專利名稱：紫菜序列鑒定擴增區標記的建立方法
技術領域：
本發明涉及種質資源，具體地說是一種紫菜序列鑒定擴增區(SequenceCharacterized Amplification Region縮寫SCAR)標記的建立方法。
背景技術：
紫菜是我國重要的大型經濟海藻之一，其產值在海藻中位居第一。然而在開發利用紫菜資源的過程中，種質問題長期以來一直是困擾其生產的嚴重問題。近年來發展起來的分子標記技術，如RAPD技術，AFLP技術，SSR技術，克服了傳統的形態分類學方法的諸多缺點，尤其是RAPD技術，以其簡單、快速、不涉及同位素的使用等優點，被廣泛應用于農作物的遺傳多樣性分析、種質資源鑒定等產權保護。但是用具有細胞系特異性的SCAR標記進行海藻種質鑒定，目前尚未見到有研究報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種可以對紫菜細胞系進行特異性種質鑒定的紫菜SCAR標記的建立方法。
為了實現上述目的，本發明的技術方案是應用RAPD技術對紫菜材料進行遺傳多樣性分析，獲得紫菜材料的特異性擴增片段；所述特異性片段經大量擴增后回收、克隆、測序得到其中紫菜材料P.tenuipedalis的RAPD擴增片段OPZ-19140和P.yezoensis qd-8的RAPD擴增片段OPJ-18488的堿基序列；再根據這兩個序列兩端的堿基順合成特異引物對，經PCR反應程序，將所述特異性擴增片段轉換成了SCAR標記；其中所述兩個RAPD的特異引物對為OPJ-18、OPZ-19；所述2個特異標記的堿基序列為SEQ ID NO 1～2；所述P.tenuipedalis特異片段OPZ-19140的SCAR-PCR引物P15’-GTGCGAGCAAGCACTGTTGAT-3’及P25’-GTGCGAGCAATATTTAAAGTT-3’，序列號為SEQ ID NO 3～4；所述P.yezoensis qd-8特異片段OPJ-18488的SCAR-PCR引物P35′-TGGTCGCAGA ACCGGTTACC GAC-3′及P45′-TGGTCGCAGATCTTTTCGAA TC-3′，序列號為SEQ ID NO5～6；所述P.tenuipedalis特異片段OPZ-19140的SCAR-PCR反應程序為94℃預變性4min，然后94℃1min，56℃1min，72℃1.5min，擴增30個循環，最后72℃延伸5min。反應條件為反應體系25μl，其中含有10mM Tris-HCl(pH9.0)，50mM KCl，1.8mM Mg2+，0.15mM dNTP，20ng引物，約20ng模板DNA，1單位Taq DNA聚合酶；所述P.yezoensis qd-8特異片段OPJ-18488的SCAR-PCR反應程序94℃預變性4min，然后94℃1min，58℃1min，72℃1.5min，擴增30個循環，最72℃延伸5min。反應體系25μl，其中含有10mM Tris-HCl(pH8.8)，50mM KCl，1.8mM Mg2+，0.15mM dNTP，20ng引物，約20ng模板DNA，1單位Taq DNA聚合酶。
所述由P.tenuipedalis的RAPD擴增片段OPZ-19140和P.yezoensis qd-8的RAPD擴增片段OPJ-18488轉換的SCAR標記可以作為紫菜P.tenuipedalis和P.yezoensis qd-8種質鑒定和產權保護的分子標記。
本發明具有如下優點1.為了能將在實驗室中獲得的RAPD標記應用于生產實踐、特別是應用于海藻種質鑒定，本發明將有關RAPD標記經過回收、克隆、測序、合成特異的PCR引物，優化PCR反應條件，最后將其轉換成SCAR(Sequence-characterized Amplified Region)標記。采用本發明SCAR標記進行紫菜種質檢測時，結果穩定且操作簡便快捷。現有技術中采用的RAPD技術，擴增過程中不是堿基嚴格匹配，只是部分堿基匹配，因此錯配幾率較高，重復性、穩定性較差。然而按照本發明轉換為SCAR標記后，引物與模板堿基嚴格配對，因此，重復性、穩定性高。
2.一般來講RAPD要求的條件嚴格，對設備精密度要求較高，因此，在基層單位很難應用，而本發明SCAR標記穩定性、重復性、實用性強，一般的PCR儀都可以使用，因此，該技術可在基層單位推廣應用。
3.現有技術RAPD擴增圖譜中存在大量條帶，需要認真分辯、鑒定，而在本發明SCAR圖譜中只有特異的品系才能出現特異的擴增條帶，因此，結果清晰、明確，易識別。通常用的RAPD結果不宜作為種質鑒定的法律證據，而本發明SCAR標記可以作為法律證據，用于種質鑒定(如對紫菜細胞系P.tenuipedalis和P.yezoensis qd-8進行種質鑒定)及產權保護。
4.本發明將RAPD標記轉換為SCAR標記的方法不僅應用于海藻種質鑒定，同樣適合于把其它類型的標記(如AFLP，RFLP)轉換為SCAR標記。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例詳述本發明。
實施例1本發明SCAR標記的建立主要內容包括以下幾個方面1、選用的實驗材料本研究共收集了7種共27個紫菜材料，其中條斑紫菜(P.yezoensis)15個，壇紫菜(P.haitanensis)6個，少精紫菜(P.oligospermatangia)2個，甘紫菜(P.tenera)1個，半葉紫菜(P.katadai.var.hemiphylla)1個，列紫菜P.seriata 1個和生活史特異的貝殼紫菜(P.tenuipedalis)1個(見表1)。
表1 紫菜材料的來源和特性種類編號特性 來源Y9101 高產，耐高溫，抗病性強江蘇連云港海區Ymg9602 Y9602的綠色突變體 江蘇海洋水產研究所Y9430 質優，絲狀體成熟較難，單孢子少江蘇南通海區Y9502 耐高溫，抗逆性強，單孢子少福建海區Y9830 保持系江蘇南通海區Y92-1 研究材料 國外引進Y94-1 研究材料 國外引進條斑紫菜Y95-1 研究材料 國外引進P.yezoensisYqd-2 研究材料 江蘇如東海區Ynt-6 高產，適溫廣，抗逆性強江蘇連云港海區Ynt-8 質優，適溫廣，抗逆性強，藻體薄江蘇海區Yqd-6 研究材料 江蘇如東海區Yqd-8 研究材料 青島海區Ysh-6 Y92-1的綠色突變體 上海水大Y92-3 研究材料 國外引進H9208 優質，絲狀體成熟 福建南日島海區H9161 野生種的栽培種質 福建海區壇紫菜 H182雜種 福建海區P.haitanensis Hqd-1 研究材料 浙江舟山海區Hqd-5 研究材料 福建連江海區H02-1 研究材料 浙江海區少精紫菜 O9406研究材料福建連江海區P.oligospermatangia O9301研究材料福建連江海區甘紫菜T94-2研究材料國外引進P.tenera列紫菜S02-1研究材料國外引進P.seriata半葉紫菜K9401研究材料山東青島海區P.katadai貝殼紫菜Tsh-8研究材料國外引進P.tenuipedalis2、紫菜DNA的提取及純化按如下程序提取各個紫菜的基因組DNA(參見王斌等，玉米自交系8112特異SCAR標記的獲得，高技術通訊，1999，9(3)45-47)。簡述如下取新鮮組織2g，在液氮中研磨成粉，置于50ml離心管，加入8ml提取液(100mM Tris，pH8.0，50mM EDTA，500mM NaCl，1.5％SDS)，50℃下處理30分鐘，不時顛倒混勻，加2.5ml 5M乙酸鉀(KAC)，冰浴10分鐘，加2.5ml氯仿，顛倒混勻，10000rmp離心8分鐘，取上清移入新管，加2/3體積預冷異丙醇，顛倒混勻，-20℃置1-2小時，攪出絮狀白色DNA，70％乙醇洗1～2次，吹干，溶于100μl TE中，并在1％瓊脂糖凝膠上電泳，用標準λDNA作對照，估算紫菜DNA樣品的濃度，獲得高純度紫菜DNA。
3、用獲得高純度紫菜DNA為模板進行RAPD分析RAPD反應在MJ Research PTC-100型PCR儀上完成，引物分別選用美國Operon公司的產品420個引物中的OPJ-18、OPC-04和OPX-06；RAPD-PCR反應體系為25μl，其中含有10mM Tris-HCl(pH9.0)，50mMKCl，2.0mM Mg2+，0.15mM dNTP，15ng引物，20ng模板DNA，1單位Taq DNA聚合酶；反應程序為94℃預變性4min，然后按94℃45s，37℃1min，72℃1.5min，擴增42個循環，最后72℃延伸5min；擴增產物在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳，經EB染色后在Bio-Rad DOC-1000型凝膠成像系統中觀察并記錄結果，獲得7個紫菜材料的特異性擴增片段。
4、RAPD特異擴增產物的回收、克隆和測序(參見王斌等，玉米自交系8112特異SCAR標記的獲得，高技術通訊，1999，9(3)45-47)。
RAPD產物經瓊脂糖電泳，在紫外燈下切取目的片段，用DNA片段回收純化試劑盒(Promega)進行回收。回收片段經瓊脂糖電泳檢驗、定量后，利用T-Easy連接試劑盒(Promega)克隆到pGEM-T Easy載體中，經電擊轉化轉入E.coli DH10B菌株，搖菌培養，提取質粒DNA后用EcoR I進行酶切檢驗。確認所得克隆與相應RAPD特異片段一致后，送博亞生物技術公司進行測序分析，得5個特異標記的堿基序列。這時，本實施例從420個引物的擴增產物中篩選出兩個特異片段OPZ-19140和OPJ-18488，結果示于
圖1和圖2。其中圖1 P.tenuipedalis特異片段OPZ-19140的SCAR標記轉換中A為RAPD標記(OPZ-19140)；BSCAR標記；M為DNA marker DGL-2000；1-27為供試的27個紫菜的編號(詳見表1)；箭頭所示為P.tenuipedalis的特異擴增片段OPZ-19140。
圖2 P.yezoensis qd-8特異片段OPJ-18488的SCAR標記轉換中A為RAPD標記(OPJ-18488)；BSCAR標記；M為DNA marker DGL-2000；1-27為供試的27個紫菜的編號(詳見表1)；箭頭所示為P.yezoensis qd-8的特異擴增片段OPJ-18488。
這兩個特異片段的測序結果分別示于序列表SEQ ID NO 1～2，SEQ IDNO 1為紫菜細胞系P.tenuipedalis的特異擴增片段OPZ-19140的堿基序列GTGCGAGCAAGCACTGTTGA TACAAATAAG GATATCTTTGAATCAAATTA CCAACAGTAT GTTGTTTAGT TGGAGAAGTTTTTTCTTGGC TTTGACGAAT TAAATTACTG AGACGTTTTAACTTTAAATATTGCTCGCAC；其中下劃線所示為隨機引物OPZ-19的堿基序列。
SEQ ID NO2為紫菜細胞系P.yezoensis qd-8的特異擴增片段OPJ-18488的堿基序列TGGTCGCAGATCTTTTCGAA TCATATGTAG GATCAATCATTGGAACCATG GTGCTTGGTG CCGCTTTTAT GGGACTTGCACCATTTCAAG GTGATGGCTT TGGTGGTTTG AGTGCTGTGCTTTTGCCGCT CGCATTGGCG AGTATGGGTA TCGTAACTTCGATTCTTGGT ACTTTCTTCG TGAAAGTTAA AGAAGGCGGAGATCCGCATA AAGCCTTGAA TAAAGGCGAA TTTGGTTCAGCACTGGTATT ACTGGTGGCA ACTTATTTCG CAGTTAAAGGCATGCTGCCG GAATCCTGGA CAGTTGCCGG CGCCGAAAGC
GCTTACACTT CTAATGGCGT TTTTATCTCT ATCCTTATCGGCCTTGCCTC TGGTTTGGCT ATTGGTAAAA TTACCGAATATTACACCGGC ACCGGTACTG GTCCGGGTAT TTCAATTGTAAAACAGTCGG TAACCGGTTCTGCGACCA其中下劃線所示為隨機引物OPJ-18的堿基序列。
5、SCAR引物設計分析測序結果確認目的片段后，根據測序的2個末端的序列設計各20-24bp SCAR-PCR引物，每對引物都包含對應的RAPD引物10堿基序列和與之相鄰的10-14堿基序列，由北京賽百盛公司進行引物合成。(參見王斌等，玉米自交系8112特異SCAR標記的獲得，高技術通訊，1999，9(3)45-47)。
對特異片段OPZ-19140和OPJ-18488的末端順序(參見序列表SEQ ID NO1～2)，設計的兩對引物如下P.tenuipedalis特異擴增片段OPZ-19140的SCAR-PCR引物(參見序列表SEQ ID NO 3～4)P15’-GTGCGAGCAAGCACTGTTGAT-3’P25’-GTGCGAGCAATATTTAAAGTT-3’P.yezoensis qd-8特異擴增片段OPJ-18488的SCAR-PCR引物(參見序列表SEQ ID NO 5～6)P35′-TGGTCGCAGA ACCGGTTACC GAC-3′P45′-TGGTCGCAGA TCTTTTCGAA TC-3′6、SCAR-PCR反應取合成的SCAR引物先按常規PCR反應進行擴增，然后優化反應條件，得到了特異的目的片段。本實施例的兩個反應程序具體為P.tenuipedalis特異擴增片段OPZ-19140的SCAR-PCR反應程序(稱為程序1)為94℃預變性4min，然后94℃1min，56℃1min，72℃1.5min，擴增30個循環，最后72℃延伸5min。反應條件為反應體系25μl，其中含有10mM Tris-HCl(pH9.0)，50mM KCl，1.8mM Mg2+，0.15mM dNTP，20ng引物，約20ng模板DNA，1單位Taq DNA聚合酶。擴增產物在MJResearch PTC-100型PCR儀上完成。
P.yezoensis qd-8特異擴增片段OPJ-18488的SCAR-PCR反應程序(稱為程序2)為94℃預變性4min，然后94℃1min，58℃1min，72℃1.5min，擴增30個循環，最后72℃延伸5min。反應條件為反應體系25μl，其中含有10mM Tris-HCl(pH8.8)，50mM KCl，1.8mM Mg2+，0.15mM dNTP，20ng引物，約20ng模板DNA，1單位Taq DNA聚合酶。擴增產物在MJResearch PTC-100型PCR儀上完成。
如圖1和圖2所示，將P.tenuipedalis特異片段OPZ-19140和P.yezoensisqd-8的特異片段OPJ-18488轉換為SCAR標記已獲成功。可以看出，在SCAR-PCR擴增中只有一個細胞系特異的擴增條帶出現，而其它細胞系中都沒有擴增產物，結果清楚、明了。
本實施例應用RAPD技術對生產上廣泛應用的、野生的和國外引進的共27個紫菜材料進行遺傳多樣性分析，獲得7個紫菜材料的特異性擴增片段。這些特異性片段經大量擴增后回收、克隆、測序得到了其中5個特異標記的堿基序列，根據克隆片段兩端序列合成特異引物對，成功地將其中2個標記(即紫菜材料P.tenuipedalis的RAPD標記OPZ-19140和P.yezoensisqd-8的RAPD標記OPJ-18488)轉換成了SCAR標記。這兩個SCAR標記可以用于對這2個紫菜細胞系進行種質鑒定和產權保護。
實施例2建立細胞系特異的SCAR標記難度較大，費用較高，但是SCAR標記一旦建立后使用起來非常方便，而且便宜、快速，應用價值高。本實施例采用已獲得的SCAR標記對紫菜細胞系(P.tenuipedalis和P.yezoensis qd-8)進行種質鑒定。
要確定未知材料是否是細胞系P.tenuipedalis，只要采用本發明確定的SCAR引物Primer 1和Primer 2用反應程序1進行SCAR-PCR擴增，能夠擴增出特異片段OPZ-19140的就是細胞系P.tenuipedalis；沒有擴增片段OPZ-19140的就不是這個材料。實驗結果快速、正確。
同樣，如果要確定一個未知材料是否是細胞系P.yezoensis qd-8，只要用本發明確定SCAR引物Primer 3和Primer 4，用反應程序2進行SCAR-PCR擴增，能夠擴增出特異片段OPJ-18488的就是細胞系P.yezoensisqd-8；沒有該擴增片段的就不是這個材料。
權利要求
1.一種紫菜序列鑒定擴增區標記的建立方法，其特征在于應用RAPD技術對紫菜材料進行遺傳多樣性分析，獲得紫菜材料的特異性擴增片段；所述特異性片段經大量擴增后回收、克隆、測序得到其中紫菜材料P.tenuipedalis的RAPD擴增片段OPZ-19140和P.yezoensis qd-8的RAPD擴增片段OPJ-18488的堿基序列；再根據這兩個序列兩端的堿基順合成特異引物對，經PCR反應程序，將所述特異性擴增片段轉換成了SCAR標記。
2.按照權利要求1所述紫菜序列鑒定擴增區標記的建立方法，其特征在于所述兩個RAPD的特異引物對為OPJ-18、OPZ-19。
3.按照權利要求1所述紫菜序列鑒定擴增區標記的建立方法，其特征在于所述特異標記的堿基序列為SEQ ID NO 1～2。
4.按照權利要求2所述紫菜序列鑒定擴增區標記的建立方法，其特征在于所述P.tenuipedalis特異片段OPZ-19140的SCAR-PCR引物P15’-GTGCGAGCAAGCACTGTTGAT-3’及P25’-GTGCGAGCAATATTTAAAGTT-3’，序列號為SEQ ID NO 3～4。
5.按照權利要求1所述紫菜序列鑒定擴增區標記的建立方法，其特征在于所述P.yezoensis qd-8特異片段OPJ-18488的SCAR-PCR引物P35′-TGGTCGCAGA ACCGGTTACC GAC-3′及P45′-TGGTCGCAGATCTTTTCGAA TC-3′，序列號為SEQ ID NO 5～6。
6.按照權利要求1所述紫菜序列鑒定擴增區標記的建立方法，其特征在于所述P.tenuipedalis特異片段OPZ-19140的SCAR-PCR反應程序為94℃預變性4min，然后94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1.5min，擴增30個循環，最后72℃延伸5min。反應條件為反應體系25μl，其中含有10mMTris-HCl(pH9.0)，50mM KCl，1.8mM Mg2+，0.15mM dNTP，20ng引物，約20ng模板DNA，1單位Taq DNA聚合酶。
7.按照權利要求5所述紫菜序列鑒定擴增區標記的建立方法，其特征在于所述P.yezoensis qd-8特異片段OPJ-18488的SCAR-PCR反應程序94℃預變性4min，然后94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1.5min，擴增30個循環，最72℃延伸5min。反應體系25μl，其中含有10mM Tris-HCl(pH 8.8)，50mM KCl，1.8mM Mg2+，0.15mM dNTP，20ng引物，約20ng模板DNA，1單位Taq DNA聚合酶。
8.按照權利要求5所述紫菜序列鑒定擴增區標記的建立方法，其特征在于所述由P.tenuipedalis的RAPD擴增片段OPZ-19140和P.yezoensis qd-8的RAPD擴增片段OPJ-18488轉換的SCAR標記可以作為紫菜P.tenuipedalis和P.yezoensis qd-8種質鑒定和產權保護的分子標記。
全文摘要
本發明涉及種質資源，具體地說是一種紫菜SCAR標記的建立方法。它應用RAPD技術對紫菜材料進行遺傳多樣性分析，獲得紫菜材料的特異性擴增片段；所述特異性片段經大量擴增后回收、克隆、測序得到紫菜材料P.tenuipedalis的RAPD擴增片段OPZ－19
文檔編號C12Q1/68GK1624152SQ20031010526
公開日2005年6月8日 申請日期2003年12月5日 優先權日2003年12月5日
發明者王斌, 翁曼麗, 金德敏, 馬家海, 段德麟 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所, 中國科學院海洋研究所