專利名稱：定量評價至少一種生物培養基總的和特定的dna修復能力的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種通過評價生物培養基的切除(excision)/再合成的能力，從而對所述培養基的總的和特定的DNA修復能力進行定量評價的方法，本發明也涉及該方法的應用。
背景技術：
DNA連續的受到內在和外在的攻擊，從而引起基(base)的形成或糖的損壞。
這些損壞包括-嘌呤或嘧啶基的損壞細胞代謝光敏作用誘導的氧化損壞；通過化學加成物的損壞，該損壞由許多基因毒性(genotoxic)試劑的有害反應產生的，如燃燒產物中的多環烴；以及通過次甲撐(metheno)基或艾塞諾(etheno)基的形成引起的損壞；-DNA雙螺旋結構的損壞鏈內(同一鏈上兩個相鄰基之間)或鏈間(設置在同源鏈上的兩個基之間)橋的形成通常由紫外線(形成二聚的嘧啶間的橋的形成)或雙功能抗癌抗菌劑引起，如順鉑(Cisplatin)和嵌入試劑，它們在對應鏈攜帶的基之間形成穩定的共價鍵；-由于DNA是部分不穩定分子所引起的自發的損壞自發的去胺基作用(deaminations)或嘌呤丟失作用(depurinations)；-單鏈或雙鏈裂解引起的損壞由試劑如致電離輻射試劑產生和通過自由基反應產生；-糖損壞去氧核糖的破壞導致損壞位置的磷酸雙酯鍵(phosphodiester bond)的裂解，隨后發生鏈的裂解。
誘導損壞的多樣性通過分析UVC照射后檢測到的穩定的光化產物進行說明由于環丁烷環的形成，嘧啶(6-4)嘧啶酮和嘧啶二聚物在兩個相鄰嘧啶間形成。嘧啶二聚物和(6-4)產物的相對比例范圍為104～1。它們各自在紫外線輻射中的致命效應(lethal effect)和誘變效應(mutagenic effect)也是不同的和(6-4)產物相比，二聚物具有較大的細胞毒素作用，而對于誘變效應事實上卻相反。同樣的，致電離輻射(例如，鈷60的γ-射線)同時會產生單鏈或雙鏈的裂解(比例約為9∶1)、許多基的加成物、基消除以及DNA和鄰近蛋白質(如染色體)之間大劑量的橋。平均來說，一個鏈的裂解以每個改性基來計算。在輻射的細胞毒素效應中，雙鏈裂解的主要作用伴隨著由于基取代引起的誘變效應。
在孤立的DNA中可以產生不同類型的損壞。例如，(6-4)光化產物的損壞和環丁烷型的嘧啶二聚物是由UVC照射誘導的(Hoei jmakeret al.，Mutation Res.，1990，236，223-238)；氧化型的損壞是由鐵和過氧化氫參加的芬同反應(Fenton’s reaction)誘導的(Elliotet al.，Free Rad.Biol.Med.，2000，1438-1446)。制備改性DNA的另一種方法是通過分子生物技術處理質粒，插入化學合成得到的、并包含有益的損壞寡核糖核酸(Biade et al.，J.Biol.Chem.，1997，273，898-902)。
所有活的有機體具有DNA的修復系統，以保持其基因組的完整性。
在這些修復系統中，有兩個系統具有從DNA上消除改性基的功能它們是基的切除修復(BER)系統和核苷切除修復(NER)系統·BER系統主要是用于DNA中小損壞的修復，如氧化損壞、脫堿基位點(abasic sites)、基的分裂、基的甲基化和艾塞諾-基等。
·NER系統用于大的、誘導DNA雙螺旋扭曲的損壞，如乙酰胺氟(acetylaminofluorine)-DNA、順鉑-DNA和補骨脂素-DNA加合物、源于UVB和UVC照射DNA的二聚物、DNA基和其它分子間形成的共價損壞等(Sancar et al.，Annu.Rev.Genetics，1995，29，69-105)。
這些不同的修復系統具有共同的特征，特別是在下述步驟中-通過屬于修復系統的蛋白質識別損壞；-損壞的切除，和可選擇的，鄰近核苷的切除；
-通過培養基中的聚合酶對消失的核苷進行再合成；-一般修復結束時伴隨著贅生鏈(neoformed strand)和存在的DNA鏈的綁定。
在所有的這些情況下，該方法包括改性核苷的消除和作為DNA鏈的取代、在修復培養基中出現的至少一個核苷三磷酸鹽的合并。
然而需要注意的是，特別是在真核細胞中，修復系統是很復雜的，這種過分簡單的結構存在很多變化(全部的修復、涉及DNA轉錄的修復、以及涉及DNA復制的修復等等)。一些蛋白質同時也包含在幾種修復系統中；對于單一系統，其它的是特定的，一些可以通過細胞或外界因素進行誘導，另一些具有普遍存在和穩定的表達。
其它情況的說明術語“培養基”指的是可以在細胞提取液和延伸的DNA損壞中發生修復反應的DNA。
術語“生物培養基”或“細胞提取液(cell extract)”指的是通過未提純的生物制劑的提純制劑，該制劑可包含至少一種和DNA修復相關的酶活性。
通常，損壞與決定DNA修復的特定蛋白質相關。有機生物體之間存在差異；在原核生物如埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)中，酶不很明顯，而在人體中，可以觀察到一個非常完整的損壞-明顯的修復酶的締合(association)，特別是在BER系統中。例如，Lindahl和Wood(Science，1999，286，1897-1905)公開了BER系統中人體最重要的酶和與之相關的損壞。例如，在人體中，屬于BER系統的修補糖(glycosylase)的OGG1蛋白質和8-氧-2’-脫氧鳥苷(deoxyguanosine)的修復相關。在埃希氏大腸桿菌中，氨基甲肟嘧啶(formamidopyrimidine)-DNA-N-修補糖修復了同樣的損壞，但通常更多的也是氧化的嘌呤基(Seeberg et al.，TIBS，1995，20，391-397)。人類蛋白質ANPG是細菌蛋白質ALKA的等同物。然而，這些酶和它們的培養基沒有相同的親和力，并具有不同的切除比率常數(Laval et al.，Mut.Res.，1998，402，93-102)。如果損壞沒有修復，BER系統修復的超過大約40個不同的損壞具有巨大的陰性生物重要性。一般認為決定它們修復的酶具有很大的抗癌作用。可以看到，了解它們培養基的特性是非常重要的。
細胞修復能力的分析已經發展成熟，并可以分為兩類活性細胞提取液的體外分析與活細胞體內或半體內分析。
I.以切除/再合成活性為基礎的方法A.大部分的體外分析已經在Wood et al.(Cell，1988，53，97-106and Biochemistly，1989，26，8287-8292)的基礎上發展成熟，該分析是評價修復的切除/再合成步驟。
更明確的，這種分析包括應用引入損壞的質粒DNA(通過UV照射嘧啶二聚物和橋的形成；通過脫氧核糖核酸酶I的反應單鏈的裂解或分裂)；改性的DNA在修復制劑中、在30℃下進行培育(incubate)，該制劑至少包括要評價的細胞提取液、在α位標記32P和ATP的核苷三磷酸鹽。提取液中的酶切割質粒DNA并消除損壞。DNA通過取代消除的核苷重新合成。引入到培養基內的放射性核苷在合成的過程中和DNA接合。通過瓊脂糖膠體的電泳將修復的質粒分離后，對和培養基修復比率成比例的結合的放射量進行了測試。制備細胞提取液的方法和反應條件影響修復的質量。特別是，獲得最好的修復效果是來自于全部用體外轉錄獲得的細胞提取液，而那些用于改善源于SV40復制起點的質粒復制的細胞質(cytosolic)提取液和其它的天然細胞提取液顯示了核酸酶活性，這些核酸酶活性不能對修復進行正確的譯碼。
在Wood et al.等確定的條件下，關于照射DNA反應的特異性在KCL的濃度位40-100mM時更明顯。除此以外，修復過程中發生的照射DNA的復制很大程度上取決于ATP和ATP-再生系統(磷酸肌酸+肌氨酸磷酸激酶)的存在，為了保持ATP的恒量，這種水平的維持和修復切割步驟更加特別相關。例如，在鏈裂解修復時，這種依賴不會發生。同時在反應混合物中使用了一個含有沒有被改性的質粒的對照試樣。
Wood et al.的分析需要使用放射性標記，這限制了常規分析中應用這種方法；除此以外，這種分析在常規使用時不容易、而且不具有很好的實用性。
Wood et al.的方法建議在來自于經受著色性干皮病(xerodermapigmentosum)的病人的提取液為特征的分析中使用(Satoh et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90，6335-6339；Jones et al.，Nucl.Acids Res.，1992，20，991-995；Robins et al.，EMBO J.，1991，10，3913-3921)。著色性干皮病是一種多基因的、多等位基因的(multiallelic)、常染色體的隱性疾病。經受這種疾病的病人的細胞對紫外線的輻射非常敏感，并顯示出DNA修復缺陷。8個基因涉及到這種疾病的不同的互補群XPA～XPG和變異群XPV。每個群相對于DNA修復、特別是不同的NER子類具有不同的特點。DNA損壞，無論是屬于小損壞的類別還是大損壞的類別，都根據互補群(complementationgroup)進行不同的修復。
其它的修復疾病(柯凱因氏癥候群(Cockayne Syndrome)，毛細管擴張失調癥(Ataxia Telangectasia))也具有特定的修復特點，Woodet al.的方法已經研究過。
B.在許多公開出版物中，B.Salles和P.Calsou團隊(Biochimie1995，77，796-802；Anal.Biochem.1995，232，37-42)公開了一種通過負載在微盤(microplate)井(well)上的質粒切除/再合成反應探測DNA損壞的方法。質粒吸附在微盤井(microplate wells)內，然后用化學試劑(posteriori)進行改性。細胞提取液和地高辛(Digoxigenin)標記的核苷三磷酸鹽一起加入到井中。在再合成的步驟中，如果發生了損壞切除，標記就和DNA結合。然后標記通過偶聯到堿性磷酸酶的抗體在每個井中顯現。在堿性磷酸酶的去磷作用后，發光的培養基加到每個井中。在每個井中發光信號被檢測到。這和標記結合的比率是成比例的。
這種方法也在國際申請WO96/28571中有敘述，該發明人也屬于B.Salles和P.Calsou團隊，其公開的方法是定性和定量探測DNA的損壞，含有損壞的DNA與載體和含有細胞提取液的成分連接，其中的標記和所述的含有損壞的DNA相關聯(在所述載體負載物的前面或后面)。他們認為他們的方法可以同時處理大量的樣品；如果將該方法應用到實例中，細胞提取液中進行的修復反應介質為50ul，所用的提取液含有150ug的蛋白質、50mM的KCL、5mM的氯化鎂、DDT、磷酸肌酸、磷酸肌酸激酶和多種dNTPs，這些組分中的一個用地高辛(digoxigenin)標記。在30℃下培育3小時后完成修復，井用洗液進行清洗，洗液中含有磷酸鹽緩沖液，非離子表面活性劑(Tween20)加入的比例為0.05～0.15％(優選的組成為10mM磷酸緩沖液、137mMNaCl和0.1％的Tween20)。很明顯，這種分析是非常靈敏的，在分析液中，其檢測范圍為40ng的DNA，而不是200或300ng。
B.Salles和P.Calsou團隊的分析方法在負載在載體后必須進行質粒的改性。現在公知的是，包括許多化學或物理試劑引起的損壞是鏈的裂解。現在，這些裂解可以通過活性細胞提取液有效而快速的進行修復。因此，通過這種分析方法不可能區分裂解修復和其它損壞的修復之間的差別。裂解修復甚至掩蓋了其它損壞的修復，并和其它DNA的損壞修復的信號發生干擾。因此，這是一種檢測總的效果的方法，而不能區分由修復系統鑒別的損壞；除此以外，該發明的目的不是檢測和定量分析DNA修復中的蛋白質的活性，而是鑒別處理后的DNA上的損壞的存在。
II.以評價切割/切除(incision/excision)步驟為基礎的方法Wood et al等提出的不同方法已經應用，特別是在僅僅測試損壞切割活性上的應用。
A.Redaelli et al.(Terat.Carcinog.Mut.，1998，18，17-26)公開了一種方法，該方法中的質粒直接用提取液進行培育，而不用核苷三磷酸鹽。超螺旋質粒中的分裂在電泳時對瓊脂糖凝膠的移動速率產生了影響。由于超螺旋質粒的形成，超螺旋質粒比切割的質粒的移動速度快。相對于質粒不同形式的數量被確定；切割形式的數量和質粒損壞的切割活性相關，包括提取液。
更進一步，該論文研究了AP-核酸內切酶的切割反應，該反應發生在脫堿基位點上，該反應是在特別用于要修復的改性反應糖苷酶的反應后(烷化、水解去氨、氧化和不匹配(mismatching))，通過分裂定位在脫堿基位點上的3’或5’上的去氧核糖磷酸雙酯(phosphodiester)的連接獲得的。
在這篇論文中，AP-核酸內切酶的活性進一步在人類淋巴細胞的天然提取液上進行了研究。提取液(80ul)首先和未破壞的質粒(對照物)一起進行培育，然后和德帕耐悌(depurinated)質粒一起進行培育。于是在發現切割活性的范圍內定量AP-核酸內切酶的活性取決于破壞和對EDTA的靈敏度。
B.P.Calsou和B.Salles的團隊(Biochem.Biophys.Res.Com.，1994，202，788-795)提出了另一種進一步測定質粒的損壞切割活性的方法。在第一切除步驟后，為了防止正常DNA片段通過內生的聚合酶進行再合成，他們在修復介質中引進了特別用于真核狀態聚合酶、蚜黃素(aphidicolin)的抑制劑。外生的原核聚合酶核在所有的試管中和反應介質等量混合。得到了反映損壞切除步驟中的結果差異，而不是切除的DNA片段的再合成。
C.另一種方法以彗星試驗Comet assay)(堿性介質中單一細胞的凝膠電泳現象)的改性為基礎的另一種方法也可以用于測定切割的活性。該方法由Collins et al.(Mutagenesis，2001，16，297-301)發展成熟。氧化的損壞在可見光存在下，通過海拉細胞的光敏作用引入到染色體組DNA中。然后將這些細胞和放在顯微鏡載片上的瓊脂糖膠體結合，細胞膜和蛋白質以控制的融解來消除。膠體中分離的核苷在細胞提取液中培育，這些細胞提取液在第一損壞切割步驟中是活性的。然后將這些載片在堿性介質中進行電泳。分裂的出現使DNA的移動和核苷整體移動得更快。于是，DNA的發射物形成彗星的外觀，完好的DNA在頭部，而含有分裂的DNA在彗星的尾部。取決于特殊軟件的彗星尾部DNA的比例直接和包含在提取液中的、用于研究中的損壞的切割活性相關。這些方法已經用于人體淋巴細胞提取液的氧化破壞的切除活性的測定。和Redaelli et al.，1998公開的測定質粒分裂的方法相比，Collins et al.的方法采用了彗星方法來估計鏈分裂，該方法認為首先這種變化更加靈敏(能夠探測約每109道爾頓的0.2～2的分裂)，其次，更加經濟(根據所用材料的節約)，這是因為反應混合物(膠體中的DNA)的量僅為50ul，10ml血液(可以進行幾次培育)中就含有足夠的要分析的材料的量。
D.國際申請WO 01/90408公開了一種探測和確定DNA損壞修復中涉及的蛋白質的活性的方法。
更進一步，該方法包括至少一個被破壞的DNA的載體的連接，該DNA含有至少一個公知的損壞；然后該被破壞的DNA經過修復成分的修復，該修復成分含有或不含有至少一種涉及該被破壞DNA修復的蛋白質，并且，在前述步驟的過程中，是通過測定連接到載體或自己從載體上移走的標記所釋放的不同信號對修復蛋白質的活性進行測定。
這個方法和被破壞DNA一起使用，被破壞DNA為15～100個基的寡核苷酸形式或100～20000基的多核苷酸的形式，從而該方法有可能比其它的方法獲得了更多的信息，從而幾種培養基的切除能夠同時監測。
然而，這種方法涉及到DNA損壞切割活性的演示。因而限制了確定可以引入到合成寡核苷酸的損壞切除的步驟。而且，盡管該方法提供了大量關于切除活性的信息，但是，它不適合對酶在DNA的切除/再合成中的活性進行精確定量。
而且，除了上述報道的各種技術的特定缺陷外，這些不同的方法也具有下述缺陷-上述的所有方法都需要使用一定量的生物材料，特別是超過10ul的細胞提取液對于約100ug的蛋白質，通常用的反應體積為50ul，含有10～40ul的提取液。提取液需要花很長時間制備，可用的細胞量通常很小，這限制了上述方法使用的次數。
-無論使用的探測方法和分析方法是否在溶液或載體上進行，上述所有的方法提供的信息是關于點對點(point-by-point)修復信息，這些信息限于針對提取液一整部分的給定的培養基；這是因為在測定由Wood et al.提出的修復能力時，例如，每種方法單獨在一個試管中，即反應在給定的質粒和給定的提取液中進行。對于每種要測試的提取液，標記和質粒結合的比率與在對照提取液(control extract)存在下、以相同方式制備的培養基中獲得的標記的結合比率相比較。所使用的對照提取液通常從和EBV或SV40一起轉化的特征細胞中制備。在上述的Wood et al.不同方法中大體是相同的。
-由于分析方法操作相對繁瑣，并需要獲得大量的生物材料，試驗限制了使用的培養基的數量和測試的生物提取液的數量。
-引入質粒的損壞既不能測試也不能定量。為了排除含有鏈裂解的DNA，使用由Wood et al.發展的方法的作者僅僅排除了失去其超螺旋結構的質粒。對于精確定義和確定給定的生物培養基的修復能力，所獲得的信息也是非常片面和不充分的。
因此，申請人確定的目的就是克服現有技術的缺陷，特別提出了一種可以確定和定量針對DNA修復的切除/再合成的酶的活性的方法，該方法在生物提取液中以快速、精確、小型化和有效的方式進行，并且不需要使用對照修復溶液。
發明內容
本發明的主題是一種定量分析至少一種生物培養基的總的和特定DNA修復能力，其特征在于該方法包括以下步驟(a)制備一定范圍的質粒，每個質粒含有明顯的DNA損壞，通過對所述的不同質粒和至少一種物理和/或化學試劑一起進行單獨的處理，并對所述的每種質粒的超螺旋部分進行恢復，從而排除了鏈的裂解，并進而避免了核酸酶的反應，(b)確定出現在每個所述范圍內的質粒的損壞；(c)根據預設的構型A，將所述質粒范圍內的多種質粒和沒有損壞的至少一個超螺旋對照質粒沉積到一個載體上，從而形成一個劃分有不同區域A1～Ax的功能載體，x指的是等于需要同時測試的生物培養基數目的整數，每個從而形成一個劃分有不同區域A1～Ax含有所述范圍的質粒；因而，所述范圍內的改性的質粒的不同制備沉積在相同載體上的指定的精細的位置上。由沒有DNA損壞的超螺旋質粒組成的至少一個對照物共同沉積下來。
(d)用多種修復溶液對步驟(c)中得到的功能載體進行培育，含有至少一種生物培養基的每種溶液可能具有修復、ATP、ATP-再生系統的酶活性，標記的核苷三磷酸鹽和任何其它對修復酶活性的必要組分在所述生物培養基中存在，優選在30℃下進行1～5小時，優選為3小時，在所述的培育前，每種所述的修復溶液沉積在所述功能載體的所述的不同和預設的區域A1～Ax。
(e)至少清洗所述功能載體一次，(f)直接或間接測定標記產生的信號，該標記在步驟(d)的修復反應過程中和所述不同和預設區域A1～Ax和DNA結合為一體，(g)記錄和定量對應于在每個區域A1～Ax的質粒沉積的信號，以及(h)測定含有相對于直接沉積的對照質粒的損壞的質粒信號的比率。
根據本發明，這種方法具有一定的優點-由于同時平均阿不同類型損壞的修復成為可能，該方法在鑒別多種損壞時可以用于探測整體效果。
-本發明使得測定生物提取液的切除和/或切除/再合成能力不需和對照的生物培養基進行對比。這是因為通過實現該方法獲得的結果和生物提取液的單一標本足以使提取液的修復效果精確和定量損壞。
-特別適合研究不同生物培養基，對于體內狀態是一個好的反映。
-根據本發明的方法，該方法根據給定生物培養基在DNA修復中的酶活性“繪制”給定的生物培養基。該發明根據得到的繪制的圖對生物提取液進行鑒別。
-本發明可測定在給定生物培養基中缺失或部分缺失的修復蛋白質，從而作為診斷測試。
-根據本發明，該方法也能夠根據DNA損壞修復比較不同生物培養基的性能水平。
-本方面不使用任何放射性的同位素。
-由于本發明的小型化，所以其能夠用很小量的生物材料獲得大量的信息。
-本發明可以是自動化的。
根據所述方法的優選實施例，步驟(a)中制備的質粒從具有雙鏈超螺旋形態(pBR322、M13、pUC等)中選擇。
對照質粒的超螺旋形態是通過用公知的技術進行提純得到的，例如，恰根(Qiagen)質粒提純組合體。也優選用其它的提純步驟限制不想要的質粒形態的生成，如氯化銫離心和/或蔗糖梯度離心。
根據本發明步驟(a)中的另一優選實施例，不同的能夠引入DNA損壞的物理、生物或化學試劑從更適宜進行誘導中選出單一損壞的形成、限制數目的損壞或屬于同一族的不同損壞的形成。
例如，對于提到的損壞的種類可能包括氧化損壞、由紫外線B或C輻射誘導的光化產物、化學加合物、艾塞諾-基、脫堿基位點和DNA裂解。
例如，物理和化學試劑選自那些功能主要為-通過II型光敏作用機理純態氧主要是靶向鳥嘌呤；在這種情況下，形成的大量的損壞是8-羥鳥嘌呤(8-oxoguanine)(Ravanatet al.，Chem.Res.Tox.，1995，8，379-388)；-通過I型光敏作用機理或通過釋放羥基自由基的機理；在這種情況下，得到的DNA損壞是氧化性的損壞；這些損壞以等同的方式影響嘌呤基和嘧啶基。在上述提到的這些損壞中，可能由8-羥鳥嘌呤、乙二醇、胸腺嘧啶、法批-鳥嘌呤(fapy-guanine)、法批-腺嘌呤(fapy-adenine)、羥甲基尿嘧啶(hydroxymethyluracil)、5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine)和甲酸尿嘧啶(formyluracil)組成(Cadet et al.，Rev.Physiol.Biochem.Pharm.，1997，31，1，87)；-通過三重態-三重態能量遷移(triplet-triplet energytransfer)；在這種情況下，形成的主要損壞是環丁烷嘧啶二聚物(Costalat et al.，Photochem，Photobiol.，1990，51，255-262)；
-通過釋放由DNA基直接吸收的能量，如紫外線B或C的輻射。形成的連接(linkages)是環丁烷嘧啶二聚物，(6-4)光化產物和德瓦價異構體(Douki et al.，J.Biol.Chem.，2000，275，11678-11685)；-通過釋放純態氧。這些試劑例如屬于內過氧化物族。這種情況下形成的損壞是8-羥鳥嘌呤(Ravanat et al.，J.Biol.Chem.，2001，276，40601-40604)。
化學試劑選自那些誘導公知基的改性、屬于致癌物質的一類。例如，提到的試劑包括乙酰胺基芴(acetylaminofluorene)(Hess et al.，1996，Nucleic Acid Res.24，824-828)、順鉑(Pasheva et al.，2002，Int.J.Biochem.Cell Biol.，34，87-92)、苯并芘(Laws et al.，2001，Mut.Res.；484，3-18)、補骨脂素(Zhang et al.，Mol.Cell.Biol.，2002，22，2388-2397)、氯乙醛(Chloroacetaldehyde)(CAA-Wang et al.，2002，13，1149-1157)、三苯氧胺(Dasaradhi et al.，1997，Chem.Res.Tox.，10，189-196)和反、反2.4-癸二烯醛(DDE-Carvalho et al.，1998，Chem.Res.Tox.，11，1042-1047)。
仍然根據所述方法的另一優選實施例的步驟(a)，不同試劑用在所述質粒范圍的每個質粒上。
根據所述方法的另一優選實施例的步驟(b)，損壞的確定包括(i)取出每種具有損壞的一部分質粒，(ii)用從DNA中釋放出核苷的酶分解所述的一部分質粒，以及(iii)用和定量分析技術匹配的分離技術的組合對分解的結果進行分析。
根據本實施例的優選方案，用至少一種下述的酶進行分解牛脾磷酸二酯酶、P1核酸酶、蛇毒磷酸二脂酶和堿性磷酸酶(Douki et al.，J.Biol.Chem.，2000，275，11678-11685)。
根據本實施例的另一優選方案，酶分解的結果用下述一種方法進行分析前后偶聯質譜的高性能液體色譜(HPLC)(Douki et al.，2000，J.Biol.Chem.，275，11678-11685；Sauvaigo et al.，2001，Photochem.Photobiol.，73，230-237；Frelon et al.，Chem.Res.Tox.，2000，13，1002-1010)，與氣相色譜偶聯的HPLC(Wang et al.，2000，13，1149-1157；Pouget et al.，2000，Chem.Res.Tox.，13，541-549)或者與電化學檢測偶聯的HPLC(Pouget et al.，2000，Chem.Res.Tox.，13，541-549)。
根據所述方法的另一優選實施例，在步驟(c)之前，步驟(a)中得到的質粒的超螺旋形態優選用蔗糖梯度離心和/或氯化銫梯度離心法進行提純。
根據所述方法的另一優選實施例，也是在步驟(c)之前，質粒范圍內的每種質粒濃度在稀釋的緩沖溶液中稀釋為5～100ug/ml，優選的緩沖液的PH值為6.5～8.0，可選擇含有鹽和非離子表面活性劑；優選的，所述緩沖液是含有0.05M～0.05M的NaCl的10mM磷酸鹽緩沖液或SSC緩沖液。
不同的質粒優選用生成微陣列(microarrays)的自動設備進行沉積，即，沉積的量優選為100～1000微微升(picoliters)。
根據所述方法的另一優選實施例的步驟(c)，所述載體被激活，以增加其相對DNA的親和力，載體選擇由有機或無機材料組成，這些材料選自玻璃、硅和其類似物，以及合成或非合成高分子(尼龍或硝化纖維膜)，載體的表面可選擇的進行功能化；優選的，所述載體由涂有多聚賴氨酸的玻璃載片以吸附DNA，或用環氧基對玻璃載片進行功能化，以和DNA形成共價鍵。
如有必要，通過處理增加DNA和其載體之間的連接。這些處理必須不能在沉積的DNA上產生附加的損壞。
根據本發明，標準的載體含有區域A1～Ax，含有全部范圍質粒的每個區域在每個所述區域內包括-至少對比質粒的一個沉積，和-含有光化產物的質粒的一個沉積，和/或-含有氧化性破壞的質粒的一個沉積，和/或-含有艾塞諾基的質粒的一個沉積，和/或-含有DNA裂解的質粒的一個沉積，和/或含有致癌試劑加合物的質粒的一個沉積。
根據本發明方法的步驟(d)-根據Manley et al.，1983，Methods Enzymol.101，568-582的方法或根據Biade et al.，J.Biol.Chem.，1998，273，898-902的方法或根據任何其它能夠提供含有修復蛋白質的培養基的方法，生物提取液可以用生物培養基制備。
-標記選自親和力分子、熒光物質、抗體或生物素；優選的，標記或用于肉眼觀察標記的試劑特別選自由具有直接的熒光(Cy-3或Cy-5)的熒光物質或間接的熒光物質(生物素或地高辛)組成。
-然后載體在一定溫度下培育1～5小時以改善修復反應，溫度優選為30℃，時間優選為3小時。
根據本發明優選實施例的步驟(e)，載體用含有非離子表面活性劑的鹽溶液至少清洗一次，特別是在含有Tween 20的10mM磷酸緩沖液中，然后用清水至少漂洗一次。
根據本發明方法的步驟(f)，用適合標記的方法對信號進行測定；例如，如果標記是熒光的，直接測定由載體上的不同沉積釋放出來的熒光信號。
根據本發明優選實施例的步驟(g)，所述信號用能夠激活標記的方法進行定量分析，優選為熒光團(fluorophore)，以及用能夠測定激活后釋放出來的信號的方法進行分析。
信號用適合載體和標記用的儀器進行測定。掃描器可以用作熒光成像分析，優選為標記用的特殊波長的激光發生器。
根據本發明優選實施例的步驟(h)，含有損壞的質粒獲得的信號和設置在同一載體上的對照質粒獲得的信號的數量比例是確定的。
根據本發明，因而獲得了給定生物培養基的修復情況(repairprofile)。
這個修復情況可以用于測試培養基總的和特定的修復能力，用于診斷修復相關的疾病，或用來評價物理或化學處理(例如，基因毒性產品)對給定培養基的修復能力的影響。
因此，本發明的一個主題是上述方法的應用-用于確定生物培養基的修復情況；-用于診斷修復相關的疾病；-用于評價物理或化學處理(例如，基因毒性產品)對給定培養基的修復能力的影響；-用于篩選能夠調節生物培養基修復系統的物質。
圖1顯示的是載體形狀的實施例；可以看到9個區域沉積的平面圖；圖2表示的是每個區域的沉積平面圖；以及圖3表示的是修復流程圖-與細胞系的修復關系，該細胞系用于制備修復反應的提取液。
具體實施例方式
除了上述方案外，本發明也包括下文中提到的其它方案，此處所述的實現所述方法的實例是本發明的主題，然而，顯而易見的是這些實例僅僅是為了演示本發明的主題而示出，而不應是對本發明的一個限制。
實例1質粒的制備和損壞的分析根據Stratagene提供的方案，質粒pBluescript II通過來自Stratagene的XL1-藍色MRF超能力細胞(supercompetent cells)的變形所生成。
然后，根據推薦的方案，質粒用恰根質粒組合體(midi kit)提純質粒。
質粒的附加提純質粒放置在10ml、蔗糖梯度為5～20％、PH為7.5、25mM Tris HCl緩沖液中；1M NaCl；5mM EDTA；并在4℃和25000rpm下用SW-41轉子的貝克曼超高速離心器進行分離。取出1ml在瓊脂糖膠體上進行分析。僅僅保留含有至少90％的旋繞形態的質粒部分。質粒和溶解在PBS中的乙醇一起沉淀。
質粒改性-UVC照射-環丁烷嘧啶二聚物(CPDs)和(6-4)光化產物的形成在PBS中稀釋至20ug/ml的質粒，用帶有兩個15W氖燈的生物磚(Bioblock)殺菌燈照射。三個質粒制劑分別用0.06、0.12和0.2J/cm2進行照射。
-用氯乙醛(CCA-Signa)處理-丙二醛-脫氧鳥嘌呤(MDA-dG)的形成質粒在1mg/ml的PBS中制備，加入等量的CAA(水中為50％)。溶液在37℃下培育過夜。質粒通過沉淀恢復，并在蔗糖梯度上提純。
-用反，反-2，4-癸二烯醛(DDE-Sigma)-艾塞諾-鳥苷和艾塞諾-腺苷的形成PH為9.2的200ul的0.2M碳酸鹽/重碳酸鹽緩沖液和等量的THF以1mg/ml的量加入到200ul水中制備的質粒中。然后加入4ul的DDE和12ul、30％的雙氧水。溶液在黑暗的情況、50℃下培育2小時。DDE通過用二氯甲兩次萃取消除。DNA被沉淀，然后在蔗糖梯度上提純。
-用內過氧化物DHPNO2處理-8-氧-2’-脫氧鳥苷的形成20ul的內過氧化物溶液在37℃的情況下在質粒中培育2小時，該質粒為200ul，在PBS中稀釋為1mg/ml。然后質粒沉淀并在蔗糖梯度上進行提純。
質粒中的損壞分析在同一條件下處理的一部分質粒DNA或一部分牛胸腺DNA用于分析改性基成分。
DNA和Douki et al.，J.Biol.Chem.，275，11678-11685描述的一樣進行分解，并用HPLC-前后質譜進行分析。
得到下述每104正常基損壞的量。
需要注意的是，處理使損壞以不同的比例形成-UVC照射在很大范圍的內形成環丁烷嘧啶二聚物(CPs)，在較小的范圍內形成(6-4)光化產物，-DDE主要形成艾塞諾-脫氧鳥苷，-內過氧化物主要形成8-氧-2’脫氧鳥苷。
可以看到，這些試劑誘導了特定損壞的主要形成，該損壞靶向合適的不同的修復酶族。
實例2根據本發明，在實例1制備的質粒范圍實現本方法質粒在載體上沉積質粒在PBS中稀釋為20ug/ml。在涂有商業用的多聚賴氨酸的玻璃載片上(VWR)用GESIM自動設備制備500微微升的沉淀。載片在4℃下保藏。
根據圖1中的構型A，每個載片(載體S)含有設置的9個相同的區域(A1至A9)。
根據圖2所述，在每個區域中的質粒范圍被沉積，如所示的區域A1。
每個區域可以測試不同的生物培養基。
修復反應制備含有生物培養基或要測試的提取液的溶液；對于5ul的溶液，成分如下-提取液 0.5ul-5x修復緩沖液1ul-CY5-dUTP(AmershamPharmaciaBiotech)(0.1nmol/μl)0.2ul-2M KCL 0.2ul-ATP(Roche-100) 0.1ul用水將體積補充為5ul。
5x修復緩沖液的成分Hepes/KOH，200mM，PH7.8；35mM的MgCl2；2.5mM的DTT；2uM的dATP，2uM的dGTP；2uM的dCTP；50mM的磷酸肌酸；250ug/ml的肌氨酸磷酸激酶；0.5mg/ml的BSA；17％的甘油。
使用的細胞系實例中使用的是源自三種不同細胞系的三種不同提取液。
■細胞系1其為海拉(Hela)細胞。提取液使商業用和提取液，來自4C生物科技公司(比利時)。它們通過Dignam et al.(Nucl.Ac.Res.，1983，11，1475-1489)提出的方法進行制備。其蛋白質的含量為24mg/ml。
■細胞系2該細胞系是來自經受著色性干皮病病人的AS203細胞，互補基團D。根據Manley et al.方案制備提取液。用微BCA組合體分析蛋白質可以測定44mg/ml的蛋白質的量。
■細胞系3其為XP12RO細胞。該細胞系是來自經受著色性干皮病病人的AS203細胞，互補基團A。根據Manley et al.(Methods Enzymol.，1983，101，568-582)方案制備提取液。獲得的提取液含有36mg/ml的蛋白質(微BCA分析組合體，Interchim)。
3ul的每種修復溶液沉積在載片單一區域的所有沉淀上。載片在30℃、濕潤條件下培育3小時。載片用含有0.1％的Tween 20的PBS緩沖液清洗3次、清洗10分鐘。然后用水漂洗15分鐘。干燥后，可以看到熒光。
修復信號的分析修復反應后，每個區域上的不同沉淀的熒光用635nm的Axon掃描器和GenePix Pro分析軟件進行分析。然后測試三個一樣點的平均值。于是得到每種類型改性的值。對每種細胞系繪制圖表。這個圖表和修復系統的繪制相對應，該修復系統和載體或切片上的損壞相關，并且特別適合所用的提取液。得到的結果如圖3所示。熒光水平用任意的單位(AU)表示。
可以看到，每個圖表是獨一無二的，對于用于制備所用的細胞提取液的細胞系來說是特定的。因此，可以用于精確定量給定細胞提取液的總的修復活性，以及表示靶向系統的功能。
可以看到，海拉細胞兩次修復DDE(主要是艾塞諾-dG)誘導的損壞的效果和修復由UV輻射(主要微CPD和(6-4))誘導的損壞的效果一樣。可以看到，氧化性破壞(主要是8-氧-dG)修復的程度更弱。
對于AS203細胞系，最高的修復水平盡管很低，也可以看到UV-誘導的損壞。
關于XP12RO細胞系，可以看到，DDE-誘導的損傷(主要是艾塞諾-dG)被最有效的修復，釋放出的信號比UVC輻射高三倍。一般都知道，XPA細胞系不修復CPDs；UVC-照射DNA獲得的信號是(6-4)光化產物的修復產生的。
本發明意料外的優點是對于給定的提取液，即使提取液之間的蛋白質的量不同，得到的含有損壞的DNAs的信號和對照DNA的信號的比率可以用于比較不同提取液彼此間的修復能力。
權利要求
1.一種定量分析至少一種生物培養基的總的和特殊DNA修復能力的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(a)制備一定范圍的質粒，每個質粒含有明顯的DNA損壞，通過對所述的不同質粒用至少一種物理和/或化學試劑進行單獨的處理，并對所述的每種質粒的超螺旋部分進行恢復；(b)確定出現在每個所述范圍內的質粒的損壞；(c)根據預設的構型A，將所述質粒范圍內的多種質粒和沒有損壞的至少一個超螺旋對照質粒沉積到單一載體上，從而形成一個劃分有不同區域A1～Ax的功能載體，x指的是等于需要同時測試的生物培養基數目的整數，每個區域A1～Ax含有所述范圍的質粒；(d)用多種修復溶液對步驟(c)中得到的功能載體進行培育，含有至少一種生物培養基的每種溶液具有修復、ATP、ATP-再生系統的酶活性，標記的核苷三磷酸鹽和任何其它對修復酶活性的必要組分存在于所述生物培養基中，優選在30℃下培育1～5小時，優選為3小時，在所述的培育前，每種所述的修復溶液被沉積在所述功能載體的所述的不同和預設的區域A1～Ax；(e)至少清洗所述功能載體一次；(f)直接或間接測定標記產生的信號，該標記在步驟(d)的修復反應過程中在所述不同和預設區域A1～Ax處和DNA結合為一體；(g)記錄和定量分析對應于每個區域A1～Ax質粒沉積的信號；以及(h)測定含有損壞的質粒相對于共同沉積的對照質粒信號比率。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(a)中的質粒選自具有雙鏈超螺旋結構的質粒。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于在所述方法的步驟(a)中，能夠誘導DNA損壞的多種物理或化學試劑選自能夠優先誘導單一損壞的形成、有限數量損壞的形成或屬于同一族的多種損壞的形成的試劑。
4.如權利要求1～3中任一權利要求所述的方法，其特征在于在所述方法的步驟(a)中，多種試劑用在所述質粒范圍的每種質粒上。
5.如權利要求1～4中任一權利要求所述的方法，其特征在于在所述方法的步驟(b)中，損壞的確定包括以下步驟(i)取出每種具有損壞的一部分質粒，(ii)用從DNA中釋放出核苷的酶分解所述的一部分質粒，以及(iii)用和定量分析技術匹配的分離技術的組合對分解的結果進行分析。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于用至少一種下述的酶進行分解牛脾磷酸二酯酶、P1核酸酶、蛇毒磷酸二脂酶和堿性磷酸酶。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于酶分解的結果用下述之一的技術進行分析前后偶聯質譜的高性能液體色譜(HPLC)、與氣相色譜偶聯的HPLC或者與電化學檢測偶聯的HPLC。
8.如權利要求1～7中任一權利要求所述的方法，其特征在于在步驟(c)之前，步驟(a)中得到的超螺旋結構的質粒用蔗糖梯度離心法和/或氯化銫離心法進行提純。
9.如權利要求1～8中任一權利要求所述的方法，其特征在于液在步驟(c)前，所述質粒范圍內的每種質粒的濃度在稀釋緩沖液中稀釋為5～100ug/ml，緩沖液優選為PH值為6.5～8.0，可選擇的與鹽和非離子表面活性劑結合。
10.如權利要求1～9中任一權利要求所述的方法，其特征在于在所述方法的步驟(c)中，質粒范圍內的沉積的量優選為100～1000微微升。
11.如權利要求1～10中任一權利要求所述的方法，其特征在于在所述方法的步驟(c)中，為了增加載體對于DNA的親和力，所述載體進行了激活，載體選自玻璃、硅和其類似物、合成或非合成高分子，載體的表面被可選擇的功能化。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于所述的載體由涂有多聚賴氨酸、吸附DNA的玻璃載片，或用環氧基進行功能化、和DNA形成共價鍵的玻璃載片組成。
13.如權利要求11或12所述的方法，其特征在于所述載體含有不同的區域A1～Ax，所述的每種區域包括-至少對照質粒的一個沉積，和-含有光化產物的質粒的一個沉積，和/或-含有氧化性破壞的質粒的一個沉積，和/或-含有艾塞諾—基的質粒的一個沉積，和/或-含有DNA裂解的質粒的一個沉積，和/或含有致癌試劑加合物的質粒的一個沉積。
14.如權利要求1～13中任一權利要求所述的方法，其特征在于在權利要求1所述方法的步驟(e)中，載體用含有非離子表面活性劑的鹽溶液、特別是含有Tween 20的10mM磷酸鹽緩沖液至少清洗一次，然后用清水至少漂洗一次。
15.如權利要求1～14中任一權利要求所述的方法，其特征在于在權利要求1所述方法的步驟(f)中，信號用適合標記的方法進行測定。
16.如權利要求1～15中任一權利要求所述的方法，其特征在于在權利要求1所述方法的步驟(g)中，所述信號用一種儀器進行定量分析，該儀器能夠激發標記，并能測試激發后釋放的信號。
17.如權利要求1～16中任一權利要求所述的方法，其特征在于所述方法的步驟(h)中，用含有損壞的質粒獲得的信號和用設置在同一載體上的對照質粒獲得的信號的比率值是確定的。
18.權利要求1～17中任一權利要求所述的方法在確定給定培養基修復情況中的應用。
19.權利要求1～17中任一權利要求所述的方法在在診斷修復相關的疾病方面的應用。
20.權利要求1～17中任一權利要求所述的方法在評價物理或化學時間的處理對于給定培養基修復能力的影響方面的應用。
21.權利要求1～17中任一權利要求所述的方法在篩選調節生物培養基修復系統的物質上的應用。
全文摘要
本發明涉及一種定量分析至少一種生物培養基的總的和特殊DNA修復能力的方法，以及評價所述培養基的切除/再合成能力的方法及其應用。本發明的方法包括一下步驟(a)制備一定范圍的質粒，每個質粒含有明顯的DNA損壞；(b)確定出現在每個所述范圍內的質粒的損壞；(c)根據預設的構型A，將所述質粒范圍內的多種質粒和沒有損壞的至少一個超螺旋對照質粒沉積到單一載體上，從而形成一個劃分有不同區域A
文檔編號C12Q1/68GK1738913SQ200380108840
公開日2006年2月22日 申請日期2003年12月19日 優先權日2002年12月20日
發明者西爾維·索萬高 申請人:法國原子能委員會