鑒定微生物的方法和設備的制作方法

專利名稱：鑒定微生物的方法和設備的制作方法
技術領域：
本發明涉及根據權利要求1前序部分的定量和/或定性測定微生物的方法。本發明還涉及根據權利要求27前序部分的定量和/或定性測定微生物的設備，尤其是用于實施上述方法的設備，和該設備的用途，尤其優選用于自動化生產和/或質量控制。
工業、貿易、家居、健康、食品等多個領域對大量的物質、原材料和產品需要保證其微生物安全性。
就此而論，例如細菌和真菌的各種微生物的性質和數量，必須監控在一個窄的界限內。
定量微生物分析技術用于質量保證已有一段時間。這些方法的基礎是擴增存在于待研究材料中的單獨微生物，以使其以劃線或菌落的形式為肉眼所見。為實現這一目的，在固體營養底物或液體營養溶液或培養基中增殖這些微生物的培養方法是標準的操作。取決于方法和微生物的類型，用于檢測細菌和真菌的常規培養方法須進行長至數天。
根據現有技術，培養方法的步驟通常是將樣品接種到營養培養基(常見為帶有基于瓊脂的營養培養基的培養皿)，然后在適合各自微生物的溫度(通常是升高的溫度)下培養長達一周(如在培養箱中)。根據得到的培養物的生長和形態，本領域技術人員能推斷樣品中存在的細菌的性質和含量。
該技術的嚴重不足之處在于只有樣品中含有的未確定部分的微生物可以被培養，而該信息直到一周后才能知道。
為解決上述問題，過去開發了一系列加快微生物檢測和增強靈敏度的方法。這些方法包括非選擇性或選擇性將微生物染色并相應地檢測的顯微鏡方法，以及基于免疫分析的方法和擴增微生物的遺傳物質并通過凝膠電泳檢測的直接的分子生物學方法。
為將檢測時間從數天降低數小時，甚至更少，使用新的稱作“快速檢測方法”進行了一段時間的努力。“快速檢測方法”部分已經在使用(電阻，生物發光等)，由于“快速檢測方法”建立在時間依賴性的生物材料的富集基礎上，24到48小時仍然是分析所必需的，于是存在對更快和更直接的方法的需求。
最近，熒光光學方法更多地取代了傳統的“快速檢測方法”和培養方法。直接的落射熒光過濾技術(DEFT)，例如，首次使“死/活”微生物的定量檢測的直接方法在小于一小時內完成。這種非特異的光學熒光方法在學術基礎研究中作為定性的方法已有超過25年(參見例如Pettipher等，Appl.Environ.Microbiol.44(4)809-13，1982)，并且自20世紀90年代早期以來建立于越來越多的工業應用中(如釀酒、乳品、食品工業等)作為定量研究的方法(Hermida等，J.AOAC Int.83(6)1345-1348，2000和Nitzsche等，Brauwelt，No.5，177-178，2000)。使用DEFT篩選方法檢測輻射的食品有歐洲專利說明書(EN 137832001“使用落射熒光過濾技術/有氧噬溫微生物計數(DEFT/APC)篩選方法檢測食品的輻射(Detection of irradiation of foods using epifluorescencefilter technology/aerobic mesophilic germ count(DEFT/APC)screeningmethod)”。
不同的生產商以實驗室試劑盒提供替代的選擇性作用的熒光染料用于體內檢測(如Molecular Probes和EasyProof Laborbedarf GmbH)。一些供應商(如Chemunex公司)出售成套設備；例如Chemunex提供的設備，基于流式細胞計數原理(L.Philippe，SFW-Journal 126，28-31，2000)，其對低水平的微生物需要富集24小時，或基于顯微鏡過濾方法，其不能區分“活的/死的”微生物(Wallner等，PDA J.Pharm.Sci.Technol.53(2)70-74，1999)。
稱作膜濾器微菌落熒光(MMCF)的方法(參見例如，J.Baumgart，Microbiological inVestigation of foods，Behr′s...Verlag 1993，3rd edition，pp.98 ff.)提供了在膜濾器上樣品制備或樣品中的微生物。不足之處是必須首先進行耗時的微生物預先富集，膜濾器必須預處理(用特定的培養基濕潤、量度和干燥)然后進行落射熒光顯微鏡，微生物計數必須在落射熒光顯微鏡或紫外燈下通過計數熒光標記的菌落來完成。
盡管上述的一些技術在數小時內得到結果，它們通常需要非常復雜的檢測設備和必需的用戶知識。因此，這些方法迄今沒有達到足以適合常規使用的程度。此外，個別的方法在特異性和靈敏度上存在限制。一些上述的方法對微生物檢測上限過高，以至不可避免需要前述的培養過程。
此外，傳統培養方法和具有相應的富集步驟的“快速檢測方法”的操作原理意味著存在一些基本的不足之處營養培養基的選擇在何種微生物能被增殖方面起著決定性作用。選擇性營養培養基在此具有優勢。即使這些培養基還是只能增殖那些具有某種生理能力的微生物。根據最近的發現，只有5％的微生物能夠被培養。因此使用傳統方法經常產生假-陰性的結果，盡管這些樣品中確實含有微生物。
此外，分析方法提供信息的能力受可利用的時間限制。在富集時間結束后，所有微生物必須增殖到可以看見的程度。由于不利的取樣條件或飼養條件產生延遲的生長可導致錯誤的陰性結果。因此，傳統的培養方法檢測細菌和真菌需要數天；以致微生物學結果對生產過程中的任何調控干預過程而言都太遲。
利用基于微生物培養的檢測方法，只有能增殖的活微生物能被檢測。然而產品防腐劑常常已經殺死了污染物。產品中存在的“死的”微生物在這種方式中不能檢測到，因此無法發現生產或包裝中的可能的衛生問題，或只有在降解，即防腐劑失效后才能檢測到。
因此本發明的目的是提供前述的適合定量和定性測定微生物和特別地，至少部分消除上述提到的不足的方法；和用于實施這種方法的設備。
因此，根據本發明的第一方面，本發明的主題是定量和/或定性測定樣品中微生物的方法，該方法包括樣品制備的步驟(a)和進行檢測和/或評估的步驟(b)，利用至少一種熒光標記在步驟(a)中標記樣品含有的至少一些微生物，而定量和/或定性檢測和/或評估通過熒光反射光譜測定或熒光反射光度測定在步驟(b)中完成(兩個術語“熒光反射光譜測定”和“熒光反射光度測定”在下文中是同義的，檢測方法的原理在下文中更加詳細地闡述)。
因此本發明的基本概念表現為下列事實樣品中的微生物首先被熒光標記，然后通過熒光反射光度測定完成定量和/或定性評估或檢測。下文中將更詳細解釋，由于熒光標記的微生物為此目的基本不需要進一步的準備，熒光反射光度測定提供了幾乎沒有復雜性的相對簡單的檢測或評估的巨大優點。尤其是，省去了耗時耗力的(預先)富集微生物的步驟，即，根據本發明通過熒光反射光度測定檢測或評估直接提供“真正的”微生物計數，或樣品中存在的數量。
因此本發明的一個特別的方面是使用合適的熒光標記物標記微生物，與隨后使用簡化的檢測或評估方法，即通過熒光反射光度測定，和相應的設備檢測熒光標記物的微生物的組合。由于在熒光反射光度測定方法中樣品只是短暫地暴露給輻射，熒光標記物的漂白，及由此產生的檢測結果的失真可以被有效防止。
通過熒光反射光譜分析或熒光反射光度測定檢測或評估來自動檢測由熒光標記的微生物在相應的波長照射下反射發出的輻射，或其強度，該照射與樣品中存在的微生物數量相關。(與反射光度測定或反射光度測定方法相關的進一步細節，可以參考，例如Rmpp，化學字典(Chemical dictionary)，Thieme Verlag，第十版，Vol.5，pp.3756-3757的相關討論，條目為“反射”和“反射光譜學”，和Vol.4，pp.3312-3314，條目為“光度測定”，每個情形中包括此處引用的文獻，在此引入其全部內容作為參考)。因此可以避免相對繁重的菌落計數和計數之前的微生物富集，而這些工作在落射熒光顯微方法，例如在膜濾器微菌落熒光(MMCF)方法是必須進行的。
本發明的方法中可使用的熒光反射光度計或分光計可由本領域技術人員根據從商業獲得的通常用于這一目的的組件方便地設計。
短語“標記樣品中存在的至少一些微生物”指，尤其是下文根據待確定的是否只是特定的微生物或微生物類型出現在樣品中，或所有的微生物出現在樣品中，前一情況下只有樣品中出現的特定部分的微生物以受控的方式標記(通常使用微生物特異的熒光標記物)，而在后一種情況下，樣品中所有微生物都被標記(通常使用非微生物特異性熒光標記物或不同微生物特異性熒光標記物的混合物)。
根據本發明的方法有可能基于熒光反射光度測定確定的測量值通過合適的校準曲線來決定樣品中微生物的數量(在熒光標記樣品中所有微生物的情況下，為樣品中的全部微生物；而在只熒光標記特定的微生物的情況下，為標記微生物的總數)。下文中將進一步闡述，使用微生物特異的熒光標記物還有可能對樣品中存在特定微生物進行定性的陳述。
通常，在方法的步驟(a)進行樣品制備的情況下，將熒光標記的微生物施加到優選為多孔的膜濾器上(如，聚碳酸酯膜濾器)。膜濾器通常應以截留微生物和/或對微生物不透過的方式實施。為此，膜濾器的孔徑應當選擇以使其小于樣品中存在的微生物。下文中將更詳細闡述，膜濾器的部分或局部，通常其邊緣，不應帶有或聚集很多微生物，這可保證對各樣品的參照和內部校準或標準。本發明合適的膜濾器材料除聚碳酸酯外為PTEF、聚酯和纖維素和纖維素衍生物，如醋酸纖維素、再生纖維素、硝酸纖維素或纖維素混合酯。本發明合適的膜濾器由例如Macherey-Nagel公司(如“PORAFIL”系列)銷售。
使用膜濾器在膜濾器上直接完成為通過熒光反射光度測量的檢測或評估提供了很大便利，特別是不需要進一步樣品處理、制備、轉移等(即，尤其不需要預先富集)。
根據本發明方法的特別優選的實施方案，在方法的步驟(a)中將熒光標記的微生物施用到硅微篩上。這是非常有利的，因為硅微篩具有非常平整的表面，可以更方便地檢測在其上面的微生物。此外，這種篩相對容易清潔，它們可以重復使用。硅微篩進一步具有好的生物相容性和好的反射率。微篩的另外的益處在于它們的剛性結構，這在處理時提供相當的便利。特別均勻的孔徑有另外的益處，其進一步增加選擇性過濾操作的精確性。本發明方法使用的微篩的孔徑在大約0.1和0.2μm之間是有利的。孔徑從0.45μm到1.2μm的微篩是特別優選的。與上述不同孔徑的篩當然也可以根據待檢測的微生物的大小使用，即，包括孔徑小于0.1μm或大于2μm的。
在本發明的范圍內，還可以在使用膜濾器時使用硅微篩。根據本發明，具有膜濾器的方法或設備的有利的實施方案能移植到每個使用硅微篩的情形中。
有利地，本發明的方法使用的熒光標記物以這樣的方式選擇對方法的步驟(a)中進行的樣品制備使用的膜濾器而言，其是可透過膜的。其有利之處在于就通過熒光反射光度測量進行檢測或評估而論，沒有由過多的熒光標記物產生的背景噪聲和干擾信號，因此可以達到有利的信號-背景比例或信號-噪聲比例。
本發明方法步驟(a)的樣品中出現的微生物的熒光標記以原本已知的方法進行。這是本領域技術人員的常識。為此，例如，待標記的微生物與以相對微生物過量存在的熒光標記物的溶液或分散體接觸，接觸時間必須足以保證在這種方法的步驟中所有待標記的微生物都被熒光標記(根據熒光標記物的選擇，例如，樣品中的所有微生物或一種或多種微生物類型的所有微生物)。在實際熒光標記后，多余的熒光標記物可以除去或與熒光標記的微生物分離。這可以例如在使用對熒光標記物是膜透過性但對微生物不透過的膜濾器的情形中，通過去除(例如，施用超壓或真空)該溶液或將多余的熒光標記物從多孔膜濾器中分散掉，和任選地然后用水、緩沖液或其他液體淋洗所有東西，使最終留在膜濾器上的只有熒光標記的微生物(如果可行，還可以含有故意未標記的微生物)。這使隨后在本發明方法的步驟(b)通過熒光反射光度測量檢測或評估變得非常方便。
如果可行，方法的步驟(a)的樣品制備還可以包括滅活和/或去除樣品中存在的抑制微生物的和/或殺微生物的物質或組分(例如，防腐劑、表面活性劑等)。這使隨后的測量結果避免被下列事實失真一些微生物被抑制微生物或殺微生物的物質或組分在樣品制備或測量過程中殺死或失活而使測定的微生物計數錯誤地非常低。這使得有可能即使在含有抑制微生物的和/或殺微生物的物質或組分(例如，防腐劑、表面活性劑等)的樣品中確定微生物數量，從而本發明的方法可以用于，例如在表面活性劑或分散產品中。
滅活或去除可能出現在樣品中的抑制微生物或殺微生物的物質或組分，僅根據樣品類型可行的方法步驟，有利地在熒光標記之前進行，優選直接在取樣后或在本發明方法的步驟(a)樣品制備的一開始就進行，這保證抑制微生物或殺微生物的物質、組分、成分等能基本上不改變原始樣品中的微生物計數。同樣可能的是，盡管不太優選，在熒光標記后滅活或去除可能出現在樣品中存在的抑制微生物的或殺微生物的物質或組分。同樣可能同時進行熒光標記和滅活或去除抑制微生物的或殺微生物的物質或組分。
根據樣品類型可行的滅活或去除可能出現在樣品中的抑制微生物的或殺微生物的物質或組分的方法步驟，以原本公知的方式完成。可以參考，例如，Stumpe等的稿件，“基于化學發光直接檢測微生物食品和化妝品工業中的經驗報告(Chemoluminescence-based directdetection of microorganismsa report on experience in the food andcosmetics industry)”，會議紀要第317頁到323頁“HY-PRO 2001，衛生的生產技術”，第二屆國際會議和展覽，Wiesbaden May 15-17，2001，和該論文集中指定的文獻；該論文集的全部內容，包括此處引用文獻的內容，在此引入全文作為參考。這通常可以通過將待分析的樣品與合適的滅活和/或調節溶液接觸而完成。這種滅活或調節溶液對本領域技術人員而言原本是已知的(如，TLH吐溫/卵磷脂/組氨酸)調節水溶液)。適合本發明的滅活或調節水溶液還可以包括，例如，除TLH(如聚山梨醇酯80＝吐溫80，大豆卵磷脂，和L-組氨酸)，緩沖物質(如，磷酸氫鹽和/或磷酸二氫鹽的磷酸鹽緩沖液)，另外的鹽(如氯化鈉和/或硫代硫酸鈉)，和胰蛋白胨(來自酪蛋白的蛋白胨)。
特別適合本發明的滅活或調節溶液具有下列組成- 蛋白胨1.0g- 氯化鈉8.5g- 五水合硫代硫酸鈉5.0g- 0.05M磷酸鹽緩沖液10ml-TLH的水補至 1000ml。
本發明可用的“TLH的水”具有，特別是，下列組成- 聚山梨醇酯80(吐溫80)30.0g- 大豆卵磷脂3.0g- L-組氨酸1.0g- 去離子水補至1000ml。
本發明可用的磷酸鹽緩沖液，特別地，具有下列組成- 磷酸二氫鉀6.8045g- 磷酸氫二鉀8.709g- 去離子水補至1000ml。
熒光標記物的選擇不是關鍵的。可以根據應用和微生物的類型而使用現有技術原本已知的熒光標記物，只要它們適用于本發明的方法的范圍內。
術語“熒光標記物”應該在本發明的范圍內作廣義的解釋，尤其表示任何以與微生物相互作用的方式，例如，結合到微生物，特別結合到其細胞壁(包膜)和/或核酸，和/或被微生物攝取，特別是被代謝和/或被酶轉化而實施的熒光標記物。
使用的熒光標記物可以是，例如，非微生物特異的熒光標記物或非微生物特異的熒光標記物的混合物。這可以實現相對經濟的對樣品中所有微生物的熒光標記，并因此相對快速確定樣品中總微生物計數。
特別在只有特定的微生物被定性地和定量地以選擇性的方式自動檢測的情況下，微生物特異的熒光標記物或不同微生物特異的熒光標記物的混合物可以用作熒光標記物。
相似地，非微生物特異的和微生物特異的熒光標記物的混合物可以用作熒光標記物。
例如，與活微生物相互作用的熒光標記物可以用作熒光標記物。相似的，與“死”微生物相互作用的熒光標記物可以用作熒光標記物。
同樣，有可能使用與“活”微生物作用的熒光標記物，和與“死”微生物作用的熒光標記物的混合物作為熒光標記物。樣品中微生物活/死的差別是可以分辨的。這種混合物是現有技術中原本已知的(參見例如，Stumpe等，loc.cit.，和此處引用的系統EasyProof LaborbedarfGmbH，Voerde)。
前面提到的EasyProof Laborbedarf GmbH的標記系統最初引進是用于釀造工業(Eggers等，Brauindustrie 6，34-35，2001)。熒光標記物的非熒光的初始階段(即前體)被攝入到完整的微生物細胞內并在細胞內(細胞質)被酶活性(酯酶)轉化為有熒光的化合物(綠色＝檢測到活細胞)；為實現該方法，必須存在具有膜電勢的完整的細胞膜。“死”細胞的檢測通過引入特異性熒光染料到細胞的DNA中而完成。這種摻入反過來只在細胞膜缺陷的細胞中發生(紅色＝檢測到死細胞)。由于兩個反應基于不同的原理，其結果不相互依賴。這種標記技術不損傷細胞，所以可以在評估的環境下確定樣品中當時的微生物學狀態。
通常用于在落射熒光顯微鏡或在直接落射熒光過濾技術(DEFT)或在膜濾器微菌落熒光(MMCF)方法中的微生物標記的熒光標記物也能，例如用作本發明的方法中的熒光標記物。
例如，熒光染料或這種熒光染料的前體可用作熒光標記物，從所述前體通過與微生物作用特別是通過代謝和/或酶轉化產生所述熒光染料。
該熒光染料的前體的例子描述于，例如，WO 86/05206 A1和EP 0443 700 A2，其各自全部的公開內容在此引入作為參考(如，可以酶學轉化為熒光素的非熒光二乙酰熒光素)。
本發明可用的熒光染料作為熒光標記物的例子是，但不限于，例如3，6-雙[二甲基氨基]吖啶(吖啶橙)，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)，3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基phenanthridinium溴化物(溴乙錠)，3，8-二氨基-5-[3-(二乙基methyammonio)丙基]-6-phenylphenanthridinium diiodide(碘化丙錠)，羅丹明如羅丹明B和磺酰羅丹明B，和熒光素異硫氰酸酯。另外的例子可以參考EP 0 940 472 A1或熒光探針和研究化學品的分子探針手冊，第五版，分子探針公司，Eugene，Oregon(P.R.Haugland，編輯，1992)，其各自的全部公開內容在此引入作為參考。也可以參考相關的化學品目錄(如生命科學研究的生化藥品和試劑的“熒光標記試劑”目錄，Sigma-Aldrich公司，2002/2003版)。
本發明方法中還可以使用，例如，隨后被熒光標記的核酸探針(如，微生物特異性核酸探針)，特別是用熒光基團或熒光分子標記的核酸探針作為熒光標記物。熒光基團或熒光分子可以，例如共價地或其他方式結合到核酸探針上。本發明用作熒光標記物的核酸探針可以，例如是熒光標記的核酸寡核苷酸或多核苷酸或熒光標記的DNA探針或RNA探針。出于穩定的考慮，本發明通常優選DNA探針。
本發明中用作熒光標記物的核酸探針的例子，例如在WO01/85340 A2，WO 01/07649 A2和WO 97/14816 A1中闡述的，其各自的全部公開內容在此引入作為參考。
例如，通常在熒光原位雜交(FISH)中用于標記(DNA標記或RNA標記)的核酸探針可以用作核酸探針。進一步的相關細節，可以參考Rmpp生物技術和遺傳工程字典，第二版，Georg Thieme VerlagStuttgart，pp.285-286，在“FISH”條目下，和參考此處引用的文獻，和WO 01/07649 A2，其各組全部公開內容在此引入作為參考。
同樣可以用作熒光標記物尤其是微生物特異的抗體，其隨后被熒光標記的，特別是用熒光基團或熒光分子標記，以致熒光基團或熒光分子可以共價地或其他方式結合到抗體。
使用的熒光標記物的數量或濃度由本領域技術人員根據個別案例的具體情況來調整。對本領域技術人員而言這是完全常見的操作。在分辨樣品中死/活微生物時，例如，應當選擇合適的“活染料”和“死染料”的混合比例，以使微生物染色充分的同時進行弱的“背景染色”；在個別案例中的選擇是本領域技術人員的專業技能。
利用本發明的方法，待檢測的微生物的界限為通常≤100菌落形成單位(CFUs)/毫升樣品體積，優選≤10菌落形成單位(CFUs)/毫升樣品體積。因此本發明的方法不需要任何預先富集。低的檢測界限是非常關鍵的，例如，為了符合一些指南或說明書。根據CTFA指南，例如對更高的微生物計數界限(如，102到103CFUs/mL)的化妝品原料，必須進行耗時耗力的特定問題微生物，即病源微生物的檢測。
利用本發明的方法，通常可以確定微生物計數范圍在大約每毫升樣品體積10CFUs或更低，到大約每毫升樣品體積108CFUs。為定量評估的目的，超過一定微生物計數(通常超過大約每毫升樣品體積102CFUs)，則該樣品首先必須相應地(即合適地)稀釋。
本發明的方法原理上適合確定任何微生物，特別是所有類型的病源微生物(如，所有類型的微生物，特別是單細胞微生物，如細菌和如酵母或霉菌的真菌)。
本發明的方法原理上適合定量和/或定性確定任何產品中的微生物(如，培養基，基質、溶液等)，優選可濾過的，特別是液體和/或多孔的產品。在固體產品或不可濾過的產品的例子中，它們必須在樣品制備階段轉化為本發明的方法可作用的形式；使用原本已知的方法例如，通過粉碎、抽提等將其轉化為溶液或分散體來進行。
本發明的方法適用于，例如定量和/或定性確定食品、含有表面活性劑的產品如洗滌和清洗劑、表面處理劑、分散產品、化妝品、衛生用品和個人護理產品、藥物、粘合劑、冷卻劑潤滑劑、涂料和(涂層)凝結劑，及原材料和上述產品的起始物質中的微生物。
因此本發明的方法適合所有類型的可能的原材料、中間物和終產物，它們來自不同行業例如食品、貼有商標的產品、化妝品、粘合劑、冷卻劑潤滑劑(如，油性冷卻劑潤滑劑乳液)；工業系統的處理液等，限制在于其應該可以使用如過濾或沉淀的分離方法分離微生物。產品以固體或液體形式存在在此情況下無關緊要。
由于方法步驟的相對簡單的操作和特定組合，本發明的方法特別適合自動化(如在生產和/或質量控制過程中)。在生產和/或質量控制之外(如在液體表面活性劑產品、分散體、腌制產品等的包裝過程中)，本發明的方法還適合，例如調查故障或污染的場合以確定微生物狀態，或用于評估產品衛生措施，或還用于優化或檢查設施清潔操作(如在用于生產腌制產品的設施中)，例如用于在位清潔(CIP)和在位滅菌(SIP)過程中。
本發明的方法通常按照下面的方式進行含有待定量和/或定性確定的微生物的樣品被引入到合適的樣品容器中，該容器應以無微生物的方式密封，其底部具有通常為圓形的膜。膜濾器的外緣與樣品容器接觸，所以外緣的同心圓沒有微生物聚集。如果待調查的樣品含有抑制微生物或殺微生物的物質或組分(如防腐劑或表面活性劑)，首先通過將樣品與合適的滅活和/或調節溶液接觸而滅活和/或去除這些物質或組分，特別是持續一段足以滅活和/或去除這些物質或組分的時間。滅活和/或調節溶液通過膜濾器在超壓或真空作用下除去。過多的或剩余的滅活和/或調節溶液如果需要用水洗滌一次或數次通過膜濾器除去，通常使用超壓或真空，以使洗滌的水以簡單的方式去除。其后通過至少一種熒光標記物標記樣品中至少一些微生物。為此，微生物可以與，例如熒光標記物的溶液或分散體接觸，維持一段足以標記微生物的時間。過多的熒光標記物溶液或分散體然后再次使用超壓或真空通過膜濾器去除。最后，如果可行，樣品能夠用水、緩沖液或其他液體進行單次或多次淋洗以除去多余的熒光標記物。在通過膜濾器使用超壓或真空抽出水后，膜濾器最終與樣品容器分離，產生聚集有熒光標記的微生物的膜濾器，其外緣沒有微生物。這可以立即用于熒光反射光度測量，即通常無需對樣品或濾器進一步準備或處理。在通過熒光反射光度測量的過程中，聚集有熒光標記的微生物的膜濾器用合適波長的光照射，即在該過程中被掃描。確認的測量值與膜濾器上或樣品中的微生物計數相關。對下面的不同粘度的洗滌劑產品，使用本發明的設備進行研究
本發明方法在自動處理情形下的典型過程順序包括，例如，用戶將確定量(如1mL)的樣品置于以無微生物方式密封，并含有調節培養基或滅活培養基和在外緣具有膜濾器的預設樣品容器中。啟動測量程序，使樣品振蕩并根據微生物的類型而恒溫控制在合適的溫度(如37℃)。在配置的一段時間后，培養基從膜濾器濾掉。用無微生物的水、緩沖液或其他液體進行一次或多次洗滌步驟，然后按順序自動洗出樣品中含有的物質，接著用熒光標記物標記。根據要求不同，標記可以使用結合樣品中所有微生物的非特異性熒光標記(如與核苷酸片段結合)，或使用DEFT方法辨別所有活的和“死的”微生物的標記物，或在第三種情況下使用基于FISH技術的熒光標記物完成，其可以選擇性使用基因標記的熒光探針對個別微生物染色。在標記步驟之后，過多的標記溶液再次自動化地用水洗去，以便在自動化操作流程完成后，熒光標記的微生物出現在膜濾器上。使用熒光反射光度計或分光計自動化測量各熒光的強度及微生物數。用合適波長的光照射濾膜，由標記的微生物激發的熒光以相應的波長分辨的方式檢測。隨后的評估將膜邊緣區域的強度，該區域應該沒有聚集微生物，與帶有標記微生物的區域的強度比較，并根據儲存的標準曲線計算樣品中微生物的數量。
本發明的方法具有一些優點；最主要的一些將在下文討論，但不是以限制性的方式。
本發明方法的一個優點在于其可以以自動化方式實施。整個過程的全部自動化表明該方法可以更簡單，更快捷和更可重復性地實施。這在成本、人力需求和靈敏度上產生優勢。進行研究時有好的可重復性同樣是非常有利的。
本發明方法的其他優點在于其不需要落射熒光顯微鏡。用簡化的評估和檢測方法和系統(即，使用熒光反射光度測量)取代現有技術使用的落射熒光顯微鏡降低了用戶在工作中的費用和固定設備，樣品的評估可以完全自動化的進行(如，使用對應的算法)。輻射的影響也可以降低。
本發明方法的另一個優點是使用標準化的或常規的組分實施本發明的方法所需的整個系統以可以使用多個標準化的或常規的組分(容器、培養基、濾器等)的方式整合，因此降低操作者的工作量并增強該方法的可靠性。
本發明方法的另一個優點是其簡單的檢測和評估本發明的方法可以例如在合適的樣品容器中進行，以使標記的微生物制備在合適的濾膜上。合適的膜大小(如8mm直徑)的選擇和不聚集微生物的同心圓邊緣使各樣品可以參考和內部標準化。
本發明方法的另一個優點是實施本發明的方法的速度本發明的方法可以允許根據微生物的類型和其數量，在只有數分鐘(大約3到5)后確定微生物計數。而相對的常規的培養方法，需要最長達數天。
本發明的方法的高靈敏度也是特別具有優勢的本發明的方法可以在高稀釋度下檢測微生物。加速的培養方法還不夠靈敏到足以檢測每毫升樣品體積10CFUs的界限。
本發明方法的其他優點在于熒光標記的微生物只在相對短的時間內暴露給輻射，因為測量值可以相對快速地通過熒光反射光度測量獲得。結果，幾乎可以完全避免熒光標記合的任何“漂白”和測量結果的失真。這也避免殺死活的微生物，這在辨別活的/死的微生物的情況下是非常重要的。
本發明的方法或通過熒光反射光度測量進行評估的情況下對樣品的“掃描”(或更精確對聚集有熒光標記的微生物的膜濾器的掃描)產生另外的優點一方面，掃描可以激發大的區域，另一方面，尤其是與常規的具有限制的傳感區域的熒光顯微鏡相比，伴隨短的比較可以實現高的單點激發密度。掃描形成對樣品均勻的照明尤其在密度測量的過程中是非常重要的。
最后，本發明的用戶友好性可以看作是另外的一個優點。測定樣品中微生物含量的整個過程包括，在自動化執行的過程中，簡單添加樣品和啟動順序。用戶然后接收微生物含量的數值。用于樣品制備和測量的工作是最少的。因此系統還可以，理想情況下摻入到處理系統中用于監控、保證和記錄質量。
根據本發明的第二方面，本發明還涉及如權利要求28所述的設備，用于定量和/或定性測定樣品中的微生物，采用的方法是樣品制備和隨后檢測和/或評估，在樣品制備過程中可通過設備用至少一種熒光標記物標記樣品中至少一些微生物，及檢測和/或評估可利用熒光標記物，尤其是用于實施前面的方法權利要求限定的方法。
本發明設備的另外有利的實施方案是獨立的設備權利要求的主題(權利要求29到36)。涉及本發明方法的陳述對應地適用于本發明的設備。
在附圖中，

圖1示意性地描繪了用于實施定量和/或定性確定樣品中微生物的方法的設備。該設備的基礎是樣品接收容器1。該樣品接收容器1，如示意圖所示，在設備中通過各種線2連接到通風口4和壓縮空氣5的控制閥3，并通過泵6連接到染料7(“熒光標記”)和淋洗溶液8的連接器。無菌的濾器2a整合到各個線2上。
圖1示意性顯示了已經闡述的相互關系。該設備的操作方式邏輯上遵循方法權利要求中闡述的步驟。
安置在樣品接收容器1的出口處--如優選的示例性的實施方案中闡述，位于樣品接收容器1的底部--是在示例性實施方案中表示為簡單的圓盤的膜濾器9。后者在實施時截留待檢測的微生物和/或對待檢測的微生物是不透過的。還提供經配置通過熒光反射光度進行測量的檢測系統10，為檢測和/或評估目的，其上面還可放置帶有膜濾器9的樣品接收容器1，或優選地除去樣品接收容器1的膜濾器9。總體的結構顯示于圖2的熒光反射光度檢測系統10中對聚集微生物的膜9的分析在示例性的實施方案中使用圖1顯示的計算機控制的控制和/或評估裝置11來完成。
圖1還以指示性的方式顯示樣品接收容器1底部的膜濾器9。這表明在圖1顯示的示例性的實施方案中，膜濾器9能從樣品接收容器1的下方除去以通過檢測系統10。這種安排的具體外觀可以由本領域的技術人員來設計。
如果膜濾器9是有孔的，特別是聚碳酸酯膜濾器；以及如果，特別地，膜濾器9的孔徑小于樣品中出現的或期望出現的待檢測的微生物的大小，則是特別有優勢的。
特別優選使用硅微篩代替膜濾器9。使用硅微篩的優點在上文中已經詳細討論。這里還將提到硅微篩可以普遍用于本發明的設備上代替膜濾器。
在樣品接收容器1內的安排和膜濾器9從樣品接收容器1中分離以檢測標記的微生物方面，推薦使用基準面以使各樣品可以自給自足的標準化。根據優選的實施方案，為上述目的可以規定安置于樣品接受容器1內的膜濾器9具有區域12，尤其是不能或實際上不能在樣品制備時聚集微生物，并用作實施檢測和/或評估時的基準面的邊緣區域。未聚集標記的區域或邊緣12使得樣品本身在膜濾器9上的內標化。
關于膜濾器9和樣品接受收容器1的大小，對所示用途而言，推薦膜濾器9具有有效過濾的直徑從大約5到大約25mm，特別是大約6mm到大約12mm，優選大約8mm到大約10mm。
上文已經提到膜濾器9保留微生物，即用熒光標記物標記的微生物保留在膜濾器9的上側。為此目的，推薦選擇對膜濾器9可透過的熒光標記物以在檢測系統10中達到理想的信號-噪聲比率。為在樣品接收容器1內處理樣品，必須在膜濾器9上分離熒光標記(“標記的”)的微生物。關于設備，為此推薦使用滴注的裝置、抽吸裝置(真空抽吸)，和/或滴注和收集膜濾器9上方的樣品液體和/或接受熒光標記物和/或淋洗液體的排出裝置。圖1顯示的示例性實施方案表明，使用壓縮空氣5完成排出的變體形式。
最后關于設備，圖1還顯示設備包括用于樣品接收容器1的恒溫控制的恒溫裝置13。此處可見的恒溫裝置13具有總共四個接受口，所以可以同時恒溫控制總共四個樣品接收容器1至由目標微生物決定的通常需要的溫度(如37℃)。
圖2顯示本發明使用的熒光反射光度檢測系統10的基本結構。評估裝置11控制將測量參數傳送給電子控制系統15用于激發光學系統16的中央控制器14和定位平臺17。測量樣本，即此由情形下聚集有標記微生物的膜濾器9定位在定位平臺17上。從激發光學系統16發射到測量標本18上的激發光以熒光形式被反射到檢測光學系統19。檢測的信號傳遞到電子檢測系統20，其隨后提供給控制器14。簡化的熒光反射光度檢測系統10取代復雜的落射顯微鏡降低了用戶的資金開銷。
根據本申請的第三方面，本發明還進一步涉及根據上文所述的本發明的設備的使用，構成應用型權利要求的主題(權利要求37到39)。
本發明另外的實施方案、修飾、變體和優點對本領域的技術人員是顯而易見的，并且在閱讀本說明書后無需脫離本發明內容的前提下得以實現。
權利要求
1.定量和/或定性測定樣品中微生物的方法，該方法包括樣品制備步驟(a)和檢測和/或評估步驟(b)，在步驟(a)中利用至少一種熒光標記物標記樣品含有的至少一些微生物，及在步驟(b)中完成定量和/或定性檢測和/或評估，其中在步驟(b)中進行的檢測和/或評估通過熒光反射光度測量完成。
2.權利要求1的方法，其中在通過熒光反射光度測量確定的測量值的基礎上，特別是通過合適的校準，確定樣品中存在的微生物的數量。
3.權利要求1或2的方法，其中在步驟(a)的樣品制備過程中，熒光標記的微生物被施加到硅微篩上，所述硅微篩截留微生物和/或對微生物是不透過的。
4.權利要求1或2的方法，其中在步驟(a)的樣品制備過程中，熒光標記的微生物被施加到有孔的膜濾器，特別是聚碳酸酯膜濾器上，所述膜濾器截留微生物和/或對微生物是不透過的。
5.權利要求3或4的方法，其中膜濾器或硅微篩的孔徑選擇小于樣品中存在的微生物的大小。
6.權利要求3到5之一的方法，其中通過熒光反射光度測量進行的檢測和/或評估直接在膜濾器或微篩上完成，特別地，不需要進一步處理或制備或轉移樣品。
7.權利要求1到6之一的方法，其中選擇熒光標記物使其對步驟(a)中進行樣品制備使用的膜濾器而言是可透過的，或對使用的硅微篩而言是可透過的。
8.權利要求1到7之一的方法，其中樣品制備步驟(a)還包括滅活和/或除去樣品可能存在的抑制微生物和/或殺微生物的物質或組分，特別是防腐劑或表面活性劑，尤其是其中滅活和/或除去樣品中存在的抑制微生物和/或殺微生物的物質或組分可以通過將樣品與合適的滅活和/或調節溶液接觸而完成。
9.權利要求1到8之一的方法，其中選擇熒光標記物使其與微生物相互作用，特別是結合到微生物上，特別是結合到它們的細胞壁(包膜)和/或核酸上，和/或被這些微生物攝入，特別是被代謝和/或被酶轉化。
10.權利要求1到9之一的方法，其中非微生物特異的熒光標記物或非微生物特異的熒光標記物的混合物用作熒光標記物。
11.權利要求1到9之一的方法，其中微生物特異的熒光標記物或不同微生物特異的熒光標記物的混合物用作熒光標記物。
12.權利要求1到9之一的方法，其中非微生物特異的熒光標記物和微生物特異的熒光標記物的混合物用作熒光標記物。
13.權利要求1到12之一的方法，其中與活的微生物相互作用的熒光標記物用作熒光標記物。
14.權利要求1到12之一的方法，其中與死的微生物相互作用的熒光標記物用作熒光標記物。
15.權利要求1到12之一的方法，其中與活的微生物相互作用的熒光標記物和與死的微生物相互作用的熒光標記物的混合物用作熒光標記物，以區分樣品中存在的活的/死的微生物。
16.權利要求1到15之一的方法，其中在落射熒光顯微鏡或在直接落射過濾技術(DEFT)或在膜濾器微菌落熒光(MMCF)方法中通常用于微生物標記的熒光標記物用作熒光標記物。
17.權利要求1到16之一的方法，其中熒光染料或這種熒光染料的前體用作熒光標記物，從所述前體通過與微生物作用，尤其是通過代謝和/或酶轉化產生所述熒光染料。
18.權利要求16的方法，其中熒光染料選自3，6-雙[二甲基氨基]吖啶(吖啶橙)，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)，3，8-二氨基-5-乙基-6-phenylphenanthridinium溴化物(溴乙錠)，3，8-二氨基-5-[3-(diethylmethyammonio)丙基]-6-phenylphenanthridinium diiodide(碘化丙錠)，羅丹明如羅丹明B和磺酰羅丹明B，和熒光素異硫氰酸酯。
19.權利要求1-18之一的方法，其中尤其是微生物特異的核酸探針用作熒光標記物，該探針又特別是用熒光基團或熒光分子而被熒光標記，特別其中熒光基團或熒光分子可以共價或其他方式結合到核酸探針上，和/或特別其中核酸探針包括熒光標記的寡核苷酸或多核苷酸，和/或特別其中核酸探針是熒光標記的DNA或RNA探針。
20.權利要求19的方法，其中在熒光原位雜交(FISH)中通常用于標記的核酸探針用作核酸探針。
21.權利要求1-20之一的方法，其中尤其是微生物特異性抗體用作熒光標記物，該抗體又特別是用熒光基團或熒光分子而被熒光標記，特別其中熒光基團或熒光分子可以共價或其他方式結合到抗體上。
22.權利要求1-21之一的方法，其中微生物的檢測界限為≤100菌落形成單位(CFUs)/毫升樣品體積，優選≤10菌落形成單位(CFUs)/毫升樣品體積。
23.權利要求1-22之一的方法，其中待檢測的微生物是各種病源微生物，特別是單細胞微生物，如細菌和真菌(如酵母或霉菌)。
24.權利要求1-23之一的方法，用于定量和/或定性確定食品、含表面活性劑的產品如洗滌和清潔劑、表面處理劑、分散產品、化妝品、衛生用品和個人護理產品、藥物、粘合劑、冷卻劑潤滑劑、涂料和(涂層)凝結劑，及上述產品的原材料和起始物質中的微生物。
25.權利要求1-24之一的方法，用于定量和/或定性確定可濾過的微生物，尤其是液體和/或有孔產品中的微生物。
26.權利要求1-25之一的方法，其中該方法是自動化的。
27.權利要求1-26之一的方法，其中該方法在生產監測和/或質量控制的過程中進行。
28.采用下列方法進行定量和/或定性確定樣品中微生物的設備樣品制備和隨后檢測和/或評估，用至少一種在樣品制備過程中通過該設備標記的熒光標記物標記樣品中存在的至少一些微生物，利用該熒光染料進行檢測和/或評估，特別地，用于實施上述方法權利要求之一的方法，特征在于-樣品接受容器(1)；-硅微篩或膜濾器(9)，其實施用于截留待檢測的微生物和/或對待檢測的微生物是不可透過的，其安置于樣品接受容器(1)的出口，特別是在其底部；-配置用于通過熒光反射光度測量進行測量的檢測系統(10)，并且為檢測和/或評估的目的可以放置于帶有硅微篩或膜濾器(9)的樣品接受容器(1)上，或優選放置于從樣品接受容器(1)取出的硅微篩或膜濾器(9)上。
29.權利要求28的設備，其中計算機控制的控制和/或評估裝置(11)作為檢測系統(10)的一部分，或提供用于控制檢測系統(10)。
30.權利要求28或29的設備，其中該設備中用硅微篩取代膜濾器(9)。
31.權利要求28或29的設備，其中膜濾器(9)是有孔的膜濾器，特別是聚碳酸酯膜濾器。
32.權利要求30或31的設備，其中膜濾器(9)或硅微篩的孔經小于樣品中存在的和/或期待在樣品中出現的待檢測的微生物的大小。
33.權利要求28-32之一的設備，其中安置于樣品接受容器(1)內的膜濾器(9)或硅微篩具有區域(12)，特別是在樣品制備過程中不能或實際上不能聚集微生物，并用作檢測和/或評估性能時的基準面的邊緣。
34.權利要求28-33之一的設備，其中膜濾器(9)或硅微篩具有有效過濾的直徑，從大約5mm到大約25mm，尤其是從大約6mm到大約12mm，優選從大約8mm到大約10mm。
35.權利要求28-34之一的設備，其中樣品接受容器(1)包括滴注裝置、抽吸裝置，和/或用于滴注、抽吸和/或排出膜濾器(9)或硅微篩上方存在的樣品液體和/或接收熒光標記物的液體和/或淋洗液體的排出裝置。
36.權利要求28-35之一的設備，其中該設備含有用于恒溫控制樣品接收容器1的恒溫裝置(13)。
37.權利要求28到36之一的設備的應用，用于定量和/或定性檢測食品、含表面活性劑的產品如洗滌和清潔劑、表面處理劑、分散產品、化妝品、衛生用品和個人護理產品、藥物、粘合劑、冷卻劑潤滑劑、涂料和(涂層)凝結劑，及上述產品的原材料和起始物質中的微生物。
38.權利要求28到36之一的設備的應用，用于定量和/或定性檢測可濾過的，特別是液體和/或可灌注產品，尤其是培養基、溶液、液體、基質等中的微生物。
39.權利要求28到36之一的設備的應用，優選用于自動化生產和/或質量控制。
全文摘要
本發明公開定量和/或定性鑒定樣品中微生物的方法。所述方法包括樣品制備的步驟(a)和進行檢測和/或評估的步驟(b)。樣品中所含的至少一部分微生物通過至少一種熒光標記物在步驟(a)中標記，而定量和/或定性檢測和/或評估通過熒光反射光度測量方法在步驟(b)中完成。同時還公開實施上述方法的相應設備。
文檔編號C12Q1/24GK1726286SQ200380106569
公開日2006年1月25日 申請日期2003年12月2日 優先權日2002年12月17日
發明者蒂洛·韋斯, 斯特凡·施通佩, 弗里德黑爾姆·西普曼, 安德烈亞斯·圖恩舍, 弗蘭克·溫豪森, 安德烈亞斯·凱特肯佩, 麥克爾·海因策爾, 羅蘭德·布里福斯, 米爾科·魏德 申請人:漢高兩合股份公司