用于四種細菌pcr檢測的多重擴增內標的制備方法

專利名稱：用于四種細菌pcr檢測的多重擴增內標的制備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種食品安全技術領域的方法，具體地說，是一種用于四種 細菌PCR檢測的多重擴增內標的制備方法。
技術背景金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙門氏菌(Salmonella)、單 核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)與副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是四種重要的食源性致病菌是公知公開的菌種，它廣泛分布 于自然界，它們主要是通過食品(特別是動物性食品)傳播、感染人體，直接造 成人體健康損害。PCR (聚合酶鏈式反應)技術具有操作簡便、快速、靈敏度高、 特異性強等特點，現在已廣泛應用于金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生 李斯特菌和副溶血弧菌的檢測。但PCR方法在不同的實驗室或檢測部門所檢測的 目的基因和操作流程有一定的差異，沒有形成標準，得到的檢測結果也不盡相同。 近年來的實踐應用表明，食品和培養基中存在的抑制劑可影響PCR反應，使檢測 結果呈假陰性。盡管PCR方法在不斷的改進和完善，卻不能有效地阻止假陰性結 果的發生。為了解決常規PCR方法中普遍存在的假陰性問題，近幾年在PCR擴增 體系中引入了擴增內標(IAC)。大多數學者認為在PCR體系中加入擴增內標能 有效避免假陰性現象的出現，是PCR檢測標準化的措施之一。制備IAC的方法有 很多，根據不同的實驗目的和要求采用不同的制備方法。初期的擴增內標是利用 克隆技術將目標序列的PCR產物通過插入、刪除或者替換等手段處理后制備的， 制備方法較煩瑣，且制備的擴增內標僅能用于單一微生物的檢測。經對現有技術的文獻檢索發現，Younes Maaroufi等在《FEMS Immunol Med Microbiol》(免疫醫學微生物學)2006年第48期183-191頁上發表的 "Development of a multiple internal control for clinical diagnostic real—time amplification assays"(—禾中運用于臨床診斷突光定量PCR體系的 多重擴增內標)，該文中提出一種多重擴增內標(mIAC)的合成方法，方法為通過重疊PCR技術將5種病毒的檢測引物序列合成到一條核苷酸序列中構建多重 擴增內標，通過一條多重擴增內標可用于5種病毒的檢測。但無法用于金黃色葡 萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌和副溶血弧菌普通PCR檢測。 發明內容本發明的目的在于填補國內在多重擴增內標研究上的空白，提供一種用于四 種細菌PCR檢測的多重擴增內標的制備方法。本發明利用生物信息學的方法，根 據金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌irwA基因、單核細胞增生李斯特菌hlyA 基因和副溶血弧菌toxR基因設計特異性檢測引物，根據這四對引物序列運用重 疊PCR技術人工合成了一種多重擴增內標，可分別用于金黃色葡萄球菌、沙門氏 菌、單核細胞增生李斯特菌和副溶血弧菌的普通PCR檢測，在確保檢測準確性與 高效性的同時大大降低檢測成本，填補了國內在多重檢測內標研究上的空白。本發明通過以下技術方案實現的，包括以下步驟第一步，利用生物信息學的方法，根據金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏 菌irwA基因、單核細胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因設計特 異性檢測引物；第二步，采用重疊PCR技術將金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌irwA 基因、單核細胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因的特異性檢測引 物序列拼接成一條核苷酸片段，構建多重擴增內標；第三步，采用分子生物學技術將該人工序列克隆到質粒載體pMD-18T，構建 含多重擴增內標序列的質粒pMD-mIAC;第四步，多重擴增內標分別在金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李 斯特氏菌和副溶血弧菌檢測中的驗證。所述的特異性檢測引物，是指四對分別用于金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、 單核細胞增生李斯特菌、副溶血弧菌PCR檢測的檢測引物(vicKF/vicKR、 invAF/invAR、 toxRF/toxRR、 hlyAF/hlyAR)，進行PCR檢測時，上述引物能擴增 到金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血弧菌菌株特有的 檢測基因，或者是PCR體系中添加的擴增內標。所述的重疊PCR技術，是指采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成了 重疊鏈，從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來。所述的多重擴增內標，是指人工合成DNA片段，該片段是通過重疊PCR技術人工合成的，其中包含金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌 和副溶血弧菌的特異檢測引物序列，在確保擴增效率的同時減少了非目標菌(大腸桿菌、奇異變形桿菌、空腸彎曲桿菌、腸球菌等)的DNA對PCR檢測的干擾。 其用途是顯示假陰性的發生，增加PCR檢測的準確率，可分別用于金黃色葡萄球 菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血弧菌普通PCR檢測。所述的分子生物學技術，具體如下采用轉基因方法轉移上述帶有擴增內標 的載體到大腸桿菌(E. coli TG-1)中，然后涂布于90ram選擇性平板上，其中 含有100mg/ml氨芐青霉素10 P 1 ， 20%的IPTG溶液7 u 1 ， 2%的X-gal溶液40 y 1 ， 經37'C培養12h。用滅菌的牙簽從選擇性平板上挑取白色菌落，接菌到裝有5ml LB培養液的PA瓶中，再在37'C下以150r/min搖床培養8h，提取質粒pMD-mlAC， 經PCR擴增后，確定獲得轉化子。所述的載體，其轉化的宿主細胞，在實例中它是大腸桿菌，其中包含有擴增 內標的DNA片段。所述的多重擴增內標的驗證，是指通過將含多重擴增內標的質粒pMD-mIAC 添加到普通PCR反應體系中，可以用相應檢測引物與目的基因同時進行擴增，多 重擴增內標與目的基因可擴增出大小不同的DNA片段。當樣品中含有的目的基因 時，電泳結果中含有目的基因和多重擴增內標的擴增片段，檢測結果呈陽性；當 樣品中不含目的基因時，電泳結果中只有擴增內標的擴增片段，檢測結果為陰性； 當電泳結果中不含有任何擴增片段時，檢測結果即為假陰性。所述的目的基因，是指金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌invA基因、 單核細胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因。所述的假陰性，是指PCR反應受到了食品或培養基等物質中存在的抑制劑的 影響而沒有發生反應，或者是由于操作人員的操作失誤導致結果呈現陰性。本發明構建了可分別用于金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特 菌和副溶血弧菌普通PCR檢測的多重擴增內標。本發明利用生物信息學的方法， 根據金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌irwA基因、單核細胞增生李斯特菌 hlyA基因、副溶血弧菌toxR基因設計特異性檢測引物，根據這四對引物序列運用重疊PCR技術人工合成了 一種多重擴增內標，在確保目標序列擴增效率的同時 與金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血弧菌及其它細菌 的基因組非同源。本發明將所構建的擴增內標片段添加到PCR反應體系中，有助 于檢測時顯示假陰性的發生，從而提高PCR檢測的準確率，為滿足檢疫執法過程 中所急需的對食源性致病菌調查和檢測提供有效可靠的技術手段。在本發明中，可選用本領域己知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘 粒等。將用于作為擴增內標的基因序列可操作地連于表達調控序列，從而帶有擴 增內標的載體。


圖l多重擴增內標的序列特征圖中左側從外至內依次為金黃色葡萄球菌引物vicKF、單核細胞增生李斯 特菌引物hlyAF、沙門氏菌引物invAR和副溶血弧菌引物toxRR;右側從外至內 依次為金黃色葡萄球菌引物vicKR、單核細胞增生李斯特菌引物hlyAR、副溶血 弧菌引物toxRF和沙門氏菌引物invAF。圖2重疊PCR方法合成多重擴增內標示意中引物0P1與0P2、 0P3與0P4互為模板分別經過第一輪PCR擴增，將 兩組擴增產物混合后進行第二論PCR擴增，取第二輪擴增產物為模板，以引物 0P5與0P6進行第三輪PCR擴增，其產物即為所需的多重擴增內標序列。圖3大腸桿菌陽性克隆進行PCR檢測結果示意中電泳泳道l:以金黃色葡萄球菌引物vicKF/vicKR擴增結果(221bp)。 M: 100bp DNA分子量標準。圖4添加多重擴增內標的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯 特菌和副溶血弧菌PCR檢測驗證結果示意中電泳泳道l:以單核細胞增生李斯特菌DNA為模板；電泳泳道2:以 沙門氏菌DNA為模板；電泳泳道3:以副溶血弧菌DNA為模板；電泳泳道4:以金黃色葡萄球菌DNA為模板；5-8:陰性對照；M: 100bp DNA分子量標準。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案 為前提下進行實施，實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。以下 是實力給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但保護范圍不限于下述的實施 例。實施例一、特異性檢測引物的設計利用生物信息學分別對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特 菌和副溶血弧菌的已知特異基因進行分析，從中選出用于檢測的目的基因vicK、 invA、 hlyA、 toxR。通過Genbank中公用的BLAST軟件(為現有技術，共用免費)， 將vicK、 invA、 hlyA、 toxR基因的序列分別與其他微生物進行比對，選出特異 性較高的序列區段。然后用軟件Primer 5. 0 (為現有技術，市售，Premier公司， 加拿大)在這段特異序列中設計一對內標引物。引物序列如下-1. 金黃色葡萄球菌檢測引物(vicKF/vicKR) vicKF: 5， _ CGCAGGCTAATACTGAAAG -3，vicKR: 5， -TTCTGTTTCTTCACGGGTA _3，(a) 檢測目的基因的序列特征*長度512堿基對 *類型核酸*鏈型雙鏈 *拓撲結構線形(b) 分子類型DNA(C) 最初來源金黃色葡萄球菌2. 沙門氏菌檢測引物(invAF/invAR)invAF: 5， -GTCACCGTGGTCCAGTTTA -3，invAR: 5， -CGACAAGACCATCACCAAT -3， (a)檢測目的基因的序列特征-*長度361堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線形 (b) 分子類型DNA (C) 最初來源沙門氏菌3. 單核細胞增生李斯特菌(hlyAF / hlyAR) hlyAF: 5' _ TATCCAGGTGCTCTCGT _3，hlyAR: 5， - ACTGTAAGCCATTTCGTC -3'(a) 檢測目的基因的序列特征*長度264堿基對*類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓撲結構線形(b) 分子類型DNA(C) 最初來源單核細胞增生李斯特菌4. 副溶血弧菌(toxRF / toxRR) toxRF: 5， -CAAATAGTAATTCGCTCGCAG-3，toxRR: 5， -ATTCACAGCAGAAGCCACAG-3 ，(a) 檢測目的基因的序列特征*長度473堿基對 *類型核酸*鏈型雙鏈 *拓撲結構線形(b) 分子類型DNA(C) 最初來源副溶血弧菌二、多重擴增內標的序列的設計多重擴增內標的序列特征(如圖l):*長度221堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線形(b)分子類型DNA(C)最初來源人工合成(d) 序列描述SEQ ID NO. 1:TACCCGTGAAGAAACAGAA三、采用重疊PCR技術合成多重擴增內標1. 根據內標序列設計重疊PCR引物將人工設計的擴增內標DNA序列按重疊PCR的要求分成六段，每段均作為 引物用于擴增內標的合成，具體引物序列如下0P1:TATCCAGGTGCTCTCGTCGACGACAAGACCATCACCAATTCACAGCAGAAGCCACAGCA OP 2:GATGATGTGGGCGGCGAGTGCTCCTATAGATGCTGGTGGTGCCATGCTGTGGCTTCTGC OP 3:GAGCACTCGCCGCCCACATCATCGAAAAGMACACGCGGATGTAAACTGGACCACGGTG OP 4:CTGTAAGCCATTTCGTCGAATTCAAATAGTAATTCGCTCGCAGTCACCGTGGTCCAGTT OP 5: CGCAGGCTAATACTGAAAGTATCCAGGTGCT OP 6: TTCTGTTTCTTCACGGGTACTGTAAGCCATT2. 采用重疊PCR方法合成多重擴增內標，具體過程如圖2: 第一輪PCR擴增確定的反應體系如下第一組 第二組 10 X buffer (含Mg") 5.0 y 1 5.0uld證(2. 5 mM) 2. On 1 2. On 1引物(各lOyM) 0P1: lul + 0P2: lul 0P3: lul+0P4: 1 y 1Taq DNA聚合酶(2. 50.5yl 0.5ylU/u 1)補無菌水至 50 ul 50 ulPCR循環參數為在94。C預變性3min，接著作15個循環，每個循環的程序 包括94'C變性30s，退火溫度45°C-60°C (每個循環升高1°C )，退火時間為60s， 然后在72'C延伸30s，循環結束后降溫至4'C，結束所有操作程序。 第二輪PCR擴增將上述兩組PCR產物混合，取50 y 1進行第二輪PCR反應。 PCR循環參數為在94。C預變性3min，接著作15個循環，每個循環的程序 包括94。C變性30s，退火溫度45°C-60°C (每個循環升高1°C)，退火時間為60s， 然后在72'C延伸30s，循環結束后在72'C延伸5min,最后降溫至4'C，結束所 有操作程序。第三輪PCR擴增取第二輪PCR產物0.2y l作為模板，反應體系如下 10 X buffer 5.0p1MgCl2溶液(25 mM) dNTP (2. 5 mM) 上下游引物(各10uM) Taq DNA聚合酶(2. 5U/ii 1) 模板3.0p 1 2. Oy 1 0P5: lyl+0P6: lul 0. 5u 1 0. 2ii 1補無菌水至50 ulPCR循環參數為在94。C預變性3min，接著作30個循環，每個循環的程序 包括94。C變性30s，退火溫度55。C，退火時間為30s，然后在72。C延伸30s，循 環結束后在72X:延伸10min，最后降溫至4'C，結束所有操作程序。3. 連接按PCR回收試劑盒說明書回收第三輪PCR擴增產物片段。回收的擴增產物 片段與pMD-18T載體在連接緩沖液作用下16。C過夜。4. 轉化大腸桿菌用氯化鈣法轉移上述帶有擴增內標的載體到大腸桿菌E. coli TG-1中，然 后涂布于90mm選擇性平板上，其中含有100mg/ml氨芐青霉素10u 1，20%的IPTG 溶液7ul和2。/。的X-gal溶液40u 1，經過37'C培養12h，用滅菌的牙簽從選擇 性平板上挑取白色菌落用于陽性克隆的檢測。5.檢測將上述白色菌落接種到裝有5ml LB培養液的PA瓶中，在37。C下150r/min搖床培養8h，提取質粒pMD-mIAC，利用特異引物(vicKF和vicKR)對提取的質粒進行PCR檢測，具體結果如圖3。 四、多重擴增內標的驗證1. 多重擴增內標在金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌和 副溶血弧菌PCR檢測中的擴增大小分別為221bp、 121bp、 184 bp、 124bp。2. 分別提取多重擴增內標和金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李 斯特菌和副溶血弧菌的DNA稀釋備用。3. 將多重擴增內標分別加入到金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生 李斯特菌和副溶血弧菌各自的PCR反應體系中。確定的反應體系如下10X buffer2. 5p 1MgCl2溶液(25 mM)1. 1dNTP (2. 5 mM)1. Oy 1上下游引物(各10yM)0. 1 + 0. 1多重擴增內標lu 1Taq DNA聚合酶(1 U/n 1)lu 1模板5. On 1補無菌水至25 ulPCR循環參數為在95'C預變性3min，接著作35個循環，每個循環的程序 包括95。C變性30s，退火溫度56。C，退火時間為30s，然后在72。C延伸30s，循 環結束后在72'C延伸10min，最后降溫至4'C，結束所有操作程序。擴增結果如圖4所示，以金黃色葡萄球菌DNA為模板能擴增出512bp的目標序列特異產物和221bp的擴增內標產物；以沙門氏菌DNA為模板能擴增出 361bp的目標序列特異產物和121bp的擴增內標產物；以單核細胞增生李斯特菌 DNA為模板能擴增出264bp的目標序列特異產物和184bp的擴增內標產物；以副 溶血弧菌基因組DNA為模板皆能擴增出473bp的目標序列特異產物和124bp的擴 增內標產物。因此，本發明成功的構建了一段可分別用于金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、 單核細胞增生李斯特菌和副溶血弧菌普通PCR檢測的多重擴增內標，填補了國內 在多重檢測內標研究上的空白，有助于檢測時顯示假陰性的發生，在確保檢測準 確性與高效性的同時大大降低檢測成本，為滿足檢疫執法過程中所急需的對食源 性致病菌調査和檢測提供有效可靠的技術手段。本發明涉及的序列及記號分列如下 〈110〉上海交通大學<120〉用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內標的制備方法<160> 15<170> Patentln version 3.4〈210〉 1<211〉 221〈212〉 DNA <213〉人工序列〈220〉<223〉采用重疊PCR技術合成的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內標序列 〈400〉 1cgcaggctaa tactgaaagt atccaggtgc tctcgtcgac gacaagacca tcaccaattc 60 acagcagaag ccacagcatg gcaccaccag catctatagg agcactcgcc gcccacatca 120 tcgaaaagaa acacgcggat gtaaactgga ccacggtgac tgcgagcgaa ttactatttg 180 aattcgacga aatggcttac agtacccgtg aagaaacaga a 221<210〉 2〈211〉 59〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220〉〈223〉用于多重擴增內標合成的重疊PCR引物0P1〈400〉 2tatccaggtg ctctcgtcga cgacaagacc atcaccaatt cacagcagaa gccacagca 59〈210〉 3〈211〉 59<212〉 DNA <213>人工序列〈220〉〈223〉用于多重擴增內標合成的重疊PCR引物0P2<400〉 3gatgatgtgg gcggcgagtg ctcctataga tgctggtggt gccatgctgt ggcttctgc 59<210〉 4<211> 59〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220〉<223>用于多重擴增內標合成的重疊PCR引物0P3〈400〉 4gagcactcgc cgcccacatc atcgaaaaga aacacgcgga tgtaaactgg accacggtg 59〈210〉 5<211〉 59<212〉 DNA <213〉人工序列〈220〉<223〉用于多重擴增內標合成的重疊PCR引物0P4〈400〉 5ctgtaagcca tttxgtcgaa ttcaaatagt aattcgctcg cagtcaccgt ggtccagtt 59〈210〉 6<211〉 31〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220〉〈223〉用于多重擴增內標合成的重疊PCR引物OP5<> 6cgcaggctaa tactgaaagt atccaggtgc t 31〈210〉 7〈211〉 31〈212〉 DNA 〈213>人工序列<220〉<223>用于多重擴增內標合成的重疊PCR引物0P6 〈400〉 7ttctgtttct tcacgggtac tgtaagccat t 31<210> 8〈211〉 19〈212〉 DNA<213〉 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) <220>〈223〉金黃色葡萄球菌上游檢測引物<400> 8cgcaggctaa tactgaaag 19〈210〉 9〈211〉 19<212〉 DNA〈213〉 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 〈220〉〈223〉金黃色葡萄球菌下游檢測引物〈400〉 9ttctgtttct tcacgggta 19<210〉 10〈211〉 19〈212〉 ■〈213〉 沙門氏菌(Salmonella) <220>〈223〉沙門氏菌上游檢測引物〈400〉 10gtcaccgtgg tccagttta 19〈210〉 11〈211〉 19〈212〉 DNA〈213〉 沙門氏菌(Salmonella)<220〉<223〉沙門氏菌下游檢測引物<400〉 11cgacaagacc atcaccaat 19<210〉 12<211〉 17〈212〉 DNA<213> 單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) 〈220〉<223>單核細胞增生李斯特菌上游檢測引物〈400〉 12tatccaggtg ctctcgt 17<210〉 13<211〉 18<212〉 DNA〈213〉 單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) 〈220〉〈223〉單核細胞增生李斯特菌下游檢測引物〈400> 13actgtaagcc atttcgtc 18<210> 14<211〉 21<212> 薩〈213〉 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) 〈220〉〈223>副溶血弧菌上游檢測引物<400〉 14caaatagtaa ttcgctcgca g 21<210> 15<211> 20<212〉 腿〈213> 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) 〈220><223>副溶血弧菌下游檢測引物<400〉 15attcacagca gaagccacag 20
權利要求
1、一種用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內標的制備方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，利用生物信息學的方法，根據金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌invA基因、單核細胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因設計特異性檢測引物；第二步，采用重疊PCR技術將金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌invA基因、單核細胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因的特異性檢測引物序列拼接成一條核苷酸片段，構建多重擴增內標；第三步，采用分子生物學技術將該人工序列克隆到質粒載體pMD-18T，構建含多重擴增內標序列的質粒pMD-mIAC；第四步，多重擴增內標分別在金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌和副溶血弧菌檢測中的驗證。
2、 根據權利要求1所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內標的制備方 法，其特征是，所述的特異性檢測引物，是指四對分別用于金黃色葡萄球菌、 沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血弧菌PCR檢測的檢測引物 vicKF/vicKR、 invAF/invAR、 toxRF/toxRR、 hlyAF/hlyAR，進行PCR檢測時，上 述引物能擴增到金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血弧 菌菌株特有的檢測基因，或者是PCR體系中添加的擴增內標。
3、 根據權利要求1所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內標的制備方 法，其特征是，所述的重疊PCR技術，是指采用具有互補末端的引物，使PCR 產物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的 擴增片段重疊拼接起來。
4、 根據權利要求1所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內標的制備方 法，其特征是，所述的多重擴增內標，是指人工合成DNA片段，該片段是通過 重疊PCR技術人工合成的，其中包含金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生 李斯特菌和副溶血弧菌的特異檢測引物序列，在確保擴增效率的同時減少了非目標菌的DNA對PCR檢測的干擾。
5、 根據權利要求1所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內標的制備方法，其特征是，所述的分子生物學技術，具體如下采用轉基因方法轉移上述帶有擴增內標的載體到大腸桿菌E. coli TG-1中，然后涂布于選擇性平板上，經 37t:培養12h，用滅菌的牙簽從選擇性平板上挑取白色菌落，接菌到裝有5mlLB 培養液的PA瓶中，再在37。C下以150r/min搖床培養8h，提取質粒pMD-mIAC， 經PCR擴增后，確定獲得轉化子。
6、 根據權利要求5所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內標的制備方 法，其特征是，所述的選擇性平板，是指90mm選擇性平板，其中含有100mg/ml 氨芐青霉素10ul， 20%的IPTG溶液7u 1， 2M的X-gal溶液40ul。
7、 根據權利要求1所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內標的制備方 法，其特征是，所述的載體，其轉化的宿主細胞，是大腸桿菌，其中包含有擴增 內標的DNA片段。
8、 根據權利要求1所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內標的制備方 法，其特征是，所述的多重擴增內標的驗證，是指通過將含多重擴增內標的質 粒pMD-mIAC添加到普通PCR反應體系中，用相應檢測引物與目的基因同時進行 擴增，多重擴增內標與目的基因可擴增出大小不同的DNA片段，當樣品中含有的 目的基因時，電泳結果中含有目的基因和多重擴增內標的擴增片段，檢測結果呈 陽性；當樣品中不含目的基因時，電泳結果中只有擴增內標的擴增片段，檢測結 果為陰性；當電泳結果中不含有任何擴增片段時，檢測結果即為假陰性。
9、 根據權利要求8所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內標的制備方 法，其特征是，所述的假陰性，是指PCR反應受到了食品或培養基等物質中存在 的抑制劑的影響而沒有發生反應，或者是由于操作人員的操作失誤導致結果呈現 陰性。
10、 根據權利要求8所述的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內標的制備方 法，其特征是，所述的目的基因，是指金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌 invA基因、單核細胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因。
全文摘要
本發明涉及一種食品安全技術領域的用于四種細菌PCR檢測的多重擴增內標的制備方法，步驟為根據金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌invA基因、單核細胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因設計特異性檢測引物；采用重疊PCR技術將金黃色葡萄球菌vicK基因、沙門氏菌invA基因、單核細胞增生李斯特菌hlyA基因和副溶血弧菌toxR基因的特異性檢測引物序列拼接成一條核苷酸片段，構建多重擴增內標；將該人工序列克隆到質粒載體pMD-18T，構建含多重擴增內標序列的質粒pMD-mIAC；多重擴增內標分別在金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌和副溶血弧菌檢測中的驗證。本發明在確保檢測準確性與高效性的同時大大降低檢測成本。
文檔編號C12Q1/68GK101220393SQ200810032998
公開日2008年7月16日 申請日期2008年1月24日 優先權日2008年1月24日
發明者史賢明, 張忠明, 施春雷, 馬瑜丹, 飛 龍 申請人:上海交通大學