專利名稱：細胞測試體系及構建方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及細胞生物學和分子生物學領域，尤其涉及細胞測試體系及構建方法和用途。
背景技術：
在這2種細胞模型中，我們應用了一種名為d2EGFP的報告基因。GFP(greenfluorescent protein)綠色熒光蛋白是來自水母的的基因報告分子，可用于活體、原位、即時的檢測基因表達及蛋白定位，不需要附加蛋白或底物，GFP在藍光激發下會發出明亮的綠色熒光。GFP熒光穩定，不依賴于物種，對活細胞沒有損害。對GFP改進得到EGFP(enhanced green fluorescent protein)激發出的熒光比野生型GFP強約35倍，選用人類偏愛的密碼子使表達量提高。d2EGFP是在EGFP的基礎上對其進行了改造，由EGFP融合了小鼠鳥氨酸脫羧酶(MODC)的422-461氨基酸殘基而來，MODC的422-461區域含有PEST功能域，能夠促使蛋白降解，在不降低表達強度的前提下減小了半衰期。哺乳動物中EGFP的表達非常穩定，超過24小時。而d2EGFP的半衰期僅為2個小時。d2EGFP蛋白可以用于精確測定啟動子調節的mRNA轉錄，基因表達。
我們所用的2種細胞系分別是CHO-K1細胞系和HEK-293細胞系。CHO-K1細胞系是中國倉鼠卵巢細胞系，HEK-293是人胚胎腎細胞系。二者均為貼壁生長的細胞系。
發明內容
本發明的目的是提供一種細胞測試體系及構建方法和用途。
細胞測試體系是CHO-K1/d2EGFP和HEK-293/d2EGFP細胞系，并且其中包含由4xCRE和HSV-TK的DNA序列所構建的4xCRE-d2EGFP質粒。
細胞測試體系構建方法的步驟如下1)設計4xCRE-HSV-TK序列，人工合成相應的寡核苷酸；2)以合成的4xCRE-HSV-TK寡核苷酸為模板，設計引物擴增出相應的PCR產物；3)將上述的PCR產物克隆到d2EGFP載體上；4)測序鑒定連接產物，挑選出正確插入有4xCRE-HSV-TK序列的重組質粒，構建的質粒命名為4xCRE-d2EGFP；
5)將4x CRE-d2EGFP轉入CHO-K1和HEK-293細胞中；6)用G418抗生素篩選轉染的CHO-K1和HEK-293細胞，直至出現抗性克隆；7)挑選出抗性細胞克隆；8)對篩選的細胞克隆進行功能上的測試。
細胞測試體系的用途是用于篩選與cAMP信號傳導途徑相互作用的化合物。
本發明的優點是靈敏度高，特異性強，檢測方便，經濟，易于觀察，可應用于大規模藥物篩選，縮短藥物研發周期，減少研發費用。
附圖是構建細胞模型的原理圖。
具體實施例方式
我們首先構建4xCRE-d2EGFP質粒(4x即重復4次)，將4xCRE連同HSV-tk啟動子克隆入報告基因d2EGFP上，HSV-tk(Herpes simplex virus thymidinekinase)是單純皰疹病毒胸苷激酶。構建出的質粒轉化CHO-K1與HEK-293細胞系，用G418篩選，挑選出克隆鑒定，陽性克隆加入foscolin刺激后(foscolin是一種植物提取物，具有使細胞中cAMP濃度升高的作用)，5個小時后熒光顯微鏡下觀察可見有綠色熒光。
我們成功的構建了可供藥物篩選及研究的報告基因細胞測試體系。這2種測試體系可以用來檢測細胞中cAMP濃度的變化，所有基于cAMP信號轉導路徑的GPCR(G protein coupled receptor)(G蛋白偶聯受體)都可用此模型來篩選激動劑以及拮抗劑。從篩選出化合物中，有望找出有價值的藥物。此模型靈敏度高，特異性強。檢測方便，經濟，易于觀察。
構建報告基因細胞測試體系的方法為1)設計4xCRE-HSV-TK序列，人工合成相應的寡核苷酸。
2)以合成的4xCRE-HSV-TK寡核苷酸為模板，設計引物擴增出相應的PCR產物。
3)將上述的PCR產物克隆到d2EGFP載體上。
4)測序鑒定連接產物，挑選出正確插入有4xCRE-HSV-TK序列的重組質粒，構建的質粒命名為4xCRE-d2EGFP。
5)將4x CRE-d2EGFP轉入CHO-K1和HEK-293細胞中。
6)用G418抗生素篩選轉染的CHO-K1和HEK-293細胞，直至出現抗性克隆。
7)挑選出抗性細胞克隆。
8)對篩選的細胞克隆進行功能上的測試。
首先，本發明設計一段DNA序列，此序列含有4xCRE序列和HSV-TK序列，CRE(cAMP response element)是與磷酸化的CREB蛋白結合的DNA序列，4x即重復4次。HSV-TK是單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶啟動子，可用于啟動基因在哺乳動物中表達，表達強度為中等。對這部分DNA序列的設計是本發明的關鍵之處，人工合成相應的寡核苷酸。
根據本發明所公開的有關核苷酸序列來設計引物，引物設計的時候在5’端加上了BamH I酶切位點序列以方便連接到其它的載體上。以合成的4xCRE-HSV-TK寡核苷酸為模板，擴增出相應的PCR產物。
在此基礎上，本發明將上述的PCR產物克隆到d2EGFP載體上。d2EGFP載體含有編碼d2EGFP的DNA序列，在d2EGFP基因的上游沒有啟動子，方便因不同的需要而插入各種啟動子。該載體上有編碼新霉素(neomycin)的基因可用于真核細胞篩選標記，同時也可以作為原核細胞的篩選標記，可以用卡那霉素來篩選。連接的過程首先要BamH I內切酶將d2EGFP載體上切成線性，并用同樣的內切酶作用PCR產物，然后將酶切后的產物以適當比例混合，在T4連接酶的作用下完成連接。
將上述的連接產物轉化大腸桿菌DH5α，涂布到含有卡那霉素的平板上。隨機挑選菌落，小量擴增培養并提取質粒，測序鑒定插入有4xCRE-HSV-TK序列的陽性質粒。克隆成功的質粒應含有4xCRE-HSV-TK序列，位于d2EGFP基因的上游并與設計的序列完全一致，將其命名為4x CRE-d2EGFP。該質粒包含本發明的4xCRE序列，以及HSV-tk啟動子和d2EGFP報告基因。
本發明進一步地將4xCRE-d2EGFP轉入CHO-K1細胞中和HEK-293細胞中，二者均為貼壁生長的細胞系。CHO-K1細胞應用F12培養基+10％胎牛血清培養，每隔2-3天更換一次培養液。HEK-293細胞應用DMEM培養基+10％胎牛血清培養，每隔2-3天更換一次培養液。二者均用0.25％胰蛋白酶消化傳代。轉染的方式可以用脂質體方法，磷酸鈣方法，電轉化等轉染方式。在本發明中，我們應用的是脂質體轉染的方法。
轉染后的細胞可以用G418抗生素篩選出抗性克隆。G418是一種類新霉素的氨基糖苷，可以抑制原核和真核細胞蛋白合成，4xCRE-d2EGFP載體上含有neomycin抗性基因，因此G418可以用來篩選穩定轉染4xCRE-d2EGFP質粒的細胞。于轉染后2天在CHO-K1細胞中和HEK-293細胞中加入G418(600ug/ml)，每隔2到3天更換一次培養液，直至出現抗性克隆。挑取若干個抗性克隆到96孔板上繼續培養，待細胞達到一定數目后進行功能上的測試，具體方法是加入foskolin(10uM)，foscolin是一種植物提取物，具有使細胞中cAMP濃度升高的作用。5個小時后在熒光顯微鏡下觀察，比較加入foskolin前后熒光強度的改變。可以觀察到未加入foskolin時細胞沒有綠色熒光即沒有d2EGFP的表達，而加入后有很強的綠色熒光，d2EGFP的表達很強。化合物篩選方法的步驟如下1)將待測化合物加入細胞測試體系；2)采用熒光顯微鏡觀察是否有綠色熒光變化來檢測細胞中cAMP濃度的改變；3)所有能使測試細胞發生綠色熒光變化的化合物即為與cAMP信號轉導路徑相互作用的化合物。
序列表1.SEQ ID NO.1 4xCRE-HSV-TK序列(1)序列特征a.長度210堿基b.類型DNAc.鏈型單鏈d.幾何結構線性(2)分子類型核苷酸(3)序列描述ggctggcgta gggcctgcgt cagctgcagc ccgccggagc tcgacgtcac agtatgacgg 60ccatgggagc tcaaattgac gtcatggtaa aaattgacgt catggtaaga attcgaacac120gcagatgcag tcggggcggc gcggtccgag gtccacttcg ccatattaag gtgacgcgtg180tggcctcgaa caccgagcga ccctgcacgt 210
權利要求
1.一種細胞測試體系，其特征在于它是CHO-K1/d2EGFP和HEK-293/d2EGFP細胞系，并且其中包含由4xCRE和HSV-TK的DNA序列所構建的4xCRE-d2EGFP質粒。
2.根據權利要求1所述的一種細胞測試體系，其特征在于所說的4xCRE和HSV-TK的DNA序列為SEQ ID NO.1
3.一種細胞測試體系構建方法，其特征在于它的步驟如下1)設計4xCRE-HSV-TK序列，人工合成相應的寡核苷酸；2)以合成的4xCRE-HSV-TK寡核苷酸為模板，設計引物擴增出相應的PCR產物；3)將上述的PCR產物克隆到d2EGFP載體上；4)測序鑒定連接產物，挑選出正確插入有4xCRE-HSV-TK序列的重組質粒，構建的質粒命名為4xCRE-d2EGFP；5)將4x CRE-d2EGFP轉入CHO-K1和HEK-293細胞中；6)用G418抗生素篩選轉染的CHO-K1和HEK-293細胞，直至出現抗性克隆；7)挑選出抗性細胞克隆；8)對篩選的細胞克隆進行功能上的測試。
4.根據權利要求3所述的一種細胞測試體系，其特征在于所說的4xCRE和HSV-TK的DNA序列為SEQ ID NO.1
5.一種細胞測試體系的用途，其特征在于它用于篩選與cAMP信號傳導途徑相互作用的化合物。
6.根據權利要求5所述的一種細胞測試體系的用途，其特征在于所說的化合物篩選方法的步驟如下1)將待測化合物加入細胞測試體系；2)采用熒光顯微鏡觀察是否有綠色熒光變化來檢測細胞中cAMP濃度的改變；3)所有能使測試細胞發生綠色熒光變化的化合物即為與cAMP信號轉導路徑相互作用的化合物。
全文摘要
本發明公開了一種細胞測試體系及構建方法和用途。細胞測試體系是CHO－K1/d2EGFP和HEK－293/d2EGFP細胞系，并且其中包含由4xCRE和HSV－TK的DNA序列所構建的4xCRE－d2EGFP質粒。細胞測試體系構建方法是設計4xCRE－HSV－TK序列，人工合成相應的寡核苷酸；以該寡核苷酸為模板，設計引物進行PCR擴增并克隆到d2EGFP載體上；測序鑒定連接產物，挑選出正確的重組質粒，將質粒轉入CHO－K1和HEK－293細胞中；用G418抗生素篩選抗性克隆并進行功能測試。細胞測試體系的用途是用于篩選與cAMP信號傳導途徑相互作用的化合物。本發明的優點是靈敏度高，特異性強，檢測方便，經濟，易于觀察，可應用于大規模藥物篩選，縮短藥物研發周期，減少研發費用。
文檔編號C12Q1/68GK1414108SQ02136218
公開日2003年4月30日 申請日期2002年7月24日 優先權日2002年7月24日
發明者閻東升, 董偉, 談學海, 胡詠武, 汪建 申請人:杭州華大基因研發中心