具有成骨細胞增殖促進活性的肽及其利用

具有成骨細胞增殖促進活性的肽及其利用
【專利摘要】為了提供兼具骨形成促進作用和軟骨細胞增殖促進作用的新型肽，本發明提供包含下述(a)、(b)或(c)的氨基酸序列、氨基酸殘基數為100以下、具有成骨細胞增殖促進活性的肽或其衍生物或其鹽。(a)Val?Asn?Pro?Glu?Ser?Glu?Glu?Glu?Asp?Glu?Ser?Ser?Pro?Tyr?Glu(序列號1)(b)在(a)的氨基酸序列中具有1～3個氨基酸的保守性置換或缺失的氨基酸序列(c)由(a)或(b)的氨基酸序列中至少4個連續的氨基酸構成的氨基酸序列。
【專利說明】
具有成骨細胞増殖促進活性的化及其利用
技術領域
[0001] 本發明設及具有成骨細胞增殖促進活性的膚、含有該膚的骨形成促進劑、骨吸收 抑制劑、軟骨細胞增殖促進劑、透明質酸產生促進劑、軟骨祖細胞分化誘導劑、間充質干細 胞增殖促進劑、間充質干細胞分化誘導劑、W及它們的利用。
【背景技術】
[0002] 骨質疏松癥是因骨量或骨礦含量的減少而導致骨的微細結構破壞、骨強度降低、 骨折的風險提高的全身性疾病。在日本，骨質疏松癥的患者據說有約1100萬人，其中8成是 女性。此外，骨質疏松癥是中年之后多見的疾病，因此，伴隨著近年來的老齡化，推測今后患 者數會增加。另外，近年來，中小學生的骨折率增加，從預防骨質疏松癥的觀點出發，在幼年 期切實地提高骨礦含量、獲得更高的最大骨量也是非常重要的。由此可見，無論性別、年齡 如何，確保骨的健康是目前全社會關注的事宜。
[0003] W往，作為預防或治療骨疾病的方法，進行了通過藥膳療法補巧、輕度運動、日光 浴、藥物治療等。作為通過藥膳療法進行的補巧，使用了碳酸巧、憐酸巧等巧鹽、牛骨粉、蛋 殼、魚骨粉等天然巧劑，但從溶解性、吸收性、呈味性的觀點出發，未必是適合口服攝取的材 料。適度的運動可增加骨量、使骨強化，因此，散步、慢走被認為有益于骨的健康，但在體質 弱的情況下，輕度運動也是有麻煩的。何況邸床的老人幾乎無法運動。日光浴在補給活化維 生素 D3的方面被認為是有益的，但僅此是不充分的。
[0004] 另一方面，在各種軟骨疾病的預防和治療的過程中，軟骨細胞的增殖、分化功能的 表現很重要。即，認為軟骨細胞的增殖、成熟化帶來骨的正常成長或骨折的情況下的修復。 作為誘導軟骨細胞增殖的因子，報告了TGF-PUl'ransforming Growth Factor:轉化生長因 子）、IGF-l(Insulin-l;Lke Growth Factor:膜島素樣生長因子）、bFGF(basic F;Lb;roblast Growth Factor:堿性成纖維細胞生長因子）、PTHrP(PTH-related p邱tide:甲狀旁腺激素 相關膚）、HGF(Hepat〇(：yte Growth Factor:肝細胞生長因子）、BMP(bone morphogenetic protein:骨形態發生蛋白）等。但是，尚未確立安全性、穩定性、有效性優良的軟骨細胞增殖 促進藥的臨床應用。
[0005] 軟骨疾病中，患者數最多的疾病是變形性關節病。認為原因之一是老齡化，預測在 今后的老齡化社會中該病例會增加。在關節疾病等W軟骨的變性為主要病變的軟骨障礙 (軟骨障害)的預防和治療中，W往主要使用雌激素、降巧素等骨吸收抑制物質、阿司匹林或 非醬體消炎劑(NSAID)，但不僅未得到充分的效果，而且消化道障礙等有害作用是眾所共知 的。因此，迫切要求在軟骨損傷、軟骨障礙的治療中安全使用的預防或改善劑。
[0006] 本發明人們發現，至少包含WAla-Glu-Ser表示的氨基酸序列的卵黃來源的膚具 有成骨細胞增殖促進活性(參考專利文獻1)、卵黃蛋白水解物具有軟骨細胞增殖促進活性 (參考專利文獻2 )，并進行了專利申請。
[0007] 現有技術文獻 [000引專利文獻
[0009] 專利文獻1:日本特開2011-211979號公報
[0010] 專利文獻2:國際公開第2014/007318號

【發明內容】

[ocm]發明所要解決的問題
[0012] 本發明的課題在于提供兼具骨形成促進作用和軟骨細胞增殖促進作用的新型膚， 并且提供利用該膚的優良用途。
[0013] 用于解決問題的方法
[0014] 為了解決上述問題，本發明包含下述各發明。
[0015] [1]一種膚或其衍生物或其鹽，所述膚包含下述(a)、（b)或(C)的氨基酸序列，氨基 酸殘基數為100 W下，且具有成骨細胞增殖促進活性。
[0016] (a)化l-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu-Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glul；序列號 1)
[0017] (b)在(a)的氨基酸序列中具有1~3個氨基酸的保守性置換或缺失的氨基酸序列
[0018] (C)由（a)或(b)的氨基酸序列中至少4個連續的氨基酸構成的氨基酸序列
[0019] [2巧日上述[1]所述的膚或其衍生物或其鹽，其中，具有至少一個憐酸化絲氨酸。
[0020] [3]如上述[1]或[2]所述的膚或其衍生物或其鹽，所述膚為卵黃脂憐蛋白1的片 段。
[0021] [4巧日上述[1]~[3]中任一項所述的膚或其衍生物或其鹽，其還具有軟骨細胞增 殖促進活性和/或透明質酸產生促進活性。
[0022] [5]如[1]~[4]中任一項所述的膚或其衍生物或其鹽，所述膚由選自下述（i)~ (Vi)中的氨基酸序列構成。
[0023] (i)化l-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu-Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glul；序列號 1)
[0024] (ii)化 l-Asn-Pr〇-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu(序列號 2)
[00 巧](i i i)化l-Asn-Pr〇-Glu-Ser-Glu-Glu(序列號3)
[0026] (iv)P;r〇-Glu-Se;r-Glu-Glu(序列號 4)
[0027] (v)Asp-Glu-Se;r-Se;r-P;r〇-Ty;r-Glu(序列號5)
[00 巧](vi)Glu-Asp-Glu-Se;r-Se;r-P;r〇-Ty;r-Glu(序列號6)
[0029] [6]-種多核巧酸，其編碼上述[1]~[引中任一項所述的膚。
[0030] [7]-種表達載體，其含有上述[6]所述的多核巧酸。
[0031] [引一種轉化體，其利用上述[7]所述的重組載體進行了轉化。
[0032] [9]-種骨形成促進劑，其特征在于，含有上述[1]~[5]中任一項所述的膚或其衍 生物或其鹽，或者含有卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0033] [10巧日上述[9]所述的骨形成促進劑，其具有成骨細胞增殖促進作用。
[0034] [11]-種骨吸收抑制劑，其特征在于，含有上述[1]~[5]中任一項所述的膚或其 衍生物或其鹽，或者含有卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0035] [12]-種軟骨細胞增殖促進劑，其特征在于，含有上述[1]~[5]中任一項所述的 膚或其衍生物或其鹽，或者含有卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0036] [13]-種透明質酸產生促進劑，其特征在于，含有上述[1]~[5]中任一項所述的 膚或其衍生物或其鹽，或者含有卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0037] [14]-種軟骨祖細胞分化誘導劑，其特征在于，含有上述[1]~[5]中任一項所述 的膚或其衍生物或其鹽，或者含有卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0038] [15] -種間充質干細胞增殖促進劑，其特征在于，含有上述[1]~[5]中任一項所 述的膚或其衍生物或其鹽，或者含有卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0039] [16] -種間充質干細胞分化誘導劑，其特征在于，含有上述[1]~[5]中任一項所 述的膚或其衍生物或其鹽，或者含有卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0040] [17巧日上述[9]~[16]中任一項所述的劑，其用于口服給藥。
[0041] [1引一種藥物，其特征在于，含有上述[1]~[5]中任一項所述的膚或其衍生物或 其鹽，或者含有卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0042] [19巧日上述[18]所述的藥物，其用于促進骨形成，或者用于預防或改善軟骨障礙 或關節疾病。
[0043] [20]-種飲食品，其特征在于，含有上述[1]~[5]中任一項所述的膚或其衍生物 或其鹽，或者含有卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0044] [21巧日上述[20]所述的飲食品，其用于促進骨形成，或者用于預防或改善軟骨障 礙或關節疾病。
[0045] [22] -種營養補充劑，其特征在于，含有上述[1]~[5]中任一項所述的膚或其衍 生物或其鹽，或者含有卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0046] [23巧日上述[22]所述的營養補充劑，其用于促進骨形成，或者用于預防或改善軟 骨障礙或關節疾病。
[0047] [24] -種食品添加物，其特征在于，含有上述[1]~[5]中任一項所述的膚或其衍 生物或其鹽，或者含有卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0048] [25巧日上述[24]所述的食品添加物，其用于促進骨形成，或者用于預防或改善軟 骨障礙或關節疾病。
[0049] [26]-種化妝品，其特征在于，含有上述[1]~[5]中任一項所述的膚或其衍生物 或其鹽，或者含有卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0050] [27巧日上述[26]所述的化妝品，其用于促進骨形成，或者用于預防或改善軟骨障 礙或關節疾病。
[0051] [2引一種骨形成促進方法，其特征在于，對哺乳動物給藥有效量的上述[1]~[5] 中任一項所述的膚或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0052] [29] -種軟骨障礙或關節疾病的預防或改善方法，其特征在于，對哺乳動物給藥 有效量的上述[1]~[5]中任一項所述的膚或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂憐蛋白1或其衍 生物或其鹽。
[0053] [30]在骨形成促進、或者軟骨障礙或關節疾病的預防或改善中使用的上述[1]~ [引中任一項所述的膚或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0054] [31]上述[1]~[5]中任一項所述的膚或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂憐蛋白1或 其衍生物或其鹽在促進骨形成、或者預防或改善軟骨障礙或關節疾病中的應用。
[0055] [32]上述[1]~[5]中任一項所述的膚或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂憐蛋白1或 其衍生物或其鹽在制造用于促進骨形成、或者用于預防或改善軟骨障礙或關節疾病的藥物 中的應用。
[0056] 發明效果
[0057] 根據本發明，能夠提供兼具骨形成促進作用和軟骨細胞增殖促進作用的新型膚。 該膚通過口服攝取能夠促進骨形成，因此，作為用于促進骨形成或者用于預防、改善軟骨障 礙或關節痛的藥物、飲食品、營養補充劑、食品添加物、化妝品等有用。
【附圖說明】
[0058] 圖1是示出利用分級分子量為lW)a的UF膜將卵黃蛋白水解物分級、并對各個級分 的成骨細胞增殖活性進行測定而得到的結果的圖。
[0059] 圖2是示出將卵黃蛋白水解物的分子量lW)aW上的級分供于陰離子交換柱、并對 非吸附級分(直接通過）、W各氯化鋼濃度(750mM、lM)洗脫得到的級分的成骨細胞增殖活性 進行測定而得到的結果的圖。
[0060] 圖3是示出對確認到強成骨細胞增殖活性的750mM化C1洗脫級分進行反相HPLC而 分取的級分的圖。
[0061] 圖4是示出對圖3中所示的G1~G9各自的成骨細胞增殖活性進行測定而得到的結 果的圖。
[0062] 圖5是示出對G3和G4中的級分11~20的成骨細胞增殖活性進行測定而得到的結果 的圖。
[0063] 圖6是示出進一步在不同的條件下對級分12進行HPLC而檢測到的峰的圖。
[0064] 圖7是示出分取分別含有圖6中所示的2個峰的級分、并對成骨細胞增殖活性進行 測定而得到的結果的圖。
[0065] 圖8是示出分析結果所明確的膚的結構的圖。
[0066] 圖9是示出對合成膚(No. 1)進行成骨細胞增殖活性的測定而得到的結果的圖。
[0067] 圖10是示出對合成膚(No. 2和No.3)進行成骨細胞增殖活性的測定而得到的結果 的圖。
[0068] 圖11是示出對合成膚(No.4和No.5)進行成骨細胞增殖活性的測定而得到的結果 的圖。
[0069] 圖12是示出對合成膚(No.6)進行成骨細胞增殖活性的測定而得到的結果的圖。
[0070] 圖13是示出對口服給藥了合成膚(No. 1)的大鼠的腔骨生長板的伸長幅度進行測 定而得到的結果的圖。
[0071] 圖14是示出對合成膚(No. 1和No.6)進行軟骨細胞增殖活性的測定而得到的結果 的圖。
[0072] 圖15是示出對合成膚(No. 1和No.6)進行透明質酸產生促進活性的測定而得到的 結果的圖。
[0073] 圖16是示出實施例14的實驗操作程序的圖。
[0074] 圖17是示出對合成膚給藥組測量每一天的生長軟骨伸長速度(縱向）而得到的結 果的圖。
[0075] 圖18是示出對合成膚給藥組利用巧光顯微鏡確認初級松質骨的形成而得到的結 果的圖。
[0076] 圖19是示出對合成膚給藥組確認血清中膜島素樣生長因子(IGF-1)濃度增加而得 到的結果的圖。
[0077] 圖20是示出實施例15的實驗操作程序的圖。
[0078] 圖21是示出對合成膚給藥組計算每一天的大鼠腔骨生長幅度而得到的結果的圖。
[0079] 圖22是示出對合成膚給藥組測定大鼠單位骨組織的次級松質骨的骨量而得到的 結果的圖。
[0080] 圖23是示出對合成膚給藥組測定成骨細胞所局限的骨表面積相對于總骨表面積 的比例而得到的結果的圖。
[0081] 圖24是示出對合成膚給藥組測定破骨細胞所局限的骨表面積相對于總骨表面積 的比例而得到的結果的圖。
[0082] 圖25是示出實施例16的實驗操作程序的圖。
[0083] 圖26是示出對合成膚給藥組計算每一天的大鼠次級松質骨巧化速度而得到的結 果的圖。
[0084] 圖27是示出對合成膚給藥組測定成骨細胞所局限的骨表面積相對于總骨表面積 的比例而得到的結果的圖。
[0085] 圖28是示出對合成膚給藥組測定大鼠單位骨組織的成骨細胞數而得到的結果的 圖。
[0086] 圖29是示出對合成膚給藥組計算骨形成速度而得到的結果的圖。
【具體實施方式】
[0087] [膚]
[0088] 本發明提供具有成骨細胞增殖促進活性的膚。
[0089] 本發明人們嘗試了從將卵黃蛋白水解而得到的膚混合物中鑒定具有強成骨細胞 增殖促進活性的膚，分離出由下述(i)~(Vi)的各氨基酸序列構成的膚。（ii)~(Vi)的各氨 基酸序列為(i)的氨基酸序列中所包含的部分序列。
[0090] (i)化l-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu-Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glul；序列號 1)
[0091] (ii)化 l-Asn-Pr〇-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu(序列號 2)
[0092] (iii)化 l-Asn-Pr〇-Glu-Ser-Glu-Glu(序列號 3)
[0093] (iv)P;r〇-Glu-Se;r-Glu-Glu(序列號 4)
[0094] (v)Asp-Glu-Se;r-Se;r-P;r〇-Ty;r-Glu(序列號5)
[00 巧](vi)Glu-Asp-Glu-Se;r-Se;r-P;r〇-Ty;r-Glu(序列號6)
[0096] 本發明的膚為包含下述(a)、（b)或(C)的氨基酸序列、且具有成骨細胞增殖促進活 性的膚。
[0097] (a)化l-Asn-Pro-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu-Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glul；序列號 1)
[0098] (b)在(a)的氨基酸序列中具有1~3個氨基酸的保守性置換或缺失的氨基酸序列
[0099] (C)由（a)或(b)的氨基酸序列中至少4個連續的氨基酸構成的氨基酸序列
[0100] 本發明的膚可w是僅由上述(a)、（b)或(c)的氨基酸序列構成的膚，也可w是由上 述(a)、化)或山）的氨基酸序列和除此W外的氨基酸序列構成的膚。在包含(a)、化)或山）^ 外的氨基酸序列的情況下，只要膚具有成骨細胞增殖促進活性，則(a)、（b)或(c)W外的氨 基酸序列不受特別限定。例如，作為(a)、（b)或（c)W外的氨基酸序列，可W包含標簽序列 (例如，多聚組氨酸標簽、MyC標簽、FLAG標簽等）。
[0101] 本發明的膚的氨基酸殘基數沒有特別限定，優選為1000W下，更優選為500W下， 進一步優選為200 W下，進一步優選為100 W下，進一步優選為80 W下，進一步優選為70 W 下，進一步優選為60W下，進一步優選為50W下，進一步優選為40 W下，進一步優選為30W 下，進一步優選為20W下，特別優選為15W下。只要具有成骨細胞增殖促進活性，則下限沒 有特別限定，優選為3 W上，更優選為4 W上，進一步優選為5W上。
[0102] 同源性檢索的結果表明，序列號1的氨基酸序列是卵黃中含有的前體蛋白質的一 種即卵黃蛋白原(vitellogenin)2的氨基酸序列(序列號7)的第1060位-第1074位。因此，本 發明的膚優選為包含卵黃蛋白原2的第1060位-第1074位中的至少4個連續的氨基酸、且具 有成骨細胞增殖促進活性的卵黃蛋白原2的片段。
[0103] 在此，已知卵黃蛋白原2是卵黃中含有的前體蛋白質，其被切斷成卵黃脂憐蛋白1 (Lipovitellin-1)、卵黃高憐蛋白（陸osvitin)、卵黃脂憐蛋白 2(Lipovitellin-2Wl]YGP40 (yolk glycoprotein of 40kDa，40kDa的卵黃糖蛋白）運4種卵黃蛋白（參考DATABASE 化iProt:P02845(V 口 2_CHICK))。卵黃蛋白原2的第1060位-第1074位相當于卵黃脂憐蛋白1 的氨基酸序列（序列號8)的第1045位-第1059位。因此，本發明的膚優選為包含卵黃脂憐蛋 白1的第1045位-第1059位中的至少4個連續的氨基酸、且具有成骨細胞增殖促進活性的卵 黃脂憐蛋白2的片段。
[0104] 作為本發明的膚，優選由上述(i)~(Vi)的氨基酸序列構成的膚。
[0105] 本說明書中，"氨基酸的保守性置換"是指下述表1的各組內的氨基酸間的置換。其 中，作為優選的氨基酸的保守性置換，可W列舉天冬氨酸與谷氨酸之間的置換、精氨酸與賴 氨酸與組氨酸之間的置換、色氨酸與苯丙氨酸之間的置換、苯丙氨酸與鄉氨酸之間的置換、 亮氨酸與異亮氨酸與丙氨酸之間的置換、甘氨酸與丙氨酸之間的置換等。
[0106] 表1
[0107]
[0108] 對于本發明的膚的衍生物而言，W特定的氨基酸序列表示的膚的C末端可W為簇 基(-C00H)、簇酸根（力瓜樂年シレ一Η (-CO〇-)、酷胺(-CON也）或醋（-C00R)中的任意一種。 作為醋中的R，可W列舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基或正下基等Cl-6烷基;例如環戊基、 環己基等C3-8環烷基;例如苯基、α-糞基等C6-12芳基;例如芐基、苯乙基等苯基-Ci-2烷基或α- 糞甲基等α-糞基-Cl-2烷基等C7-14芳烷基，除此W外，還可W列舉作為口服用醋被廣泛使用 的新戊酷氧基甲基等。作為酷胺體，可W列舉酷胺、被1個或2個Ci-6烷基取代的酷胺、被1個 或2個被苯基取代的Ci-6烷基取代的酷胺、形成包含酷胺基的氮原子的5~7元環的氮雜環燒 控的酷胺等。
[0109] 本發明的膚在C末端W外具有簇基或簇酸根的情況下，運些基團酷胺化或醋化而 成的物質也包含在本發明的膚的衍生物中。
[0110] 本發明的膚的衍生物也包括N末端的氨基被保護基（例如甲酯基、乙酷基等C2-6燒 酷基等Cl-6酷基等)保護的衍生物、N末端側在生物體內被切斷而生成的谷氨酷基經焦谷氨 酸化后的衍生物、分子內的氨基酸的側鏈上的取代基(例如-OH、-甜、氨基、咪挫基、嗎I噪基、 脈基等)被適當的保護基(例如甲酯基、乙酷基等C2-6燒酷基等Cl-6酷基等)保護的衍生物。
[0111] 構成本發明的膚的衍生物的氨基酸的側鏈可W被任意的取代基修飾。取代基沒有 特別限定，可W列舉例如氣原子、氯原子、氯基、徑基、硝基、烷基、環烷基、烷氧基、氨基、憐 酸基等。另外，側鏈的取代基可W被保護基保護。此外，結合有糖鏈的糖膚也包含在本發明 的膚的衍生物中。
[0112] 本發明的膚或其衍生物可W形成鹽，作為其鹽，優選生理學上可接受的鹽。作為生 理學上可接受的鹽，可W列舉例如與鹽酸、硫酸、憐酸、乳酸、酒石酸、馬來酸、富馬酸、草酸、 蘋果酸、巧樣酸、油酸、棟桐酸等酸的鹽;與鋼、鐘、巧等堿金屬或堿±金屬或者侶的氨氧化 物或碳酸鹽的鹽;與Ξ乙胺、節胺、二乙醇胺、叔下胺、二環己胺、精氨酸等的鹽等。
[0113] 只要可保持原來的膚的特性，本發明的膚或其衍生物可W含有D-氨基酸，也可W 含有非天然氨基酸。另外，只要可保持原來的膚的特性，本發明的膚或其衍生物可W在膚上 連接其他物質。作為能夠與膚連接的其他物質，可w列舉例如其他膚、脂質、糖或糖鏈、乙酷 基、天然或合成的聚合物等。另外，只要保持原來的膚的特性，本發明的膚也可W對膚進行 糖基化、側鏈氧化、憐酸化等修飾。
[0114] 本發明的膚其衍生物或其鹽優選具有至少一個憐酸化絲氨酸。憐酸化絲氨酸的位 置沒有特別限定，優選序列號1所示的氨基酸序列的第5位、第11位和第12位的絲氨酸殘基 中的至少一個被憐酸化，更優選第5位和第11位中的至少一個被憐酸化，進一步優選第5位 和第11位運兩者都被憐酸化。通過對絲氨酸進行憐酸化，確認到骨化細胞的增殖促進作用 增強。
[0115] 作為本發明的膚衍生物，優選由序列號9~14所示的氨基酸序列構成的具有憐酸 化絲氨酸的膚(參考圖10)。
[0116] 本發明的膚其衍生物或其鹽下將它們簡記為"本發明的膚"）可W按照公知的 一般的膚合成的操作程序利用固相合成法巧moc法、Boc法)或液相合成法進行制造。另外， 可W使用導入了含有編碼本發明的膚的DNA的表達載體的轉化體進行制造。另外，可W將含 有編碼在一部分中含有本發明的膚的膚的DNA的表達載體導入轉化體，使用該轉化體獲取 膚，將其利用適當的蛋白酶、膚酶切斷，由此進行制造。另外，可W通過使用體外轉錄-翻譯 系統的方法進行制造。
[0117] 另外，本發明的膚可W由雞的卵黃蛋白的水解物純化而獲取。卵黃蛋白的水解物 的制備方法、膚的純化方法沒有特別限定，可W適當選擇公知的方法來使用。具體而言，可 W列舉例如制備脫脂卵黃粉末、使用蛋白酶等酶制備水解物、使用超濾、HPLC等各種色譜純 化目標膚的方法等。
[0118] 所得到的膚具有成骨細胞增殖促進活性如下確認即可:在從測定細胞增殖的公知 的方法中適當選擇的試驗體系中使用成骨細胞，將添加了膚的情況與未添加膚的情況相比 較，添加了膚的情況下成骨細胞的增殖水平更高。可W列舉例如在使用成骨細胞來源的細 胞株的細胞培養體系中使用Μ?Τ檢測、細胞計數法的方法。
[0119] 所得到的膚具有軟骨細胞增殖促進活性如下確認即可:在從測定細胞增殖的公知 的方法中適當選擇的試驗體系中使用軟骨細胞或軟骨祖細胞，將添加了膚的情況與未添加 膚的情況相比較，添加了膚的情況下成骨細胞的增殖水平更高。可W列舉例如在使用成骨 細胞來源的細胞株的細胞培養體系中使用MTT檢測、細胞計數法的方法。
[0120] 所得到的膚具有透明質酸產生促進活性如下確認即可:使用具有透明質酸產生能 力的培養細胞，利用公知的方法測定在培養基中添加了膚的情況下和未添加膚的情況下的 培養上清中的透明質酸量并進行比較，添加了膚的情況下培養上清中的透明質酸量更高。 作為透明質酸量的測定方法，可W列舉例如化ISA法等。
[0121] [多核巧酸]
[0122] 本發明的多核巧酸只要是編碼上述本發明的膚的多核巧酸即可。多核巧酸可 RNA (例如mRNA)的形態或DNA的形態（例如cDNA或基因組DNA)存在。多核巧酸可W為雙鏈也 可W為單鏈。雙鏈的情況下，可W為雙鏈DNA、雙鏈RNA、或DNA與RNA的雜合鏈中的任意一種。 單鏈的情況下，可W為編碼鏈(有義鏈)或非編碼鏈(反義鏈)中的任意一種。另外，本發明的 多核巧酸可W在其5'側或3'側與編碼標簽標識(標簽序列或標記序列）多核巧酸融合。此 夕h可W包含非翻譯區域(UTR)的序列、載體序列(包含表達載體序列)等序列。
[0123] 編碼本發明的膚的多核巧酸的堿基序列可W通過基于本發明的膚的氨基酸序列 適當選擇并組合各氨基酸的密碼子來任意地進行設計。另外，如上所述，序列號1的氨基酸 序列是作為卵黃中含有的前體蛋白質的一種的卵黃蛋白原2的氨基酸序列（序列號7)的一 部分，因此，可W基于編碼卵黃蛋白原2的基因的堿基序列進行設計。
[0124] 本發明的多核巧酸可W通過公知的DNA合成法、PCR法等來獲取。具體而言，例如， 基于本發明的膚的氨基酸序列，適當選擇各氨基酸的密碼子來設計堿基序列，使用市售的 DNA合成儀進行化學合成即可。另外，可W設計出用于擴增編碼卵黃蛋白原2的基因的堿基 序列（登錄號:X13607)中編碼本發明的膚的區域的引物，使用運些引物W雞基因組DNA或 cDNA等為模板進行PCR等，由此可W大量獲取包含本發明的多核巧酸的DNA片段。
[0125] [表達載體]
[0126] 本發明提供用于制造上述本發明的膚而使用的表達載體。本發明的表達載體只要 包含編碼本發明的膚的多核巧酸，則沒有特別限定，優選具有RNA聚合酶的識別序列的質粒 載體(pSP64、pBluescript等）。作為表達載體的制作方法，可W列舉使用質粒、隧菌體或粘 粒等的方法，沒有特別限定。載體的具體種類沒有限定，可W適當選擇能夠在宿主細胞中進 行表達的載體。即，根據宿主細胞的種類，選擇用于可靠地表達本發明的多核巧酸的適當啟 動子序列，將其與本發明的多核巧酸組入各種質粒等中，使用所得到的載體作為表達載體 即可。對使用本發明的表達載體轉化后的宿主進行培養、栽培或飼養后，可W按照慣用的方 法(例如過濾、離屯、分離、細胞的破碎、凝膠過濾層析、離子交換層析等)從培養物等中回收、 純化本發明的膚。
[0127] 表達載體優選包含至少一個選擇標記。作為運樣的標記，對于真核生物細胞培養， 可W列舉二氨葉酸還原酶或新霉素抗性基因，對于大腸桿菌化scherichia coli)和其他細 菌中的培養，可W列舉四環素抗性基因或氨節青霉素抗性基因。使用上述選擇標記時，可W 確認本發明的多核巧酸是否導入了宿主細胞、W及是否在宿主細胞中可靠地表達。或者，也 可融合膚的形式表達本發明的膚，例如，可W使用維多利亞多管發光水母來源的綠色 巧光蛋白質GFP(Green Fluorescent Protein)作為標記，WGFP融合膚的形式表達本發明 的膚。
[0128] 宿主沒有特別限定，可W適當使用現有公知的各種細胞。具體而言，可W列舉例如 大腸桿菌等細菌、酵母(芽殖酵母:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母:粟酒 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ))、線蟲（秀麗隱桿線蟲，Caenorhabditis elegans)、非洲爪贍（Xenopus laevis)的卵母細胞、動物細胞（例如CH0細胞、COS細胞和 Bowes黑色素瘤細胞)等。將上述表達載體導入到宿主細胞中的方法、即轉化法也沒有特別 限定，可W適當使用電穿孔法、憐酸巧法、脂質體法、DEAE葡聚糖法等現有公知的方法。
[0129] [轉化體]
[0130] 本發明提供導入有上述本發明的表達載體的轉化體。本發明的轉化體不僅包括細 胞、組織或器官，還包括生物個體。另外，作為轉化對象的生物也沒有特別限定，可W列舉作 為上述宿主細胞所例示的各種微生物、植物或動物。本發明的轉化體的特征在于表達了本 發明的膚。本發明的轉化體優選穩定地表達本發明的膚，但也可W瞬時地表達本發明的膚。
[0131] [骨形成促進劑、骨吸收抑制劑、軟骨細胞增殖促進劑、透明質酸產生促進劑、軟骨 祖細胞分化誘導劑、間充質干細胞增殖促進劑、間充質干細胞分化誘導劑]
[0132] 本發明提供含有本發明的膚的骨形成促進劑。本發明的膚具有骨形成促進活性， 因此能夠適合用作骨形成促進劑的有效成分。本發明的膚具有骨形成促進活性可W如下確 認：例如，W-定的期間（例如7、14、21天等)對受試動物給藥(例如口服給藥等)本發明的 膚，然后，W腔骨生長板的伸長幅度的增加、生長軟骨的伸長速度的增大、初級松質骨的形 成促進、血清中膜島素樣生長因子(IGF-1)濃度的增加、單位骨組織的次級松質骨的骨量的 增大、成骨細胞的增加、破骨細胞的減少、次級松質骨巧化速度的增大等作為指標進行確 認。在此，生長軟骨是指例如位于骨端的骨的伸長部位。初級松質骨是指例如緊挨生長軟骨 之下的未成熟的松質骨。次級松質骨是指例如成熟的松質骨。即，本發明中，"骨形成促進" 可W換言之為"腔骨生長板的伸長幅度的增加"、"生長軟骨的伸長速度的增大"、"初級松質 骨的形成促進"、"血清中膜島素樣生長因子(IGF-1)濃度的增加"、"單位骨組織的次級松質 骨的骨量的增大"、"成骨細胞的增加"、"破骨細胞的減少"、"次級松質骨巧化速度的增大" 等。另外，本發明提供含有本發明的膚的成骨細胞增殖促進劑。本發明的膚具有成骨細胞增 殖促進活性，因此能夠適合用作成骨細胞增殖促進劑的有效成分。另外，本發明提供含有本 發明的膚的骨吸收抑制劑。本發明的膚具有骨吸收抑制活性，因此能夠適合用作骨吸收抑 制劑的有效成分。另外，本發明提供含有本發明的膚的軟骨細胞增殖促進劑。本發明的膚具 有軟骨細胞增殖促進活性，因此能夠適合用作軟骨細胞增殖促進劑的有效成分。另外，本發 明提供含有本發明的膚的透明質酸產生促進劑。本發明的膚具有透明質酸產生促進活性， 因此能夠適合用作透明質酸產生促進劑的有效成分。另外，本發明提供含有本發明的膚的 軟骨祖細胞分化誘導劑。本發明的膚具有軟骨祖細胞分化誘導活性，因此能夠適合用作軟 骨祖細胞分化誘導劑的有效成分。另外，本發明提供含有本發明的膚的間充質干細胞增殖 促進劑。本發明的膚具有間充質干細胞增殖促進活性，因此能夠適合用作間充質干細胞增 殖促進劑的有效成分。另外，本發明提供含有本發明的膚的間充質干細胞分化誘導劑。本發 明的膚具有間充質干細胞分化誘導活性，因此能夠適合用作間充質干細胞分化誘導劑的有 效成分。
[0133] 作為上述各劑的有效成分，除了本發明的膚W外，還可W適當使用卵黃脂憐蛋白1 或其衍生物或其鹽。本說明書中，卵黃脂憐蛋白1是指，由與序列號8所示的氨基酸序列相同 或實質上相同的氨基酸序列構成、且具有與卵黃脂憐蛋白1實質上相同的活性的蛋白質。作 為與序列號8所表示的氨基酸序列實質上相同的氨基酸序列，可W列舉例如在序列號8所表 示的氨基酸序列中缺失、置換或添加了 1個~幾個氨基酸而得到的氨基酸序列。"缺失、置換 或添加了 1個~幾個氨基酸"是指，缺失、置換或添加利用定點誘變法等公知的突變膚制作 法所能夠缺失、置換或添加的程度的數量(優選為10個W下、更優選為7個W下、進一步優選 為5個W下）的氨基酸。運樣的突變蛋白質并不限定于具有利用公知的突變多膚制作法人為 地導入的突變的蛋白質，也可W是分離純化天然存在的蛋白質而得到的蛋白質。另外，實質 上相同的氨基酸序列可W列舉與序列號1所表示的氨基酸序列至少80%相同、更優選至少 85%相同、90%相同、92%相同、95 %相同、96%相同、97 %相同、98%相同或99%相同的氨 基酸序列。
[0134] 作為卵黃脂憐蛋白1的衍生物，優選在上述本發明的膚的衍生物的說明中例示的 各種衍生物。另外，作為卵黃脂憐蛋白1或其衍生物的鹽，優選在上述本發明的膚或其衍生 物的鹽的說明中例示的各種鹽。
[0135] 卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽可W使用公知的基因重組技術W重組蛋白質的 形式制造。另外，可W通過使用體外轉錄-翻譯系統的方法進行制造。另外，可W從雞的卵黃 蛋白進行純化。
[0136] W下，將卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽也包含在內，記作"本發明的膚等"。
[0137] 已確認本發明的膚等通過口服給藥于哺乳動物可發揮目標效果，因此，運些劑可 用于口服給藥的劑的形式適當實施。另外，本發明的膚等是作為卵黃蛋白的卵黃脂憐 蛋白1或其片段，因此，安全性高，作用溫和，能夠長期攝取或使用。
[013引[藥物]
[0139] 本發明提供含有本發明的膚等的藥物。本發明的膚等具有成骨細胞增殖促進活 性，因此能夠用作骨形成促進用的藥物。本發明的骨形成促進用藥物適合用作例如骨質疏 松癥、骨形成障礙、高巧血癥、甲狀旁腺功能亢進癥、軟骨病、骨軟化、骨溶解性骨疾病、骨壞 死、派杰氏病、類風濕性關節、變形性關節病所致的骨減少、炎癥性關節炎、骨髓炎、糖皮質 激素治療、轉移性骨疾病、牙周的骨喪失、癌癥所致的骨喪失、老年化所致的骨喪失、骨折、 腰痛等的預防或治療用藥物。
[0140] 另外，本發明的膚等具有軟骨細胞增殖促進活性和/或透明質酸產生促進活性，因 此能夠用作軟骨障礙或關節疾病的預防或改善用藥物。作為軟骨障礙，可W列舉例如變形 性關節病、軟骨的缺損、軟骨損傷、半月板損傷等。作為關節疾病，可W列舉關節痛、慢性類 風濕關節炎、變形性關節炎、化脈性關節炎、痛風性關節炎、外傷性關節炎、骨關節炎等。
[0141] 本發明的藥物W本發明的膚等作為有效成分，可W按照作為藥物制劑的制造法而 公知的方法(例如日本藥典中記載的方法等），適當配合藥學上可接受的載體或添加劑進行 制劑化。具體而言，可W列舉例如片劑(包括糖衣片、薄膜包衣片、舌下片、口腔內崩解片、含 片等）、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑(包括軟膠囊劑、微膠囊劑）、口腔用含片劑、糖漿劑、液 劑、乳劑、混懸劑、控釋制劑(例如速釋性制劑、緩釋性制劑、緩釋性微膠囊劑）、氣溶膠劑、膜 劑(例如口腔內崩解膜、口腔粘膜貼膜）、注射劑(例如皮下注射劑、靜脈內注射劑、肌肉內注 射劑、腹腔內注射劑）、滴注劑、經皮吸收型制劑、軟膏劑、洗劑、貼劑、栓劑(例如肛口栓劑、 陰道栓劑）、顆粒、經鼻劑、經肺劑(吸入劑）、滴眼劑等口服劑或非口服劑。關于載體或添加 劑的配合比例，基于藥物領域中通常采用的范圍適當設定即可。可配合的載體或添加劑沒 有特別限制，可W列舉例如水、生理鹽水、其他水性溶劑、水性或油性基劑等各種載體;賦形 劑、粘結劑、抑調節劑、崩解劑、吸收促進劑、潤滑劑、著色劑、矯味劑、香料等各種添加劑。
[0142] 作為可W混合到片劑、膠囊劑等中的添加劑，可W使用例如明膠、玉米淀粉、黃著 膠、阿拉伯膠之類的粘結劑、微晶纖維素之類的賦形劑、玉米淀粉、明膠、海藻酸等之類的膨 化劑、硬脂酸儀之類的潤滑劑、薦糖、乳糖或糖精之類的甜味劑、胡椒薄荷、紅珠樹油（7力 子7油)或樓桃之類的香味劑等。在制劑單元形態為膠囊的情況下，可W在上述類型的材料 中進一步含有油脂之類的液態載體。用于注射的無菌組合物可W按照通常的制劑操作（例 如使有效成分溶解或懸浮于注射用水、天然植物油等溶劑中等)進行制備。作為注射用的水 性液，可W使用例如含有生理鹽水、葡萄糖或其他助劑的等滲液(例如D-山梨醇、D-甘露醇、 氯化鋼等)等，可W與適當的助溶劑、例如醇(例如乙醇）、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇）、 非離子型表面活性劑(例如聚山梨醋80?、HC0-50)等組合使用。作為油性液，可W使用例如 芝麻油、大豆油等，可W與作為助溶劑的苯甲酸節醋、節醇等組合使用。另外，可W與緩沖劑 (例如憐酸鹽緩沖液、乙酸鋼緩沖液）、舒緩劑(例如苯扎氯錠、鹽酸普魯卡因等）、穩定劑(例 如人血清白蛋白、聚乙二醇等）、防腐劑(例如節醇、苯酪等）、抗氧化劑等進行配合。
[0143] 如此得到的制劑安全且低毒性，因此，可W對例如人或其他哺乳動物(例如大鼠、 小鼠、兔、山羊、豬、牛、貓、狗、猴等)給藥。
[0144] 對于本發明的藥物而言，盡管根據劑型、給藥方法、載體等而有所不同，但可W通 過相對于制劑總量W通常為0.01~100 % (w/w)、優選為0.1~95 % (w/w)的比例添加本發明 的膚等并按照常規方法進行制造。
[0145] 給藥量根據給藥對象、癥狀、給藥途徑等而有所差異，在口服給藥的情況下，例如 對于體重約60kg的人而言，通常每1天為約O.Olmg~約lOOOmg，優選為約O.lmg~約lOOmg， 更優選為約0.5mg~約500mg。每1天的總給藥量可W單次給藥，也可W分次給藥。
[0146] 本發明的藥物通過與其他骨疾病治療用藥物、其他軟骨或關節疾病治療用藥物組 合使用，可W期待相加或協同性的效果的提高。作為其他骨形成促進用藥物，可W列舉例如 活性型維生素 D3制劑、維生素 K2制劑、甲狀旁腺激素制劑(特立帕膚）、女性激素制劑(雌激 素）、雙憐酸鹽制劑、SERM(鹽酸雷洛昔芬）、降巧素制劑等。作為其他軟骨或關節疾病治療用 藥物，可W列舉例如葡糖胺、軟骨素、I型膠原蛋白、Π 型膠原蛋白、N-乙酷葡糖胺等。
[0147] [飲食品]
[0148] 本發明提供含有本發明的膚等的飲食品。本發明的飲食品適合作為骨形成促進用 飲食品、W及軟骨障礙或關節疾病的預防、改善用飲食品。
[0149] 飲食品中包括健康食品、功能性食品、特定保健用食品、患者用食品。飲食品的形 態沒有特別限定。可W列舉例如茶飲料、清涼飲料、碳酸飲料、營養飲料、果實飲料、乳酸飲 料等飲料;養麥面、烏冬面、中華面、即食面等面類;始糖、糖果、口香糖、巧克力、休閑零食、 餅干、果凍、果醬、奶油、烘賠食品、面包等點屯、和面包類;魚糕、火腿、香腸等水產/畜產加工 食品；加工乳、發酵乳等乳制品；色拉油、天婦羅油、人造奶油、蛋黃醬、起酥油、打發奶油、調 味料等油脂和油脂加工食品；調味汁、醬汁等調味料;咖囑、燭菜、蓋飯、粥、泡飯等蒸煮袋食 品;冰洪淋、沙冰、創冰等冷飲等。
[0150] 本發明提供含有本發明的膚等的營養補充劑。本發明的營養補充劑適合作為骨形 成促進用營養補充劑、W及軟骨障礙或關節疾病的預防/改善用營養補充劑。營養補充劑例 如可W W片劑、顆粒劑、散劑、飲劑等形態提供。
[0151] 本發明提供含有本發明的膚等的食品添加物。本發明的食品添加物適合作為骨形 成促進用食品添加物、W及軟骨障礙或關節疾病的預防/改善用食品添加物。本發明的食品 添加物的形態沒有特別限定，可W列舉例如液狀、糊狀、粉末狀、薄片狀、顆粒狀等。本發明 的食品添加物可W基于一般的食品添加物的制造方法進行制造。
[0152] 此外，也可含有本發明的膚等的飼料或飼料添加物的形式實施。
[0153] 本發明提供含有本發明的膚等的化妝品。本發明的化妝品適合作為骨形成促進用 化妝品、W及軟骨障礙或關節疾病的預防、改善用化妝品。化妝品中包括所謂的藥用化妝品 (準藥品（醫薬部外品））。作為化妝品，可W列舉例如清洗劑、洗發水、護發素、養發液、護發 乳液、須后水、潤膚乳、化妝乳液、潔面霜、按摩霜、潤膚霜、氣溶膠制品、除臭劑、芳香劑、脫 臭劑或沐浴劑等。本發明的化妝品中，除了本發明的膚W外，可W根據目的適當配合作為化 妝品常規使用的成分、例如表面活性劑、保濕劑、動植物來源油脂、有機娃類、高級醇、低級 醇、動植物來源提取物、紫外線吸收劑、消炎劑、金屬封鏈劑、維生素類、抗氧化劑、增稠劑、 防腐劑、殺菌劑、抑調節劑、著色劑、各種香料等。
[0154] 本發明進一步包含下述發明。
[0155] (a)上述本發明的膚或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽在 制造用于促進骨形成、或者用于預防或改善軟骨障礙或關節疾病的藥物中的應用。
[0156] (b)用于促進骨形成、或者用于預防或改善軟骨障礙或關節疾病的上述本發明的 膚或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0157] (C)-種骨形成促進方法，其特征在于，對哺乳動物給藥有效量的上述本發明的膚 或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0158] (d) -種軟骨障礙或關節疾病的預防或改善方法，其特征在于，對哺乳動物給藥有 效量的上述本發明的膚或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0159] (e)-種非治療性的骨形成促進方法，其特征在于，使哺乳動物口服攝取上述本發 明的膚或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0160] (f)-種非治療性的軟骨障礙或關節疾病的預防或改善方法，其特征在于，使哺乳 動物口服攝取上述本發明的膚或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0161] (g)在骨形成促進、或者軟骨障礙或關節疾病的預防或改善中使用的上述本發明 的膚或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽。
[0162] 化)上述本發明的膚或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽在 促進骨形成、或者預防或改善軟骨障礙或關節疾病中的應用。
[0163] (i)上述本發明的膚或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂憐蛋白1或其衍生物或其鹽在 制造用于促進骨形成、或者用于預防或改善軟骨障礙或關節疾病的藥物中的應用。
[0164] 實施例
[0165] W下，利用實施例詳細地對本發明進行說明，但本發明并不限定于運些實施例。
[0166] [實施例1:卵黃蛋白水解物中的成骨細胞增殖促進活性成分的鑒定]
[0167] (1)卵黃蛋白水解物的制備
[0168] 在脫脂卵黃粉末(丘比株式會社制造）100質量份中添加水500質量份，均勻攬拌 后，添加商品名"7瓜力弓一管'（地衣芽抱桿菌(Bacillus lichen if ormi S)來源的蛋白酶、 諾維信日本株式會社制造)5質量份，在抑7下在55~60°C反應3小時。反應結束后，通過90°C 下10分鐘的熱處理使酶失活后，進行過濾，回收濾液。將濾液噴霧干燥，得到卵黃蛋白水解 物。
[0169] 需要說明的是，脫脂卵黃粉末可W從市售的卵黃粉末(例如丘比株式會社制造)進 行制備。具體而言，在市售的卵黃粉末1質量份中添加乙醇(或正己燒)5~10質量份，用混合 器攬拌約30分鐘后，過濾回收固體成分。將該操作重復3次左右，從卵黃中脫脂。將脫脂后的 卵黃風干，由此能夠制備脫脂干燥粉末。
[0170] (2)成骨細胞增殖活性的測定方法
[0171] 將小鼠成骨細胞樣細胞株MC3T3-E1亞克隆-4(ATCC No.C化-2593)使用含有10% FBS的α-ΜΕΜ培養液在37°C、5 %C02-95 %空氣的條件下培養至匯合后，通過膜蛋白酶處理收 集細胞。將收集的細胞懸浮到上述α-ΜΕΜ培養液中，制備細胞懸浮液（1 X 104個/mL)。將該細 胞懸浮液W每孔Im接種到24孔板中，在37°C、5%C02-95%空氣的條件下進行預培養。次日， 更換為在添加有化Cl2而使化濃度為50化g/mL的α-ΜΕΜ培養液95化L中添加樣品或PBS(-)50 yL并充分混合而得到的培養液，進一步培養72小時。成骨細胞的增殖活性通過細胞計數法 進行測定。樣品的成骨細胞增殖促進活性W將PBS(-)的生長值設為100時的相對值來表示。
[0172] (3)利用UF膜的分級
[0173] 將卵黃蛋白水解物60g溶解于水600mL，使用UF膜(分級分子量：lkDa、日本密理博 株式會社制造)進行分級，對于分子量lW)aW下的級分和分子量lW)aW上的級分測定成骨 細胞增殖活性。作為陽性對照，使用未分級的卵黃蛋白水解物（Img/mL)。對于分子量IkDaW 下的級分和分子量IkDaW上的級分，添加與未分級的卵黃蛋白水解物中的各個級分的含量 相當的量(與卵黃蛋白水解物〇.2mg相當的量）。
[0174] 將結果示于圖1。由圖1表明，在分子量IkDaW上的級分中確認到成骨細胞增殖活 性。
[0175] (4)利用陰離子交換柱的分級
[0176] 將上述(3)中確認到成骨細胞增殖活性的分子量lW)aW上的級分供于陰離子交換 柱（樹脂：Dowex、柱尺寸：Φ 10mmX63mm)，對于直接通過的級分和W各化C1濃度（750mM或 1M)的水溶液洗脫、分級而得到的各級分測定成骨細胞增殖活性。作為陽性對照，使用未分 級的卵黃蛋白水解物（Img/mL)。對于各級分，添加與未分級的卵黃蛋白水解物中的各個級 分的含量相當的量(與卵黃蛋白水解物lOmg相當的量）。
[0177] 將結果示于圖2。由圖2表明，在750mM化C1洗脫級分中確認到最強的成骨細胞增 殖活性。
[0178] (5)利用HPLC的分級(第1次）
[0179] 將上述(4)中確認到最強的成骨細胞增殖活性的750mM NaCl洗脫級分利用C18-反 相柱(柱尺寸：Φ 50mmX250mm)進行分級，分鐘的間隔分取洗脫時間0~45分鐘的級分。 HPLC的條件如下所述。
[0180] 柱："C18-反相柱、尺寸：Φ 50mmX250mm)"(株式會社/、斗八';/7。研究所制造）
[0181] 流動相：（A)10% 乙臘/0.1%TFA
[0182] (B)60% 乙臘/0.1%TFA
[0183] B 5%一95% (40分鐘)梯度
[0184] 檢測：UV215nm [01化]樣品量：601mg
[0186] 將所得到的45個級分W每5個級分進行混合，作為G1~G9(參考圖3)、對其測定成 骨細胞增殖活性。對于各級分，添加與未分級的卵黃蛋白水解物中的各個級分的含量相當 的量（與卵黃蛋白水解物66mg相當的量）。作為陽性對照，使用未分級的卵黃蛋白水解物 (Img/mL)。
[0187] 將結果示于圖4。由圖4表明，在G3中確認到強的成骨細胞增殖活性。
[0188] 接著，對于G3的5個級分(級分11~15)和G4的5個級分(級分16~20)測定成骨細胞 增殖活性。對于各級分，添加與未分級的卵黃蛋白水解物中的各個級分的含量相當的量(與 卵黃蛋白水解物66mg相當的量）。作為陽性對照，使用未分級的卵黃蛋白水解物（Img/mL)。
[0189] 將結果示于圖5。由圖5表明，在級分11~20的任意一個級分中均確認到強于對照 的成骨細胞增殖活性。
[0190] (6)利用HPLC的分級(第2次）
[0191] 對于級分11~20,進一步W下述條件進行HPLC。
[0192] 柱:商品名''0DS-A(10X4.6mmI.D.Γ(YMC公司制造）
[0193] 流動相:4%乙臘/0.1%TFA(等度）
[0194] 溫度:40°C
[0195] 檢測：UV215nm
[0196] 樣品量:50yg
[0197] 級分11~20中，在級分12中檢測出2個明確的峰(參考圖6)，因此，對該級分12進行 分析。即，將級分12供于上述條件的HPLC，分取包含峰1和峰2的級分(參考圖6)。對于包含峰 1的級分(峰1)、包含峰2的級分(峰2) W及峰1和峰2W外的級分(其他），測定成骨細胞增殖 活性。對于各級分，添加與未分級的卵黃蛋白水解物中的各個級分的含量相當的量(與卵黃 蛋白水解物133mg相當的量）。需要說明的是，作為陽性對照，使用未分級的卵黃蛋白水解物 (Img/mL)。
[0198] 將結果示于圖7。由圖7表明，在包含峰2的級分中確認到最強的成骨細胞增殖活 性。
[0199] (7)膚的鑒定
[0200] 使用MALDI-T0F-MS(質譜分析儀)對包含峰2的級分中含有的膚的氨基酸序列進行 分析。由它們的分析結果表明，在包含峰2的級分中，至少存在圖8所示的6種膚。運些膚為卵 黃中含有的卵黃脂憐蛋白1的片段，在卵黃脂憐蛋白1的氨基酸序列(序列號8)中，No. 1對應 于第1045位-第1052位、No. 2對應于第1045位-第1051位、No. 3對應于第1047位-第1051位、 No .4對應于第1053位-第1059位、No. 5對應于第1052位-第1059位、No. 6對應于第1045位-第 1059位。
[0201] [實施例2:使用合成膚的成骨細胞增殖促進活性的研究]
[0202] 對實施例1中鑒定的具有成骨細胞增殖促進活性的6種膚進行化學合成，測定成骨 細胞增殖促進活性。膚的合成使用膚自動合成裝置Syro II(Bio化ge日本株式會社制造）。
[0203] 利用與實施例1相同的方法測定各合成膚的成骨細胞增殖活性。在各孔中添加各 合成膚，使濃度為2.扣g/mL、扣g/mL、1 Oyg/mL。在對照中添加 PBS(-)。成骨細胞的增殖促進 活性W將PBS(-)的生長值設為100時的相對值來表示。
[0204] 將No. 1的結果示于圖9，將No. 2和No. 3的結果示于圖10，將No. 4和No. 5的結果示于 圖11，將No.6的結果示于圖12。由圖9~12表明，任意一種合成膚均濃度依賴性地促進成骨 細胞的增殖。
[0205] [實施例3:利用合成膚的生長期大鼠的骨伸長促進作用的研究]
[0206] 使用胃管天1次對3周齡的Sprague-Dawl巧系雄性大鼠分別強制口服給藥4天 合成膚(No. 1)或生理食鹽液(對照）。合成膚的用量為Img/kg/天、lOmg/kg/天或lOOmg/kg/ 天。另外，作為陽性對照，W20yg/kg/天、1天1次皮下給藥4天人生長激素化GH;human growth hormone、諾德欣(Norditropin)、日本標準商品分類編號872412)。在第4天給藥后， 皮下給予巧黃綠素，再飼養1天。將大鼠在麻醉下放血使其安樂死，采集腔骨，制作腔骨生長 板的組織標本，使用巧光顯微鏡測定腔骨生長板中形成的巧黃綠素的沉積面(巧光區域）， 由此觀察骨的伸長幅度。
[0207] 將結果示于圖13。由圖13表明，確認到腔骨生長板的伸長幅度依賴于合成膚的給 藥量而增加。最大給藥量時的作用與皮下給藥人生長激素時觀察到的伸長幅度的增加量基 本同等。由該結果表明，本發明的膚通過口服給藥能夠促進骨形成。
[0208] [實施例4:使用合成膚的軟骨細胞增殖促進活性的研究]
[0209] 使用具有向軟骨細胞分化的分化能力的小鼠來源細胞株ATDC5(理研細胞庫 (RIKEN BANK)、RBC0565)。將處于對數生長期的ATDC5懸浮于含有5%FCS(胎牛血清）的 化gle MEM培養基中，制備細胞懸浮液(3 X 104個/mU，W每孔10化L接種到96孔板中，在5% C02-95%空氣、37°C的條件下進行預培養。次日，除去全部培養基，添加含有lOnmol/mL合成 膚(No. 1或No. 6)的培養基，培養72小時。在對照中添加不含合成膚的培養基。在各孔中添加 細胞計數試劑盒8(同仁化學研究所）的反應溶液（1化g/孔），解育3小時后，用酶標儀測定 450nm的吸光度。合成膚的軟骨細胞增殖促進活性W將對照的吸光度(增殖值)設為100 %時 的相對值來表示。
[0210] 將結果示于圖14。由圖14表明，在合成膚No.6和作為其片段的合成膚No. 1運兩者 中均確認到軟骨細胞的增殖促進作用。
[0211] [實施例5:使用合成膚的透明質酸產生促進活性的研究]
[0212] 使用與實施例4相同的小鼠來源細胞株ATDC5細胞。將處于對數生長期的ATDC5W2 X 104個/mL/孔接種到24孔板中，使用含有5%FCS(胎牛血清）、10μg/ml轉鐵蛋白、3 X 10-8M 亞砸酸鋼的DMEM/F-12 (1:1)培養基，在5 % CO2-95 %空氣、37 °C的條件下進行預培養。次日， 除去全部培養基，添加含有lOnmol/mL合成膚(No. 1或No. 6)的培養基，培養72小時。在對照 中添加不含合成膚的培養基。回收培養48小時后的培養上清，使用化E透明質酸化ISA檢測 劑(Biotech化ading Partners)測定透明質酸濃度。將減去與背景相當的吸光度后的值應 用于利用標準物質預先制作的標準曲線，算出合成膚添加組中的培養上清中的透明質酸濃 度。
[0213] 將結果示于圖15。由圖15表明，在合成膚No.6和作為其片段的合成膚No. 1運兩者 中均確認到透明質酸產生促進作用。
[0214] [實施例6:利用合成膚的骨密度恢復試驗]
[0215] 對3周齡的Sprague-Dawley系雄性大鼠給予低巧飲食m碳酸巧計為0.05%)，進 行1周預飼養后，轉換為普通飲食碳酸巧計為1.2%)，使用胃管天1次分別強制口服 給藥7天合成膚(No.l)或生理食鹽液(對照）。合成膚的用量為Img/kg/天、lOmg/kg/天或 lOOmg/kg/天。在第7天的口服給藥后，將大鼠在麻醉下放血使其安樂死，摘除股骨和腔骨， 利用雙能X射線吸收測定(DXA)法和周圍骨定量的計算機斷層攝影(pQCT)法進行腔骨和股 骨的骨量和骨形態測量。結果，與對照組相比，在合成膚給藥組中確認到腔骨的長度、重量 和骨密度增加的傾向，顯示出促進了因巧缺乏而降低的骨密度的恢復。
[0216] [實施例7:使用卵巢摘除大鼠的閉經后骨質疏松癥模型中的研究]
[0217] 對實施了卵巢摘除手術(0VX)的雌性大鼠（8月齡、各10例/組)從手術次日開始使 用胃管W1天1次強制口服給藥6個月的合成膚No. 1。合成膚的用量為Img/kg/天、lOmg/kg/ 天或1 OOmg/kg/天。結果，在0VX-合成膚給藥組中，隨著合成膚給藥量的增加，股骨骨干端遠 端部的骨密度增加，與0VX對照組(合成膚非給藥組)相比確認到顯著的增加。另外，在中等 用量給藥組（lOmg/kg/天)和高用量給藥組（lOOmg/kg/天）中，與未摘除卵巢的假手術組為 同等程度W上。另外，關于骨形態測量參數，在ovx-合成膚給藥組中，隨著給藥量的增加，腔 骨骨干端近端部的松質骨骨量增加，與0VX對照組相比確認到顯著的增加，在中用量給藥組 和高用量給藥組中，與未摘除卵巢的假手術組為同等程度W上。另外，由0VX導致的骨小梁 數和骨小梁寬度的減少W及骨小梁間隔的增大在0VX-合成膚給藥組中觀察到被抑制的傾 向。
[0218] [實施例8:成熟大鼠和老年大鼠中的骨形成促進作用]
[0219] 對成熟雌性大鼠（8月齡、各10例/組)使用胃管則天1次強制口服給藥20周合成膚 No. 1。合成膚的用量為Img/kg/天、lOmg/kg/天或lOOmg/kg/天。另外，作為陽性對照，W1天1 次連續皮下給藥20周阿侖麟酸鋼水合物（W下稱為"阿侖麟酸"）（300yg/kg)。結果，在給藥 結束時，股骨的骨密度和腔骨骨干端近端部的松質骨骨量在合成膚給藥組和阿侖麟酸給藥 組中與對照組相比顯著地增加，合成膚給藥組和阿侖麟酸給藥組中的增加程度為同等程 度。
[0220] 對老年雌性大鼠（13~14月齡、各10例/組)使用胃管則天1次強制口服給藥20周 合成膚No. 1。合成膚的用量為Img/kg/天、lOmg/kg/天或lOOmg/kg/天。另外，作為陽性對照， 天1次連續皮下給藥20周阿侖麟酸(300yg/kg)。結果，股骨的骨密度和腔骨骨干端近端 部的松質骨骨量在合成膚給藥組中W用量依賴性的方式增加。
[0221] [實施例9:破骨細胞培養系中的骨吸收抑制作用]
[0222] 將由兔的長管骨和肩腫骨制備的破骨細胞粗級分在象牙切片上在合成膚(0.0001 ~1000皿ol/L)存在下培養48小時，結果，確認到濃度依賴性的吸收陷窩的總面積的減少。 另外，將對破骨細胞粗級分進行膠原蛋白處理而制備的分離破骨細胞利用合成膚(0.0001 ~lOOOymol/L)進行15分鐘預處理后，在象牙切片上培養24小時，結果，確認到濃度依賴性 的吸收陷窩的總面積的減少。
[0223] [實施例10:使用合成膚的間充質干細胞增殖促進活性的研究]
[0224] 將小鼠間充質干細胞10T1/2(JCRB細胞編號：JCRB9080)或ST2(理研BRC ID: RCB0224) W每孔5000個接種到裝有添加了 10%胎牛血清的DMEM培養基的96孔板中，分別W 0.1~lOOnmol/ml添加合成膚，培養72小時。每10化L培養液添加10化的細胞計數試劑盒8 (同仁化學研究所），在37°C下解育1~4小時。然后，使用酶標儀對450nm下的吸光度進行測 定。結果，通過添加合成膚，1〇1'1/^2和5了2的增殖活性顯著升高。
[0225] [實施例11:使用合成膚的間充質干細胞分化誘導作用的研究]
[02%]將小鼠間充質干細胞10T1/2或ST2W每孔5000個接種到裝有添加了 10%胎牛血清 的DMEM培養基的96孔板中，分別W0.1~lOOnmol/ml添加合成膚，培養4天后，更換為添加有 0甘油憐酸I(lOmM)和抗壞血酸巧化g/ml)的DMEM培養基。此時，對含有上述合成膚的培養基 和不含上述合成膚的培養基分別進行研究。在該培養基中進一步進行3天培養(總計為7天） 后，將細胞固定。固定后，使用堿性憐酸酶底物試劑盒KVECT0R Red〉(Vector實驗室)進行 堿性憐酸酶的活性染色。結果，在添加有合成膚的細胞中，確認到強堿性憐酸酶活性。另一 方面，在非添加的細胞中，未確認到運樣的活性。即，通過添加合成膚，在4天運樣較短的時 間內，能夠有效地誘導從未分化的間充質干細胞向成骨細胞樣細胞(骨祖細胞)的分化。
[0227] [實施例12:使用合成膚的軟骨祖細胞的分化誘導作用的研究]
[0228] 將具有向軟骨細胞分化的分化能力的小鼠 EC (胚胎癌)來源的克隆化細胞株ATD巧 (理研BRC ID: RCB0565)在含有5 % FBS的DMEM/F-12培養基中進行培養。將ATDC細胞W 2 X 1〇4個/孔接種到48孔板中。24小時后除去培養上清，添加含有lOng/mL膜島素的DMEM/F-12 培養基。同時W 0.1~100皿01/ml的濃度添加合成膚。作為陽性對照，添加 Ing/mL和5ng/mL 的BMP-2或BMP-4(R&D)。每3~4天更換培養基。
[0229] 進一步，為了確認合成膚與BMP-2或BMP-4的協同效果，同時添加0.1~lOOnmol/ml 的合成膚與Ing/mL的BMP-2或BMP-4。一邊反復更換培養基，一邊進行14天培養后，利用10 % 福爾馬林中性緩沖液進行細胞的固定。固定后，利用阿利新藍液進行4小時染色，清洗色素 后使板干燥，拍攝照片。
[0230] 在小鼠軟骨祖細胞ATDC5細胞中，通過添加合成膚，確認到阿利新藍陽性結節的形 成，且其數量依賴于濃度而增加。運顯示合成膚使ATDC5細胞分化為軟骨細胞。此外，顯示出 與BMP-2或BMP-4的協同效果。
[0231] [實施例13:使用成骨樣細胞的骨形成因子的分析]
[0232] 使用W合成膚濃度為2.扣g/mL、扣g/mL、10yg/mL的方式分別添加有合成膚的含有 10 %FBS的α-ΜΕΜ培養液，在37 °C、5 % C02-95 %空氣的條件下將小鼠成骨細胞樣細胞株 MC3T3-E1亞克隆-4(ATCC No.C化-2593)培養72小時。培養結束后，利用對硝基苯基憐酸底 物法測定成骨樣細胞的堿性憐酸酶(ALP)活性。進一步，使用骨巧蛋白測定用試劑盒(寶生 物），利用化ISA測定培養上清中的骨巧蛋白（0CN)量。結果，ALP活性和0CN量依賴于合成膚 的添加濃度而顯示出增加傾向。ALP、0CN被認為是反映骨形成功能的因子，暗示出各合成膚 通過運樣的相關因子促進成骨樣細胞的骨形成功能。
[0233] [實施例14:利用合成膚的生長軟骨和初級松質骨的骨形成促進作用的研究]
[0234] 使用胃管天1次對4周齡的Crlj:Wl雄性大鼠分別強制口服給藥7天合成膚 (No.l)或注射水閑照）（各組:n = 3)。合成膚(No.l)的用量為lOOmg/kg/天。另外，作為陽性 對照，W5(K)yg/kg/天、1天1次皮下給藥7天人生長激素化GH;諾德欣、日本標準商品分類編 號872412)。作為骨形成部位的巧光標記，在給藥第4天后皮下給予四環素（20mg/kg)、在給 藥第6天后皮下給予巧黃綠素（lOmg/kg)。在第7天給藥樣本后，在斷食條件下飼養大鼠。24 小時后采血，然后將大鼠在麻醉下放血使其安樂死，采集腔骨(參考圖16)。然后，對于腔骨 近端部制作非脫巧標本，利用巧光顯微鏡(奧林己斯公司制造的BX-53)獲取圖像，使用形態 測量系統化istometry RT digitizer,System Su卵ly Co.,Ltd.)和分析軟件（CSS-840松 質骨形態測量版，System Supply Co.,Ltd.)進行骨形態測量。在生長軟骨的縱向的生長率 (Xo.G.R;Longitudinal Growth Rate)的測量中，關于生長率，測量四環素和巧黃綠素的標 記寬度，由運些巧光標記的給予間隔（2天)算出每一天的生長寬度。
[0235] 結果，帕Η給藥組和No. 1給藥組相對于對照組顯示出顯著的骨生長促進作用，No. 1 給藥組相對于MM給藥組也顯示出顯著的骨生長促進作用（圖17)。此外，相對于對照組和 hGH給藥組，No.l給藥組高頻率地檢測出攝取到初級松質骨中的巧光標記，暗示出在生長期 中早期誘導了松質骨的形成(圖18;白色部位）。
[0236] 另外，對血清中的膜島素樣生長因子（IGF-1)濃度進行化ISA(R&D公司制造的小 鼠/大鼠 IGF-I Quant化ine ELISA試劑盒;MG100)測定，結果，相對于對照組，h細給藥組和 No.l給藥組的IGF-1濃度為高值（圖19)。暗示出在生長期中參與骨、肌肉發育的IGF-1的增 加可能是帶來上述骨生長促進作用的因素之一。
[0237] 由運些結果表明，本發明的膚通過口服給藥可促進縱向的骨生長和作為內部結構 的松質骨的形成。
[0238] [實施例15:利用合成膚的生長軟骨和次級松質骨的骨形成促進作用的研究]
[0239] 使用胃管天1次對4周齡的Crlj:Wl雄性大鼠分別強制口服給藥21天合成膚 (No.l)或注射水(對照）（各組:n = 3)。合成膚的用量為lOOmg/kg/天。另外，作為陽性對照， W500yg/kg/天、1天1次皮下給藥21天人生長激素化GH;諾德欣、日本標準商品分類編號 872412)。作為骨形成部位的巧光標記，在給藥第18天后皮下給予四環素(20mg/kg)、在給藥 第20天后皮下給予巧黃綠素（lOmg/kg)。在第21天給藥樣本后，在斷食條件下飼養大鼠。24 小時后，將大鼠在麻醉下放血使其安樂死，采集腔骨(參考圖20)。然后，對于腔骨近端部制 作非脫巧標本，利用巧光顯微鏡（奧林己斯公司制造的BX-53)獲取圖像，使用形態測量系統 巧istometry RT digitizer,System Su卵ly Co.,Ltd.)和分析軟件（CSS-840松質骨形態 測量版，System Supply Co.，Ltd.)進行骨形態測量。在骨端軟骨的縱向的生長率化ο.G.R; Longitudinal Growth Rate)的測量中，關于生長率，測量四環素和巧黃綠素的標記寬度， 由運些巧光標記的給予間隔（2天)算出每一天的生長寬度。
[0240] 結果，帕Η給藥組和No. 1給藥組相對于對照組顯著地顯示出骨生長促進作用，No. 1 給藥組相對于MiH給藥組也顯示出顯著的骨生長促進作用（圖21)。由此顯示出，本發明的膚 在更長期的口服給藥條件下也可促進縱向的骨生長。
[0241 ] 進一步，利用上述分析系統對次級松質骨的骨量（BV;Bone volume/TV;Tissue volume)進行分析，結果，相對于對照組和hGH給藥組，No. 1給藥組的次級松質骨的骨量為高 值（圖22)。另外，No.l給藥組中，成骨細胞所局限的骨表面積相對于總骨表面積的比例 (0b.S;0steoblast surface/BS;Bone surface)為高值（圖23)，破骨細胞所局限的骨表面 積相對于總骨表面積的比例（Oc . S ;0steoclast surface/BS;Bone su;rface)為低值（圖 24)。
[0242] 由運些結果顯示出，通過口服給藥本發明的膚，能夠誘導成骨細胞的增加、向破骨 細胞的分化抑制所介導的形成占優勢的骨代謝。
[0243] [實施例16:利用合成膚的次級松質骨的骨巧化速度的增加作用的研究]
[0244] 使用胃管天1次對4周齡的Crlj:Wl雄性大鼠分別強制口服給藥7天合成膚 (No. 1)或注射水(對照）（各組:n=10)。合成膚的用量為Img/kg/天、lOmg/kg/天和lOOmg/ kg/天。另外，作為陽性對照，W5(K)yg/kg/天、1天1次皮下給藥7天人生長激素化GH;諾德欣、 日本標準商品分類編號872412)。作為骨形成部位的巧光標記，在給藥第4天后皮下給予四 環素(20mg/kg)、在給藥第6天后皮下給予巧黃綠素（lOmg/kg)。在第7天給藥樣本后，在斷食 條件下飼養大鼠。24小時后，將大鼠在麻醉下放血使其安樂死，采集腔骨。然后，對于腔骨近 端部制作非脫巧標本，利用巧光顯微鏡（奧林己斯公司制造的BX-53)獲取圖像，使用形態測 量系統化istomehy RT digitizer,System Su卵ly Co.,Ltd.)和分析軟件（CSS-840松質 骨形態測量版，System Supply Co.，Ltd.)進行骨形態測量。關于次級松質骨的骨巧化速度 (MAR:Mineral Apposition Rate)，測量次級松質骨中的四環素和巧黃綠素的標記寬度，由 運些巧光標記的給予間隔（2天)算出每一天的骨巧化速度。結果，與對照組相比，hGH給藥組 和No.l給藥組的骨巧化速度顯著增力日。此外，No.l給藥組中，在lOmg/kg/天W上時，相對于 hGH給藥組也顯示出顯著的骨巧化速度的增加（圖26)。齡.1給藥組中，成骨細胞所局限的骨 表面積相對于總骨表面積的比例（Ob. S;Osteoblast surface/BS;Bone su;rface)為高值 (圖27)，單位骨組織的成骨細胞數(N.Ob;Numbe;r of osteoblast/TV:Tissue volume)也為 高值(圖28)。認為No. 1給藥組中觀察到的次級松質骨的骨巧化速度的增加可能起因于運樣 的成骨細胞的增加。另外，算出W骨表面積為基準在1年間所形成的骨量作為骨形成速度 (BFR;Bone formation rate/BS;Bone surface),結果，No. 1 給藥組中為高值（圖 29) eNo.l 給藥組中，在lOmg/kg/天W上時，相對于對照組顯示出顯著的骨形成速度的增加。
[0245] 由運些結果顯示出，通過口服給藥本發明的膚，次級松質骨的骨巧化得到促進，骨 形成速度增加。
[0246] 需要說明的是，本發明并不限定于上述各實施方式和實施例，可W在權利要求書 所示的范圍內進行各種變更，將不同實施方式中分別公開的技術手段適當組合而得到的實 施方式也包含在本發明的技術范圍中。另外，本說明書中記載的學術文獻和專利文獻全部 W參考的形式援引于本說明書中。
【主權項】
1. 一種肽或其衍生物或其鹽，所述肽包含下述(a)、（b)或（c)的氨基酸序列，氨基酸殘 基數為1 〇〇以下，且具有成骨細胞增殖促進活性， (a) Val-Asn-Pr〇-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu-Asp-Glu-Se;r-Se;r-P;r〇-Ty;r-Glu(序列號1); (b) 在(a)的氨基酸序列中具有1~3個氨基酸的保守性置換或缺失的氨基酸序列； (c) 由（a)或(b)的氨基酸序列中至少4個連續的氨基酸構成的氨基酸序列。2. 如權利要求1所述的肽或其衍生物或其鹽，其中，具有至少一個磷酸化絲氨酸。3. 如權利要求1或2所述的肽或其衍生物或其鹽，所述肽為卵黃脂磷蛋白1的片段。4. 如權利要求1~3中任一項所述的肽或其衍生物或其鹽，其還具有軟骨細胞增殖促進 活性和/或透明質酸產生促進活性。5. 如權利要求1~4中任一項所述的肽或其衍生物或其鹽，所述肽由選自下述（i)~ (vi)中的氨基酸序列構成， (i )Val-Asn-Pr〇-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu-Asp-Glu-Se;r-Se;r-P;r〇-Ty;r-Glu(序列號1); (ii) Val-Asn-Pr〇-Glu-Ser-Glu-Glu-Glu(序列號2); (iii) Val-Asn-Pr〇-Glu-Ser-Glu-Glu(序列號3); (iv) Pr〇-Glu-Ser-Glu-Glu(序列號4); (v) Asp-Glu-Ser-Ser-Pro-Tyr-Glu (序列號5); (vi )Glu-Asp-Glu-Ser-Ser-P;r〇-Ty;r-Glu(序列號6) 〇6. -種多核苷酸，其編碼權利要求1~5中任一項所述的肽。7. -種表達載體，其含有權利要求6所述的多核苷酸。8. -種轉化體，其利用權利要求7所述的重組載體進行了轉化。9. 一種骨形成促進劑，其特征在于，含有權利要求1~5中任一項所述的肽或其衍生物 或其鹽，或者含有卵黃脂磷蛋白1或其衍生物或其鹽。10. 如權利要求9所述的骨形成促進劑，其具有成骨細胞增殖促進作用。11. 一種骨吸收抑制劑，其特征在于，含有權利要求1~5中任一項所述的肽或其衍生物 或其鹽，或者含有卵黃脂磷蛋白1或其衍生物或其鹽。12. -種軟骨細胞增殖促進劑，其特征在于，含有權利要求1~5中任一項所述的肽或其 衍生物或其鹽，或者含有卵黃脂磷蛋白1或其衍生物或其鹽。13. -種透明質酸產生促進劑，其特征在于，含有權利要求1~5中任一項所述的肽或其 衍生物或其鹽，或者含有卵黃脂磷蛋白1或其衍生物或其鹽。14. 一種軟骨祖細胞分化誘導劑，其特征在于，含有權利要求1~5中任一項所述的肽或 其衍生物或其鹽，或者含有卵黃脂磷蛋白1或其衍生物或其鹽。15. -種間充質干細胞增殖促進劑，其特征在于，含有權利要求1~5中任一項所述的肽 或其衍生物或其鹽，或者含有卵黃脂磷蛋白1或其衍生物或其鹽。16. -種間充質干細胞分化誘導劑，其特征在于，含有權利要求1~5中任一項所述的肽 或其衍生物或其鹽，或者含有卵黃脂磷蛋白1或其衍生物或其鹽。17. 如權利要求9~16中任一項所述的劑，其用于口服給藥。18. -種藥物，其特征在于，含有權利要求1~5中任一項所述的肽或其衍生物或其鹽， 或者含有卵黃脂磷蛋白1或其衍生物或其鹽。19. 如權利要求18所述的藥物，其用于促進骨形成，或者用于預防或改善軟骨障礙或關 節疾病。20. -種飲食品，其特征在于，含有權利要求1~5中任一項所述的肽或其衍生物或其 鹽，或者含有卵黃脂磷蛋白1或其衍生物或其鹽。21. 如權利要求20所述的飲食品，其用于促進骨形成，或者用于預防或改善軟骨障礙或 關節疾病。22. -種營養補充劑，其特征在于，含有權利要求1~5中任一項所述的肽或其衍生物或 其鹽，或者含有卵黃脂磷蛋白1或其衍生物或其鹽。23. 如權利要求22所述的營養補充劑，其用于促進骨形成，或者用于預防或改善軟骨障 礙或關節疾病。24. -種食品添加物，其特征在于，含有權利要求1~5中任一項所述的肽或其衍生物或 其鹽，或者含有卵黃脂磷蛋白1或其衍生物或其鹽。25. 如權利要求24所述的食品添加物，其用于促進骨形成，或者用于預防或改善軟骨障 礙或關節疾病。26. -種化妝品，其特征在于，含有權利要求1~5中任一項所述的肽或其衍生物或其 鹽，或者含有卵黃脂磷蛋白1或其衍生物或其鹽。27. 如權利要求26所述的化妝品，其用于促進骨形成，或者用于預防或改善軟骨障礙或 關節疾病。28. -種骨形成促進方法，其特征在于，對哺乳動物給藥有效量的權利要求1~5中任一 項所述的肽或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂磷蛋白1或其衍生物或其鹽。29. -種軟骨障礙或關節疾病的預防或改善方法，其特征在于，對哺乳動物給藥有效量 的權利要求1~5中任一項所述的肽或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂磷蛋白1或其衍生物或 其鹽。30. 在骨形成促進、或者軟骨障礙或關節疾病的預防或改善中使用的權利要求1~5中 任一項所述的肽或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂磷蛋白1或其衍生物或其鹽。31. 權利要求1~5中任一項所述的肽或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂磷蛋白1或其衍生 物或其鹽在促進骨形成、或者預防或改善軟骨障礙或關節疾病中的應用。32. 權利要求1~5中任一項所述的肽或其衍生物或其鹽、或者卵黃脂磷蛋白1或其衍生 物或其鹽在制造用于促進骨形成、或者用于預防或改善軟骨障礙或關節疾病的藥物中的應 用。
【文檔編號】A23L33/18GK106029685SQ201580010279
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2015年2月25日
【發明人】山崎千廣, 安芝英, 原田清佑, 渡部和哉, 金武祚
【申請人】富爾瑪株式會社