可直接檢測基因的免沖洗pcr擴增管的制作方法

專利名稱：可直接檢測基因的免沖洗pcr擴增管的制作方法
專利說明
一、技術領域本實用新型涉及一種用于基因擴增和直接檢測的PCR擴增管(PCR擴增管是本領域技術人員熟知的技術名詞)，尤其是指一種可直接檢測擴增產物的免沖洗PCR擴增管。
二、技術背景目前，在分子生物學研究和醫學臨床診斷過程中，聚合酶鏈式反應(PCR)技術是不可缺少的。PCR通常是在一個封閉的管腔內進行，它可以將被檢測的靶基因放大數萬至數百萬倍。但是，基因擴增之后，一般需要用電泳等方法對擴增產物進行檢測。由于PCR方法靈敏度極高，其擴增產物在檢測過程中不可避免的會進入空氣中。當進行下一次試驗時，這些飄浮在空中的產物將可能又被擴增出來，這就是PCR檢測容易獲得所謂“假陽性”的原因。為此，國際上一些生物技術公司發展了封閉式的基因擴增和檢測技術。如熒光定量PCR技術。但是，該技術需要有十分復雜的動態光學檢測裝置，檢測儀器十分復雜，在我國很難推廣。同時，該技術每次試驗只能檢測一個基因的信息，不能滿足生物信息時代人們需要對大量基因信息的檢測的要求。
基因芯片技術為人們同時檢測大量基因信息提供了工具。基因芯片把許多不同的核酸探針(單鏈寡核苷酸)固定于玻片上。把樣品中基因的擴增產物標記熒光，并與芯片上的核酸探針進行雜交，通過熒光掃描儀進行檢測。雖然基因芯片獲得的信息量大，但是目前大部分基因芯片主要用于細胞的mRNA表達檢測等實驗室研究應用。在重要病原微生物檢測方面，至今沒有成熟的應用實例和過硬的產品問世。就其主要原因在于樣品的處理、擴增標記、雜交、檢測等操作過程都是分開來單獨進行的，由此導致現有技術存在著操作繁瑣、復雜的缺陷，并因此而增加了污染的機會，降低了所得結果的可靠性。盡管目前已將基因擴增技術與芯片檢測方法合為一體，但其特點是整個基因擴增過程在一個微反應池中進行，因而，需要對器件的同一部位反復地升溫降溫，這將無法對結果進行動態跟蹤和實時定量分析。為此，國內外一些研究者提出把基因芯片與微流體技術相結合，來實現所有操作過程的一體化。申請人對此也進行了研究，并已提出了基因擴增微陣列探針循環檢測型生物芯片等。然而，由于這種芯片制備困難，并需要研制專門的反應器與之配套，故其成本很高。同時，基因芯片要求靶基因的擴增產物標記熒光，通過熒光信號來檢測核酸探針的雜交狀態。這就要求在樣品處理過程中要摻入熒光，這不僅提高了樣品處理的成本，增加了難度和不確定因素。而且，在這個過程中因標記效率問題，影響檢測的可靠性。同時，由于整個操作過程的的復雜性提高，如樣品處理過程的條件控制和雜交后非特異探針的反復清洗等，不利于集成化檢測。因此，發展可以對被檢測的基因序列進行非標記檢測的低成本的生物芯片技術是實現生物芯片在醫學和生命科學等領域中大量實際應用的關鍵之一。
三、技術內容技術問題本實用新型提供一種能使基因擴增、雜交及檢測一體化操作方法的操作得以簡便、靶基因擴增時無需摻入熒光、成本得以降低且可使所得結果的可靠性得以提高的可直接檢測基因的免沖洗PCR擴增管。
技術方案本實用新型即一種可直接檢測基因的免沖洗PCR擴增管，包括反應管且該反應管由管蓋11和管體12組成，在用于PCR的反應管1內固定有分子信標2。有益效果 ①由于本實用新型將分子信標設置于反應管內反應管自身能夠構成一個相對封閉的空間，使基因擴增、雜交及檢測一體化的操作方法可以按如下步驟在上述相對封閉的空間內完成A)將制備好的待擴增基因提取物、擴增液(包括相應的引物和酶等)加入反應管本體中，把蓋帽緊扣在反應管上；B)把封閉好的反應管放置于相應的基因擴增儀中進行擴增；基因擴增儀可以使用各種流行的儀器，也可以是通過改進的專用的擴增雜交和檢測一體化儀器；C)將管內擴增后的溶液流倒固定的分子信標區域，與管內表面上的分子信標進行作用，控制一定的溫度使其進行特異性的雜交；D)通過光學檢測方法，讀出反應管上分子信標的熒光信號，從而獲得基因的雜交信息。而這種方法正是由于有了本實用新型，才能通過一些簡單的操作，實現基因擴增、雜交、檢測操作的連續，而且無需在靶基因的擴增過程中加入熒光基團等標記物，避免在PCR擴增后打開擴增管，以清洗非特異性雜交的靶基因，以及加入雜交液等操作，不僅簡化了操作步驟，更重要的是完全避免了PCR擴增產物的檢測假陽性并使該方法可以采用現有的設備或是對現有設備稍加改進后的設備，降低了成本。分子信標與普通的核酸探針(單鏈核酸探針)不同。分子信標是由熒光基團、熒光淬滅基團、和雙鏈核酸的莖桿區、單鏈環形核酸區等4部分組成的。其中，單鏈環形核酸區為分子信標與被檢測的靶基因雜交識別的區域。當分子信標與靶基因結合后，雙鏈核酸的莖稈被打開，從而使熒光集團和熒光淬滅基團之間的距離改變，引起分子信標的熒光發光性質的改變。而普通的核酸的DNA單鏈探針是通過與被標記有熒光分子的靶基因雜交，實現檢測的。分子信標一般直接在溶液中檢測靶基因，但這只能檢測一種靶基因。本實用新型用固定化的分子信標法檢測靶基因，不僅可以同時對多個基因進行檢測，而且可以無需對靶基因摻入熒光等特殊的操作處理，也無需對雜交后芯片上的非特異性吸附進行清洗，以降低熒光背景。本實用新型就是把分子信標直接固定于PCR擴增管內，在PRC擴增管內實現基因擴增和雜交檢測一體化。分子信標內的熒光基團和熒光猝滅基團，在雜交檢測時，用于與分子信標雜交的核酸片斷不需要進行熒光標記，雜交后，核酸片斷與分子信標結合，使分子信標內部具有的熒光基團和熒光猝滅基團在空間分開，其熒光基團的信號可以被檢測，同時，沒有進行雜交的分子信標具有的熒光基團和熒光猝滅基團在空間上保持微小距離，熒光信號不能被檢測到，所以不需要進行沖洗，減少了操作步驟，降低了檢測的難度。綜上，本實用新型能使基因擴增、雜交及檢測一體化操作方法的操作得以簡便、成本得以降低且可使所得結果的可靠性得以提高，并可實現免沖洗。
②由于本實用新型能使操作方法進行多遍擴增、雜交及檢測，故本實用新型能夠使該方法實現動態跟蹤檢測并獲得定量結果。
③本實用新型采用“將分子信標通過化學活性基團連接在透明窗口上”的連接，具有結合牢固，不容易脫離，可多次反復使用的優點，同時需要的檢測樣品少，分子探針的密度高。
④本實用新型“把分子信標固定于高分子凝膠介質中，再固定在透明窗口上”的技術措施提高了固定分子信標的密度，增強了雜交信號，使所得結果的可靠性得以進一步提高。
⑤本實用新型“把透明窗口分割成若干區域，分別在不同的區域上組裝具有不同或相同堿基排列方式的核酸序列分子信標”的方法，可以在一次PCR試驗中對數個甚至數萬個基因片斷進行雜交檢測，可進行高通量的檢測。
四

圖1是本實用新型的結構示意圖。
圖2是本實用新型分子信標的直接化學連接關系圖。
五、具體實施方案實施例1 一種可直接檢測基因的免沖洗PCR擴增管，包括反應管且該反應管由管蓋11和管體12組成，在用于PCR的反應管1內固定有分子信標2，在PCR反應管內固定分子信標的區域上有透明窗口3，分子信標2固定透明窗口3內側，在透明窗口3上設有化學活性其團層，分子信標2設在化學基團層上，該化學基團層可以采用氨基層、醛基層、氰基層、巰基層等本實施例可以采取如下具體辦法將分子信標通過化學集團層連接固定在透明窗口上1.在聚苯乙烯等透明塑料窗口、玻璃等表面上通過等離子體激活、紫外輻射激活、和化學激活等方法，在透明窗口表面上連接化學活性基團如氨基、醛基、氰基、巰基等，再利用上述化學活性基團與分子信標上的化學基團反應，把分子信標連接到透明窗口上。
2.對透明塑料窗口、玻璃表面的修飾方法有很多種，如戊二醛修飾法)、聚賴氨酸修飾法、巰基修飾法、多糖修飾法、BSA-NHS修飾法、水凝膠修飾法等，透明玻璃窗口的化學處理放入由1/3過氧化氫(30％)和2/3硫酸(18M)組成的溶液中，浸泡1小時(21)。再用去離子蒸餾水沖洗3遍；放入去離子蒸餾水煮沸10分鐘；在氬氣流下干燥，于干燥處保存備用。
氨基硅烷化處理將預處理后的基片浸入含有1％3-aminopropyltriethoxysilane(氨基硅烷)的95％丙酮/水的溶液10分鐘，取出后，用丙酮和去離子水沖洗干凈，在120℃下干燥45分鐘后，置于干燥處保存。將硅烷化后的玻片放入含3％～4％戊二醛的PBS溶液中，室溫浸泡2小時，取出，洗凈，用氮氣吹干，置于4℃保存備用。
BSA-NHS修飾制備將已經硅烷化的透明塑料窗口、玻片放入含有1.76g N-N′-disuccinimidyl carbonate，1.2ml N-N′-diisopropylethylamine，和68.8ml N-N′-dimethylformamide(DMF)的溶液A中，室溫反應3小時后取出，浸入含1％BSA的PBS溶液室溫放置12小時，然后取出放入溶液A中，室溫繼續反應3小時，取出，洗凈吹干備用。
瓊脂糖修飾處理瓊脂糖加雙蒸水配制成1％的瓊脂糖水溶液，完全混合煮沸3分鐘。在每一片已經硅烷化的透明塑料窗口上都傾倒2 ml的瓊脂糖水溶液，待凝固后于37℃下過夜干燥，室溫干燥條件下保存。使用前用20mM的NaIO4水溶液活化，再用雙蒸水洗凈即可。
巰基修飾處理配制含巰基硅烷1％的甲苯溶液，將要處理的透明塑料窗口放入溶液中，室溫下過夜。取出玻片，用三氯甲烷、丙酮等有機溶劑清洗，吹干。
聚賴氨酸修飾處理將清洗干凈的透明塑料窗口放入含3％聚賴氨酸的PBS溶液中浸泡2小時，洗凈，吹干，于4℃保存。
實施例2一種可直接檢測基因的免沖洗PCR擴增管，包括反應管且該反應管由管蓋11和管體12組成，在用于PCR的反應管1內固定有若干分子信標2，分別用于檢測非典型性肺炎相關的冠狀病毒的特定基因片斷和甲型、乙型流感病毒的特定基因片斷，在PCR反應管內固定分子信標的區域上有透明窗口3，分子信標2固定透明窗口3內側，本實施例把透明窗口分割成若干區域，分別在不同的區域上組裝具有不同或相同堿基排列方式的核酸序列分子信標，本實施例還可以把分子信標2固定于高分子凝膠介質中，再固定在透明窗口3上，上述高分子凝膠介質可選用聚丙烯酰胺、瓊脂糖、聚乙烯醇等。檢測樣品經病毒裂解處理后，放入免沖洗PCR擴增管中，同時加入反轉錄PCR(RT-PCT)試劑和冠狀病毒和甲型、乙型流感病毒的擴增引物，封閉擴增管后，進行PCR反應裝置上進行擴增反應。擴增完成后，將擴增產物引入窗口區；若在檢測樣品中存在有被檢測的病毒，則在相應的分子信標固定區域將可檢測到熒光信號。
實施例3一種可直接檢測基因的免沖洗PCR擴增管，包括反應管且該反應管由管蓋11和管體12組成，在用于PCR的反應管1內固定有若干分子信標2，分別用于檢測非典型性肺炎相關的冠狀病毒的特定基因片斷和甲型、乙型流感病毒的特定基因片斷，在PCR反應管內固定分子信標的區域上有透明窗口3，在本實施例中，在透明窗口3上設有透明的高分子凝膠層4(如聚丙烯酰胺、瓊脂糖、聚乙烯醇等)，再把分子信標2固定于高分子凝膠介質層上。
權利要求1.一種可直接檢測基因的免沖洗PCR擴增管，包括反應管且該反應管由管蓋(11)和管體(12)組成，其特征在于在用于PCR的反應管(1)內固定有分子信標(2)。
2.根據權利要求1所述的可直接檢測基因的免沖洗PCR反應管，其特征在于在PCR反應管內固定分子信標的區域上有透明窗口(3)，分子信標(2)固定透明窗口(3)內側。
3.根據權利要求1或2所述的可直接檢測基因的免沖洗PCR擴增管，其特征在于在透明窗口(3)上設有化學活性其團層，分子信標(2)設在化學基團層上。
4.根據權利要求1或2所述的所述的可直接檢測基因的免沖洗PCR擴增管，其特征在于在透明窗口(3)上設有透明的高分子凝膠層(4)，再把分子信標(2)固定于高分子凝膠介質層(4)上。
5.根據權利要求2所述的所述的可直接檢測基因的免沖洗PCR擴增管，其特征在于把透明窗口分割成若干區域，分別在不同的區域上組裝具有不同或相同堿基排列方式的核酸序列分子信標。
專利摘要本實用新型公開了一種可直接檢測基因的免沖洗PCR擴增管，包括反應管上且該反應管由管蓋和管體組成，在用于PCR的反應管內固定有分子信標，在PCR反應管內固定分子信標的區域上有透明窗口，分子信標固定透明窗口內側。本實用新型將分子信標引入技術方案后，能使基因擴增、雜交及檢測一體化操作方法的操作得以簡便、靶基因擴增時無需摻入熒光、成本得以降低且可使所得結果的可靠性得以提高。
文檔編號C12Q1/68GK2615141SQ03221640

公開日2004年5月12日 申請日期2003年5月1日 優先權日2003年5月1日
發明者陸祖宏, 劉全俊, 王宏 申請人:東南大學