專利名稱：用于基因表達時序研究的質粒及其制備方法
技術領域：
本發明的技術方案涉及芽孢桿菌屬載體的DNA重組技術，具體地說是用于早期感受態基因與脂肽合成酶基因表達時序研究的質粒及其制備方法。
背景技術：
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)作為Bacillus的模式種，是重要的工業酶的來源。它在不利的環境條件下會產生芽孢，整個分化過程由一系列基因介導，這些基因有序而又協調地表達，其中至少有6個σ因子和139個基因參與。一旦環境條件適應，枯草芽孢桿菌又可以恢復正常生長。另外，枯草芽孢桿菌還可自發進入感受態。目前，對枯草芽孢桿菌的研究主要包括細胞壁的合成與細胞生長及細胞分裂；中間代謝過程酶的基因定位；芽孢形成和萌發有關的生化和形態學變化的基因的確定；轉化和轉導過程中遺傳交換機制；感受態等基因的分析與定位；DNA、RNA與蛋白質的合成以及抗生素產生基因定位等。1968年發現枯草芽孢桿菌可以產生脂肽合成酶。細菌的信號傳導和遺傳控制是在復雜的調控網絡中進行的，脂肽合成酶基因處于該調控網絡的中心位置，細菌在感知外界的刺激和內部的各種反應，如營養水平、細胞濃度、感受態、芽孢形成等，都與脂肽合成酶基因有直接或間接的聯系。但遺憾的是，多年來人們只著重于感受態和芽孢的相關研究，卻忽略了具有如此重要的處于調控網絡中心位置的脂肽合成酶基因的研究。迄今為止，枯草芽孢桿菌的srfA操縱子結構是研究最為深入和廣泛的脂肽合成酶基因(Bourret，R.B.Protein phosphorylationin chemotaxis and two-component regulatory systems of bacteria.J.Biol.Chem.1989，2647085-7088)。從90年代至今，雖然有文獻報道枯草芽孢桿菌的早期感受態基因comA與srfA基因的相互作用關系，但在這些文獻中報道的實驗受體菌均采用不產脂肽或低產脂肽菌株(1.Cosby，W.M.Altered srf expression in Bacillussubtilis resulting from changes in culture pH is dependent on the Spookoligopeptide permease and the ComQX system of extracellular control.J.Bacteriol.1998，1801438-1445；2.Kim S.B.Involvement of acetyl phosphatein the in vivo activation of the response regulator ComA in Bacillus subtilis.FEMS Microbiol Lett.2001，195179-183；3.Hahn，J.Growth stage signaltransduction and the requirement for srfA induction in development ofcompetence.J.Bacteriol.1991，1737275-7282)，幾乎所有的實驗都采用srfA基因5’末端的幾kb的序列與lacZ形成融合，或是連接在自主復制質粒上，或是整合在基因組染色體上，只獲得了一定量的間接證據，因此具有局限性。只有以脂肽高產菌株為研究對象，研究早期感受態基因comA與脂肽合成酶基因lps的相互作用關系才能完善該調控機制理論，而且只有制備出早期感受態基因comA與脂肽合成酶基因lps表達時間研究所需的質粒才能對脂肽高產菌株中comA和lps基因的表達時序進行深入研究。CN1371423公開了環狀脂肽酰基轉移酶編碼區的核苷酸序列的測定、以及所述酰基轉移酶全氨基酸序列的測定、含有編碼所述酶的基因的表達載體以及提供通過在宿主細胞中表達所述表達載體而制備環狀脂肽酰基轉移酶的方法；CN1240482和日本專利03-098595都是公開了利用Bacillus subtilis生產多肽的方法。這些報道與本發明的技術主題雖然有點關聯，但是并不屬于同一技術領域，也無法作為本發明專利性的對比文獻。總之，通過對國內外文獻數據庫的檢索尚未發現有有關早期感受態基因comA與脂肽合成酶基因lps表達時序研究所需的質粒及其制備方法的報道。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供用于基因表達時序研究的質粒及其制備方法，本發明的質粒有兩種，將這兩種質粒分別轉化到由天然物質分離獲得的脂肽高產菌株中制備成基因工程菌株，用來分別研究早期感受態基因comA與脂肽合成酶基因lps的表達時間。
本發明解決該技術問題所采用的技術方案是本發明的用于基因表達時序研究的質粒，包括pMUTIN-COMA系列質粒和pDGlps-lacZ系列質粒，其中pMUTIN-COMA系列質粒包含pMUTIN-COMA1和pMUTIN-COMA2質粒，pMUTIN-COMA1的構建如圖2所示，pMUTIN-COMA2的構建如圖3所示；pDGlps-lacZ系列質粒包含pDGlps(-288～+124)-lacZ、pDGlps(-288～+262)-lacZ、pDGlps(-230～+257)-lacZ和pDGlps(-230～+304)-lacZ質粒，pDGlps(-288～+124)-lacZ的構建如圖4所示，pDGlps(-288～+262)-lacZ的構建如圖5所示，pDGlps(-230～+257)-lacZ的構建如圖6所示，pDGlps(-230～+304)-lacZ的構建如圖7所示。
pDGlps-lacZ質粒中攜帶的脂肽合成酶基因lps的啟動子區，即簡稱為Plps的序列如下所示GAATTCGC TCTTCGCA AGGGTGTC TTTTTTTT GCCTTTTT TTCGGTTTTTGTGCGG TACACATA GTCATGTA AAGATTGT AAATTGCA GTCAGCAATAAAAAGA ATTGAACG CAGCAGTT CGGTTTAA AAATTTTT ATTTTTCTGTAAATAA TGTTTAGT GGAAATGA TTGCGGCA TCCCGCAA AAATATCCCTGTAAAT AAACTGGA ATCTTTCG GCATCCCG CATGAAAC TTTTCACCCATTTTTC GGTGATAA AAACATTT TTTTCATT TAAAGTGA ACGGTAGTAAGATAAA AAATATTG AAAACAAT GAATAAAT AGCCAAAA ATGTTTCCTATTAGGA TAGGGGAT CTTGCGGT CTTTATCC GCTTATGT TAAACGCCGCAATGCT GACTGACG GCTGCCCG TTTTTATA GCGGCAAT CTGTTTTTTGTTTGGA AGCTCTGC TTTTTAAG TGTAGTAC TTTGGGCT ATTTCGGCTGGTAGTT CATAAGAA TTAAAAGC TGATATGG ATAAGAAA GAGAAAATGCGTTGCA CAGGATCC本發明的用于基因表達時序研究的質粒的制備方法如下第一步，B.subtilis MO-L010基因組DNA的提取按照下列Bacillus基因組DNA的提取方法，對B.subtilis MO-L010基因組DNA進行提取，得到DNA片斷大小為23kb左右；Bacillus基因組DNA的提取方法①挑取LB培養基平板上新鮮活化的單菌落于5ml LB培養基中，于37℃震蕩培養12小時，②轉移3ml菌液于5ml離心管中，4℃，轉速為12000r/min，離心5分鐘，棄掉上清液，③將細菌沉淀物用0.5M NaCl洗一次，盡量空干上清液，④將沉淀重懸于pH＝8.0的50mM Tris緩沖液1ml中，然后加入新鮮配置的溶解在pH＝8.0的0.25M Tris緩沖液中的濃度為10mg/ml的溶菌酶溶液0.2ml和0.25M的EDTA溶液0.8ml，混勻后于37℃放置1小時，再加入200μl 10％SDS溶液，混勻后于55℃下放置5分鐘，⑤加入體積比為1∶1的酚-氯仿1.5～2ml，混勻，用轉速為12000r/min的離心機，離心10分鐘，形成上下兩相，⑥轉移⑤中上相至一新的離心管中，重復上個步驟直到無白色變性蛋白層出現，⑦取上清液，加入3μl 10mg/ml的去DNase的RNase溶液，于37℃水浴1小時，⑧加入體積比為1∶1的酚-氯仿1.5～2ml，混勻，用轉速為12000r/min的離心機，離心10分鐘，形成上下兩相，⑨轉移⑧中上相至一新的離心管中，加入1/10體積的pH＝5.2的3mol/LNaAc溶液和2倍體積的冷無水乙醇，于-70℃下放置30分鐘，⑩將⑨的液體于4℃下，轉速為12000r/min，離心10分鐘，棄上清液，用70％乙醇洗兩次，干燥后溶于100μl的TE溶液中，在-20℃下保存備用；第二步，全長comA序列的擴增及測序按照下列引物設計及合成方法，獲得全長comA序列擴增引物如下上游引物5’CCA TAA GCT TGG GGC TTT CTG GCA 3’下游引物5’TGG GAA TTC AGA TCA GCC TCT CTT 3’引物設計及合成方法參考Bacillus subtilis全基因組、comA、Psrf序列，以及質粒pMUTIN2、pDG1728、pUC19、pHT315序列，使用OLIGO6.0和Primer Premier5.0引物分析軟件進行輔助設計，上海Sangon或BioAsia合成；
按照下列DNA擴增方法，以B.subtilis MO-L010基因組DNA為模板擴增出全長comA，由上海生工測序，全長comA序列4753～5964bp如下CCATAAGC TTGGGGCT TTCTGGCA TTAAGGAG AGAGTCAG GGCTTTAGATGGGCGC CTTCGGAT TGAAACAA GTGAAGGA AAGGGCTT TAAGGCTGATATTGAA ATCGAATT GTAATGGA TTTATAAC GGAAACGA CTTGGCACAGGCCAAG TCTTTTTT ATAAAATG GAAAAGAG TGAGTAAA AGGGAGGAAAACATGA AAAAGATA CTAGTGAT TGATGACC ATCCGGCT GTCATGGAAGGCACCA AGACAATT TTGGAAAC GGATTCGA ATTTGTCT GTTGATTGTCTCAGTC CTGAACCG AGCGAACA GTTTATCA AGCCGCAT GATTTCTCGTCATATG ATCTCATT TTAATGGA TCTGAATC TAGGCGGC GAGGTCAATGGGATGG AGCTTTCT AAACAGAT TTTACAAG AGAATCCT CATTGTAAAATTATCG TGTATACC GGTTATGA GGTCGAGG ATTATTTC GAGGAAGCGATTCGTG CGGGTCTG CACGGTGC CATCAGCA AAACGGAA TCTAAAGAAAAGATCA CCCAATAC ATATACCA CGTACTCA ATGGAGAA ATTTTAGTCGATTTTG CTTACTTT AAACAGCT GATGACTC AGCAAAAA ACAAAGCCGGCTCCTT CCTCTCAA AAAGAACA AGATGTGC TCACACCT AGAGAATGCCTGATTC TTCAAGAA GTTGAAAA AGGATTTA CAAACCAA GAAATCGCAGATGCCC TTCATTTA AGCAAGCG GTCCATTG AATACAGC TTGACATCGATTTTCA ATAAGCTG AATGTCGG TTCACGGA CGGAAGCG GTTTTGATAGCGAAAT CAGACGGT GTACTTTA AATGTTGG GGGTGTAG ATGATGGATACGAAAC ACACATTG CTTGAAGC GCTTGGTA TAGAGATT GTTGAAAACACAGCGG AACGATGC GTTGCGGT CATGCCGG TGGATCAT CGGACGGTGCAGCCGT TCGGATAT TTGCATGG GGGCGCTT CAGTGGCC CTGGCGGAAACAGCGG CGAGCGCA GGTGCACA GAACCTGA TTGATCAT TCAACACAGGCTTGTG TCGGTTTG GAGATTAA CGCCAACC ATTTAAAA TCTGTAAAGGAAGGAA CGGTAAAG GCGATAGC CGAGCCCG TTCATATC GGCAGAACGACGATTG TCTATCAC ATTCACAT ATATGACG AGCAAGAG AGGCTGATCTGAATTC CCADNA擴增方法①在200μl薄壁離心管中依次加入下列試劑，成分 體積(μl) 說明H2O 33.75 按順序加入薄壁管，在冰上操作10×Ex Taq Buffer(Mg2+free) 5.0025mmol/L MgCl24.002.5mmol/L dNTP Mixture 5.0020pmol/μl上游引物 1.0020pmol/μl下游引物 1.00DNA模板1.0015ng/μl基因組DNA或0.5ng/μl質粒TaKaRa Ex Taq(5U/μl) 0.25total volume 50.00②在4℃短暫離心，使液體集中在管的底部，③將薄壁管放在PCR儀中按如下程序開始循環，熱蓋 103℃熱變性 94℃ 5min
復性40～50℃ 30sec30個循環延伸72℃ 1min/2min保溫72℃ 9min4℃ 無限長第三步，構建pUCCOMA質粒按照第二步的引物設計及合成方法，獲得comA編碼序列擴增引物，如下上游引物5’GTA AAA GCT TGG AAA ACA TGA AAA 3’下游引物5’TGT TCT AGA CAA TCG TCG TTC T 3’按照第二步的DNA擴增方法，以B.subtilis MO-L010基因組DNA為模板擴增出comA編碼序列，并將該序列亞克隆于pUC19載體上，構建如圖1所示的pUCCOMA質粒，pUCCOMA質粒的擴增、提取都按照以下E.coli感受態細胞的制備、轉化及質粒DNA的提取等方法進行，E.coli感受態細胞的制備和轉化方法E.coli JM109感受態的制備和轉化參照Promega公司pGEM-T Easy VectorSystems Technical Mannual；E.coli DH5α感受態的制備和轉化①在LB液體培養基中接入單菌落，于37℃下振蕩培養至OD600為0.3～0.4，在4℃，轉速為5000r/min，離心10分鐘，收集菌體，②用原體積1/10的PIPES緩沖液輕懸，冰浴30分鐘，PIPES緩沖液的組成為PIPES 2ml、0.5M CaCl212ml、甘油14ml、重蒸水72ml，③在4℃，轉速為5000r/min，離心10分鐘，棄盡上清液，輕緩地用1/25 PIPES緩沖液重懸，即成感受態細胞，④每100μl感受態細胞加入4μl DNA連接產物，彈勻后冰浴30分鐘，⑤于42℃準確熱激45秒，立即放置在冰上2分鐘，加入200μl LB培養基重懸，在37℃，100r/min振蕩預培養1小時，⑥將預培養物涂布于含相應抗生素的LB培養基平板，20分鐘后倒置平皿，在37℃下正置培養16～20小時，⑦挑選單菌落，用下列方法提取質粒，然后進行電泳，酶切和PCR鑒定，E.coli質粒DNA提取方法E.coli質粒提取使用經典的堿裂解法提取，參照MolecuLar Cloning Alaboratory Mannual，3rded；第四步本發明質粒的構建方法I.pMUTIN-COMA質粒的構建方法1.按照第二步的引物設計及合成方法，獲得擴增comA response regulatory序列355bp的引物分別如下上游引物5’TTG GAA TTC ATG AAA AAG ATA CTA 3’下游引物5’GTT AGG ATC CAA ACC GAC ACA 3’將PCR擴增的comA response regulatory序列355bp克隆于pMUTIN4質粒，構建pMUTIN-COMA1質粒，如圖2所示，2.按照第二步的引物設計及合成方法，獲得擴增comA response regulator序列和HTH-LUXR區的5’端序列共482bp的引物分別如下上游引物5’GCC AAG CTT GGA AAA CAT GAA AAA 3’下游引物5’GTT AGG ATC CAA ACC GAC ACA 3’將PCR擴增的comA response regulator序列和HTH-LUXR區的5’端序列共482bp克隆于pMUTIN4構建質粒pMUTN-COMA2質粒，如圖3所示，構建時將pMUTIN4的lacZ基因與comA基因的讀框融合，發生同源重組后lacZ基因則完全依賴于PcomA轉錄和表達，lacZ基因本身的RBS被置換為B.subtilis 168 spoVG基因的RBS，保證lacZ基因在B.subtilis細胞保持很高的表達活性；II.pDGlps-lacZ質粒的構建方法1.按照第二步的引物設計及合成方法，獲得脂肽合成酶基因lps的啟動子區，即簡稱為Plps的序列擴增引物如下
上游引物5’TTG GAA TTC GCT CTT CGC AAG GGT 3’下游引物5’CTA GGA TCC GAA ATA GCC CAA AGT 3’以B.subtilis MO-L010全基因組DNA為模板，擴增Plps，由上海生工測序，Plps的序列如下所示GAATTCGC TCTTCGCA AGGGTGTC TTTTTTTT GCCTTTTT TTCGGTTTTTGTGCGG TACACATA GTCATGTA AAGATTGT AAATTGCA GTCAGCAATAAAAAGA ATTGAACG CAGCAGTT CGGTTTAA AAATTTTT ATTTTTCTGTAAATAA TGTTTAGT GGAAATGA TTGCGGCA TCCCGCAA AAATATCCCTGTAAAT AAACTGGA ATCTTTCG GCATCCCG CATGAAAC TTTTCACCCATTTTTC GGTGATAA AAACATTT TTTTCATT TAAAGTGA ACGGTAGTAAGATAAA AAATATTG AAAACAAT GAATAAAT AGCCAAAA ATGTTTCCTATTAGGA TAGGGGAT CTTGCGGT CTTTATCC GCTTATGT TAAACGCCGCAATGCT GACTGACG GCTGCCCG TTTTTATA GCGGCAAT CTGTTTTTTGTTTGGA AGCTCTGC TTTTTAAG TGTAGTAC TTTGGGCT ATTTCGGCTGGTAGTT CATAAGAA TTAAAAGC TGATATGG ATAAGAAA GAGAAAATGCGTTGCA CAGGATCC2.使用下列4對引物lps5’端序列進行PCR擴增，將PCR擴增的4種lps5’端序列插入pDG1728質粒中多克隆位點，構建攜帶Plps的重組質粒pDGlps(-288～+124)-lacZ、pDGlps(-288～+262)-lacZ、pDGlps(-230～+257)-lacZ，pDGlps(-230～+304)-lacZ，它們的構建分別如圖4、5、6、7所示，使用引物分別為pDGlps(-288～+124)-lacZ上游引物5’TTG GAA TTC GCT CTT CGC AAG GGT 3’下游引物5’GCA GGA TCC CGT CAG TCA GCA TTG 3’pDGlps(-288～+262)-lacZ上游引物5’TTG GAA TTC GCT CTT CGC AAG GGT 3’下游引物5’CTA GGA TCC GAA ATA GCC CAA AGT 3’pDGlps(-230～+257)-lacZ上游引物5’GTA GAA TTC TCT TCG CAA GGG TGT 3’下游引物5’AAC GGA TCC TCT CTT TCT TAT CCA 3’
pDGlps(-230～+304)-lacZ上游引物5’GTA GAA TTC TCT TCG CAA GGG TGT 3’下游引物5’CAG GGA TCC TGT GCA ACG CAT TTT 3’pDG1728質粒攜帶amyE基因兩段末端序列和無啟動子的lacZ基因編碼序列，它的同源重組發生在amyE基因序列固定位點處；同時lacZ基因的轉錄需要在多克隆位點處插入啟動子。
本發明的有益效果是本發明提供了研究脂肽高產菌株B.subtilis MO-L010早期感受態基因comA與脂肽合成酶基因lps表達時序所需的質粒及其制備方法，并用于研究comA和lps的時序表達模式中，同時優化了適合脂肽高產菌株B.subtilisMO-L010的感受態細胞制備方法。文獻1.Yasbin，R.E.Transformation andtransfection in lysogenic strains of Bacillus subtilisEvidence forselective induction of prophage in competence cells.J.Bacteriol.1975，121296-304.；2.Anagnostopoulos，C.Requirements for transformation inBacillus subtilis.Bacterio.1961，81741-746.；3.Dubnau，D.Fate oftransforming DNA following uptake by competent Bacillus subtilis I formationand properties of the donor-recipient complex.J.Mol.Biol.1971，56209-221分別報道了3種枯草芽孢桿菌感受態細胞制備方法，它們用于脂肽高產菌株B.subtilis MO-L010都沒能獲得高轉化效率的感受態細胞，本發明將其中的高滲透壓制備感受態細胞方法進行了優化，制備出B.subtilis MO-L010的良好感受態細胞，其轉化自主復制質粒的效率達到108個轉化子/μgDNA，整合質粒的轉化率達到1～10個轉化子/μgDNA。
下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
圖1pUCCOMA質粒的構建圖2pMUTIN-COMA1質粒的構建圖3pMUTIN-COMA2質粒的構建圖4pDGlps(-288～+124)-lacZ質粒的構建圖5pDGlps(-288～+262)-lacZ質粒的構建圖6pDGlps(-230～+257)-lacZ質粒的構建圖7pDGlps(-230～+304)-lacZ質粒的構建具體實施方式
實施例1按照上述本發明的用于基因表達時序研究的質粒的制備方法，制取pMUTIN-COMA系列質粒，包含pMUTIN-COMA1和pMUTIN-COMA2質粒，pMUTIN-COMA1的構建如圖2所示，pMUTIN-COMA2的構建如圖3所示。
實施例2用本發明pMUTIN-COMA系列質粒構建B.subtilis NK-LRL1菌株，研究comA基因的表達時間。
1.按照B.subtilis MO-L010菌株感受態細胞的制備方法，制備感受態細胞，B.subtilis MO-L010菌株感受態細胞的制備方法①挑單菌落接種于5ml LB液體培養基中，于37℃180r/min振蕩培養過夜，全部轉移到含0.5M山梨醇的100ml LB液體培養基中，于37℃180r/min振蕩培養至OD600為0.7～0.75；②冰上預冷20分鐘后，在4℃，轉速為5000r/min，離心10分鐘，用預冷的含0.5M山梨醇；0.5M甘露醇；10％甘油的電擊緩沖液洗四次；③將沉淀重懸于2ml的預冷的電擊緩沖液中，終細胞濃度為1.3～1.4×1010cfu/ml，即得感受態細胞，直接存儲于-70℃下，該感受態細胞轉化自主復制質粒的效率達到108個轉化子/μgDNA，轉化整合質粒的效率達到1～10個轉化子/μgDNA；2.按照下列B.subtilis MO-L010感受態細胞的電轉化方法，將pMUTIN-COMA1與pMUTIN-COMA2各1μg混勻后，電轉化B.subtilis MO-L010，篩選紅霉素抗性菌株即為B.subtilis NK-LRL1菌株，B.subtilis MO-L010感受態細胞的電轉化方法①60μl感受態細胞與1μl質粒DNA混合，自主復制質粒，濃度25～50ng/μL；整合質粒濃度1～5ug/μl，以不加質粒的感受態細胞作陰性對照；②轉移至預冷的電轉化杯中；冰上放置1～5分鐘；③1mm electrode gap轉化杯，采用2kV/mm，4.5～5.9ms電擊，2mm electrodegap轉化杯，采用2.5kV/mm，4.0～5.9ms電擊一次，所用儀器為BioRad，MicropμLserTM；④立即加入500μl含有0.5M山梨醇和0.38M甘露醇的LB培養基；⑤轉移至無菌的1.5ml離心管，37℃，100r/min，預培養3小時；⑥將培養液鋪在1/2含相應抗生素的LB培養基平板上，正置2小時后倒置培養，1/2LB培養基包括胰蛋白胨0.5％、NaCl0.25％、酵母粉0.25％，pH＝7.0～7.2；⑦挑選單菌落，提取質粒進行電泳、酶切、PCR鑒定。
采用以上方法進行感受態細胞制備和轉化，轉化自主復制質粒效率為108個轉化子/μgDNA，整合載體的轉化率為1～10個轉化子/μgDNA。
3.將B.subtilis NK-LRL1菌株分別用脂肽發酵培養基、產芽孢培養基、芽孢桿菌誘導感受態培養基于37℃培養，間隔取樣，按照β-半乳糖苷酶活性測定方法，測試每個樣品的β-半乳糖苷酶活性。
1升脂肽發酵培養基含葡萄糖10g、MgSO4.7H2O0.2g、KH2PO44.1g、NH4NO34g、Na2HPO414.3g、酵母粉0.1g、0.4mol/l的FeSO42μl、0.7mol/l的CaCl24μl，pH＝7.0；1升產孢培養基含蛋白胨1g、葡萄糖1g、酵母粉0.7g、(NH4)2SO40.2g、MgSO4.7H2O0.2g、K2HPO41g，pH＝7.2；1升芽孢桿菌誘導感受態培養基含葡萄糖5g、(NH4)SO414g、KH2PO46g、檸檬酸三鈉1g、MgSO4.7H2O0.2g、酪氨酸0.2g、酵母粉1g，pH＝7.0；β-半乳糖苷酶活性測定方法
①無菌取不同時間的菌液，在波長595nm處測吸光度OD595，4℃12000r/min離心3分鐘；②棄上清液，用冷的1.5ml 25mM pH＝7.4Tris-HCl緩沖液，洗一次；③棄上清液，用1.9ml Z buffer懸起細胞，加入0.48ml lysozyme貯液，該貯液是將濃度為2.5mg/ml的lysozyme溶于Z buffer中，現用現配，輕混，于37℃溫浴5分鐘；④加24μL 10％Trion-X-100，輕混，貯于冰上；⑤30℃預熱樣品5分鐘，加0.6ml ONPG溶液，該ONPG溶液是將濃度為4.0mg/ml ONPG溶于Z buffer中獲得，樣品溫浴在30℃水浴中記錄時間；⑥當樣品由無色轉為明顯的黃色后，加1M Na2CO31.2ml終止反應，記錄終止時間；⑦用12000r/min離心10分鐘，以含有1.6ml Z buffer，0.4ml ONPG和1.0ml Na2CO3空白樣3ml為對照，測420nm波長處的吸光度OD420；⑧計算酶活Unit Definition(1000×OD420)/(reaction time(min)×OD595)Z-bufferNa2HPO4.7H2O 60mM、NaH2PO440mM、KCL 10mM、MgSO4.7H2O 1mM、β-mercaptopethanol 5.0mM，現用現加入Z-bufferB.subtilis NK-LRL1在產脂肽培養基、產芽孢培養基和感受態培養基中β-半乳糖苷酶活性大小變化趨勢相同，表明在脂肽大分子代謝產物的合成、感受態生理狀態的自發形成、細胞分化發育為芽孢的三個過程中，comA的表達時序特征是一致的。細菌進入對數生長早期，PcomA控制的lacZ基因就擁有了很高的轉錄與表達活性；在整個對數生長期，β-glactosidase活性不斷增強，直至對數生長期與平衡期的轉折點，進入平衡期后，β-glactosidase活性開始下降。
實施例3按照上述本發明的用于基因表達時序研究的質粒的制備方法，制取pDGlps-lacZ系列質粒構，包含pDGlps(-288～+124)-lacZ、pDGlps(-288～+262)-lacZ、pDGlps(-230～+257)-lacZ和pDGlps(-230～+304)-lacZ質粒，pDGlps(-288～+124)-lacZ的構建如圖4所示，pDGlps(-288～+262)-lacZ的構建如圖5所示，pDGlps(-230～+257)-lacZ的構建如圖6所示，pDGlps(-230～+304)-lacZ的構建如圖7所示。
實施例4用本發明pDGlps-lacZ系列質粒構建Bacillus subtilisNK-LRL2菌株，研究lps基因的表達時間1.按照實施例1的B.subtilis MO-L010感受態細胞的制備方法，制備感受態細胞，該感受態細胞轉化自主復制質粒的效率達到108個轉化子/μgDNA，轉化整合質粒的效率達到1～10個轉化子/μgDNA，2.按照實施例1的B.subtilis MO-L010感受態細胞的電轉化方法，將攜帶Plps的重組質粒pDGlps(-288～+124)-lacZ、pDGlps(-288～+262)-lacZ、pDGlps(-230～+257)-lacZ，pDGlps(-230～+304)-lacZ各0.5μg混勻電轉化B.subtilis MO-L010感受態細胞，進入宿主菌后這些質粒大部分會很快丟失，僅有很少的一些質粒與染色體發生同源重組獲得穩定遺傳。同源重組中有發生雙交換的，也有發生單交換的，只有Plps～lacZ和抗生素選擇標記置換出amyE兩個片段間序列，造成amyE基因突變的雙交換同源重組，才是本實驗篩選的目標。目標菌株抗生素表型為Spcr，Erythromycin-Lincomycins，將篩選的目標菌株命名為Bacillus subtilis NK-LRL2。
3.將B.subtilis NK-LRL2接種于產脂肽、產芽孢和誘導感受態三種培養基中，按照本發明提供的β-半乳糖苷酶活性測定方法，檢測β-半乳糖苷酶活性，監測Plps的表達水平和最佳表達時期。
B.subtilis NK-LRL2菌株Plps控制的lacZ基因表達與PcomA控制的lacZ基因表達變化趨勢差異很大。在三種培養基中，當B.subtilis NK-LRL2處于對數生長期時，β-半乳糖苷酶表達活性很低，到對數生長期與平衡期交界的轉折點，β-半乳糖苷酶的表達量激增，直到生長末期表達量才下降。由此可見，comA基因與lps基因
Plps的序列如下所示GAATTCGC TCTTCGCA AGGGTGTC TTTTTTTT GCCTTTTT TTCGGTTTTTGTGCGG TACACATA GTCATGTA AAGATTGT AAATTGCA GTCAGCAATAAAAAGA ATTGAACG CAGCAGTT CGGTTTAA AAATTTTT ATTTTTCTGTAAATAA TGTTTAGT GGAAATGA TTGCGGCA TCCCGCAA AAATATCCCTGTAAAT AAACTGGA ATCTTTCG GCATCCCG CATGAAAC TTTTCACCCATTTTTC GGTGATAA AAACATTT TTTTCATT TAAAGTGA ACGGTAGTAAGATAAA AAATATTG AAAACAAT GAATAAAT AGCCAAAA ATGTTTCCTATTAGGA TAGGGGAT CTTGCGGT CTTTATCC GCTTATGT TAAACGCCGCAATGCT GACTGACG GCTGCCCG TTTTTATA GCGGCAAT CTGTTTTTTGTTTGGA AGCTCTGC TTTTTAAG TGTAGTAC TTTGGGCT ATTTCGGCTGGTAGTT CATAAGAA TTAAAAGC TGATATGG ATAAGAAA GAGAAAATGCGTTGCA CAGGATCC全長comA序列4753～5964bp如下CCATAAGC TTGGGGCT TTCTGGCA TTAAGGAG AGAGTCAG GGCTTTAGATGGGCGC CTTCGGAT TGAAACAA GTGAAGGA AAGGGCTT TAAGGCTGATATTGAA ATCGAATT GTAATGGA TTTATAAC GGAAACGA CTTGGCACAGGCCAAG TCTTTTTT ATAAAATG GAAAAGAG TGAGTAAA AGGGAGGAAAACATGA AAAAGATA CTAGTGAT TGATGACC ATCCGGCT GTCATGGAAGGCACCA AGACAATT TTGGAAAC GGATTCGA ATTTGTCT GTTGATTGTCTCAGTC CTGAACCG AGCGAACA GTTTATCA AGCCGCAT GATTTCTCGTCATATG ATCTCATT TTAATGGA TCTGAATC TAGGCGGC GAGGTCAATGGGATGG AGCTTTCT AAACAGAT TTTACAAG AGAATCCT CATTGTAAAATTATCG TGTATACC GGTTATGA GGTCGAGG ATTATTTC GAGGAAGCGATTCGTG CGGGTCTG CACGGTGC CATCAGCA AAACGGAA TCTAAAGAAAAGATCA CCCAATAC ATATACCA CGTACTCA ATGGAGAA ATTTTAGTCGATTTTG CTTACTTT AAACAGCT GATGACTC AGCAAAAA ACAAAGCCGGCTCCTT CCTCTCAA AAAGAACA AGATGTGC TCACACCT AGAGAATGCCTGATTC TTCAAGAA GTTGAAAA AGGATTTA CAAACCAA GAAATCGCAGATGCCC TTCATTTA AGCAAGCG GTCCATTG AATACAGC TTGACATCGATTTTCA ATAAGCTG AATGTCGG TTCACGGA CGGAAGCG GTTTTGATAGCGAAAT CAGACGGT GTACTTTA AATGTTGG GGGTGTAG ATGATGGATACGAAAC ACACATTG CTTGAAGC GCTTGGTA TAGAGATT GTTGAAAACACAGCGG AACGATGC GTTGCGGT CATGCCGG TGGATCAT CGGACGGTGCAGCCGT TCGGATAT TTGCATGG GGGCGCTT CAGTGGCC CTGGCGGAAACAGCGG CGAGCGCA GGTGCACA GAACCTGA TTGATCAT TCAACACAGGCTTGTG TCGGTTTG GAGATTAA CGCCAACC ATTTAAAA TCTGTAAAGGAAGGAA CGGTAAAG GCGATAGC CGAGCCCG TTCATATC GGCAGAACGACGATTG TCTATCAC ATTCACAT ATATGACG AGCAAGAG AGGCTGATCTGAATTC CCA
權利要求
1.用于基因表達時序研究的質粒，包括pMUTIN-COMA系列質粒和pDGlps-lacZ系列質粒，其中pMUTIN-COMA系列質粒包含pMUTIN-COMA1和pMUTIN-COMA2質粒，pMUTIN-COMA1的構建如圖2所示，pMUTIN-COMA2的構建如圖3所示；pDGlps-lacZ系列質粒包含pDGlps(-288～+124)-lacZ、pDGlps(-288～+262)-lacZ、pDGlps(-230～+257)-lacZ和pDGlps(-230～+304)-lacZ質粒，pDGlps(-288～+124)-lacZ的構建如圖4所示，pDGlps(-288～+262)-lacZ的構建如圖5所示，pDGlps(-230～+257)-lacZ的構建如圖6所示，pDGlps(-230～+304)-lacZ的構建如圖7所示。
2.根據權利要求1所述的用于基因表達時序研究的質粒，其特征在于pDGlps-lacZ質粒中攜帶的脂肽合成酶基因lps的啟動子區，簡稱為Plps的序列如下所示GAATTCGC TCTTCGCA AGGGTGTC TTTTTTTT GCCTTTTT TTCGGTTTTTGTGCGG TACACATA GTCATGTA AAGATTGT AAATTGCA GTCAGCAATAAAAAGA ATTGAACG CAGCAGTT CGGTTTAA AAATTTTT ATTTTTCTGTAAATAA TGTTTAGT GGAAATGA TTGCGGCA TCCCGCAA AAATATCCCTGTAAAT AAACTGGA ATCTTTCG GCATCCCG CATGAAAC TTTTCACCCATTTTTC GGTGATAA AAACATTT TTTTCATT TAAAGTGA ACGGTAGTAAGATAAA AAATATTG AAAACAAT GAATAAAT AGCCAAAA ATGTTTCCTATTAGGA TAGGGGAT CTTGCGGT CTTTATCC GCTTATGT TAAACGCCGCAATGCT GACTGACG GCTGCCCG TTTTTATA GCGGCAAT CTGTTTTTTGTTTGGA AGCTCTGC TTTTTAAG TGTAGTAC TTTGGGCT ATTTCGGCTGGTAGTT CATAAGAA TTAAAAGC TGATATGG ATAAGAAA GAGAAAATGCGTTGCA CAGGATCC
3.用于權利要求1所述的基因表達時序研究的質粒的制備方法，其特征在于有如下步驟，第一步，B.subtilis MO-L010基因組DNA的提取按照下列Bacillus基因組DNA的提取方法，對B.subtilis MO-L010基因組DNA進行提取，得到DNA片斷大小為23kb左右；Bacillus基因組DNA的提取方法①挑取LB培養基平板上新鮮活化的單菌落于5ml LB培養基中，于37℃震蕩培養12小時，②轉移3ml菌液于5ml離心管中，4℃，轉速為12000r/min，離心5分鐘，棄掉上清液，③將細菌沉淀物用0.5M NaCl洗一次，盡量空干上清液，④將沉淀重懸于pH＝8.0的50mM Tris緩沖液1ml中，然后加入新鮮配置的溶解在pH＝8.0的0.25M Tris緩沖液中的濃度為10mg/ml的溶菌酶溶液0.2ml和0.25M的EDTA溶液0.8ml，混勻后于37℃放置1小時，再加入200μl 10％SDS溶液，混勻后于55℃下放置5分鐘，⑤加入體積比為1∶1的酚-氯仿1.5～2ml，混勻，用轉速為12000r/min的離心機，離心10分鐘，⑥轉移上相至一新的離心管中，重復上個步驟直到無白色變性蛋白層出現，⑦取上清液，加入3μl 10mg/ml的去DNase的RNase溶液，于37℃水浴1小時，⑧加入體積比為1∶1的酚-氯仿1.5～2ml，混勻，用轉速為12000r/min的離心機，離心10分鐘，形成上下兩相，⑨轉移⑧中上相至一新的離心管中，加入1/10體積的pH＝5.2的3mol/L NaAc溶液和2倍體積的冷無水乙醇，于-70℃下放置30分鐘，⑩將⑨的液體于4℃下，轉速為12000r/min，離心10分鐘，棄上清液，用70％乙醇洗兩次，干燥后溶于100μl的TE溶液中，在-20℃下保存備用；第二步，全長comA序列的擴增及測序按照下列引物設計及合成方法，獲得全長comA序列擴增引物如下上游引物5’CCA TAA GCT TGG GGC TTT CTG GCA 3’下游引物5’TGG GAA TTC AGA TCA GCC TCT CTT 3’引物設計及合成方法參考Bacillus subtilis全基因組、comA、Psrf序列，以及質粒pMUTIN2、pDG1728、pUC19、pHT315序列，使用OLIGO6.0和Primer Premier 5.0引物分析軟件進行輔助設計，上海Sangon或BioAsia合成；按照下列DNA擴增方法，以B.subtilis MO-L010基因組DNA為模板擴增出全長comA，由上海生工測序，全長comA序列4753～5964bp如下CCATAAGC TTGGGGCT TTCTGGCA TTAAGGAG AGAGTCAG GGCTTTAGATGGGCGC CTTCGGAT TGAAACAA GTGAAGGA AAGGGCTT TAAGGCTGATATTGAA ATCGAATT GTAATGGA TTTATAAC GGAAACGA CTTGGCACAGGCCAAG TCTTTTTT ATAAAATG GAAAAGAG TGAGTAAA AGGGAGGAAAACATGA AAAAGATA CTAGTGAT TGATGACC ATCCGGCT GTCATGGAAGGCACCA AGACAATT TTGGAAAC GGATTCGA ATTTGTCT GTTGATTGTCTCAGTC CTGAACCG AGCGAACA GTTTATCA AGCCGCAT GATTTCTCGTCATATG ATCTCATT TTAATGGA TCTGAATC TAGGCGGC GAGGTCAATGGGATGG AGCTTTCT AAACAGAT TTTACAAG AGAATCCT CATTGTAAAATTATCG TGTATACC GGTTATGA GGTCGAGG ATTATTTC GAGGAAGCGATTCGTG CGGGTCTG CACGGTGC CATCAGCA AAACGGAA TCTAAAGAAAAGATCA CCCAATAC ATATACCA CGTACTCA ATGGAGAA ATTTTAGTCGATTTTG CTTACTTT AAACAGCT GATGACTC AGCAAAAA ACAAAGCCGGCTCCTT CCTCTCAA AAAGAACA AGATGTGC TCACACCT AGAGAATGCCTGATTC TTCAAGAA GTTGAAAA AGGATTTA CAAACCAA GAAATCGCAGATGCCC TTCATTTA AGCAAGCG GTCCATTG AATACAGC TTGACATCGATTTTCA ATAAGCTG AATGTCGG TTCACGGA CGGAAGCG GTTTTGATAGCGAAAT CAGACGGT GTACTTTA AATGTTGG GGGTGTAG ATGATGGATACGAAAC ACACATTG CTTGAAGC GCTTGGTA TAGAGATT GTTGAAAACACAGCGG AACGATGC GTTGCGGT CATGCCGG TGGATCAT CGGACGGTGCAGCCGT TCGGATAT TTGCATGG GGGCGCTT CAGTGGCC CTGGCGGAAACAGCGG CGAGCGCA GGTGCACA GAACCTGA TTGATCAT TCAACACAGGCTTGTG TCGGTTTG GAGATTAA CGCCAACC ATTTAAAA TCTGTAAAGGAAGGAA CGGTAAAG GCGATAGC CGAGCCCG TTCATATC GGCAGAACGACGATTG TCTATCAC ATTCACAT ATATGACG AGCAAGAG AGGCTGATCTGAATTC CCADNA擴增方法①在200μl薄壁離心管中依次加入下列試劑，成分 體積(μl)說明H2O 33.75按順序加入薄壁管，在冰上操作10×Ex Taq Buffer(Mg2+free) 5.0025mmol/L MgCl24.002.5mmol/L dNTP Mixture 5.0020pmol/μl上游引物 1.0020pmol/μl下游引物 1.00DNA模板1.00 15ng/μl基因組DNA或0.5ng/μl質粒TaKaRa Ex Taq(5U/μl) 0.25total volume 50.00②在4℃短暫離心，使液體集中在管的底部，③將薄壁管放在PCR儀中按如下程序開始循環，熱蓋 103℃熱變性 94℃ 5min 延伸 72℃ 1min/2min保溫 72℃ 9min4℃ 無限長第三步，構建pUCCOMA質粒按照第二步的引物設計及合成方法，獲得comA編碼序列擴增引物，如下上游引物5’GTA AAA GCT TGG AAA ACA TGA AAA 3’下游引物5’TGT TCT AGA CAA TCG TCG TTC T 3’按照第二步的DNA擴增方法，以B.subtilisMO-L010基因組DNA為模板擴增出comA編碼序列，并將該序列亞克隆于pUC19載體上，構建如圖1所示的pUCCOMA質粒，pUCCOMA質粒的擴增、提取都按照以下E.coli感受態細胞的制備、轉化及質粒DNA的提取等方法進行，E.coli感受態細胞的制備和轉化方法E.coli JM109感受態的制備和轉化參照Promega公司pGEM-T Easy Vector SystemsTechnical Mannual；E.coli DH5α感受態的制備和轉化①在LB液體培養基中接入單菌落，于37℃下振蕩培養至OD600為0.3～0.4，在4℃，轉速為5000r/min，離心10分鐘，收集菌體，②用原體積1/10的PIPES緩沖液輕懸，冰浴30分鐘，PIPES緩沖液的組成為PIPES2ml、0.5M CaCl212ml、甘油14ml、重蒸水72ml，③在4℃，轉速為5000r/min，離心10分鐘，棄盡上清液，輕緩地用1/25 PIPES緩沖液重懸，即成感受態細胞，④每100μl感受態細胞加入4μl DNA連接產物，彈勻后冰浴30分鐘，⑤于42℃準確熱激45秒，立即放置在冰上2分鐘，加入200μl LB培養基重懸，在37℃，100r/min振蕩預培養1小時，⑥將預培養物涂布于含相應抗生素的LB培養基平板，20分鐘后倒置平皿，在37℃下正置培養16～20小時，⑦挑選單菌落，用下列方法提取質粒，然后進行電泳，酶切和PCR鑒定，E.coli質粒DNA提取方法E.coli質粒提取使用經典的堿裂解法提取，參照MolecuLar Cloning A laboratoryMannual，3rded；第四步本發明質粒的構建方法I.pMUTIN-COMA質粒的構建方法1.按照第二步的引物設計及合成方法，獲得擴增comA response regulatory序列355bp的引物分別如下上游引物5’TTG GAA TTC ATG AAA AAG ATA CTA 3’下游引物5’GTT AGG ATC CAA ACC GAC ACA 3’將PCR擴增的comA response regulatory序列355bp克隆于pMUTIN4質粒，構建pMUTIN-COMA1質粒，2.按照第二步的引物設計及合成方法，獲得擴增comA response regulator序列和HTH-LUXR區的5’端序列共482bp的引物分別如下上游引物5’GCC AAG CTT GGA AAA CAT GAA AAA 3’下游引物5’GTT AGG ATC CAA ACC GAC ACA 3’將PCR擴增的comA response regulator序列和HTH-LUXR區的5’端序列共482bp克隆于pMUTIN4構建質粒pMUTN-COMA2質粒；II.pDGlps-lacZ質粒的構建方法1.按照第二步的引物設計及合成方法，獲得脂肽合成酶基因lps的啟動子區，即簡稱為Plps的序列擴增引物如下上游引物5’TTG GAA TTC GCT CTT CGC AAG GGT 3’下游引物5’CTA GGA TCC GAA ATA GCC CAA AGT 3’以B.subtilis MO-L010全基因組DNA為模板，擴增Plps，由上海生工測序，Plps的序列如下所示GAATTCGC TCTTCGCA AGGGTGTC TTTTTTTT GCCTTTTT TTCGGTTTTTGTGCGG TACACATA GTCATGTA AAGATTGT AAATTGCA GTCAGCAATAAAAAGA ATTGAACG CAGCAGTT CGGTTTAA AAATTTTT ATTTTTCTGTAAATAA TGTTTAGT GGAAATGA TTGCGGCA TCCCGCAA AAATATCCCTGTAAAT AAACTGGA ATCTTTCG GCATCCCG CATGAAAC TTTTCACCCATTTTTC GGTGATAA AAACATTT TTTTCATT TAAAGTGA ACGGTAGTAAGATAAA AAATATTG AAAACAAT GAATAAAT AGCCAAAA ATGTTTCCTATTAGGA TAGGGGAT CTTGCGGT CTTTATCC GCTTATGT TAAACGCCGCAATGCT GACTGACG GCTGCCCG TTTTTATA GCGGCAAT CTGTTTTTTGTTTGGA AGCTCTGC TTTTTAAG TGTAGTAC TTTGGGCT ATTTCGGCTGGTAGTT CATAAGAA TTAAAAGC TGATATGG ATAAGAAA GAGAAAATGCGTTGCA CAGGATCC2.使用下列4對引物lps 5’端序列進行PCR擴增，將PCR擴增的4種lps5’端序列插入pDG1728質粒中多克隆位點，構建攜帶Plps的重組質粒pDGlps(-288～+124)-lacZ、pDGlps(-288～+262)-lacZ、pDGlps(-230～+257)-lacZ，pDGlps(-230～+304)-lacZ，使用引物分別為pDGlps(-288～+124)-lacZ上游引物5’TTG GAA TTC GCT CTT CGC AAG GGT 3’下游引物5’GCA GGA TCC CGT CAG TCA GCA TTG 3’pDGlps(-288～+262)-lacZ上游引物5’TTG GAA TTC GCT CTT CGC AAG GGT 3’下游引物5’CTA GGA TCC GAA ATA GCC CAA AGT 3’pDGlps(-230～+257)-lacZ上游引物5’GTA GAA TTC TCT TCG CAA GGG TGT 3’下游引物5’AAC GGA TCC TCT CTT TCT TAT CCA 3’pDGlps(-230～+304)-lacZ上游引物5’GTA GAA TTC TCT TCG CAA GGG TGT 3’下游引物5’CAG GGA TCC TGT GCA ACG CAT TTT 3’。
全文摘要
本發明涉及用于基因表達時序研究的質粒及其制備方法，包括pMUTIN－COMA系列質粒和pDGlps－lacZ系列質粒，pMUTIN－COMA系列質粒包含pMUTIN－COMA1，其構建如圖2所示和pMUTIN－COMA2質粒，其構建如圖3所示；pDGlps－lacZ系列質粒包含pDGlps(－288～+124)－lacZ、pDGlps(－288～+262)－lacZ、pDGlps(－230～+257)－lacZ和pDGlps(－230～+304)－lacZ質粒，它們的構建分別如圖4、圖5、圖6、圖7所示。將這兩種質粒分別轉化到由天然物質分離獲得的脂肽高產菌株中制備成基因工程菌，用來分別研究早期感受態基因comA與脂肽合成酶基因lps的表達時間。
文檔編號C12N15/52GK1570120SQ200310122108
公開日2005年1月26日 申請日期2003年12月25日 優先權日2003年12月25日
發明者劉如林, 黃英, 梁鳳來, 顧曉波, 王淑芳 申請人:南開大學