專利名稱：：建立油菜細胞質類型特異pcr標記以及快速鑒定油菜細胞質類型的方法
技術領域：
：本發明涉及油菜細胞質類型的鑒定，尤其涉及建立油菜細胞質類型目標基因特異PCR標記的方法，以及利用建立的標記快速鑒定油菜細胞質類型的方法。
背景技術：
：油菜細胞質具有高度異質性，是由細胞質基因組載體-線粒體基因組DNA序列決定的，不受油菜細胞核基因以及環境因素的影響。目前，國內外己報道的油菜細胞質類型較多，常見的細胞質類型主要有Nap細胞質類型(Nap)、波里瑪系統細胞質(Pol)/陜2A細胞質類型、Cam細胞質類型、蘿卜質細胞質類型(0gu)等。目前，油菜細胞質類型主要通過普通遺傳學方法研究、線粒體基因組DNA的限制性酶切片段長度多態性(即mtDNA-RFLP)標記2種進行鑒定。用普通遺傳學方法對正常油菜品種的細胞質類型鑒定，一般用待測油菜品種做母本(人工去雄)，與某種已知細胞質雄性不育類型的保持系雜交，根據該組合F2群體中是否出現不育株，來確定待測品種的細胞質類型。如果F2群體出現不育株，則說明待測品種具有該種不育胞質；如果全可育，則說明待測品種具有相對于該種不育胞質來說，稱為正常可育的胞質。該方法需要進行油菜雜交試驗，一般需要3個時代(23年)時間；費時費力，且每種雜交組合只能確定待鑒定油菜和某種已知胞質類型的油菜是否為相同的細胞質；如果不是相同的細胞質類型，則仍不能確定待鑒定油菜的細胞質到底是那種類型。利用上述遺傳學方法，Shiga(1976，1977，1978)對來自日本和歐洲的162個油菜品種，胡瓊等(1992)對來自8個國家的43個油菜品種的細胞質類型進行了鑒定。隨著分子生物學理論和技術的發展，有些研究者已通過分離提取油菜線粒體基因組(mtDNA)，利用mtDNA-RFLP標記(楊光圣等，中國農業科學，1998，31(1):27-31)或基因組重復序列的PCR技術(rep-PCR)(程計華等，作物學報，2008，34(11):1946-1952)區別和鑒定油菜各種細胞質類型。利用這兩種分子標記方法鑒定油菜細胞質類型，與普通遺傳學方法比較，實驗周期大大縮短，但是都需分離純化油菜線粒體和提取線粒體DNA，且mtDNA-RFLP方法需要進行mtDNA的限制性酶切和酶切片段的分離檢測，操作程序繁瑣、復雜、技術難度大而且成本高。目前，甘藍型油菜Nap細胞質類型的線粒體全基因組已被測序。國內外研究已表明，不同油菜細胞質類型的mtDNA組織結構差異較大；油菜細胞質雄性不育系的線粒體基因組中具有與其細胞質雄性不育相關的特異基因片段。研究已揭示出Ogu、Nap和Pol等不育系的不育性狀相關的線粒體基因序列分別為其mtDNA的特異讀碼框Orfl38、orf222/nad5c、以及Orf224/atp6。危文亮等(2005，中國農業科學，38(10):1965-1972)根據油菜線粒體基因Orfl38、orf222/nad5c、以及Orf224/atp6序列和已發表的擬南芥線粒體基因組序列設計PCR引物，可特異擴增出目標片段。程計華等(作物學報，2008，34(11):1946-1952)也得到類似的實驗結果。mtDNA這些特異基因序列是受細胞質遺傳的，不受油菜細胞核基因以及環境因素的影響。因此，依據不同細胞質類型油菜線粒體DNA特異序列開發的分子標記可作為鑒定油菜細胞質類型的可靠分子標記。
發明內容本發明的目的在于，提供一種建立油菜細胞質類型目標基因特異標記的方法，以及利用建立的該油菜細胞質類型目標基因特異PCR標記，用于快速鑒定油菜細胞質類型的用途。為了實現上述任務，本發明采取如下的技術解決方案一種建立油菜細胞質類型目標基因特異PCR標記的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟1)以已知細胞質類型的甘藍型油菜包括Nap類型、Pol類型、Ogu類型和Cam類型的gDNA為模板，用以下3對擴增引物對目標基因Orf138、orf222/nad5c、orf224進行一步多重PCR擴增，其中第一對引物的序列為GAMCGGGMGTGACAATGCATTATTTTCTCGGTCCAT;第二對引物的序列為AGCTGTCTGGAGGGMTCGCGGTCTCACGCACTAATC;第三對引物的序列為AGCTGTCTGGAGGGMTCACGACATCMGGAGGAAC;第一對引物擴增目標基因是0rfl38;第二對引物擴增目標基因是orf222/nad5c;第三對引物的擴增目標基因是orf224;2)—步多重PCR擴增采用20ul的PCR反應體系，進行35個PCR循環反應，得到片段大小分別為465bp、500bp、747bp、800bp、1102bp的特異PCR標記，其中，465bp和500bp的標記標示0gu細胞質類型，1102bp和800bp的標記標示nap細胞質類型，747bp和500bp的標記標示pol細胞質類型，800bp和500bp的標記標示Cam細胞質類型，1102bp和465bp的標記標示改良OgU細胞質類型。本發明以油菜基因組DNA(gDNA)為模板，用已報道的線粒體基因OrfB8、orf222/nad5c、orf224/atp6區域的特異引物，提供了一種建立油菜細胞質類型目標基因特異PCR標記的方法，并提供利用建立的特異PCR標記快速鑒定油菜細胞質類型的方法。采用本發明的方法，只需要3-5天就可以實現對多個待測油菜材料的細胞質類型鑒定和區分。與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下1、與普通遺傳學研究鑒定細胞質類型的方法相比，本發明無需進行油菜種植和雜交試驗，建立基于油菜mtDNA序列結構差異的特異PCR標記，利用特異分子標記鑒定油菜細胞質類型，省時、省力、準確、快速。2、與利用mtDNA-RFLP和rep-PCR標記鑒定油菜細胞質的技術相比，本發明無需分離純化油菜線粒體和提取線粒體DNA;且與利用mtDNA-RFLP標記比較，無需進行mtDNA的限制性酶切和酶切片段的分離檢測，只需提取待測油菜基因組DNA，直接以基因組DNA為模板，進行PCR擴增，即可鑒定待測油菜的細胞質類型。本發明操作簡單，省時省力，且大大降低了鑒定成本。3、本發明首次利用3對序列特異PCR引物，對已知Nap、Pol、Cam、Ogu和改良Ogu細胞質類型油菜基因組DNA進行一步多重PCR擴增，以及擴增產物的分析，建立了Nap、Pol、Cam、Ogu和改良Ogu細胞質類型油菜一步多重PCR特異標記，根據這些特異分子標;i己，可以快速鑒定出待測甘藍型油菜的細胞質類型。用本發明方法鑒定油菜細胞質類型，快速、簡單、結果準確、成本低廉。圖1是顯示根據本發明建立油菜細胞質類型特異PCR標記方法得到的Nap、Pol、Cam、0gu和改良0gu細胞質類型油菜一步多重PCR產物電泳圖譜和標示上述細胞質類型的特異標記。圖2是顯示部分油菜材料一步多重PCR產物電泳圖譜。具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的詳細的說明。具體實施例方式本發明通過一步多重PCR技術，建立了標示油菜Nap、Pol、Cam、Ogu等細胞質類型的特異PCR標記，通過利用這些特異PCR標記可以快速鑒定待測油菜的細胞質類型。本發明以油菜基因組DNA(gDNA)為模板，用已報道的線粒體基因Orfl38、orf222/nad5c、orf224/atp6區域的特異引物，提供了一種建立油菜細胞質類型目標基因特異PCR標記的方法，并提供利用建立的特異PCR標記快速鑒定油菜細胞質類型的方法。采用本發明的方法，只需要3-5天就可以實現對多個待測油菜材料的細胞質類型鑒定和區分。首先，用本領域共知的CTAB方法分別提取已知Nap、Pol、Cam和0gu細胞質類型油菜和待鑒定油菜的基因組DNA;其次，分別以提取的已知細胞質類型油菜和待鑒定油菜基因組DNA為模板，利用本發明所述的3對PCR引物和一步多重PCR方法進行PCR擴增；按照本發明所述的PCR擴增產物的檢測方法進行檢測、照相；最后，比較待鑒定油菜和已知細胞質類型油菜PCR產物電泳圖譜，確定待鑒定油菜的細胞質類型。以下是發明人給出的實施例實施例l:利用一步多重PCR技術建立油菜Nap、Pol、Cam、Ogu細胞質類型的特異PCR標記本實施例所利用的PCR引物序列、所擴增的目標基因、擴增片段的大小以及所標示的細胞質類型如下列表1所示表l:PCR引物序列、擴增目標基因、擴增片段大小以及所標示的細胞質類型<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>以已知細胞質類型的甘藍型油菜包括Nap、Pol、Ogu和Cam細胞質類型甘藍型油菜的gDNA為模板，用表1所示3對引物進行一步多重PCR擴增，建立上述細胞質類型目標基因的特異PCR標記。上述一步多重PCR擴增采用20ul反應體系，其中包括10mMTris-HCl、50mMKCl、1.5mMMgCb、250四種dNTP、0.5nM各條引物、0.5UTaqDNA酶(Tiangenbiotech.Co.,Beijing,China)和50ng基因組DNA。PCR擴增循環反應程序為變性94°C2min94。C30s54。C50s72。C70s延伸72°C7min對PCR擴增產物進行檢測，取5ulPCR產物用2。/。的瓊脂糖凝膠電泳，100V電壓下電泳35min左右，電泳緩沖液為TAEbuffer(含40mMTris-HAc、2mMEDTA);溴化乙錠染色；用凝膠成像系統觀察、照相，得到PCR產物35cycles-電泳圖譜，以及Nap、Pol、Cam、Ogu等細胞質類型油菜的一步多重PCR特異標記。其中，附圖1中的1泳道和2泳道的帶型分別為改良0gu和Ogu細胞質類型油菜一步多重PCR特異標記；3泳道和5泳道的帶型為Pol細胞質類型油菜一步多重PCR特異標記；4泳道和7泳道的帶型為cam細胞質類型油菜一步多重PCR特異標記；6泳道和8泳道的帶型為Nap細胞質類型油菜一步多重PCR特異標記；M泳道為標準DNAmarker。發明人利用本發明的上述方法，鑒定了國內外141份油菜材料的細胞質類型。以待測油菜基因組DNA為模板，同時用上述3對引物，采用上述20ulPCR反應體系和循環反應條件，進行一步多重PCR擴增；將PCR產物電泳圖譜與上述建立的各細胞質類型油菜標準圖譜進行對比，即可快速確定待測油菜的細胞質類型。部分待測油菜材料一步多重PCR產物電泳圖譜見說明書附圖2，其中圖中M泳道為標準DNAmarker;其它泳道為待檢油菜材料。141份油菜材料的名稱及鑒定結果見下列表2。表2:國內外141份油菜品種(系)細胞質類型鑒定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注0p，開放授粉品種；Line,自交系;核苷酸序列表<110>西北農林科技大學<120>建立油菜細胞質類型特異PCR標記以及快速鑒定油菜細胞質類型的方法<140><141><160>6<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1GAAACGGGAAGTGACAAT<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2GCATTATTTTCTCGGTCCAT<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3agctgtctggagggaatc<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4gcggtctcacgcactaaTc<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223><400>5AGCTGTCTGGAGGGAATC<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>6ACGACATCAAGGAGGAAC權利要求1、一種建立油菜細胞質類型目標基因特異PCR標記的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟1)以已知細胞質類型的甘藍型油菜包括Nap、Pol、Ogu和Cam類型的甘藍型油菜的gDNA為模板，用以下3對擴增引物對目標基因Orf138、orf222/nad5c、orf224進行一步多重PCR擴增，其中第一對引物的序列為GAAACGGGAAGTGACAATGCATTATTTTCTCGGTCCAT；第二對引物的序列為AGCTGTCTGGAGGGAATCGCGGTCTCACGCACTAATC；第三對引物的序列為AGCTGTCTGGAGGGAATCACGACATCAAGGAGGAAC；第一對引物擴增目標基因是Orf138；第二對引物擴增目標基因是orf222/nad5c；第三對引物的擴增目標基因是orf224；2)一步多重PCR擴增采用20ul的PCR反應體系，進行35個PCR循環反應，得到片段大小分別為465bp、500bp、747bp、800bp、1102bp的特異PCR標記，其中，465bp和500bp的標記標示ogu細胞質類型，1102bp和800bp的標記標示nap細胞質類型，747bp和500bp的標記標示pol細胞質類型，800bp和500bp的標記標示Cam細胞質類型，1102bp和465bp的標記標示改良ogu細胞質類型。2、如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述20ulPCR反應體系和PCR循環反應如下20ulPCR反應體系包括lOmMTris-HCl、50mMKCl、1.5mMMgCl2、250mM四種dNTP、0.5pM各條引物、0.5UTaqDNA酶和50ng基因組DNA;PCR循環反應程序為變性94°C，2min;循環反應94°C，30s，54°C，50s，72°C，70s,共35個循環；最后延伸72°C，7min。3、權利要求1所述的建立油菜細胞質類型目標基因特異pcr標記的方法在鑒定油菜細胞質類型中的應用。4、如權利要求3所述的應用，其特征在于，鑒定油菜細胞質類型按以下步驟進行(a)以待測油菜基因組DNA為模板，重復權利要求1中所述的一步多重PCR擴增；(b)檢測PCR擴增產物，取步驟(a)中的5ulPCR產物用2。/。的瓊脂糖電泳，100V電壓下電泳35min左右，電泳緩沖液為TAE;溴化乙錠染色；用凝膠成像系統觀察照相；(c)將步驟(b)中得到的電泳結果與權利要求1建立的特異PCR標記進行比對，從而得出待測油菜的細胞質類型。全文摘要本發明公開了一種建立油菜細胞質類型目標基因特異PCR標記的方法，以及利用建立的該油菜細胞質類型目標基因特異PCR標記，用于快速鑒定油菜細胞質類型的用途。本發明主要通過以已知細胞質類型油菜和待鑒定的油菜基因組DNA為模板，用3對特異PCR引物，對已知Nap、Pol、Cam、Ogu和改良Ogu細胞質類型油菜基因組DNA進行一步多重PCR擴增，以及擴增產物的分析，建立了Nap、Pol、Cam、Ogu和改良Ogu細胞質類型油菜一步多重PCR特異標記，根據這些特異分子標記，可以快速鑒定出待測甘藍型油菜的細胞質類型。用本發明方法鑒定油菜細胞質類型，具有快速、簡單、結果準確、成本低廉、可重復性好的特點。文檔編號C12P19/00GK101608198SQ20091002229公開日2009年12月23日申請日期2009年4月30日優先權日2009年4月30日發明者李占杰,胡勝武,趙惠賢申請人:西北農林科技大學