玻片。用熒光顯微鏡的FITC通道獲得圖像。在一些情況下，使用DAPI(例如Molecular Probes)，一種核酸染料。可用汞弧燈或用氬離子激光的紫外線激發DAPI。另外，根據先前所述的標準方法使用蘇木精-曙紅染色，以顯示表達的組織結構。
在黑猩猩和猴卵巢中，最強的信號在粒層細胞上，尤其是在原代濾泡中最靠近卵母細胞的細胞。較弱的信號存在于原始濾泡和卵丘中的粒層細胞上。顯著信號存在于卵巢皮質中，尤其在小、內卷的黃體周圍(鼯猴樣品)和卵巢的血管極的不好確定的細胞簇中，結果如圖5A-F所示(全部在55微米)。圖5A顯示蘇木精-曙紅染色，圖5B顯示2歲的黑猩猩卵巢中用FITC的EG-VEGF表達。圖5C顯示蘇木精-曙紅染色，圖5D顯示在鼯猴卵巢中用FITC的EG-VEGF表達。圖5E顯示蘇木精-曙紅染色，圖5F顯示在黑猩猩卵巢基質中用FITC的EG-VEGF表達。
在人卵巢中，在皮質基質(cortical stroma)中有擴散中等表達。在圍繞紅體的外膜中信號強烈。另外，在黃體中有中等集中的陽性信號。結果如圖6A-D所示。圖6A顯示蘇木精-曙紅染色，圖6B顯示用FITC的EG-ECGF表達(25微米)。圖6C顯示蘇木精-曙紅染色，圖6D顯示用FITC的EG-ECGF表達(115微米)。
還對具有子宮脫垂的46歲婦女的卵巢進行了原位雜交研究。在此，用先前所述的標準技術放射性標記EG-VEGF。圖7A顯示了顯示EG-VEGF表達的放射自顯影圖。圖7B顯示同一卵巢的蘇木精-曙紅染色。
另外，還對大鼠腎上腺皮質組織切片進行了原位雜交研究。圖8A和8B顯示用DAPI鑒定EG-VEGF核酸，圖8C和8D顯示用FITC鑒定EG-VEGF蛋白質。
另外，在下列組織中發現了陽性原位雜交結果卵巢癌，乳頭狀漿液；卵巢，正常皮質；卵巢囊腫，簡單囊腫；睪丸，慢性炎癥；正常卵巢；卵巢腫瘤，乳頭狀漿液；腎上腺腺瘤和正常睪丸。在第二組實驗中，根據本領域已知方法產生33P-UTP標記的RNA探針。例如，根據Melton，D.A.等，Nucleic Acids Res.，127035-7056(1984)所述的方法。從對應于人EG-VEGF序列的核苷酸219-958的cDNA片段合成有義和反義探針。根據本領域已知的方法進行原位雜交。圖9顯示這組實驗的結果。A、C、E、G、I、K、M和O欄是亮視野圖像，B、D、F、H、J、L、N和P是對應的暗視野圖像。箭頭表明血管的位置。
在睪丸中，檢測到強雜交信號(圖9，欄A-E)。圖9，欄A-E顯示該信號限于產睪酮Leydig細胞。值得注意的是睪丸內皮具有驚人的高周轉率高達3％的內皮細胞被BrdU標記，可能與精子發生和類固醇發生的強代謝活性有關[Collin和Bergh，Tnt.J.Androl.，19221-228(1996)]。關于這一點，已知Leydig細胞是血管生成的來源和滲透性增強因子，例如VEGF[Collin，見上]。感興趣的是，在這些實驗中VEGF雜交信號比EG-VEGF信號弱得多(數據未顯示)。在卵巢中，強EG-VEGF mRNA表達定位在產雄激素的皮質基質、卵丘，形成卵泡的膜和粒層中(圖9，欄F-P)。膜內EG-VEGF mRNA的強表達與濾泡發育和類固醇激素產生有關的毛細管網絡的發育一致[Basset，Am.J.Anat.，73251-278(1943)]，并與EG-VEGF的前-血管源性的作用一致。該表達模式在其它檢測的靈長類物種，食蟹猴和黑猩猩中也是基本相似的(圖9，欄G-I，數據未顯示)。而VEGF在特化的基質中表達非常低[Ravindranath等，Endocrinology，131254-260(1992)]，EG-VEGF表達非常強(圖9，欄F，G)。有趣的是，這些基質在多囊性卵巢綜合征中，變成強的增生的和血管源性的，產生過量雄激素[Goldziher和Green，J.Clin.Endocrino.Meta.，22325-332(1962)]。在卵丘中，EG-VEGF的表達模式(圖9，欄N-P)與VEGF非常相似[Ravindranath等，見上；Philips等，Endocrinology，127965-967(1990)]。在黃體(CL)中，EG-VEGF表達定位于細胞的分離的巢中(數據未顯示)。而EG-VEGF在卵巢基質和發育的卵泡內高度表達(圖9，欄D-I，數據未顯示)，VEGF以最高水平在CL中表達[Ravindranath等，見上]。在嚙齒動物[Ferrara等，Nat.Med.，4336-340(1998)]中，或在靈長類動物[Ryan等，Toxicol.Pathol.，2778-86(1999)；Fraser等，Endocrinology，141995-1000(2000)]中VEGF的滅活導致CL發育的劇烈抑制。然而卵泡發育幾乎不受損的進行(未出版的觀察結果)，表明其它因子對卵泡血管生成有作用。似乎EG-VEGF對該VEGF-依賴性血管生成有作用。因此，VEGF和EG-VEGF的部分互補表達模式表明這些分子可以協同或互補的方式起作用，以促進卵巢中和可能其它共表達這些因子的組織中的血管生成。
實施例13125I EG-VEGF細胞結合試驗用EG-VEGF進行125I配體結合研究，以確定受體在各種細胞類型上的分布。在一種情況下，用Pierce的碘珠制備物，用0.5μmCi125I標記EG-VEGF標記的蛋白質，500克。在C18 Sep Pak上，在50％乙腈、0.1％TFA中純化標記的蛋白質。在第二組實驗中，用乳糖過氧化物酶方法，用Na125I(Amersham)碘化EG-VEGF，隨后用反相層析，使用預充填的SynChropak RP HPLC C4柱(Micra Scientific，Inc.)純化標記的蛋白質。分子的比活力為49-70Ci/g。對各種細胞類型，包括Cos細胞進行競爭性結合測定。在24孔皿中培養細胞2-3天，然后結合。
在一組實驗中，用0.2-0.4nM標記的配體和未標記的EG-VEGF-his作為競爭劑進行試驗。試驗中使用的未標記EG-VEGF-his的最高濃度是270mM，對于下面10種濃度的競爭劑使用3倍稀釋系列。還用bFGF和VEGF作為競爭劑(約500倍摩爾過量)，配體都不置換標記的EG-VEGF-his。
在另一組實驗中，以3倍系列稀釋加入未標記、標記的EG-VEGF，從270nM開始，至少一式兩份進行12個濃度，進行競爭性測定。在其它實驗中，加入200摩爾過量的無關的配體，包括bFGF和VEGF，以確證特異性結合。用New Ligand程序分析配體結合數據。
競爭性分析揭示EG-VEGF對ACE細胞的高親和性和特異性結合，Kd為0.9-1.0nM，ED50＝10nM(圖10A、10B和10C)。類似的高親和結合在MS-1細胞中被得到證明(圖11A和B)。然而，其它非反應性細胞，包括HUVEC，顯示低親和結合成分(Kd＞80nM)或幾乎不顯著的結合，明顯的非特異性、低親和結合僅在高于270nM的競爭劑濃度被置換(圖11C，數據未顯示)。類似的，試驗的5種其它非反應性細胞類型不顯示高親和結合成分。蛋白質交聯實驗和膜蛋白磷酸化分析表明，EG-VEGF受體成分限于特異性EG-VEGF反應性細胞(數據未顯示)。
實施例14細胞增殖試驗為了確定響應EG-VEGF的細胞類型的范圍，分析了一組內皮和非內皮細胞類型的增殖性應答。細胞在一系列濃度的Fc-標記和His-標記的EG-VEGF配體的存在下生長5-8天。試驗的細胞類型包括牛腎上腺皮質毛細內皮細胞(ACE)、牛腦毛細內皮細胞(BBC)、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、人皮膚微血管內皮細胞(HMVEC)、成年牛主動脈內皮細胞(ABAE)、牛周細胞、人主動脈血管平滑肌細胞(HA-VSMC)、幼倉鼠腎成纖維細胞(BHK-21)和人新生兒成纖維細胞hFb。細胞以4000-6000細胞/毫升的密度鋪在6或12孔平皿中。在鋪板時，在孔中不加入配體，加入5ng/mlbFGF(GIBCO BRL)、5ng/mlVEGF或一定范圍的從1nM-100nM的EG-VEGF-Fc或-His標記的蛋白質。對于各細胞類型鋪一式兩份或三份樣品。每天監測匯合和形態。在試驗第5-7天，在0.01％胰蛋白酶(Gibco BRL)中胰蛋白酶消化細胞，用Coulter計數器評估細胞數目。培養基和其它細胞培養試劑是從Life Technologies，Inc.獲得的。從Clonetics購得HUVEC、HMVEC和人角化細胞。牛周細胞和人新生兒成纖維細胞是M.Gerritsen的禮物。對于試驗的性能，另見Aravind和Koonin，Curr.Biol.8477-478(1998)。
圖12A-E中顯示幾個初步結果，它們在縱軸上顯示細胞/孔。各組表示用對照、bFGF、VEGF或EG-VEGF以1nM、10nM或25nM的濃度細胞的相對增殖。圖12A顯示使用周細胞的結果。圖12B顯示用人主動脈血管平滑肌細胞(HA-VSMC)的結果。圖12C顯示用幼倉鼠腎成纖維細胞(BHK21)的結果。圖12D顯示使用ACE的結果。圖12E顯示使用牛腦毛細內皮細胞(BBC)的結果。
在實驗中獲得相似結果，如圖13所示。在這些實驗中，基礎培養基作為陰性對照(Ct)，bFGF(F)或VEGF(V)作為陽性對照。以各種濃度測試EG-VEGF。如欄a中所示，EG-VEGF刺激的ACE細胞增殖的ED50是0.2nM。在約2nM觀察到最大效果。細胞數中的倍數增加與VEGF誘導的非常相似。桿狀病毒產生的his-和Fc-標記的EG-VEGF蛋白質在所有實驗中表現非常相似。與促分裂功能一致，EG-VEGF在ACE細胞中誘導迅速和顯著的MAP激酶ERK1和2的磷酸化，以及其它增殖和存活的信號分子。施用在50-1000ng/ml濃度范圍內測試的VEGF可溶性受體(mFlt-IgG)不封閉EG-VEGF的促分裂活性，表明這種作用不是由VEGF釋放介導的。這些發現明顯不排除在更復雜的體內系統中有相互誘導作用的可能性。
為了確定響應EG-VEGF增殖的細胞類型的范圍，我們測試了各種其它內皮和非內皮細胞類型。測試的內皮細胞類型包括人臍靜脈(HUVEC)、人皮膚微血管(HMVEC)、牛大腦毛細血管(BBC)和成年牛主動脈(ABAE)內皮細胞。
如圖13欄b所見，BBC細胞僅顯示用VEGF所見的增殖反應的約10％，而其它內皮細胞類型在施用EG-VEGF后在所有測試的濃度不顯示任何作用。因此，相信EG-VEGF是具有限制的靶細胞特異性的內皮細胞促分裂原的第一個例子。其它內皮細胞促分裂原，例如VEGF和bFGF對于各種內皮細胞類型不顯示任何顯著的選擇性[Leung等，Science，2461306-1309(1989)]。
圖13欄c顯示發現EG-VEGF在血管平滑肌細胞、周細胞、成纖維細胞或角化細胞的培養物中不引起任何增殖反應。因此，EG-VEGF不僅是內皮細胞特異性促分裂原，還選擇性的作用于限定的內皮細胞類型。
在圖13欄b和c中，縱軸上的增殖指數是相對于陰性對照，它隨意定為1。
實施例15細胞遷移(趨化性)試驗血管生成級聯的一個主要方面是趨化性[Zetter，Nature，28541-43(1980)]。VEGF或bFGF能作為化學引誘劑，刺激內皮細胞遷移。先前描述了趨化活性的試驗(鑒定誘導或防止趨化性的蛋白質)，見例如Current Protocols inImmunology，Coligan、Kruisbeek、Margulies、Shevach和Strober編，GreenePublishing Associates and Wiley-Interscience出版，6.12章6.12.1-6.1228；Taub等，J.Clin.Invest.951370-1376，1995；Lind等，APMIS 103140-146，1995；Mueller等，Eur.J.Immunol.251744-1748；Gruber等，J.Immunol.1525860-5867，1994；Johnson等，J.Immunol.1531762-1994。為了確定EG-VEGF的生物活性，我們評估了ACE細胞和幾種其它細胞類型在改良的Boyden室實試中是否對該分子顯示趨化性應答。
具體地說，ACE細胞、狒狒腎上腺內皮細胞(BAEC)、MS-1細胞和HUVEC用于遷移試驗。MS-1細胞系來自ATCC。原代狒狒內皮細胞是從早熟的或胎兒狒狒的腎上腺中分離的(R.Clyman，UCSF的贈品)。基本按Mesiano等，J.Clin.Endocrinol.Metab.76968-976，1993中所述解離組織。簡單地說，除去若膜，將剩余的組織用無菌刀片切成約2mm3見方的片段。片段隨后在37℃在0.1％膠原酶(Sigma)的5050 Ham氏F10DMEM培養基，10％FCS，加入DNase I(Life Technologies Inc.)中溫育30-40分鐘。洗滌單細胞懸液，重懸浮在含5％FCS的PBS中，與1克抗KDR的單克隆抗體一起溫育107個細胞，洗滌，然后與異硫氰酸熒光素(Sigma)偶聯的山羊-抗小鼠抗體一起溫育。用EPICS ELITE細胞分揀儀(Coulter Corporation)分揀出KDR-陽性與陰性群。內皮細胞群維持在含有10％血清和生長因子(CellSystems，Kirkland，WA)的CSC-培養基中。用1％明膠包涂Falcon 8.0m濾膜插入物(Falcon 3097)。在如上所述試驗前培養細胞。用胰蛋白酶消化細胞，轉移到含有0.1％BSA的EBM(內皮基礎培養基，Clonetics)中用于試驗。細胞以1-5×104/上部室鋪板，將生長因子鋪在下部室中。試驗是在37℃常規進行16小時。完成時，從膜的上面一側用聚氨基甲酸乙酯拭子刮，除去細胞，然后用甲醇將固定膜底部上剩余的細胞。用碘化丙錠染色細胞，并在低電源下用Image-Pro程序計數。圖14A、14B和圖13欄d的y軸代表遷移指數，相對于陰性對照，任意定為1。
圖14A和14B顯示最初結果。各圖顯示在對照中，VEGF存在下，或EG-VEGF存在下，在0.2nM、0.5nM、1nM或5nM濃度下的相對內皮細胞遷移。圖14B顯示使用ACE的結果。
這些觀察由圖13欄d所示的進一步實驗的結果加強。ACE培養物中引發了強和可復制的趨化應答，在0.5nM EG-VEGF有峰應答。效果的數量級與VEGF誘導的相似。為了將我們的結果延伸到其它原代細胞類型，我們通過熒光活化的細胞分揀，用識別VEGF受體-2或KDR的單克隆抗體從狒狒腎上腺皮質(BAEC)純化了內皮細胞。在BAEC培養物中，0.5-5nM EG-VEGF誘導與VEGF誘導的相同數量級的趨化應答。另外，EG-VEGF在MS-1內皮細胞中誘導比VEGF程度大的遷移。從鼠內分泌胰臟的微血管分離的MS-1細胞系，維持高分化性質，例如VEGF受體表達[Arbiser等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94861-866(1997)]。然而，從HUVEC引發沒有應答，即使這些細胞顯示對VEGF有強的應答。因此，除了其促分裂活性，EG-VEGF也作為化學引誘劑，但僅對特定的內皮細胞類型。
這些發現完全符合實施例13中所述的結合研究，揭示碘化的EG-VEGF在可與膜蛋白交聯的ACE細胞中顯示高親和性、特異性結合。然而在非反應性細胞，例如HUVEC中未檢測到高親和結合。
實施例16磷酸化分析根據本領域已知的方法進行磷酸化分析。簡單地說，在0.1％FCS中14-16小時，然后在0.05％BSA中再過90分鐘除去腎上腺皮質衍生的毛細血管內皮(ACE)細胞中的血清。然后用2.5mM VEGF(誘導最大應答)或20nM EG-VEGF處理細胞，在含有0.1mM的原釩酸鈉的冰冷的PBS中洗滌一次。細胞在含有0.1mM原釩酸鈉、5mM對硝基苯酯磷酸鹽、10mM氟化鈉、0.5mM黑海綿酸和蛋白酶抑制劑混合物(Roche MB1836145)的0.5ml RIPA緩沖液中裂解細胞。從Promega購得抗磷酸ERK抗血清。
與促分裂功能一致，EG-VEGF在ACE細胞中誘導MAP激酶ERK1和ERK2(圖15)，以及其它增殖和存活信號分子(數據未顯示)的迅速和顯著的磷酸化。具體說，圖15顯示20nM EG-VEGF誘導ERK1和2的顯著和迅速磷酸化。無因子(Ct)和VEGF(V)刺激5分鐘作為對照，在泳道上方表明了EG-VEGF刺激的時間過程。在下面的免疫印跡中顯示總ERK1和2水平。另外，施用在50-1000ng/ml的濃度范圍內測試的VEGF可溶性受體(mFlt-IgG)不封閉EG-VEGF的促分裂活性，表明這種作用不是由VEGF釋放介導的。
實施例17開窗試驗腎上腺皮質內的內皮細胞顯示在也包括其它內分泌腺(脈絡叢、胃腸道和許多腫瘤)的限制位點發現的非常獨特的開窗表型[Simionescu，見上]。開窗是特定的原生質膜微結構域或窗，直徑約60nm，通常成簇[Palade等，Acta Physiol.Scand.Suppl.，46311-32(1979)]。窗孔對于液體和小溶質是高度可滲透的，被認為促進物質在間質液和血漿之間大量交換，例如在類固醇產生和其它內分泌腺，例如胰島中發生的。我們測試了EG-VEGF單獨還是與VEGF聯合誘導內皮細胞中的開窗。
根據本領域已知的方法，特別是如Gospodarowicz等，J.CellBiol.99947-961，1984中所述制備了ECM。簡單地說，從小鼠牛眼(Pel Freez，Arkansas)分離角膜內皮細胞，將其在補充有15％FCS、青霉素/鏈霉素、兩性霉素B的50∶50 Ham氏F10∶DMEM培養基中擴增。為了制備ECM包涂的平板，在6孔板的每孔中鋪4×104個細胞，在補充有10％FCS、2.5％葡聚糖(Sigma 4133)和青霉素/鏈霉素的低葡萄糖DMEM中培養約10天。在10天結束時，在0.02M NH4OH的水溶液中快速裂解細胞，用PBS漂洗幾次，4℃儲藏在含抗生素的PBS中。以1-2×105密度鋪ACE或MS-1細胞，并生長到匯合。在各孔中至少一式兩份，不加入，加入2.5nM VEGF、10nM EG-VEGF、或2.5nM VEGF加10nM EG-VEGF。開窗試驗重復3次。用PBS漂洗細胞，并用2％甲酰胺、2.5％戊二醛在0.1M二甲次胂酸鹽緩沖液固定2小時。洗滌后，在1％鋨水溶液中后固定樣品2小時，用水洗滌，通過梯度乙醇和氧化丙烯脫水，并包埋在EPONATE 12(Ted Pella，Inc.，Redding CA)中。在Reichert Ultracut E切片機上切超薄切片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛反染色，在Philips CM12透射電子顯微鏡下，以80kV監測，并用GATAN收縮式多掃描數碼照相機捕獲圖像。對于各樣品至少檢測100個細胞圖案。
圖13顯示這些實驗的代表性電鏡照片。欄e顯示未處理的ACE細胞。圖13欄f顯示用VEGF處理的ACE細胞。圖13欄g顯示用EG-VEGF處理的ACE細胞。箭頭表明窗口的位置，表明是放大。
值得注意的是，目前僅報道過VEGF顯示在體外和體內誘導開窗的作用[Roberts和Palade，Cancer Res.，57765-772(1997)；Esser等，J.CellBiol.，140947-959(1998)]。ACE或MS-1細胞在用牛角膜內皮細胞產生的胞外基質上生長至匯合，然后用配體處理24-72小時。與先前的研究[Esser等，見上]一致，VEGF在4.33±1.53％ACE細胞圖案中誘導開窗(圖13欄f)。MS-1培養物獲得了對VEGF應答的類似數量的開窗(未顯示)。EG-VEGF的作用在兩種細胞類型中與VEGF的非常相似(圖13，欄g為ACE)。這兩種因子的組合產生疊加或協同的反應，在11±1％ACE細胞圖案中誘導窗孔。在VEGF或EG-VEGF不存在時觀察不到窗孔。該發現支持假設，即這些因子可以在體內如腎上腺皮質或卵巢的定位中協作，以誘導固有的內皮細胞的開窗表型。
實施例18EG-VEGF的缺氧調節A.EG-VEGF表達的Taqman分析缺氧是生理和病理條件中血管生成的關鍵誘因。通過激活缺氧可誘導因子(HIF)1，已知低氧張力除了促紅細胞生成素(Epo)和一些糖酵解酶以外，還通過順式作用調控元件誘導VEGF的表達[Semenza，J.Appl.Physiol.881474-1480(2000)]。因此，我們要確定缺氧是否調節內皮細胞中的EG-VEGF mRNA表達。
對于表達分析，用Rneasy試劑盒(Qiagen)如廠商所述制備正常氧處理對缺氧處理的SW13和H295R細胞(均來自ATCC)的復制匹配樣品的RNA分離物。對于實時定量性RT-PCR，一式三份用Perkin Elmer Taqman試劑盒試劑和ABI引物7700序列檢測儀分析50ng總RNA。使用的寡聚物和探針如下正向EG-VEGF PCR引物5′-CCGGCAGCCACAAGGTC-3′(SEQ ID NO9)反向EG-VEGF PCR引物5′-TGGGCAAGCAAGGACAGG-3′(SEQ ID NO10)EG-VEGF探針5′-CCTTCTTCAGGAAACGCAAGCACCAC-3′(SEQ IDNO11)正向VEGF PCR引物5′-AATGACGAGGGCCTGGAGT-3′(SEQ ID NO12)反向VEGF PCR引物5′-TTGATCCGCATAATCTGCATG-3′(SEQ ID NO13)VEGF探針5′-TGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCA-3′(SEQ ID NO14)作為陰性對照，如上所述用廠商提供的引物和探針(Perkin-Elmer)類似地進行肌動蛋白的表達分析。
圖17A欄a說明發現人腎上腺癌細胞系SW13和H295R接觸缺氧條件(約2％氧氣)導致EG-VEGF mRNA水平對于正常氧分別上升了275±15％和210±12％，而VEGF mRNA分別上升了352±30％和266±14％。對于EG-VEGF啟動子序列檢索核心HIF-1結合位點，根據共有序列(5′TACGTGCGGC3′，黑體字代表不變的序列)揭示在轉錄起始位點的開始2450個核苷酸內具有推定的元件。
B.HRE熒光素酶活性分析為了確定EG-VEGF基因的缺氧調節是否由HIF-1介導，分析了推定的EG-VEGF元件控制下熒光素酶報道基因的表達。通過將相容的、退火的寡聚物克隆入pGL3-啟動子載體(Promega)的BglII位點，產生熒光素酶報道分子構建體
HRE_共有(Epo)有義5′-AGGCCCTACGTGCGGCCTCACACAGCCTGTTCTGA-3′(SEQ ID NO15)HRE_突變體(EPO)有義5′-AGGCCCTAATTGCGGCCTCACACAGCCTGTTCTGA-3′(SEQ ID NO16)HRE_EG-VEGF有義5′-GCTAAGGACGTGCTATTCATGGGGTGCAGGAAGAT-3′(SEQ ID NO17)HRE_EG-VEGF突變有義5′-GCTAAGGAATTGCFATTCATGGGGTGCAGGAAGAT-3′(SEQ ID NO18)在6孔板中用Effectene轉染試劑(Qiagen)將熒光素酶報道分子構建體瞬時轉染入HeLa細胞。對每孔，0.75g報道分子與0.25g pRL-SV40對照質體一起轉染。在平行的正常氧對缺氧培養中使用一式三份的成對轉染，在轉染后24小時開始板接觸缺氧18-24小時。裂解細胞，用雙熒光素酶報道分子試驗系統(Promega)分析細胞。熒光素酶活性標定到對照載體值，圖17B中顯示代表性實驗，誤差條代表標準偏差。
缺氧條件培養18-24小時后，含有推定的EG-VEGF元件的熒光素酶報道分子構建體賦予正常氧條件3.3±0.8倍增加。該水平與缺氧反應性元件(HRE)Epo共有序列賦予的相當，3.4±1.2倍(圖17，b欄)。使共有或推定的EG-VEGF HRE核心序列突變取消對缺氧的反應，證實該反應的特異性。雖然我們不能排除其它機制，但是這些發現表明多半HIF-1是EG-VEGF基因的缺氧調節的關鍵介體。
因此，驚人的是盡管缺乏序列同源性，EG-VEGF和VEGF基因不僅在反應性內皮細胞中具有相似的作用，例如缺氧可誘導的表達，而且還可能通過共同的機制調節。
實施例19肝素結合試驗血管生成因子，包括bFGF和VEGF與胞外基質成分，例如硫酸肝素蛋白聚糖相互作用。提示血管生成因子與胞外基質成分之間的相互作用能調節這些分子的生物利用度和活性(Klagsburn，Semin Cancer Biol.381-7(1992))。因此，我們測試了EG-VEGF是否與肝素結合。
在Hi-Trap肝素-瓊脂糖凝膠柱(Pharmacia)的10mM Tris，pH7.4，0.1M NaCl中加入15g未標記的蛋白質。用NaCl(0.1-2.0M)的線性梯度洗脫柱。用人VEGF165作為參比。
當用于肝素瓊脂糖凝膠柱時，EG-VEGF在0.5M NaCl存在下洗脫，而相同層析條件下VEGF165在0.7M NaCl下洗脫。該發現表明EG-VEGF是肝素結合生長因子，可在體內的胞外區室中分離。
實施例20體內血管生成作用的選擇性A.大鼠角膜袋血管生成試驗用成年大鼠角膜袋試驗檢測EG-VEGF的體內活性，如前所述(Gille等，J.Biol.Chem.2763222-3230(2001))。將含有200ng VEGF165或500ng EG-VEGF，加上甲基纖維素和硫糖鋁的Hydron包涂的沉淀被插入角膜袋的基底中(n＝6)。對照沉淀含有500ng CD4-IgG。在第6天，使動物安樂死并注射高分子量FITC-葡聚糖，使脈管系統可見。用計算機輔助影像分析(Image-Pro Plus)進行完整角膜中新生血管面積的測量。
在大鼠角膜試驗中，純化的EG-VEGF在所有測試的眼睛中不顯示顯著的應答，而VEGF誘導預期的血管生成效果(圖19，欄a-c)。用兔角膜觀察到類似的結果。注意到VEGF蛋白質誘導強血管生成反應，而EG-VEGF基本無作用。
B.EG-VEGF定點腺病毒注射的血管生成作用為了進一步研究EG-VEGF的體內活性，檢測了局部和持續形式的EG-VEGF傳遞作用。為了實現局部和持續方式的EG-VEGF傳遞，產生腺病毒(Av)載體，注射入無胸腺裸大鼠或小鼠的各個位點。表達LacZ或VEGF的重組Av載體作為對照。
用異氟烷麻醉無胸腺裸大鼠，在背部左側切開2-2.5cm。提起卵巢，用無創傷鉗固定。通過裝有31G針的氣密性Hamilton針筒(Hamilton)注射108或5×108pfu的5-10升鹽水的劑量。所有工作在具有BSL2實驗操作的生物安全箱中進行。對于骨骼肌(左腓腸肌)或皮下耳部注射，用異氟烷麻醉無胸腺裸小鼠或大鼠，清潔部位，在各位點注射劑量為各病毒制備物5×108pfu的50升體積。在所有Av研究中的動物在Av施用一周后安樂死。在尸體剖檢時，切下組織并冷凍或固定，用于組織學分析。
當在裸大鼠的骨骼肌中注射時，lacZ和EG-VEGF AV的作用基本不可分辨，有極少的炎癥滲出液，不存在血管生成，具有大量的促分裂內皮細胞、水腫和肉芽組織(圖19，欄d-f)。在小鼠耳朵中注射相同的Av載體后獲得非常類似的結果(圖19，欄g和h)。另外，VEGF Av導致強的血管生成反應，不存在于注射EG-VEGFAv的動物中。然而，EG-VEGF或VEGF Av的卵巢內傳遞在一周內導致注射的卵巢劇烈增大，具有明顯可見的血管和出血區域(圖19，欄i)。在裸大鼠的代表性實驗中，卵巢濕重在LacZ組中是33±3mg，在EG-VEGF組中是489±30mg，在VEGF組是191±91(n＝4)。未注射卵巢(37±7mg)的重量與LacZ組沒有不同。雖然與VEGF比較在EG-VEGF中有質量較大的趨勢，組織學照片非常相似。在兩種情況下，存在破壞卵巢結構的充滿液體或血液的大囊腫區域(圖19，欄j-n)。高倍檢測揭示囊腫的周圍有強血管生成(圖19，欄m-n)。LacZ卵巢的形態是正常的。因此，VEGF和EG-VEGF能觸發反應性組織中相同系列的事件，包括誘導除了血管生成外液體外滲的能力。
材料保藏下列材料被保藏在美國典型培養物保藏中心，10801 University Blvd.，Manassas，VA20110-2209，USA(ATCC)
該保藏是根據關于微生物保藏國際認可的布達佩斯條約的規定，為了依據專利程序和細則(布達佩斯條約)的目的而作出的。這確保將活的保藏培養物自其保藏之日起維持30年。保藏物可從ATCC根據布達佩斯條約獲得，并服從GenentechInc.和ATCC的協議，根據相應的美國專利授權后，或任何美國或外國專利申請公開后，確保保藏培養物的子代對于公眾是永久和無限制可得到的。這些申請或專利不論先后，確保子代對于美國專利和商標官員根據35 USC 122和依據官員規則(包括37CFR 1.14，特別根據886 OG 638)決定是可得到的。
本申請的受讓人同意，如果在合適條件下培養時保藏的材料的培養物會死亡、丟失或破壞，材料將在收到通知后立即用相同的替換。保藏的材料的可得性不被視為允許在違反任何政府根據其專利法所授權利實施本發明的許可。
上述說明書被認為足夠使本領域技術人員實施本發明。本發明不限于保藏的構建體的范圍，因為保藏的實施例僅說明本發明的一個方面，任何功能上等價的構建體在本發明的范圍內。本文中材料的保藏并不是承認本文所含的書面描述不足以實施本發明的任何方面，包括其最佳模式，也不是認為限制權利要求對其代表的特定描述的范圍。事實上，除了本文所示和描述的，本發明的各種修改對于本領域技術人員來說，根據上面的描述是清楚的，并且在權利要求的范圍內。
序列表<110>基因技術公司(Genentech，Inc.)<120>EV-VEGF核酸和多肽及其使用方法<130>GENENT.1516QPC<150>60/130,978<151>2000-09-07<150>60/213,637<151>2000-06-23<150>PCT/US00/32678<151>2000-12-01<150>PCT/US00/08439<151>2000-03-30<150>PCT/US00/04914<151>2000-02-24<150>PCT/US00/00219<151>2000-01-02<160>18<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1415<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><400>1tggcctcccc agcttgccag gcacaaggct gagcgggagg aagcgagagg catctaagca 60ggcagtgttt tgccttcacc ccaagtgacc atgagaggtg ccacgcgagt ctcaatcatg 120ctcctcctag taactgtgtc tgactgtgct gtgatcacag gggcctgtga gcgggatgtc 180cagtgtgggg caggcacctg ctgtgccatc agcctgtggc ttcgagggct gcggatgtgc 240accccgctgg ggcgggaagg cgaggagtgc caccccggca gccacaaggt ccccttcttc 300aggaaacgca agcaccacac ctgtccttgc ttgcccaacc tgctgtgctc caggttcccg 360gacggcaggt accgctgctc catggacttg aagaacatca atttttaggc gcttgcctgg 420tctcaggata cccaccatcc ttttcctgag cacagcctgg atttttattt ctgccatgaa 480acccagctcc catgactctc ccagtcccta cactgactac cctgatctct cttgtctagt 540acgcacatat gcacacaggc agacatacct cccatcatga catggtcccc aggctggcct 600gaggatgtca cagcttgagg ctgtggtgtg aaaggtggcc agcctggttc tcttccctgc 660tcaggctgcc agagaggtgg taaatggcag aaaggacatt ccccctcccc tccccaggtg 720acctgctctc tttcctgggc cctgcccctc tccccacatg tatccctcgg tctgaattag 780acattcctgg gcacaggctc ttgggtgcat tgctcagagt cccaggtcct ggcctgaccc 840tcaggccctt cacgtgaggt ctgtgaggac caatttgtgg gtagttcatc ttccctcgat 900tggttaactc cttagtttca gaccacagac tcaagattgg ctcttcccag agggcagcag 960acagtcaccc caaggcaggt gtagggagcc cagggaggcc aatcagcccc ctgaagactc 1020tggtcccagt cagcctgtgg cttgtggcct gtgacctgtg accttctgcc agaattgtca 1080tgcctctgag gccccctctt accacacttt accagttaac cactgaagcc cccaattccc 1140acagcttttc cattaaaatg caaatggtgg tggttcaatc taatctgata ttgacatatt 1200agaaggcaat tagggtgttt ccttaaacaa ctcctttcca aggatcagcc ctgagagcag 1260gttggtgact ttgaggaggg cagtcctctg tccagattgg ggtgggagca agggacaggg 1320agcagggcag gggctgaaag gggcactgat tcagaccagg gaggcaacta cacaccaaca 1380tgctggcttt agaataaaag caccaactga aaaaa1415<210>2<211>105<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><400>2Met Arg Gly Ala Thr Arg Val Ser Ile Met Leu Leu Leu Val Thr Val1 5 10 15Ser Asp Cys Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys20 25 30Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg35 40 45Met Cys Thr Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser50 55 60His Lys Val Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His His Thr Cys Pro Cys65 70 75 80Leu Pro Asn Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys85 90 95Ser Met Asp Leu Lys Asn Ile Asn Phe100 105<210>3<211>374<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>unsure<222>(0)...(0)<223>n＝A，T，C或G<400>3tggctcccca gcttgccagg cacaaggctg agctggagga agcgagangc atctaagcag 60gcagtgtttt gccttcaccc caagtgacca tgagaggtgc cacgcgagtc tcaatcatgc 120tcctcctagt aactgtgtct gactgtgctg tgatcacagg ggcctgtgag cgggatgtcc 180agtgtggggc aggcacctgc tgtgccatca gcctgtggct tcgagggctg cggatgtgca 240ccccgctggg gcgggaaggc gaggagtgcc accccggcag ccacaaggtc cccttcttca 300ggaaacgcaa gcaccacacc tgtcttgttg cccaacctgc tgtgctccag ttccggacgg 360cagtacgctg ctca 374<210>4<211>100<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Pro Arg Ala1 5 10 15Gly Asp Ala Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Asp Lys Asp Ser Gln Cys20 25 30Gly Gly Gly Met Cys Cys Ala Val Ser Ile Trp Val Lys Ser Ile Arg35 40 45Ile Cys Thr Pro Met Gly Lys Leu Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr50 55 60Arg Lys Val Pro Phe Phe Gly Arg Arg Met His His Thr Cys Pro Cys65 70 75 80Leu Pro Gly Leu Ala Cys Leu Arg Thr Ser Phe Asn Arg Phe Ile Cys85 90 95Leu Ala Gln Lys100<210>5<211>79<212>PRT<213>蛇<400>5Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Leu Gln Cys Gly Lys Gly1 5 10 15Thr Cys Cys Ala Val Ser Leu Trp Ile Lys Ser Val Arg Val Cys Thr20 25 30Pro Val Gly Thr Ser Gly Glu Asp Cys His Pro Ala Ser His Lys Ile35 40 45Pro Phe Ser Gly Gln Arg Met His His Thr Cys Pro Cys Ala Pro Asn50 55 60Leu Ala Cys Val Gly Thr Pro Lys Lys Phe Lys Cys Leu Ser Lys65 70 75<210>6<211>83<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Cys Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln1 5 10 15Arg Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Thr Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu20 25 30Leu Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu35 40 45Leu Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu50 55 60Leu Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr65 70 75 80Phe Val Gly<210>7<211>79<212>PRT<213>爪蟾(Xenopus)<400>7Cys Leu Arg Ser Thr Asp Cys Ala Pro Gly Leu Cys Cys Ala Arg His1 5 10 15Phe Trp Ser Lys Ile Cys Lys Pro Val Leu Asp Glu Gly Gln Val Cys20 25 30Thr Lys His Arg Arg Lys Gly Ser His Gly Leu Glu Ile Phe Gln Arg35 40 45Cys His Cys Gly Ala Gly Leu Ser Cys Arg Leu Gln Lys Gly Glu Phe50 55 60Thr Thr Val Pro Lys Thr Ser Arg Leu His Thr Cys Gln Arg His65 70 75<210>8<211>79<212>PRT<213>豬(Porcine)<400>8Cys Leu Asn Ser Ala Gln Cys Lys Ser Asn Cys Cys Gln His Asp Thr1 5 10 15Ile Leu Ser Leu Ser Arg Cys Ala Leu Lys Ala Arg Glu Asn Ser Glu20 25 30Cys Ser Ala Phe Thr Leu Tyr Gly Val Tyr Tyr Lys Cys Pro Cys Glu35 40 45Arg Gly Leu Thr Cys Glu Gly Asp Lys Ser Leu Val Gly Ser Ile Thr
50 55 60Asn Thr Asn Phe Gly Ile Cys His Asp Val Gly Arg Ser Ser Asp65 70 75<210>9<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列＝合成寡核苷酸<400>9ccggcagcca caaggtc 17<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列＝合成寡核苷酸<400>10tgggcaagca aggacagg18<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列＝合成寡核苷酸<400>11ccttcttcag gaaacgcaag caccgc 26<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列＝合成寡核苷酸<400>12aatgacgagg gcctggagt 19<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列＝合成寡核苷酸<400>13ttgatccgca taatctgcat g21<210>14<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列＝合成寡核苷酸<400>14tgtgcccact gaggagtcca acatca 26<210>15<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列＝合成寡核苷酸<400>15aggccctacg tgcggcctca cacagcctgt tctga 35<210>16<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列＝合成寡核苷酸<400>16aggccctaat tgcggcctca cacagcctgt tctga 35<210>17<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列＝合成寡核苷酸<400>17gctaaggacg tgctattcat ggggtgcagg aagat 35<210>18<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列＝合成寡核苷酸<400>18gctaaggaat tgctattcat ggggtgcagg aagat 3權利要求
1.一種組合物，其特征在于，該組合物含有(a)EG-VEGF多肽，(b)EG-VEGF多肽的激動劑，或(c)EG-VEGF多肽的拮抗劑，和藥物學上可接受的載體。
2.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述EG-VEGF多肽是天然序列EG-VEGF。
3.如權利要求2所述的組合物，其特征在于，所述天然序列EG-VEGF是人的。
4.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述激動劑或拮抗劑是抗-EG-VEGF-抗體、小分子或反義分子。
5.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，該組合物還含有血管內皮細胞生長因子(VEGF)，或其激動劑或拮抗劑。
6.一種制品，其特征在于，該制品包括容器；容器上的標簽；和裝在容器中的一種含有活性劑的組合物，其中所述活性劑選自(a)EG-VEGF多肽，(b)EG-VEGF多肽的激動劑，和(c)EG-VEGF多肽的拮抗劑；容器上的標簽表明組合物有效的治療與產激素內皮組織有關的病況。
7.如權利要求6所述的制品，其特征在于，所述病況與內分泌腺中的甾體生成的內皮細胞有關。
8.如權利要求6所述的制品，其特征在于，所述組織是卵巢、睪丸、子宮頸、腎上腺、胎盤或前列腺組織。
9.如權利要求6所述的制品，其特征在于，所述病況是不育、多囊性卵巢綜合征或癌。
10.一種鑒定與EG-VEGF結合的化合物的方法，其特征在于，該方法包括a)將候選化合物與EG-VEGF接觸；和b)確定候選化合物是否與EG-VEGF結合。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述EG-VEGF是天然序列EG-VEGF，或其氨基酸序列變體。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述氨基酸序列變體與圖2(SEQID NO2)從約1或約20-105的氨基酸殘基序列具有至少約85％的序列同一性。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述氨基酸序列變體是保守取代變體。
14.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述EG-VEGF作為融合蛋白存在。
15.如權利要求10所述的方法，其特征在于，測定所述候選化合物與已知結合EG-VEGF的分子競爭的能力。
16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述候選化合物與全細胞或表達EG-VEGF編碼序列的細胞膜部分接觸。
17.一種鑒定調節EG-VEGF生物活性的化合物的方法，其特征在于，該方法包括步驟a)使候選化合物與EG-VEGF接觸，和b)確定所述EG-VEGF的生物活性的改變。
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述化合物抑制所述EG-VEGF的生物活性。
19.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述化合物增強所述EG-VEGF的生物活性。
20.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述生物活性是誘導與細胞增殖或存活有關的激酶磷酸化的能力。
21.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述激酶是MAP激酶。
22.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述MAP激酶是ERK1或ERK2。
23.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述生物活性是細胞增殖活性、趨化性的誘導、血管生成、細胞分化的誘導或內皮細胞增殖的誘導。
24.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述候選化合物與表達EG-VEGF編碼序列的全細胞或細胞膜部分接觸。
25.如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述細胞是工程改造過，表達EG-VEGF的重組宿主細胞。
26.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述候選分子與分離的EG-VEGF接觸。
27.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述EG-VEGF固定在固相載體上。
28.一種用權利要求17-27任一所述的方法鑒定出的化合物。
29.一種鑒定EG-VEGF受體的方法，其特征在于，該方法包括將EG-VEGF和一種含有細胞膜材料的組合物混合，其中所述EG-VEGF與細胞膜材料上的受體復合，鑒定所述受體為EG-VEGF受體。
30.如權利要求42所述的方法，其特征在于，EG-VEGF與所述受體結合，所述方法還包括所述EG-VEGF與所述受體交聯的步驟。
31.一種誘導細胞增殖的方法，其特征在于，該方法包括將所述細胞與誘導所述細胞增殖的有效量的EG-VEGF接觸。
32.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述細胞是內皮細胞。
33.如權利要求32所述的方法，其特征在于，所述內皮細胞是甾體生成的內皮細胞。
34.如權利要求33所述的方法，其特征在于，該方法還包括使所述細胞與VEGF接觸。
35.一種誘導細胞增殖的方法，其特征在于，所述方法包括以誘導細胞增殖的有效量將編碼EG-VEGF的核酸引入所述細胞。
36.如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述細胞是內皮細胞。
37.如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述內皮細胞是甾體生成的內皮細胞。
38.如權利要求36所述的方法，其特征在于，該方法還包括將編碼VEGF的核酸引入所述細胞。
39.一種在細胞中誘導趨化性的方法，其特征在于，該方法包括使所述細胞以誘導趨化性的有效量與EG-VEGF接觸。
40.如權利要求39所述的方法，其特征在于，所述細胞是內皮細胞。
41.如權利要求40所述的方法，其特征在于，所述內皮細胞是甾體生成的內皮細胞。
42.如權利要求40所述的方法，其特征在于，該方法還包括使所述細胞與VEGF接觸。
43.一種在細胞中誘導趨化性的方法，其特征在于，該方法包括以誘導趨化性的有效量將編碼EG-VEGF的核酸引入所述細胞。
44.如權利要求43所述的方法，其特征在于，所述細胞是內皮細胞。
45.如權利要求44所述的方法，其特征在于，所述內皮細胞是甾體生成的內皮細胞。
46.如權利要求45所述的方法，其特征在于，該方法還包括將編碼VEGF的核酸引入所述細胞。
47.一種治療個體與產激素組織有關的病癥的方法，其特征在于，該方法包括對所述個體以有效治療所述病況的量施用含有EG-VEGF或其激動劑或拮抗劑，或編碼EG-VEGF或其激動劑或拮抗劑的核酸的組合物。
48.如權利要求47所述的方法，其特征在于，該方法還包括對所述個體施用VEGF或其激動劑或拮抗劑，或編碼VEGF或其激動劑或拮抗劑的核酸。
49.一種誘導產激素組織中血管生成的方法，其特征在于，該方法包括所述組織與EG-VEGF或其激動劑接觸，或在所述組織中以誘導血管生成的有效量引入編碼EG-VEGF或其激動劑的核酸。
50.如權利要求49所述的方法，其特征在于，該方法還包括使所述組織與VEGF或其激動劑接觸，或在所述細胞中引入編碼VEGF或其激動劑的核酸。
51.一種誘導細胞中細胞分化的方法，其特征在于，該方法包括使所述細胞與EG-VEGF或其激動劑接觸，或在所述細胞中以誘導細胞分化的有效量引入編碼EG-VEGF或其激動劑的核酸。
52.如權利要求51所述的方法，其特征在于，該方法還包括使所述細胞與VEGF或其激動劑接觸。
53.一種誘導細胞開窗的方法，其特征在于，該方法包括使所述細胞與EG-VEGF或其激動劑接觸，或在所述細胞中以誘導細胞開窗的有效量引入編碼EG-VEGF或其激動劑的核酸。
54.如權利要求53所述的方法，其特征在于，所述細胞是內皮細胞。
55.如權利要求54所述的方法，其特征在于，所述內皮細胞是甾體生成的內皮細胞。
56.如權利要求54所述的方法，其特征在于，該方法還包括使所述細胞與VEGF或其激動劑接觸，或將編碼VEGF或其激動劑的核酸引入所述細胞。
57.一種抑制內皮細胞增殖的方法，其特征在于，該方法包括將所述細胞與抑制細胞增殖的有效量的EG-VEGF拮抗劑接觸。
58.一種抑制內皮細胞趨化性的方法，其特征在于，該方法包括將所述細胞與抑制趨化性有效量的EG-VEGF拮抗劑接觸。
59.一種抑制產激素組織中血管生成的方法，其特征在于，該方法包括將所述組織與抑制血管生成的有效量的EG-VEGF拮抗劑接觸。
60.一種抑制細胞分化的方法，其特征在于，該方法包括將所述細胞與抑制細胞分化的有效量的EG-VEGF拮抗劑接觸。
61.一種調節個體生育的方法，其特征在于，該方法包括對所述個體施用調節生育的有效量的EG-VEGF拮抗劑。
62.如權利要求61所述的方法，其特征在于，通過抑制卵泡成熟調節所述生育。
63.如權利要求61所述的方法，其特征在于，所述生育是通過抑制排卵調節的。
64.如權利要求61所述的方法，其特征在于，所述個體具有或有多囊性卵巢綜合征的危險，調節生育力以維持生育力。
65.一種在個體對EG-VEGF具有反應性的細胞中治療癌癥的方法，其特征在于，所述方法包括對所述個體施用治療癌癥的有效量的EG-VEGF拮抗劑。
66.一種治療個體中生殖器官癌癥的方法，其特征在于，所述方法包括對所述個體施用抑制癌癥的有效量的EG-VEGF拮抗劑。
67.如權利要求66所述的方法，其特征在于，所述癌癥選自卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌和子宮癌。
68.如權利要求67所述的方法，其特征在于，所述癌癥是激素依賴性癌癥。
69.如權利要求68所述的方法，其特征在于，所述癌癥是雄激素依賴性癌癥。
70.如權利要求69所述的方法，其特征在于，所述癌癥是雄激素依賴性前列腺癌癥。
71.一種治療個體中卵巢囊腫的方法，其特征在于，該方法包括對所述個體施用抑制囊腫生長的有效量的EG-VEGF拮抗劑。
72.一種調節內皮細胞滲透性的方法，其特征在于，該方法包括使所述內皮細胞與有效量的EG-VEGF接觸。
73.如權利要求72所述的方法，其特征在于，所述方法包括用VEGF接觸所述內皮細胞。
74.如權利要求72所述的方法，其特征在于，所述細胞是腎上腺皮質的內皮細胞。
75.如權利要求72所述的方法，其特征在于，所述細胞是卵巢的內皮細胞。
全文摘要
本發明針對一種在本文中稱為EG－VEGF的新穎多肽，和編碼這些多肽的核酸分子。本文還提供了含有這些核酸序列的載體和宿主細胞，含有與異源多肽序列融合的本發明的多肽的嵌合多肽分子，與本發明的多肽結合的抗體和產生本發明多肽的方法。本文還提供了篩選EG－VEGF的調節劑的方法。另外，本文還描述了與調節細胞增殖和趨化性有關的方法和相關的治療方法。
文檔編號C12Q1/00GK1449445SQ01814600
公開日2003年10月15日 申請日期2001年6月22日 優先權日2000年6月23日
發明者N·弗拉拉, C·瓦達那伯, W·I·伍德 申請人:基因技術股份有限公司