非必要代謝產物生成減少的代謝工程微生物的制作方法

專利名稱：非必要代謝產物生成減少的代謝工程微生物的制作方法
在低增值(low-value added)產品如乙醇、乳酸、檸檬酸、氨基酸和許多抗生素的代謝生成中，底物上產品的產量(yield)，即消耗每單位底物形成的產物量(經常表示為消耗每kg底物形成的kg產物)和生產率(productivity)，即單位反應體積和單位時間內形成的產物的量(經常表示為每m3反應體積、每小時形成的kg產物)是待優化的最重要的設計變量。為了獲得高產量和生產率，必須引導碳以高速率從底物流向目的代謝物，并同時使所有可能的副產物的生成最小。這經常需要對中心碳代謝(central carbon metabolism)進行改造，由于細胞代謝這一部分的嚴緊調控，這種改造是困難的(Nielsen，2001)。
已經優化了許多發酵方法，從而主要形成所需的產物。但是，由于細胞代謝的復雜性，形成副產物是不可避免的。由于至少三個原因，這是不希望的·副產物可能對人類或動物有毒。
·副產物可能在后續的分離工藝中引發問題或對環境有害。
·副產物的形成導致碳流失，從而使原材料上產物的總產量低于理論最大值。
如果人類或動物直接或間接暴露于產物，第一個原因明顯是麻煩的。通常，在制備用于人消費的產品時，人們選擇不生成毒素的細胞系統，如使用不生成黃曲霉毒素的真菌細胞來生產食品級酶，使用不生成內毒素的大腸桿菌(E.coli)菌株來生產藥品。如果副產物具有與所需產物非常相似的特征，第二個原因是特別麻煩的，因為活性產物的分離需要非常有效的分離原理，其經常成本較高。在某些情況下，副產物還可以導致其他類問題，如鈍化所需的產物。生產低增值產品如乙醇、乳酸、氨基酸和許多抗生素時，碳流失到副產物中的問題是主要的問題。
舉例來說，通過釀酒酵母(S.cerevisiae)的厭氧發酵來生產乙醇時，主要問題是大量形成作為副產物的甘油。在厭氧生產條件下，由生物質(biomass)形成所形成的胞質NADH只能夠通過甘油的形成重新轉化為NAD+(van Dijken and Scheffers，1986)。有兩個基因GPD1和GPD2編碼甘油-3-磷酸脫氫酶，所述的甘油-3-磷酸脫氫酶在將二羥基丙酮-磷酸轉化為甘油-3-磷酸的同時將NADH重新生成NAD+。破壞GPD2導致甘油形成的一定程度減少，并且比生長速率也顯著下降(Valadi et al.，1998；Nissen et al.，2000a)。gpd1gpd2雙缺失突變株不能在厭氧條件下生長，因此嘗試了通過在gpd1gpd2雙缺失突變株中表達棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的細菌轉氫酶(催化NADH+NADP+＜＝＞NAD++NADPH)引入再生NAD+的新途徑(Nissen etal.，2000a)。但轉氫酶的表達不能恢復厭氧條件下的生長。EP-A-0733712中也公開了轉氫酶表達的增加。
WO99/46363報道了磷酸化脫氫酶表達導致活細胞中的凈轉氫酶活性，目的是提高產物形成。因此，通過超表達編碼磷酸化NADH依賴型谷氨酸脫氫酶(EC1.2.1.12)的GDH2，他們試圖增加始于木糖和葡萄糖的乙醇形成。使用同一概念的另一嘗試是Verho等(2002)所述的表達真菌NADPH依賴型甘油醛脫氫酶。但是，在木糖上的生長過程中，重組細胞還大量生成較多的木糖醇。
在提高乙醇生成和降低甘油形成的另一方法中，Nissen等(2000b)改造了釀酒酵母中的氨同化作用。通過破壞編碼NADPH依賴型谷氨酸脫氫酶的GDH1和超表達GDH2，與生物質的合成相關的NADH的生成顯著減少，導致甘油產量的40％以上的減小(Nissen et al.，2000b)。另外，通過用于氨同化作用并且同樣為NADH依賴型的GS-GOGAT通路在釀酒酵母中的超表達，實現了甘油產量的減小和乙醇產量的增加(Nissen et al.，2000b)。乙醇產量的這種增加緣自GS-GOGAT通路中ATP的額外消耗。該實例說明通過改造代謝的其他部分，具體通過調節氧化還原代謝可以實現通過中心碳代謝的流的再次定向，并且該方法對于提高其他產物的生成也是有作用的，因為NADPH對生物合成的供應經常限制生成能力。當幾乎只有NADPH用作細胞內生物合成中的電子供體時，NADH主要用來產生自由能(經常以ATP中的高能磷酸鍵形式)。在某些條件下，如釀酒酵母在可發酵糖上厭氧生長，形成不能用于產生ATP的過量NADH，這導致形成副產物，主要是甘油。
Valverde等(1999)公開了經人工改造來表達含豌豆(Pisum sativum)GapN基因的cDNA的E.coli菌株，所述的Pisum sativum GapN基因編碼非磷酸化甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPN或GAPDHN(EC 1.2.1.9)。該菌株中編碼NAD依賴型磷酸化甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH的天然Gap-2基因通過插入物失活。發現GAPN的表達重新賦予該菌株在糖上厭氧生長的能力，但是該菌株仍不能進行厭氧發酵。
本發明現提供了一種代謝工程微生物(metabolically engineeredmicro-organiam)，其具有可操作的第一代謝途徑，其中在NAD作為第一種酶輔因子的反應中，第一代謝物轉化為第二代謝物，所述的反應步驟產生NAPH；其中在第二種酶催化的反應中，所述的第二代謝物轉化成至少一種其他代謝物，并且具有可操作的第二代謝途徑，其特征在于關于催化NADP為輔因子、NADPH為產物的不可逆反應的第三種酶，酶活性超過天然水平，其中在沒有所述第二種酶的參與下，所述的第一代謝物轉化為所述的另一代謝物。
在上述的本發明微生物中，所述的第一代謝途徑優選為天然途徑。
在某些優選的實施方案中，所述的第一種酶是磷酸化脫氫酶。
在某些優選的實施方案中，包括前文所參考的實施方案中，所述的第二種酶是激酶。
在某些優選的實施方案中，包括在前面兩段中所參考的實施方案中，所述的第三種酶是非磷酸化脫氫酶，例如所述的第三種酶是GAPN(EC 1.2.1.9)。
磷酸化脫氫酶第一種酶的例子是GAPDH(EC 1.2.1.12)。
在某些優選的實施方案中，包括上文參考的所有實施方案中，編碼所述第三種酶的至少一拷貝基因序列已經重組導入到所述微生物中。
優選的是，編碼所述第三種酶的基因序列可操作地連接于表達信號，所述的表達信號不與所述微生物中的所述基因序列天然相關。
本發明的微生物優選為酵母。其可以是生成乙醇的發酵酵母。其可以是釀酒酵母菌株。
更通常地說，微生物可以是屬于酵母屬(Saccharomyces)的物種，如釀酒酵母、S.Kluyveri、葡萄酒酵母(S.bayanus)、少孢酵母(S.exiguus)、S.sevazzi、葡萄汁酵母(S.uvarum)；屬于克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的物種，如乳酸克魯維酵母(K.lactis)、K.marxianus var marxianus、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)；屬于假絲酵母屬(Candida)的物種，如產朊假絲酵母(C.utilis)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)；屬于畢赤酵母屬(Pichia)的物種，如P.stipidis、甲醇酵母(Pichia Pastoris)、P.sorbitophila或其他酵母物種，如漢遜氏德巴利酵母(Debaromyces hansenii)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、適冷性海洋酵母(Yarrowia lipolytica)、接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
對于其他的微生物(非酵母)，非窮舉的適當微生物的例子包括大腸桿菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、產青霉菌(penicillium chrysogenum)、米根霉(Rhizopusoryzae)。
本發明包括基因轉化的、含有與表達信號可操作連接的編碼GAPN的一個或多個拷貝的異源DNA序列并對GAPDH(EC 1.2.12)具有功能性天然或異源表達能力的微生物。
在另一個方面中，本發明包括非必要代謝產物生成減少的代謝產物的生產方法，包括培養如上所述的本發明微生物。非必要代謝產物可以是甘油、乙酸或氨基酸，也可以是微生物分泌的其他代謝物。
所需的產物可以是乙醇、乳酸、檸檬酸、氨基酸或抗生素。
因此，本發明可以用于提高微生物體內乙醇的生成，也提高乙醇之外的代謝物的生成。因此，Porro等(1999)描述了在酵母中通過去除丙酮酸脫羧酶活性和表達乳酸脫氫酶異源活性來生成乳酸。在丙酮酸向乳酸的轉化中，再生NAD+，和丙酮酸向乙醇的總體轉化情況一樣。因此，糖向乳酸的總體轉化和糖向乙醇的轉化具有高度相似性，所以本發明對乳酸的生成也具有積極效果。
在絲狀真菌黑曲霉對檸檬酸的生成中，糖向檸檬酸的轉化有NADH的凈形成，即在甘油醛-3-P脫氫酶和丙酮酸脫氫酶的部位產生NADH。通過表達GAPN，可以用蛋白質合成所需的NADPH的凈形成置換NADH的部分凈形成。因此，以其他方式如通過戊糖磷酸途徑(糖轉化為二氧化碳，同時形成NADPH)產生NADPH形式的氧化還原力(power)的糖重新導向檸檬酸的形成，導致在糖上的產物的更高產量。類似的推理同樣適用于其他代謝物如琥珀酸和蘋果酸的生成。
在許多氨基酸的生成中，如谷氨酸棒桿菌對賴氨酸的生成中，氨基酸來源于中心碳代謝中的前體代謝物。因此，在細菌中，賴氨酸來源于草酰乙酸，還來源于丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸。在糖向前體代謝物的轉化中，存在有NADH的凈生成，因此糖向賴氨酸的總體轉化涉及NADH的凈生成。在草酰乙酸向賴氨酸的轉化中，存在有NADPH的凈消耗(某些情況下，間接通過使用谷氨酸，其需要消耗NADP從2-酮戊二酸再生)。因此，GAPN的表達導致糖向賴氨酸的總體轉化中NADH的凈形成減少和NADPH的凈消耗減少。類似的推理同樣適用于其他氨基酸如異亮氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸的合成。
在許多抗生素的生成中，如產青霉菌對青霉素的生成中，糖向抗生素的總體轉化中也有NADH的凈生成和NADPH的凈消耗。對于這些過程，表達GAPN也將是有利的。
增加GAPN表達可以有利地和調節(增強或抑制)一種或多種其他酶表達或活性聯合。上面已經提到了酵母中GAPN表達和乳酸脫氫酶表達之間的相互作用。通常，本發明可以用于改進戊糖的代謝。本發明可以用于提高木糖吸收，減少木糖醇分泌。在許多微生物中，木糖代謝涉及將木糖轉化為木糖醇的木糖還原酶(XR)、將木糖醇轉化為木酮糖的木糖醇脫氫酶(XDH)，最后是將木酮糖磷酸化為進入戊糖磷酸途徑的木酮糖-5-磷酸的木酮糖激酶。XR涉及NAPDH(使用NAD+和NADP+二者作為輔因子的酶，但它對NADP+具有偏向性)的形成，而XDH涉及NADH的消耗。因此，在吸收木糖時存在有NADPH的凈消耗和NADH的凈形成。所以，如果GAPN表達與木糖還原酶、木糖脫氫酶和木糖醇激酶表達相結合，增加GAPN表達會導致木糖吸收增加。
可以通過向微生物中導入一個或多個拷貝的、帶有異源啟動子或置于天然啟動子序列的控制之下的酶的DNA編碼序列，提供GAPN或另一種所述第三種酶的表達。合適的是，編碼序列和有效表達信號以多拷貝質粒形式導入。
在優選的實施方案中，本發明特別針對功能性細胞中生成過多NADH的問題和NADPH供應受限制的問題。使細胞減少NADH形成的情況下增加NADPH的形成。例如，這通過在細胞中表達非磷酸化NADP+依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPN)(EC1.2.1.9)，以此作為改變細胞中氧化還原代謝的手段來實現。
GAPN催化甘油醛-3-磷酸和NADP+向3-磷酸甘油酸和NADPH的不可逆氧化。在多數細胞中，甘油醛-3-磷酸向3-磷酸甘油酸的轉化僅由兩種酶NAD+依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(EC 1.2.1.12)和磷酸甘油酸激酶(PGK)(EC 2.7.2.3)的依次作用來催化，將NAD+和ADP轉化為NADH和ATP(參見

圖1)。將甘油醛-3-P轉化為3-P-甘油酸的途徑的凈化學計量關系為GAPN甘油醛-3-磷酸+NADP+→3-磷酸甘油酸+NADPHGAPDH+PGK甘油醛-3-磷酸+NAD++ADP+P＝3-磷酸甘油酸+NADPH+ATP因此，當與GAPDH和PGK催化的總反應相比時，GAPN催化的反應生成一個NADPH，而非生成一個NADH和一個ATP。
甘油醛-3-磷酸向3-磷酸甘油酸的轉化是主要產能途徑糖酵解的一部分，因此當細胞生長在含己糖或戊糖的基質上時該反應總是活躍的。
通過控制微生物細胞中gapN的表達量，可以對甘油醛-3-磷酸向3-磷酸甘油酸的轉化中應有多大部分經由GAPN進行控制。因此，通過控制消耗一個NADH和ATP時形成一個NAPDH的量，可以操縱氧化還原代謝。
下面的實施例參照附圖，其中圖1說明實施例8中獲得的關于生物質、葡萄糖和木糖濃度曲線(profile)的結果(表示木糖的符號為實心圓圈和空心菱形，兩條曲線緊密相重疊)；圖2說明實施例8中獲得的關于乙醇、木糖醇、甘油和乙酸濃度曲線(profile)的結果。(閉合的和開放的方框符號用于表示乙醇和乙酸。下面的閉合和開放方框限定的曲線為乙酸。上面的閉合和開放方框限定的曲線為乙醇。)為了在下面的實施例中進行說明，將含突變鏈球菌(streptococcus mutans)中非磷酸化NADP+依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(gapN)的核苷酸序列在釀酒酵母中于多拷貝質粒上表達。所得的菌株特征在于能夠厭氧性地批量培養在己糖上(實施例3)和木糖上(實施例8)，其中厭氧性地批量培養在己糖上是用于乙醇生產的典型方法。在實施例5中測定實施例1的gapN菌株和攜帶空質粒的參照株中NADP+依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性。只能在gapN菌株中測定到GAPN活性，該活性約為NAD+依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性的10％。
當與含空質粒的菌株相比較時，實施例1中gapN菌株的生長速率不受GAPN活性表達的影響。GapN菌株生成少43％的甘油，和多3％的乙醇。在實施例8中實現了乙醇生成的更大增加。
在厭氧生長過程中釀酒酵母形成甘油來維持胞質氧化還原平衡。在厭氧條件下，作為生成生物質和有機酸的結果生成的NADH只有通過形成甘油來氧化成NAD+，因為呼吸是不可能的，且乙醇的形成是一個氧化還原中性的步驟。因此甘油的形成是一個氧化還原問題，通過將gapN導入到釀酒酵母中，通過GAPN轉化的每分子甘油醛-3-磷酸將減少一分子甘油的生成。通過具有足夠高的通過GAPN的流可以完全消除甘油的生成，使流重新導向乙醇和/或生物質，從而增加乙醇產量。
通過在細胞中表達gapN來增加用于生物合成的NADPH的量，可以在NADPH供應有限的情況下增加諸如蛋白質的產物的生成。
示例性方法的優點包括·可以實現產量的更大變化。
·只需要一個遺傳性改變。
·酶活性只影響其所催化的特定反應和氧化還原代謝——對代謝的其他部分沒有影響，因此生長速率不受影響。
·可以消除用酵母生產乙醇的過程中副產物甘油的生成。
實施例1GAPN在釀酒酵母中的表達菌株用釀酒酵母(M4054，S288C MATa ura3gap1)來構建參照菌株和GAPN菌株。為了長期維持，含質粒的菌株在基本培養基(見下文)上的搖瓶培養物中生長至靜止期。加入無菌甘油至濃度為20％(體積/體積)之后，于-80℃分裝保存。這些冷凍的貯液用于在具有基本培養基的平板上獲得單菌落(Verduyn et al.，1990)，該平板保存于4℃，2周內用于預培養物接種。
參照菌株的構建通過電穿孔，將含URA3基因和TPI1啟動子的空pYX212 2μ高拷貝載體轉化到釀酒酵母(M4054)中。
GAPN菌株的構建gapN在含URA3基因和TPI1啟動子的pYX212 2μ高拷貝載體上表達。通過共轉染以及EcoRI消化的pYX212和由突變鏈球菌PCR擴增的gapN之間的同源重組，直接在釀酒酵母中構建所述的質粒。使用Expand High Fidelity(Roche)、與pYX212中TPI1啟動子加上gapN第一部分相同的一個引物(gapN-START-EcoRI-TPI啟動子5′-CTA CAA AAA ACA CAT ACA GGA ATT CATGAC AAA ACA ATA TAA AAA TTA TG)、與pYX212的MCS和包括終止密碼子的agpN最后部分相同的第二引物(gapN-STOP-NcoI-BamHI-AvrII-ApaI 5′-GGG CCCTAG GAT CCA TGG TGAATT TTA TTA TTT GAT ATC AAA TAC GAC GG)對突變鏈球菌的基因組DNA進行PCR。因此gapN的ORF克隆到了pYX212中EcoRI和NcoI之間、TPI1啟動子的下游。原起始密碼子TTG替換為ATG，以使在釀酒酵母中的翻譯成為可能。通過診斷PCR證實構建體。
實施例2搖瓶培養和預培養在帶擋板的棉花塞住的500ml Erlenmeyer燒瓶中進行厭氧搖瓶培養，以篩選所獲得的轉化子。用于厭氧批量培養的預培養物生長在不具有擋板的類似燒瓶中。這些燒瓶每個含100ml規定的礦質培養基(defined mineralmedium)，其含有7.5g/L(NH4)2SO4；14g/L KH2PO4；0.5g/L MgSO4·7H2O；50μl/Lantifoam(Sigma A-8436)；2％(w/vol)葡萄糖；痕量金屬(15mg/L EDTA；4.5mg/LZnSO4·7H2O；0.84mg/L MnCl2·2H2O；0.30mg/L CoCl2·6H2O；0.30mg/L CuSO4·H2O；0.40mg/L Na2MoO4·2H2O；4.5mg/L CaCl2·2H2O；3.0mg/L FeSO4·7H2O；1.0mg/LH3BO3和0.10mg/L KI)和維生素(0.05mg/L D(-)生物素；1.0mg/L D(+)泛酸鈣；1.0mg/L煙酸；25mg/L肌醇；1.0mg/L鹽酸硫胺(thiamine chloride hydrochloride)；1.0mg/L鹽酸吡哆醇(pyridoxol hydrochloride)和0.20mg/L對氨基苯甲酸)。礦質培養基的pH用NaOH調至6.5，和葡萄糖溶液分別高壓滅菌。高壓滅菌后，將維生素溶液通過除菌過濾加入到燒瓶中。將搖瓶和預培養物從平板培養物接種一個單菌落，于30℃以150rpm生長。使預培養物生長至指數期，用于接種厭氧批量培養物至起始濃度為1mg CDW/L。觀察到了參照菌株和GAPN菌株的生長。
實施例3厭氧批量培養在工作體積為2升的良好控制的實驗室發酵罐(B.Braun Biotech，Germany)中進行培養。使用規定的礦質培養基(Verduyn et al.，1990)，其每升含40g葡萄糖；5.0g(NH4)2SO4；3.0g KH2PO4；0.5g MgSO4·7H2O；和搖瓶培養和預培養中所述的痕量金屬和維生素。加入300μl/L antiform(Sigma A-8436)，以免產生泡沫，向培養基添加釀酒酵母厭氧生長所必需的420mg/L Tween 80和10mg/L麥角固醇。葡萄糖溶液和礦質培養基分別高壓滅菌，然后和含維生素的無菌濾液以及首先溶解在煮沸的無水乙醇中的Tween 80和麥角固醇一起加入到發酵罐中。
用速度為600rpm的攪拌器于30℃進行培養，然后以每分鐘400ml的流量通氮氣。為了使O2向培養物的擴散最小，生物反應器安裝Norprene管。溶氧濃度用MettlerToledo極譜電極測定，并保持在檢測限之下。通過自動添加4M KOH使pH保持在5.0。生物反應器安裝冷凝器，放出的氣體導向氣體分析儀(INNOVA，Denmark)，以測定CO2的含量。參照菌株和GAPN菌株發酵過程中的生物質濃度如圖2所示。發現GAPN菌株的最大比生長速率和參照菌株的相同。
實施例4分析細胞外代謝物用來測定葡萄糖、乙醇、甘油、乙酸、丙酮酸和琥珀酸濃度的培養物樣品在取樣后馬上通過0.45μm的醋酸纖維素濾器(Osmonics)進行過濾，將濾液于-20℃冷凍，待進行進一步分析。通過在保持于65℃的、用5mMH2SO4以0.6ml/min的速率洗脫的Aminex HPX-87Hm柱(Bio-Rad)上進行高壓液相層析來測定代謝物的濃度。用Waters 486可變波長紫外檢測器(Tumable AbsobanceDetector)在210nm處通過分光光度法檢測乙酸和丙酮酸。用Waters 410示差折射計(Differential Refractometer)通過折射測定法檢測葡萄糖、乙醇、甘油和琥珀酸。厭氧發酵過程中代謝物的測定值示于圖3中。代謝物的終濃度列在下文中。可以看出GAPN菌株生成了更多的乙醇和更少的甘油。
根據葡萄糖的測定值，計算向不同代謝物的總體轉化產量，如下文所示。
觀察到乙醇產量提高了3％，甘油產量下降了40％。
實施例5測定酶活性如
等(2002)所述借助Fastprep FP120儀(SavantInstruments，New York)生成無細胞提取物。
在30℃，用分光光度計(來自Hewlett Packard的、帶有Chemstation軟件的HP8353 UV-VIS系統)在340nm處跟蹤NADPH或NADH生成來分析酶活性。如Crow和Wittenberger(1979)所述測定1ml反應混合物中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性。為了測定非磷酸化NADP+依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性，反應混合物含有125mM三乙醇胺/HCl緩沖液(pH8.3)、1mM NADP+、5mM 2-巰基乙醇和無細胞提取物。用含125mM三乙醇胺/HCl緩沖液(pH8.3)、1mM NAD+、5mM半胱氨酸/HCl和無細胞提取物的反應混合物測定NAD+依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性。通過加入DL-甘油醛-3-磷酸(從DL-甘油醛-3-磷酸二乙基乙縮醛制備，Sigma G-5376)至終濃度2mM來啟動反應。通過Lowry法，使用無脂肪酸的BSA(Sigma A-6003)作為標準品來測定無細胞提取物中的蛋白質含量。酶活性的分析結果如下所示。可以看出參照菌株中沒有NADP依賴型甘油醛脫氫酶的活性，而GAPN菌株中有一定的低活性(約為總甘油醛脫氫酶活性的10％)。
實施例6 GapN的測序為了證實2μ高拷貝數質粒中表達的gapN編碼基因中沒有發生突變，對含gapN的質粒部分進行測序。插到質粒中和其中實際存在的gapN序列為“atg aca aaa caa tataaa aat tat gtc aat ggc gag tgg aag ctt tca gaa aat gaa attaaa atc tac gaa ccg gcc agt gga gct gaa ttg ggt tca gtt cca
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gaa att tct aac aaa tcg gaa tat gga ctt cag gct tct atc tttaca aat gat ttc cca cgc gct ttt ggt att gct gag cag ctt gaagtt ggt aca gtt cat atc aat aat aag aca cag cgc ggc acg gacaac ttc cca ttc tta ggg gct aaa aaa tca ggt gca ggt att caaggg gta aaa tat tct att gaa gct atg aca act gtt aaa tcc gtcgta ttt gat atc aaa”，其與突變鏈球菌的gapN序列相同。
實施例7GAPN在釀酒酵母的木糖代謝株中的表達菌株用釀酒酵母(MATa SUC2 MAL2-8 pADH-XYL1 pPGK-XYL2 pPGK-XKS1ura3-)來構建表達GAPN的釀酒酵母的木糖代謝株。為了長期維持，含質粒的菌株在基本培養基(見下文)上的搖瓶培養物中生長至靜止期。加入無菌甘油至濃度為20％(體積/體積)之后，于-80℃分裝保存。這些冷凍的貯液用于在具有基本培養基的平板上獲得單菌落(Verduyn et al.，1990)，該平板保存于4℃，2周內用于預培養物接種。
參照菌株的構建通過LiAc法將含URA3基因和TPI1啟動子的空pYX212 2μ高拷貝載體轉化到釀酒酵母(MATa SUC2 MAL2-8 pADH-XYL1 pPGK-XYL2pPGK-XKS1 ura3-)中，在具有葡萄糖的合成性最低限度氨培養基上選擇含有pYX2URA3 2μ質粒的陽性克隆。
GAPN菌株的構建通過LiAc法，將gapN編碼基因前面含有URA3基因和TPI1啟動子的pYX212 2μ高拷貝載體轉化到釀酒酵母(MATa SUC2 MAL2-8 pADH-XYL1pPGK-XYL2 pPGK-XKS1 ura3-)中，并在具有葡萄糖的合成性最低限度氨培養基上選擇URA 2μ中的TPI1啟動子下游含gapN的陽性克隆。
在厭氧搖瓶中葡萄糖上測試多個轉化子的生長速率和GAPN活性。選擇具有未改變的生長速率和高GAPN活性的轉化子，命名為Xy1GAPN菌株——參照菌株稱作Xy1參照菌株。兩種菌株具有位于預期范圍內的類似木糖還原酶和木糖脫氫酶活性。
實施例8釀酒酵母的木糖代謝株的厭氧批量培養在工作體積為4升的良好控制的實驗室發酵罐中進行培養。使用規定的礦質培養基(Verduyn et al.，1990)，其每升含20g葡萄糖；50g木糖；5.0g(NH4)2SO4；3.0g KH2PO4；0.5g MgSO4·7H2O；和搖瓶培養和預培養中所述的痕量金屬和維生素。加入500μl/Lantiform(SigmaA-8436)，以免產生泡沫，向培養基添加釀酒酵母厭氧生長所必需的420mg/L Tween80和10mg/L麥角固醇。葡萄糖溶液和礦質培養基分別高壓滅菌，然后和含維生素的無菌濾液以及首先溶解在煮沸的無水乙醇中的Tween 80和麥角固醇一起加入到發酵罐中。
用速度為500rpm的攪拌器于30℃進行培養，然后以每分鐘800ml的流量通氮氣。為了使O2向培養物的擴散最小，生物反應器安裝Norprene管。通過自動添加2MNaOH使pH保持在5.0。生物反應器安裝冷凝器，放出的氣體導向氣體分析儀(INNOVA，Denmark)，以測定CO2的含量。Xy1參照菌株(閉合的符號)和Xy1 GAPN菌株(開放的符號)的生物質、葡萄糖和木糖的濃度曲線如圖1所示。Xy1參照菌株(閉合的符號)和Xy1 GAPN菌株(開放的符號)的乙醇、木糖醇、甘油和乙酸的濃度曲線如圖2所示。發現兩種菌株中葡萄糖和木糖吸收大致相同，而Xy1 GAPN菌株與Xy1參照菌株相比生成更多的乙醇，更少的木糖醇和更少的甘油。發酵50小時之后，獲得了代謝產物的下列濃度
這對應于乙醇濃度的15％增加，甘油濃度的45％減小和木糖醇濃度的45％減小。
在葡萄糖上的生長過程中，Xy1 GAPN菌株生成稍多的乙醇和較少的甘油(和實施例4的結果類似)。在木糖上的生長過程中，估算了總的產量系數，如下所示。
這些產量系數大致對應于乙醇產量的30％增加、甘油產量的40％降低和木糖醇產量的幾乎50％降低。
實施例9釀酒酵母的木糖代謝株的厭氧恒化器培養在恒定工作體積為1.0升和稀釋速率為0.05h-1(等于比生長速率)的良好控制的2升夾套生物反應器(B.Braun Biotech，Melsungen，Germany)中獲得厭氧穩態恒化器培養物。用速度為500rpm的攪拌器于30℃進行培養，然后通純氮氣(0.2L·min-1)。通過自動添加2M NaOH使pH保持在5.0。為了使O2向培養物的擴散最小，生物反應器安裝Norprene管。溶氧濃度用Mettler Toledo極譜電極測定，并保持在檢測限之下。生物反應器安裝冷凝器(5℃)，放出的氣體導向氣體分析儀(INNOVA，Denmark)，以測定CO2的含量。穩態假設處于開始連續培養后經歷至少5個停留時間的時候，并通過跨2個停留時間的兩個測定值處恒定的(±2％)生物質濃度、代謝物濃度和二氧化碳放出速率證實。向培養物供應與實施例8所述類似的規定培養基。
用于恒化器培養的預培養物于30℃、以160rpm在具有擋板的棉花塞住的500mlErlenmeyer燒瓶中生長16-24小時，所述燒瓶每個含有與發酵罐中類似的pH為6.5的100ml培養基，除了不同濃度的葡萄糖(20g·L-1)、(NH4)2SO4(7.5g·L-1)、KH2PO4(14g·L-1)和antifoam(50μl·L-1)，并且不加Tween或麥角固醇。預培養物接種自30℃生長的平板培養物。連續培養物接種20ml指數生長的預培養物。
在穩態的恒化器培養物中，測定了乙醇、甘油和木糖醇的濃度，結果如下所示。
根據對糖的測定，計算向不同代謝物的總轉化產量，如下所示。
觀察到乙醇產量提高了24％，甘油產量減小了幾乎60％，木糖醇產量減小了33％。
在該說明書中，除非另外特別指明，“或”一詞用作在滿足所述條件中一個或兩個時返回真值的操作符(operator)，不同于需要只滿足一個條件的操作符“排他性或”。“包含”一詞的意思是“包括”，而非“由……組成”。
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權利要求
1.一種代謝工程微生物，其具有可操作的第一代謝途徑，其中在NAD作為第一種酶輔因子的反應中，第一代謝物轉化為第二代謝物，所述的反應步驟產生NADH；其中在第二種酶催化的反應中，所述的第二代謝物轉化成至少一種其他代謝物，并且具有可操作的第二代謝途徑，其特征在于關于催化NADP為輔因子、NADPH為產物的不可逆反應的第三種酶，酶活性超過天然水平，其中在沒有所述第二種酶的參與下，所述的第一代謝物轉化為所述的另一代謝物。
2.權利要求1所述的微生物，其中所述的第一代謝途徑為天然途徑。
3.前述權利要求中任意一項所述的微生物，其中所述的第一種酶是磷酸化脫氫酶。
4.權利要求1或權利要求2所述的微生物，其中所述的第二種酶是激酶。
5.權利要求3所述的微生物，其中所述的第三種酶是非磷酸化脫氫酶。
6.權利要求5所述的微生物，其中所述的第三種酶是GAPN(EC 1.2.1.9)。
7.權利要求6所述的微生物，其中所述的第一種酶是GAPDH(EC 1.2.1.12)。
8.前述權利要求中任意一項所述的微生物，其中編碼所述第三種酶的至少一拷貝基因序列已經重組導入到所述微生物中。
9.前述權利要求中任意一項所述的微生物，其中編碼所述第三種酶的基因序列可操作地連接于表達信號，所述的表達信號不與所述微生物中的所述基因序列天然相關。
10.前述權利要求中任意一項所述的微生物，其是酵母。
11.權利要求10中所述的微生物，其是屬于酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、德巴利氏酵母屬(Debaromyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、海洋酵母屬(Yarrowia)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)屬的微生物。
12.權利要求10中所述的微生物，其是菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、S.Kluyveri、葡萄酒酵母(S.bayanus)、少孢酵母(S.exiguus)、S.sevazzi、葡萄汁酵母(S.uvarum)、乳酸克魯維酵母(Klyuveromyces lactis)、K.marxianus varmarxianus、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)、產朊假絲酵母(Candida utilis)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、Pichia.stipidis、甲醇酵母(P.Pastoris)、P.sorbitophila、漢遜氏德巴利酵母(Debaromyces hansenii)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、適冷性海洋酵母(Yarrowia lipolytica)、接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
13.基因轉化的、含有與表達信號可操作連接的編碼GAPN的一個或多個拷貝的異源DNA序列并對GAPDH(EC 1.2.12)具有功能性天然或異源表達能力的微生物。
14.非必要代謝產物生成減少的所需代謝產物的生產方法，包括培養前述權利要求中所述的微生物。
15.權利要求14所述的方法，其中所需的產物是乙醇、乳酸、檸檬酸、氨基酸或抗生素。
16.權利要求14或權利要求15所述的方法，其中所述的非必要代謝產物是甘油、乙酸或氨基酸。
全文摘要
一種代謝工程微生物，其具有可操作的第一代謝途徑，其中在NAD作為適合為磷酸化脫氫酶的第一種酶的輔因子的反應中，第一代謝物轉化為第二代謝物，所述的反應步驟產生NADH。在適合為激酶的第二種酶催化的反應中，所述的第二代謝物轉化成至少一種其他代謝物。該微生物具有可操作的第二代謝途徑，其特征在于關于適合為非磷酸化脫氫酶如GAPN的、催化NADP為輔因子、NADPH為產物的不可逆反應的第三種酶，酶活性超過天然水平。在沒有所述第二種酶的參與下，所述的第一代謝物轉化為所述的另一代謝物。
文檔編號C12N1/19GK1717481SQ200380104133
公開日2006年1月4日 申請日期2003年11月25日 優先權日2002年11月25日
發明者克里斯托弗·布羅, 比吉特·雷根伯格, 延斯·尼爾森 申請人:弗盧克索姆科學公司