專利名稱：探針介質及其制造方法
技術領域：
本發明涉及含有能夠特異性結合目標物質的探針的探針介質(probe medium)及此探針介質的制造方法。本發明還涉及用于有效地將探針固定在基材上的有用的探針介質、探針介質制造方法及使用此探針介質的探針的固定方法。而且，本發明還涉及通過將探針固定在基材上而獲得的探針固定基材及使用此探針固定基材檢測目標物質的檢測元件及檢測方法。
背景技術：
隨著遺傳工程學、分子生物學等生物技術領域的進步，對于傳染病、癌癥或遺傳疾病等也可以進行DNA、RNA水平的診斷。作為利用DNA、RNA等核酸進行的診斷中使用的工具之一，DNA芯片(chip)、DNA陣列(array)逐漸為人們所關注。用以DNA芯片、DNA陣列為代表的診斷工具，將核酸等探針預先固定在基材上，使探針與目標物質雜交，由此進行檢測。已知能夠與此DNA、RNA、核酸等目標物質特異性結合的探針顯示了易溶于水的水溶性，在乙醇、異丙醇、異戊醇、雙丙甘醇、氯仿等有機溶劑中幾乎不溶。
根據斑點法(spotting)等方法，使用預先準備的探針，制作固定了DNA芯片、DNA陣列等探針的基材的情況下，在將探針固定在基材上時，使用使探針在水或含有水和用于調整pH的物質的水溶液中溶解的物質作為探針介質，使其與基材接觸，由此將探針固定在基材上。具體而言，作為固定探針的方法，特開平08-23975號公報中記載了如下方法調制使DNA溶解在水中得到的探針水溶液后，將經調制的探針介質分注并滴加入經表面處理的孔板(well plate)中，由此將探針固定在基材上。另外，在特開平05-192198號公報中記載了如下方法用10mM Tris·HCl pH7.6、1mM EDTA溶液溶解DNA，進行濃度調整，在其中加入4倍容積的H2O和5倍容積的固定化緩沖劑(1.5M NaCl，0.3M Tris·HCl pH8.0，0.3M MgCl2)，進行混合，由此調制探針介質。另外，在特開2000-146971號公報中記載了如下方法制備5’末端導入了生物素的寡核苷酸水溶液，點在異氰酸酯化載玻片上，在37℃的培養器內固定15分鐘。日本專利第2794728號說明書中記載了如下方法用TE緩沖液(pH7.5，100mM Tris·HCl，1mM EDTA)將單鏈DNA梯度稀釋，由此調制探針介質；將調制成的探針介質點在硝化纖維素膜上，經風干、加熱，將DNA固定在基材上。
但是，在目前使用的含有能夠特異性結合目標物質的探針的探針介質中，作為用于將探針固定在基材上的介質，還沒有使探針溶解在探針不溶的有機溶劑中的介質，而且在探針介質中也不存在含有使探針溶解在探針不溶的有機溶劑中的物質的介質。目前使用的探針介質是使能夠特異性結合目標物質的探針溶解在水、或含有水和用于調整pH的物質、用于減少吸附的物質的水溶液中的介質。而且，為了利用斑點法等方法將探針介質點樣在基材上，優選少量添加二醇類溶劑、醇類溶劑，但是，使以DNA、RNA等核酸為代表的探針溶解在探針不溶的有機溶劑中而調制成的探針介質還不存在。因此，即使為了適于進行探針介質在基材上的點樣，只使用不含水的有機溶劑的探針介質雖然是適當的，但由于探針不溶解而難以實施。
另外，使核酸等探針溶解在有機溶劑中的方法已知在由試樣中提取以DNA、RNA等核酸為代表的探針的情況下使用。但是，作為用于將探針固定在基材上的探針介質，不存在使探針溶解在有機溶劑中的介質。另外，在探針提取方面，已知為了使以DNA、RNA等核酸為代表的探針結合在核酸結合性載體上，使用混懸在含有表面活性劑的溶液中的載體，使其與核酸結合而將其提取出來；但是，使探針溶解在含有表面活性劑的溶液中作為探針介質使用還屬未知。
發明內容
本發明的第一個目的是提供一種探針介質，所述探針介質含有能夠特異性結合目標物質的探針、有機溶劑和使探針在有機溶劑中可溶化的物質。
本發明的第二個目的如下使探針溶解在探針可溶的溶劑中后，將使探針在有機溶劑中可溶化的物質作用于該溶劑，由此將探針從溶劑中分離，通過添加有機溶劑使探針溶解在有機溶劑中。
本發明的第三個目的如下利用探針的沉淀、再溶解，確認使探針在有機溶劑中可溶化的物質的量，進行調制以使探針沉淀，由此使其有效地溶解在有機溶劑中。
上述課題通過下述發明而解決。
即，本發明包括如下內容(1)一種探針介質，所述探針介質含有能夠特異性結合目標物質的探針、含有有機溶劑的介質和使上述探針在有機溶劑中可溶化的物質。上述探針優選是核酸探針。上述有機溶劑優選是上述探針不溶的溶劑。使上述探針在有機溶劑中可溶化的物質優選為兩親性物質。使上述探針在有機溶劑中可溶化的物質優選為溴化正十六烷基三甲銨，氯化正十六烷基三甲銨，十六烷基氯化吡啶鎓中的任一種物質，或至少含有其中一種的混合物。上述探針介質優選還含有用于將上述探針固定在基材上的物質。用于將探針固定在基材上的物質優選為硅烷偶聯劑。上述探針介質還含有上述探針可溶的溶劑。使上述探針在有機溶劑中可溶化的物質的量，優選在能夠確認上述探針介質出現白色混濁的范圍內進行調制。
(2)一種含有能夠特異性結合目標物質的探針的探針介質的制造方法，其特征在于，所述方法具有如下步驟使上述探針溶解在上述探針可溶的溶劑中的步驟；利用使上述探針在有機溶劑中可溶化的物質的作用將上述探針從上述溶劑中分離的步驟；通過在上述探針中添加有機溶劑使上述探針溶解在有機溶劑中的步驟。使上述探針在有機溶劑中可溶化的物質的量優選基于上述探針的長度與上述探針的摩爾數的乘積進行調整。使上述探針在有機溶劑中可溶化的物質的量優選基于探針從溶劑中分離的量進行調整。
(3)一種探針固定方法，是利用斑點法將探針介質賦予基材，由此進行固定的方法。
(4)一種檢測元件，是利用上述探針固定方法制成的檢測元件。
根據本發明，通過使用具有能夠特異性結合目標物質的探針、含有有機溶劑的介質和使上述探針在有機溶劑中可溶化的物質的探針介質，可以將探針有效地固定在基材上。由于探針介質具有探針和使探針在有機溶劑中可溶化的物質，使探針溶解在有機溶劑中，因此在實施斑點法時能夠獲得優選的材料組成。另外，探針介質中含有將探針固定在基材上的物質時，能夠使探針與將探針固定在基材上的物質有效地結合，能夠有效率地將探針固定在基材上。而且，通過使探針與將探針固定在基材上的物質結合，因此能夠將制造步驟中的控制簡略化并縮短時間。
另外，根據本發明，將多種探針固定在一個基材上時，不僅能夠對應于各探針種類選擇結合物質種類和濃度，而且也能夠選擇對應于探針種類的探針固定物質。而且，能夠對應于探針及將探針固定在基材上的物質調制探針介質的組成。因此，在一個基材上，能夠按照每個探針種類、探針固定物質的組合，在最適條件下結合多種探針。
而且，使探針溶解在探針可溶的溶劑中后，利用使探針在有機溶劑中可溶化的物質的作用，分離探針，通過添加有機溶劑，使探針在有機溶劑中溶解，由此可以將探針有效地固定在基材上。
具體實施例方式
本發明的探針介質具有能夠特異性結合目標物質的探針、含有有機溶劑的介質和使上述探針在有機溶劑中可溶化的物質。另外，本發明包括如下的探針介質及探針介質制造方法在使探針溶解在探針可溶的溶劑中后，利用使探針在有機溶劑中可溶化的物質的作用，將探針從溶劑中分離，通過添加探針不溶的有機溶劑，使探針溶解在有機溶劑中形成的探針介質和探針介質制造方法。另外，本發明的將探針固定在基材上方法包括使探針介質附著在基材上的步驟。
探針包括單鏈核酸探針、單鏈DNA探針、單鏈RNA探針、單鏈PNA探針、單鏈糖鏈探針等。作為介質中所含探針的量，從探針在探針介質中的穩定性方面考慮，將探針介質例如2mer～500mer，特別是2mer～80mer的探針調制成濃度為0.05～500μmol/l，特別是0.5～50μmol/l。
這些探針也可以是具有用于結合基材的反應部位的物質，此反應部位可以舉出官能團、生物素等。此反應部位也可以是作為適當長度的連接物(linker)的一部分而被提供的物質。例如，作為官能團，可以舉出氨基(NH2)、羧基(COOH)、巰基(SH)、羥基(OH)等官能團。特別是作為探針官能團，從探針官能團合成的容易性方面考慮，優選為氨基；從探針官能團的反應性方面考慮，優選為巰基。
作為探針可溶的溶劑，可以舉出水、乙二醇、丙二醇等。另外，也可以根據需要使用這些溶劑中的2種或2種以上。作為水，也包括添加了氯化鈉等鹽、磷酸等酸的探針溶解溶液中的水。
作為使探針在有機溶劑中可溶化的物質，只要是兩親性物質即可，具體而言，可以舉出表面活性劑、形成微團(micelle)催化劑的表面活性劑等。作為表面活性劑，特別優選陽離子表面活性劑。作為陽離子表面活性劑，可以舉出十六烷基氯化吡啶鎓，十六烷基三甲基溴化銨，十六烷基三甲基氯化銨。作為在探針介質中的含量，從探針對有機溶劑的溶解性、探針的穩定性方面考慮，在介質中，例如將表面活性劑的量調制為0.2μmol/l或0.2μmol/l以上，優選為1μmol/l或1μmol/l以上的濃度，或400000μmol/l或400000μmol/l以下，優選為40000μmol/l或40000μmol/l以下的濃度。作用于探針介質的量基于探針的長度與探針的摩爾數的乘積進行調整。另外，作為作用于探針介質的量，基于探針從溶劑中分離的量進行調整。而且，作為作用于探針介質的量，通過探針的沉淀、再溶解進行確認，調整為使探針發生沉淀的量。另外，本發明者發現此用量優選調制為能夠確認上述探針介質出現白色混濁的范圍內。
作為探針不溶的有機溶劑，不僅有醇類、酮類，還可以為含有硅烷偶聯劑等將探針固定在基材上的有機溶劑的多種有機溶劑。另外，作為探針介質中含有的有機溶劑的種類，不僅是1種，也可以使用多種有機溶劑。在探針不溶的有機溶劑中，不含有將探針固定在基材上的有機溶劑，探針未經其他物質即與基材結合時，作為探針不溶的有機溶劑，優選醇類等不具有與探針及基材反應的部位的物質。探針不溶的有機溶劑中，也可以含有利用與探針及基材的反應將探針固定在基材上的有機溶劑。特別是探針與基材不結合，或幾乎不結合的情況下，優選含有將探針固定在基材上的有機溶劑。作為將探針固定在基材上的有機溶劑，具有與探針及基材反應的部位的物質可以舉出硅烷偶聯劑等。作為硅烷偶聯劑可以舉出多種物質，優選環氧基硅烷偶聯劑，異氰酸酯硅烷偶聯劑，巰基硅烷偶聯劑，氯丙基硅烷偶聯劑，氨基硅烷偶聯劑等。作為將介質中所含的探針固定在基材上的有機溶劑的量，從探針對基材的穩定性方面考慮，優選將在探針介質中的濃度調整為0.05～50000μmol/l，特別優選10～500μmol/l。探針官能團與有機溶劑的反應優選為利用官能團間的化學反應形成共價鍵。作為化學反應，在探針具有的官能團為氨基(NH2)時，作為有機溶劑，優選環氧基硅烷偶聯劑，異氰酸酯硅烷偶聯劑，巰基硅烷偶聯劑，氯丙基硅烷偶聯劑。在探針具有的官能團為羧基(COOH)時，優選氨基硅烷偶聯劑，巰基硅烷偶聯劑。在探針具有的官能團為巰基(SH)時，作為有機溶劑，優選環氧基硅烷偶聯劑，異氰酸酯硅烷偶聯劑，乙烯基硅烷偶聯劑。作為醇類，可以舉出乙醇、1-丙醇、1-丁醇、2-丁醇。作為酮類，可以舉出丙酮、甲乙酮。作為氨基硅烷偶聯劑，可以舉出γ-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-β(氨基乙基)γ-氨基丙基三甲氧基硅烷。作為環氧基硅烷偶聯劑，可以舉出γ-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷、γ-縮水甘油氧基丙基三乙氧基硅烷。作為異氰酸酯硅烷偶聯劑，可以舉出γ-異氰酸根合丙基三乙氧基硅烷，γ-異氰酸根合丙基三甲氧基硅烷。作為巰基硅烷偶聯劑，可以舉出γ-巰基丙基三甲氧基硅烷。作為氯丙基硅烷偶聯劑，可以舉出γ-氯丙基三甲氧基硅烷。作為乙烯基硅烷偶聯劑，可以舉出乙烯基三甲氧基硅烷。作為探針不溶的有機溶劑，也可以為這些有機溶劑的混合溶劑。作為探針不溶的有機溶劑，優選將探針、探針可溶的溶劑、使探針在有機溶劑中可溶化的物質、探針不溶的有機溶劑混合，制成探針介質時各相不分離的有機溶劑或有機溶劑的混合溶劑。
另外，也可以根據需要在探針介質中混合水溶性高分子材料。作為水溶性高分子材料，可以舉出聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，Paogen、羧甲基纖維素(CMC)、羥乙基纖維素(HEC)、葡聚糖、支鏈淀粉等，優選聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等常用的高分子水溶性材料。可以使用其中的1種，也可以根據需要將其中的2種或2種以上組合后使用。
作為將水溶性高分子材料在介質中混合的方法，優選如下方法預先制成使水溶性高分子材料完全溶解的規定濃度的溶液，秤量制成的水溶性高分子溶液以獲得高分子材料溶液在介質中的規定濃度，進行混合。作為水溶性高分子材料溶液，具體而言可以舉出如下獲得的物質秤量聚乙烯醇粉末，添加至純水中制成濃度0.5～5質量％的溶液，邊加熱邊使其溶解，得到所需的水溶性高分子材料溶液。優選將此水溶性高分子水溶液混合在探針介質中使其在探針介質中的濃度為0.01～1質量％。
作為制造探針介質的順序可以舉出多種順序。
作為制造探針介質的方法，在探針不溶的有機溶劑中含有或不含有將探針固定在基材上的有機溶劑時并不相同。
在探針不溶的有機溶劑中含有將探針固定在基材上的有機溶劑的情況下，作為第一種方法，可以使用如下方法。首先，將探針與少量探針可溶的溶劑混合，使探針溶解。在溶解了探針的溶劑中，添加使探針在有機溶劑中可溶化的物質。作為使探針在有機溶劑中可溶化的物質的添加方法，可以舉出在溶解了探針的溶劑中混合物質的方法，預先將其溶解在探針可溶的溶劑中達到規定濃度的混合方法，預先將其溶解在探針不溶的溶劑中達到規定濃度的混合方法；從有效率地混合方面考慮，優選預先將其溶解在探針可溶的溶劑中的方法。作為將使探針在有機溶劑中可溶化的物質溶解在探針可溶的溶劑中達到的濃度，從使探針有效地溶解在有機溶劑中的方面考慮，優選使其達到盡可能高的濃度。將含有使探針在有機溶劑中可溶化的物質的溶液滴入溶解了探針的溶劑，進行混合。作為滴加量，將使探針在有機溶劑中可溶化的物質設定為在探針的摩爾數與探針鏈長數得到的乘積再乘以0.2～4得到的摩爾數，優選為乘以0.5～3得到的摩爾數。通過將使探針在有機溶劑中可溶化的物質添加入溶解了探針的溶劑，將探針從溶劑中分離。也可以利用離心沉淀等方法收集分離后的探針。在含有分離后的探針的溶劑中滴加將探針固定在基材上的有機溶劑，進行混合。混合量根據探針官能團、將探針固定在基材上的有機溶劑等的不同而改變，可以將其調制為探針摩爾數的0.5～500倍摩爾數，優選為1.5～50倍摩爾數。而且，從探針對基材的固定性方面考慮，調制成在探針介質中的濃度例如為0.05～50000μmol/l，特別優選為10～500μmol/l。作為混合方法，只要是將利用使探針在有機溶劑中可溶化的物質的添加而分離的探針與將探針固定在基材上的有機溶劑混合的方法，就沒有特別限定。與探針可溶的溶劑的比重相比，將探針固定在基材上的有機溶劑的比重大時，緩慢滴入含有分離、沉淀后的探針的溶劑中，使其離心沉淀，由此可以使其有效地反應。也可以根據需要加熱，加熱時，也可以加熱至40℃～80℃的范圍內。與探針可溶的溶劑比重相比，將探針固定在基材上的有機溶劑比重小時，將探針在容器中充分分離、沉淀，固定在容器底部后，緩慢滴入含有探針的溶劑中。將容器密閉，通過傾斜或攪拌，可以使其發生反應。也可以與比值大的情況同樣地根據需要進行加熱。混合了將探針固定在基材上的有機溶劑后，探針介質優選為單相時，通過添加有機溶劑，能夠獲得單相。例如，將探針固定在基材上的有機溶劑為異氰酸酯硅烷偶聯劑，探針可溶的溶劑為水時，通過添加2-丙醇、雙丙甘醇，能夠獲得單相。在將探針固定在基材方面沒有問題的前提下，從操作探針介質方面考慮，也優選單相。添加量無特別限定，在能夠形成單相的范圍內，將探針濃度設定為規定濃度，優選將其設定為能固定在基材上的范圍。而且，根據需要也可以混合水溶性高分子和水。作為水溶性高分子及水的混合方法，從調制成水溶性高分子的水溶液方面考慮，優選滴加、混合成為規定量。
作為第二種方法，可以使用如下方法。首先，在放入了探針的容器中，滴加并混合將使探針在有機溶劑中可溶化的物質溶解在探針可溶的溶劑中獲得的溶液。由此，使探針溶解在有機溶劑中，由于在探針可溶的溶劑中發生不溶化，因此出現沉淀。然后，在容器中滴加并充分混合將探針固定在基材上的有機溶劑。為了使探針和將探針固定在基材上的有機溶劑充分結合，優選調整混合時間、混合溫度。有機溶劑的混合、水溶性高分子的混合及水的混合可以與第一種方法同樣地進行。
第三種方法是預先對探針與使探針在有機溶劑中可溶化的物質進行混合處理。在使探針溶解在少量的探針可溶的溶劑中后，滴加并混合在探針可溶的溶劑中溶解了使探針在有機溶劑中可溶化的物質的溶液。確認探針發生不溶化、出現沉淀后，進行干燥，除去剩余的溶劑。容器中殘留的物質是對探針與使探針在有機溶劑中可溶化的物質進行混合處理得到的物質。為了使其溶解在有機溶劑中，滴加并混合將探針固定在基材上的有機溶劑。為了使探針與將探針固定在基材上的物質充分結合，優選調整混合時間、混合溫度。有機溶劑的混合、水溶性高分子的混合、及水的混合可以與第一種方法同樣地進行。使用此方法將探針與使探針在有機溶劑中可溶化的物質混合得到的介質可以用作探針固定用試劑。
探針不溶的有機溶劑中不含有將探針固定在基材上的有機溶劑時，作為第一種方法可以使用如下方法。首先，與含有將探針固定在基材上的有機溶劑時同樣地混合探針、探針可溶的溶劑、使探針在有機溶劑中可溶化的物質，使探針從溶劑中分離。在含有分離后的探針的溶劑中滴加并混合探針不溶的有機溶劑。通過溶解從探針不溶的有機溶劑中分離的探針，探針介質成為有機溶劑與探針可溶的溶劑的混合介質。有機溶劑與探針可溶的溶劑的混合介質不是單相時，通過再混合其他的有機溶劑，能夠使探針介質成為單相。在將探針固定于基材方面沒有問題的前提下，從處理探針介質方面考慮，也優選為單相。而且，根據需要也可以混合水溶性高分子及水。作為水溶性高分子及水的混合方法，從調制水溶性高分子的水溶液方面考慮，優選滴加、混合成規定量。
作為第二種方法可以使用如下方法。首先，在放入了探針的容器中，滴加并混合將使探針在有機溶劑中可溶化的物質溶解在探針可溶的溶劑中獲得的溶液。由此，使探針溶解在有機溶劑中，進行沉淀。然后，滴加并混合有機溶劑，由此使探針溶解。有機溶劑的混合也可以與第一種方法同樣地進行。而且，水溶性高分子的混合及水的混合可以與第一種方法同樣地進行。
第三種方法是預先對探針與使探針在有機溶劑中可溶化的物質進行混合處理。在使探針溶解在少量的探針可溶的溶劑中后，滴加并混合在探針可溶的溶劑中溶解了使探針在有機溶劑中可溶化的物質的水溶液。確認探針發生不溶化、出現沉淀后，進行干燥，除去剩余的溶劑。容器中殘留的物質是對探針和使探針在有機溶劑中可溶化的物質進行混合處理得到的物質。因為可以溶于有機溶劑中，滴加并混合將探針固定在基材上的有機溶劑，由此使探針溶解。有機溶劑的混合可以與第一種方法同樣地進行。水溶性高分子的混合、及水的混合可以與第一種方法同樣地進行。
由此獲得的探針介質，適合用作調制用于檢測目標物質的固定化探針中使用的探針介質。
將得到的探針介質點樣在基材上，由此可以制成探針固定基材。用于固定探針的基材無特別限定，但是從目標物質的檢測或材料的廣泛性方面考慮，優選石英基板材料或樹脂基板、塑料基板、樹脂膜。具體而言，優選1英寸×3英寸大小的載玻片基板。從探針固定的固定特性等方面考慮，探針介質中含有將探針固定在基材上的有機溶劑時，優選玻璃材質中不含堿成分等的無堿材料載玻片基板，石英玻璃材料，二氧化硅涂層的玻璃材料或二氧化硅涂層的樹脂材料。探針介質中不含有將探針固定在基材上的有機溶劑時，優選在玻璃或樹脂表面上實施了表面處理的材料。作為表面處理，優選使探針易于固定在基材上的處理，特別優選形成利用偶聯劑等在基材表面上與探針形成共價鍵的官能團。
另外，目標物質檢測方法對板狀等的形狀沒有限定，但是，從檢測方法及裝置等的廣泛性方面考慮，優選為板狀。而且，希望為表面平滑性高的基板材料。
另外，作為用于固定探針的基材，為了將探針均勻且確實地固定在基材上，所述基材優選具有清潔表面。在固定探針前，預先洗滌基材，由此可以確保足夠清潔的表面。作為清潔基材的方法，已知有水洗滌、藥液洗滌、等離子體洗滌、UV臭氧洗滌、吹風(air blow)洗滌等多種方法。使用這些洗滌方法，優選根據基材的種類改變洗滌方法及洗滌條件等。
例如，探針介質中含有將探針固定在基材上的有機溶劑時，優選使用藥液洗滌基材表面。例如，可以舉出如下方法使用規定濃度的氫氧化鈉水溶液充分洗滌基材表面，除去基材上附著的污垢。具體而言，準備加熱至50℃左右的1mol/l氫氧化鈉水溶液，在水溶液中擦拭基材表面，或邊噴淋水溶液、邊進行刷洗(brushing)，由此確實地除去附著在基材上的污垢。除去污垢后，用水充分洗去剩余的氫氧化鈉。最后，也可以通過噴吹氮氣等將水分除去。由此，可以獲得能夠均勻且確實地固定探針介質中的探針的基材。
探針介質中不含有將探針固定在基材上的有機溶劑時，優選用水或溶劑洗滌基材表面，或進行吹風洗滌。例如可以舉出使用純水，充分洗滌基材表面，除去附著在基材上的異物的方法。具體而言，通過在基板表面上噴吹高壓純水浴(shower)(2流體浴)而將異物除去。除去異物后，再利用純水浴進行漂洗，棄去混入異物的純水。最后，也可以通過噴吹氮氣等將水分除去。由此，可以獲得能夠均勻且確實地固定探針介質的基材。
將探針介質點樣在基材上的方法已知有多種方法。作為具體方法，已知有針法、噴墨法、針&環法。其中，由于噴墨法能夠高密度且正確地進行點樣，因此是優選的點樣方法。
在利用噴墨法進行點樣的方法中，探針介質中所含的成分只要是如上所示作為探針介質從噴墨頭中噴出時對探針、探針可溶的溶劑、探針不溶的有機溶劑及使探針在有機溶劑中可溶化的物質無實質性影響的物質，并且滿足能夠使用噴墨頭從基材中正常噴出的介質組成，就沒有特別限定。例如，噴墨頭是具有對介質賦予熱能而使其噴出的裝置的噴墨頭時，作為探針介質中所含的成分，優選含有甘油、硫二甘醇、異丙醇、炔屬醇的液體。更具體而言，作為探針介質優選使用含有5～10質量％甘油、5～10質量％硫二甘醇和0.5～1質量％炔屬醇的液體。另外，噴墨頭為使用壓電元件使介質噴出的噴墨頭時，作為探針介質中所含的成分優選含有乙二醇、異丙醇的液體。更具體而言，作為探針介質優選使用含有5～10質量％乙二醇、0.5～2質量％異丙醇的液體。在這些介質成分中，就探針可溶的溶劑而言，也可以根據需要改變調制順序，在混合水溶性高分子材料前進行添加。
將由此獲得的探針介質由噴墨頭噴出，附著在基材上時，點樣的形狀為圓形，噴出范圍并不擴大。高密度地點樣探針介質時，能夠有效地抑制相鄰斑點間的連接。需要說明的是本發明的探針介質的特性并不限定于上述內容。
由于將賦予基材的探針介質中所含的探針固定在規定的位置上，更確實地防止了相鄰斑點中所含探針的污染，因此是有效的，并且作為將探針強力固定在基材上的有效方法，有使用具有能夠使將探針固定在基材上的有機溶劑與基材、或探針與基材分別互相反應的官能團的物質的方法。
作為優選例，探針介質中含有將探針固定在基材上的有機溶劑時，可以舉出在將探針固定在基材上的物質一側有硅烷醇基(SiOH)，基材上具有羥基(OH)的組合。利用這一組合，由斑點法賦予基材的探針介質中所含物質的硅烷醇基與基材的羥基發生反應，將物質固定在基材上。對于具體的基材而言，優選如下情況在將探針固定在基材上的有機溶劑中，硅烷偶聯劑為具有硅烷醇基的物質；在基材中，在上述玻璃材料、石英基板材料、樹脂基板表面上涂覆了二氧化硅的材料為具有羥基的材料，適合使用。
作為探針介質中不含有將探針固定在基材上的有機溶劑時的優選例，可以舉出探針上具有氨基(NH2)、基材側具有環氧基的組合，探針具有氨基、基材側具有異氰酸酯基的組合。利用這些組合，由斑點法賦予基材的探針介質中所含的探針的氨基與基材上的環氧基或異氰酸酯基發生反應，將探針固定在基材上。對于具體的基材而言，優選如下情況探針為附加了氨基的DNA，基材為實施如上所述的表面處理、導入環氧基的樹脂基板基材上具有環氧基的材料。
而且，探針介質中含有將探針固定在基材上的有機溶劑時，就探針與將探針固定在基材上的有機溶劑之間而言，在探針與上述物質之間，優選利用反應進行結合。利用反應將探針與上述有機溶劑強力地結合。其結果是能夠將探針更強力地固定在基材上，使探針的點樣形成在規定位置。特別是調制由具有氨基作為官能團的探針、及由具有異氰酸酯基作為能夠與探針反應的官能團、具有硅烷醇基作為能夠與基材官能團反應的官能團的物質構成的探針介質，為了達到規定的比率，調制混合了雙丙甘醇、異丙醇等的探針溶液。使用噴墨頭，將此探針溶液點樣在具有羥基作為官能團的基材上時，使探針溶液在基材上形成穩定大小的點。由此，能夠將探針固定在基材的規定位置上。
需要說明的是利用探針與將探針固定在基材上有機溶劑間的反應進行結合時，優選在探針介質中混合作為水溶性高分子材料的聚乙烯醇(PVA)。更優選使其完全溶解。通過在探針介質中混合水溶性高分子材料，使對基材上的點樣狀態的觀察變得容易，點樣后的點中的探針介質難以干燥，由此能夠使探針介質與基材更確實地反應，從而進行固定。而且，從利用點樣制成的探針固定基材的保存狀態方面考慮，即使在利用點樣形成的探針介質點干燥的情況下，在有效率且穩定地檢測目標物質方面也是有效的。
優選使將探針介質點樣在基材上得到的基材干燥。通過干燥，將探針介質中的探針確實地固定在基材上。作為干燥的方法，有真空干燥、加熱干燥等多種方法，但是從能夠簡便且確實地實施方面考慮，優選加熱干燥。作為加熱干燥的方法，優選利用熱板進行加熱干燥。具體而言，在加熱后的熱板上靜置點樣了探針介質的基材。靜置規定時間后，取出基材，使其自然冷卻。從探針的耐熱性方面考慮，熱板的溫度優選為100℃或100℃以下，更具體而言，優選為60℃～90℃。作為靜置時間優選為30min或30min以下，更具體而言，優選為1～10min。
例如，將含有堿基長20mer的探針的探針介質調制成探針濃度為9μmol/l。使探針在有機溶劑中可溶化的物質的添加量基于在探針量上僅乘以堿基鏈長的數值得到的量進行調制。優選調制成在探針量與堿基鏈長的數值的乘積上再乘以0.5～3倍得到的量。使用噴墨頭，將固相與噴墨頭的噴嘴間隔設定為0.2～0.5mm左右，使探針介質從此噴嘴中噴出時(噴出量約為20微微升)，能夠在固相上形成直徑約170～250μm左右的點，另外，起因于液體由噴嘴噴出時的飛沫的點(以下稱為“衛星點”)可以使用放大鏡憑借目視觀察而被完全確認。
此處，使用此探針固定基材，例如出于提高進行目標物質檢測等時的檢測精度(點積分強度)的目的，在將此探針固定在固相表面后，也可以進行阻斷(blocking)，以便此基材的探針非結合部分不與樣品中所含的目標物質等結合。阻斷例如將此基材在室溫的2％牛血清白蛋白水溶液中浸漬例如2小時而進行。從防止目標物質吸附在基材的探針固定部位之外的效果方面考慮，優選牛血清白蛋白水溶液。需要說明的是此阻斷步驟也可以根據需要進行，例如，對應于各點限定地對此探針固定基材進行樣品供給。樣品對點以外部位的附著因構成基材的材料不同而不同。特別是基材為玻璃、石英、二氧化硅涂層的樹脂時也可以不進行阻斷處理。
由此制成的探針固定基材也可以根據其用途構成為例如具有含有相同探針的多個點，另外，也可以構成為具有含有不同種類探針的多個點。探針的種類、數量、配置可以根據需要進行適當變更。利用此方法將探針高密度配置成的探針固定基材用于隨后的目標物質檢測或目標物質堿基序列的鑒定等。例如，用于檢測作為樣品中可能含有的、堿基序列已知的目標物質的單鏈核酸時，使用具有與此目標物質的單鏈核酸的堿基序列互補的堿基序列的單鏈核酸作為探針，準備將含有此探針的多個點配置在固相上的探針固定基材，在此探針固定基材的各點中供給樣品，在使此目標物質的單鏈核酸與探針雜交的條件下放置后，用熒光檢測等已知方法檢測各點中是否有雜交物。由此，進行樣品中有無目標物質的檢測。
另外，用于樣品中所含目標物質的單鏈核酸中堿基序列的鑒定時，設定此目標物質的單鏈核酸中堿基序列的多個候補序列，將具有與此堿基序列組分別互補的堿基序列的單鏈核酸作為探針點樣在此基材上。然后，將樣品供給至各點，在使此目標物質的單鏈核酸與探針雜交的條件下靜置后，用熒光檢測等已知方法檢測各點中是否有雜交物。由此能夠確定相對于目標物質的單鏈核酸的堿基序列。另外，作為本發明的探針固定基材的其他用途，例如適用于識別DNA結合蛋白質的特異性堿基序列的篩選或具有在DNA上結合的性質的化學物質的篩選。
探針介質可以以含有有機溶劑的液體介質、探針、探針可溶的溶劑、探針不溶的有機溶劑、使探針在有機溶劑中可溶化的物質、根據需要添加的使探針固定在基材上的有機溶劑而構成的形式提供。也可以以將這些成分至少分成2種成分，分別在不同的容器中，以使用時能夠混合的狀態的試劑盒的形式提供。
將探針收納在容器中時，為了不使其他雜質混入容器中，優選能夠密閉的容器；另外，為了在固定時易于進行混合，必須是能夠開啟的容器。就容器的開啟而言，沒有特別限定。作為收納在容器中的探針的狀態沒有特別限定，可以為溶液狀，也可以為粉末狀。官能團為巰基等時，從探針的穩定性方面考慮，優選在利用凍干法等進行粉末化后，保存在非高溫條件下。即使在官能團為氨基等的情況下，為了確保探針的穩定性，保存狀態也優選為冷凍保存；可以對應于保存時間、探針種類、探針官能團等變更保存狀態。由此，也可以在將探針收納并保存在容器中的狀態下，在固定在基材上時進行混合。
在此用途中，使用表面活性劑作為使探針在有機溶劑中可溶化的物質時，表面活性劑優選為溶液，但是也可以為粉末狀固體，也可以溶解在溶劑中后使用。
將探針可溶的溶劑、探針不溶的有機溶劑、將探針固定在基材上的有機溶劑收納在容器中時，為了不使其他雜質混入容器中，并且不發生因溶劑揮發而導致的減量，優選能夠密閉或被密閉的容器；另外，為了在固定時方便混合，優選能夠容易地開啟的容器。但是，就容器的開啟而言，無特別限定。容器中收納的溶劑的狀態無特別限定，可以為溶液狀，也可以為固體狀。而且，就將探針固定在基材上的有機溶劑而言，為了形成作為用于將探針固定在基材上的官能團實例的硅烷醇基，也可以為水解的溶液。作為保存狀態，為了確保溶劑的穩定性，優選室溫保存，可以對應于保存時間等變更保存狀態。特別是使用水解后的溶液時，優選保存中溫度不上升的情況。另外，對應于將探針固定在基材上的有機溶劑的官能團，優選通過調整水解時、水解后的pH獲得穩定性的方法。
將探針固定在基材上時，將收納在這些容器中的探針及固定探針的有機溶劑混合時，也可以根據需要添加水等溶液。另外，也可以將為了得到探針介質而充分混合的物質，例如水等溶劑預先收納在其他容器中，在調制探針介質時進行混合。
(實施例)通過下述實施例更詳細地說明本發明。
(實施例1)(1)探針的合成作為能夠與目標物質特異性結合的探針使用單鏈DNA探針。使用DNA自動合成機(Applied Biosystems社制，Model 1380A)合成序列號1的單鏈DNA探針。需要說明的是準備在序列號1的單鏈DNA末端，5’末端的羥基經由磷酸基和亞己基結合氨基得到的18倍體寡聚物，用于下述試驗。
序列號15’H2N-(CH2)6-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA 3’(2)探針溶劑使用水作為探針可溶的介質。
(3)探針可溶化物質使用十六烷基三甲基溴化銨(正十六烷基三甲基溴化銨)作為使探針在有機溶劑中可溶化的物質。為了得到十六烷基三甲基溴化銨完全溶解的水溶液，在50℃的水浴中邊加熱，邊使其溶解。
(4)探針不溶的溶劑作為探針不溶的有機溶劑，在下述試驗中使用含有具有異氰酸酯基的硅烷化合物(3-異氰酸根合丙基三乙氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBE-9007，信越化學工業(株)社制)、異丙醇、雙丙甘醇。
(5)探針介質的調制準備將上述(1)中序列號1的單鏈DNA探針分注成18nmol并進行干燥得到的樣品，在其中滴加20μl的純水，使其溶解。在溶解了探針的探針水溶液中滴加并混合20μl使探針在有機溶劑中可溶化的物質即十六烷基三甲基溴化銨的約65mmol/l水溶液。由此使DNA探針從水溶液中析出，探針介質成為白色混濁。將DNA探針離心沉淀后，滴加30μl上述探針固定物質。充分攪拌、混合后，靜置30分鐘。
然后，將作為有機溶劑的雙丙甘醇、異丙醇分別滴加500μl、1000μl，混合5分鐘。
然后，將作為水溶性高分子材料的聚乙烯醇(PVA)溶解在純水中得到濃度0.5質量％的溶液。為了使其完全溶解，在熱水浴中邊加熱至80℃，邊攪拌60分鐘。在確認無不溶物后，為了在點樣時不發生噴嘴堵塞而進行過濾，調制PVA水溶液。
在如上所述調制成的探針溶液中，滴加50μl如上所述調制成的PVA水溶液。最后，滴加純水至探針介質總量為2ml，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，調制探針介質。
(6)基板洗滌用純水沖洗1英寸×3英寸的二氧化硅涂層的鈉鈣玻璃基板(厚度約1.1mm)，除去表面上附著的異物。使用UV/O3洗滌裝置對此基板進行5分鐘處理，除去表面上附著的有機物。將經UV/O3洗滌的基板放入盒內，邊浸漬在無機堿性洗滌劑(商品名SEMICLN KG，橫濱油脂工業(株)社)的5vol％水溶液中，邊照射5分鐘超聲波。接下來，將盒與基板一同在純水流中充分沖洗，將附著在基板與盒上的洗滌劑水洗除去。充分沖洗后，將盒與玻璃基板一同浸漬在純水中，進行5分鐘超聲波洗滌。超聲波洗滌后，在純水流中充分沖洗，將附著在玻璃基板及盒上的微粒水洗并除去。對水洗后的玻璃基板按每盒進行旋轉干燥。為了確認基板是否洗凈，測定基板上的純水接觸角。結果為基板的所有部位均處于展開(spread)狀態。
(7)探針介質的點樣使用噴墨裝置，在基材上對在上述(5)中調制成的探針介質進行點樣。對于噴墨頭而言，使用壓電頭。在壓電頭內填充探針介質，在上述(6)中準備的玻璃基板上點樣探針介質。此處，壓電噴墨頭的液體噴出面與玻璃基板的液體附著面間的距離約為0.5mm。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板時，確認玻璃基板表面上形成矩陣狀的點序列。將點樣結束后的玻璃基板在加熱至80℃的熱板上靜置5分鐘。將經熱板處理的基板保存在干燥器中。由此制成探針固定基材(探針陣列)。
(8)雜交處理用DNA自動合成機合成具有與上述(1)中序列號1的單鏈DNA探針互補的堿基序列的單鏈DNA探針，使羅丹明結合在5’末端，得到標記化的單鏈DNA探針。將此標記化的單鏈DNA溶解在1MNaCl/50mM磷酸緩沖溶液(pH7.0)中，使其最終濃度為50nM，將上述(7)中獲得的探針固定基材浸漬在此溶液中，室溫(45℃)下進行2小時的雜交處理。然后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖溶液(pH7.0)洗滌探針陣列，洗去未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去剩余的鹽分，吹入氮氣使探針陣列干燥。然后，使用熒光掃描儀(商品名Gene Pix 4000B，Axon Instruments，Inc.制)評價此探針陣列上點的熒光強度。評價時，將激光強度設定為100％，將PMT設定為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描評價結果時，對于與標記化的單鏈DNA探針完全匹配的序列號1的DNA探針的點而言，532nm處熒光強度高的部位的輝度為5531。點在532nm處的熒光強度積分值為6593912。另外，DNA探針的點部分之外的熒光強度觀察結果為40左右。在用熒光觀察各DNA探針的點的狀態下，各點的形狀大致為圓形，在點樣相同的探針介質得到的點間，幾乎確認不到熒光強度的差異。另外，可以觀察到相鄰點的間隔大致均等，并且點以約300μm的間隔配置成格子狀。
(實施例2)(1)探針的合成與實施例1完全相同地準備單鏈DNA探針后，將其用于如下試驗中。
(2)探針溶劑與實施例1完全相同地使用水作為探針可溶的溶劑。
(3)探針可溶化物質作為使探針在有機溶劑中可溶化的物質，使用十六烷基三甲基氯化銨(正十六烷基三甲基氯化銨)。為了得到十六烷基三甲基氯化銨完全溶解的水溶液，在50℃的水浴中邊加熱，邊使其溶解。
(4)探針不溶的溶劑與實施例1完全相同地準備異氰酸酯硅烷偶聯劑、異丙醇、雙丙甘醇作為探針不溶的有機溶劑后，將其用于下述試驗。
(5)探針介質的調制準備將序列號1的單鏈DNA探針分注成18nmol并進行干燥得到的樣品，在其中滴加20μl純水，使其溶解。在溶解了探針的探針水溶液中滴加并混合20μl使探針在有機溶劑中可溶化的物質即十六烷基三甲基氯化銨的約163mmol/l水溶液。由此使DNA探針從水溶液中析出，探針介質成為白色混濁。將DNA探針離心沉淀后，滴加30μl上述探針固定物質。充分攪拌、混合后，靜置60分鐘。
然后，將作為有機溶劑的雙丙甘醇、異丙醇分別滴加500μl、1000μl，混合5分鐘。
然后，與實施例1完全相同地調制PVA溶液。在如上所述調制的探針溶液中，滴加50μl如上所述調制的PVA水溶液。最后，滴加純水至探針介質總量為2ml，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，調制探針介質。
(6)基板洗滌與實施例1完全相同地進行基板洗滌，準備玻璃基板。
(7)探針介質的點樣使用在上述(5)中調制成的探針介質，與實施例1完全相同地進行點樣，制成探針固定基材。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板時，確認玻璃基板表面上形成矩陣狀的點陣列。將點樣結束后的玻璃基板在加熱至80℃的熱板上靜置5分鐘。將經熱板處理的基板保存在干燥器中。由此制成探針固定基材(探針陣列)。
(8)雜交處理與實施例1完全相同地進行雜交處理。然后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖溶液(pH7.0)洗滌探針陣列，洗去未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去剩余的鹽分，吹入氮氣使探針陣列干燥。然后，使用熒光掃描儀(商品名Gene Pix 4000B，AxonInstruments，Inc.制)評價此探針陣列上點的熒光強度。評價時，將激光強度設定為100％，將PMT設定為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描評價結果時，對于與標記化的單鏈DNA探針完全匹配的序列號1的DNA探針的點而言，532nm處熒光強度高的部位的輝度為5836。點在532nm處的熒光強度積分值為6377211。另外，DNA探針的點部分之外的熒光強度觀察結果為50左右。在用熒光觀察各DNA探針的點的狀態下，各點的形狀大致為圓形，在點樣相同的探針介質的點間，幾乎確認不到熒光強度的差異。另外，可以觀察到相鄰點的間隔大致均等，并且點以約300μm的間隔配置成格子狀。
(實施例3)(1)探針的合成與實施例1完全相同地準備單鏈DNA探針后，將其用于如下試驗中。
(2)探針溶劑與實施例1完全相同地使用水作為探針可溶的溶劑。
(3)探針可溶化物質作為使探針在有機溶劑中可溶化的物質，使用十六烷基氯化吡啶鎓(十六烷基吡啶鎓氯化物)。為了得到十六烷基氯化吡啶鎓完全溶解的水溶液，邊充分攪拌，使其溶解。
(4)探針不溶的溶劑作為探針不溶的有機溶劑，在下述試驗中使用含有具有異氰酸酯基的硅烷化合物(γ-異氰酸根合丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名Y-5187，日本UNICAR(株)社制)、異丙醇、雙丙甘醇。
(5)探針介質的調制準備將實施例1(1)中序列號1的單鏈DNA探針分注成18nmol并進行干燥得到的樣品，在其中滴加20μl作為探針溶劑的純水，使探針溶解。充分攪拌至無溶解殘留物，利用離心沉淀將溶液集中在容器底部。在溶解了探針的探針溶液中滴加5μl使探針在有機溶劑中可溶化的物質即十六烷基氯化吡啶鎓的約65mmol/l水溶液，進行混合。由此使DNA探針從水溶液中析出，探針介質成為白色混濁。利用離心沉淀將DNA探針從溶液中分離后，僅滴加5μl上述探針不溶的溶劑中的硅烷偶聯劑。輕輕地攪拌并混合后，靜置60分鐘。
然后，將作為有機溶劑的雙丙甘醇、異丙醇分別滴加500μl、1000μl，混合5分鐘。
然后，將作為水溶性高分子材料的聚乙烯醇(PVA)溶解在純水中，使其濃度為0.5質量％。為了使其完全溶解，在熱水浴中邊加熱至80℃，邊攪拌60分鐘。在確認無不溶物后，為了在點樣中不發生噴嘴堵塞而進行過濾，調制PVA水溶液。
在如上所述調制成的探針溶液中，滴加50μl如上所述調制成的PVA水溶液。最后，滴加純水至探針介質總量為2ml，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，調制探針介質。
(6)基板洗滌用純水沖洗1英寸×3英寸的二氧化硅涂層的鈉鈣玻璃基板(厚度約1.1mm)，除去表面附著的異物。使用UV/O3洗滌裝置對此基板進行5分鐘處理，除去表面附著的有機物。將經UV/O3洗滌的基板放入盒內，邊浸漬在無機堿性洗滌劑(商品名SEMICLN KG，橫濱油脂工業(株)社)的5vol％水溶液中，邊照射5分鐘超聲波。接下來用純水流充分沖洗盒及玻璃基板，將附著在玻璃基板及盒上的洗滌劑水洗并除去。充分沖洗后，將盒與玻璃基板一同浸漬在純水中，進行5分鐘超聲波洗滌。超聲波洗滌后，在純水流中充分沖洗，將附著在玻璃基板及盒上的微粒水洗并除去。對水洗后的玻璃基板按每盒進行旋轉干燥。為了確認基板是否洗凈，測定基板上的純水接觸角。結果為基板的所有部位均處于展開狀態。
(7)探針介質的點樣使用噴墨裝置，在基材上對在上述(5)中調制成的探針介質進行點樣。對于噴墨頭而言，使用壓電頭。在壓電頭內填充探針介質，在上述(5)中準備的玻璃基板上點樣探針介質。此處，壓電噴墨頭的液體噴出面與玻璃基板的液體附著面間的距離約為0.5mm。點樣結束后，用放大鏡觀察玻璃基板時，確認玻璃基板表面上形成矩陣狀的點陣列。將點樣結束后的玻璃基板在加熱至80℃的熱板上靜置5分鐘。將經熱板處理的基板保存在干燥器中。由此制成探針固定基材(探針陣列)。
(8)雜交處理用DNA自動合成機合成具有與上述(1)中序列號1的單鏈DNA探針互補的堿基序列的單鏈DNA探針，使羅丹明結合在5’末端，得到標記化的單鏈DNA探針。將此標記化的單鏈DNA溶解在1MNaCl/50mM磷酸緩沖溶液(pH7.0)中，使其最終濃度為50nM，將上述(7)中獲得的探針固定基材浸漬在此溶液中，室溫(45℃)下進行2小時的雜交處理。然后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖溶液(pH7.0)洗滌探針陣列，洗去未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去剩余的鹽分，吹入氮氣使探針陣列干燥。然后，使用熒光掃描儀(商品名Gene Pix 4000B，Axon Instruments，Inc.制)評價此探針陣列上點的熒光強度。評價時，將激光強度設定為100％，將PMT設定為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描評價結果時，對于與標記化的單鏈DNA探針完全匹配的序列號1的DNA探針的點而言，532nm處熒光強度高的部位的輝度為22180。另外，DNA探針的點部分之外的熒光強度觀察結果為45左右。在用熒光觀察各DNA探針的點的狀態下，各點的形狀大致為圓形，在點樣相同的探針介質的點間，幾乎確認不到熒光強度的差異。另外，可以觀察到相鄰點的間隔大致均等，點以約300μm的間隔配置成格子狀。
(實施例4)(1)探針的合成與實施例1完全相同地準備單鏈DNA探針后，將其用于如下試驗中。
(2)探針溶劑與實施例1完全相同地使用水作為探針可溶的溶劑。
(3)探針可溶化物質與實施例3完全同樣地調制將使探針在有機溶劑中可溶化的物質溶解在純水中得到的溶液，將此溶液用于如下試驗。
(4)探針不溶的溶劑作為探針不溶的有機溶劑，與實施例3完全同樣地在下述試驗中使用含有具有異氰酸酯基的硅烷化合物(γ-異氰酸根合丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑、異丙醇、雙丙甘醇。
(5)探針介質的調制準備將序列號1的單鏈DNA探針分注成18nmol并進行干燥得到的樣品，在其中滴加20μl純水，使其溶解。在溶解了探針的探針水溶液中滴加10μl使探針在有機溶劑中可溶化的物質即十六烷基氯化吡啶鎓的約65mmol/l水溶液，進行混合。由此使DNA探針從水溶液中析出，探針介質成為白色混濁。將DNA探針離心沉淀后，僅滴加5μl上述探針不溶的溶劑中的硅烷偶聯劑。充分攪拌、混合后，靜置60分鐘。
然后，將作為有機溶劑的雙丙甘醇、異丙醇分別滴加500μl、1000μl，攪拌混合5分鐘。
然后，與實施例1完全同樣地調制PVA水溶液。在如上所述調制成的探針溶液中，滴加50μl如上所述調制成的PVA水溶液。最后，滴加純水至探針介質總量為2ml，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，調制探針介質。
(6)基板洗滌與實施例1完全同樣地進行基板洗滌，準備玻璃基板。
(7)探針介質的點樣使用在上述(5)中調制成的探針介質，與實施例1完全同樣地進行點樣，制成探針固定基材。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板時，確認玻璃基板表面上形成矩陣狀的點陣列。將點樣結束后的玻璃基板在加熱至80℃的熱板上靜置5分鐘。將經熱板處理的基板保存在干燥器中。由此制成探針固定基材(探針陣列)。
(8)雜交處理與實施例1完全同樣地進行雜交處理。然后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖溶液(pH7.0)洗滌探針陣列，洗去未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去剩余的鹽分，吹入氮氣使探針陣列干燥。然后，使用熒光掃描儀(商品名Gene Pix 4000B，AxonInstruments，Inc.制)評價此探針陣列的點所發出熒光的熒光強度。評價時，將激光強度設定為100％，將PMT設定為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描評價結果時，對于與標記化的單鏈DNA探針完全匹配的序列號1的DNA探針的點而言，532nm處熒光強度高的部位的輝度為19570。另外，DNA探針的點部分之外的熒光強度觀察結果為45左右。在用熒光觀察各DNA探針的點的狀態下，各點的形狀大致為圓形，在點樣相同的探針介質的點間，幾乎確認不到熒光強度的差異。另外，可以觀察到相鄰點的間隔大致均等，點以約300μm的間隔配置成格子狀。
(實施例5)(1)探針的合成與實施例1完全相同地準備單鏈DNA探針后，將其用于如下試驗中。
(2)探針溶劑與實施例1完全相同地使用水作為探針可溶的溶劑。
(3)探針可溶化物質與實施例3完全同樣地調制將使探針在有機溶劑中可溶化的物質溶解在純水中得到的溶液，將此溶液用于如下試驗。
(4)探針不溶的溶劑作為探針不溶的有機溶劑，與實施例3完全同樣地在下述試驗中使用含有具有異氰酸酯基的硅烷化合物(γ-異氰酸根合丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名Y-5187，日本UNICAR(株)社制)、異丙醇、雙丙甘醇。
(5)探針介質的調制準備將序列號1的單鏈DNA探針分注成18nmol并進行干燥得到的樣品，在其中滴加20μl純水，使其溶解。在溶解了探針的探針水溶液中滴加并混合20μl使探針在有機溶劑中可溶化的物質即十六烷基氯化吡啶鎓的約65mmol/l水溶液。在混合使探針在有機溶劑中可溶化的物質的同時，滴加20μl使探針介質成為白色混濁的物質，不發生因混合而再次出現的白色混濁，僅能確認極微量的白色混濁。將DNA探針離心沉淀，取出上清液后，僅滴加5μl上述探針不溶的溶劑中的硅烷偶聯劑。充分攪拌、混合后，靜置60分鐘。
然后，將作為有機溶劑的雙丙甘醇、異丙醇分別滴加500μl、1000μl，混合5分鐘。
然后，與實施例1完全同樣地調制PVA水溶液。在如上所述調制成的探針溶液中，滴加50μl如上所述調制成的PVA水溶液。最后，滴加純水至探針介質總量為2ml，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，調制探針介質。
(6)基板洗滌與實施例1完全同樣地進行基板洗滌，準備玻璃基板。
(7)探針介質的點樣使用在上述(4)中調制成的探針介質，與實施例1完全同樣地進行點樣，制成探針固定基材。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板時，確認玻璃基板表面上形成矩陣狀的點陣列。將點樣結束后的玻璃基板在加熱至80℃的熱板上靜置5分鐘。將經熱板處理的基板保存在干燥器中。由此制成探針固定基材(探針陣列)。
(8)雜交處理與實施例1完全同樣地進行雜交處理。然后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖溶液(pH7.0)洗滌探針陣列，洗去未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去剩余的鹽分，吹入氮氣使探針陣列干燥。然后，使用熒光掃描儀(商品名Gene Pix 4000B，AxonInstruments，Inc.制)評價此探針陣列的點所發出熒光的熒光強度。評價時，將激光強度設定為100％，將PMT設定為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描評價結果時，對于與標記化的單鏈DNA探針完全匹配的序列號1的DNA探針的點而言，532nm處熒光強度高的部位的輝度為7322。另外，DNA探針的點部分之外的熒光強度觀察結果為45左右。在用熒光觀察各DNA探針的點的狀態下，各點的形狀大致為圓形，與各實施例相比，點的輪廓部分模糊，難以識別，點的大小變為約1/2左右的大小。在點樣相同的探針介質的點間，幾乎確認不到熒光強度的差異。另外，可以觀察到相鄰點的間隔大致均等，點以約300μm的間隔配置成格子狀。
(實施例6)(1)探針的合成與實施例1完全相同地準備單鏈DNA探針后，將其用于如下試驗中。
(2)探針溶劑與實施例1完全相同地使用水作為探針可溶的溶劑。
(3)探針可溶化物質與實施例3完全同樣地調制將使探針在有機溶劑中可溶化的物質溶解在純水中得到的溶液，將此溶液用于如下試驗。
(4)探針不溶的溶劑作為探針不溶的有機溶劑，與實施例3完全同樣地在下述試驗中使用含有具有異氰酸酯基的硅烷化合物(γ-異氰酸根合丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名Y-5187，日本UNICAR(株)社制)、異丙醇、雙丙甘醇。
(5)探針介質的調制準備將序列號1的單鏈DNA探針分注成18nmol并進行干燥得到的樣品，在其中滴加并混合20μl純水，使其溶解。在溶解了探針的探針水溶液中滴加2.5μl使探針在有機溶劑中可溶化的物質即十六烷基氯化吡啶鎓的約65mmol/l水溶液。伴隨混合使探針在有機溶劑中可溶化的物質，探針介質出現少量白色混濁。將DNA探針離心沉淀，除去上清液后，僅滴加5μl上述探針不溶的溶劑中的硅烷偶聯劑。充分攪拌、混合后，靜置60分鐘。
然后，將作為有機溶劑的雙丙甘醇、異丙醇分別滴加500μl、1000μl，混合5分鐘。
然后，與實施例1完全同樣地調制PVA水溶液。在如上所述調制成的探針溶液中，滴加50μl如上所述調制成的PVA水溶液。最后，滴加純水至探針介質總量為2ml，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，調制探針介質。
(6)基板洗滌與實施例1完全同樣地進行基板洗滌，準備玻璃基板。
(7)探針介質的點樣使用在上述(4)中調制成的探針介質，與實施例1完全同樣地進行點樣，制成探針固定基材。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板時，確認玻璃基板表面上形成矩陣狀的點陣列。將點樣結束后的玻璃基板在加熱至80℃的熱板上靜置5分鐘。將經熱板處理的基板保存在干燥器中。由此制成探針固定基材(探針陣列)。
(8)雜交處理與實施例1完全同樣地進行雜交處理。然后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖溶液(pH7.0)洗滌探針陣列，洗去未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去剩余的鹽分，吹入氮氣使探針陣列干燥。然后，使用熒光掃描儀(商品名Gene Pix 4000B，AxonInstruments，Inc.制)評價此探針陣列的點所發出熒光的熒光強度。評價時，將激光強度設定為100％，將PMT設定為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描評價結果時，對于與標記化的單鏈DNA探針完全匹配的序列號1的DNA探針的點而言，532nm處熒光強度高的部位的輝度為8976。另外，DNA探針的點部分之外的熒光強度觀察結果為45左右。在用熒光觀察各DNA探針的點的狀態下，各點的形狀大致為圓形，與各實施例相比，點的輪廓部分模糊，難以識別，點的大小變為約1/2左右的大小。在點樣相同的探針介質的點間，幾乎確認不到熒光強度的差異。另外，可以觀察到相鄰點的間隔大致均等，點以約300μm的間隔配置成格子狀。
(比較例1)(1)探針的合成與實施例1完全相同地準備單鏈DNA探針后，將其用于如下試驗中。
(2)探針可溶化物質在下述試驗中不使用上述實施例1及2中使用的使探針在有機溶劑中可溶化的物質。
(3)探針固定物質與實施例1完全同樣地準備作為探針固定物質的異氰酸酯硅烷偶聯劑后，將其用于如下試驗。
(4)探針介質的調制準備將序列號1的單鏈DNA探針分注成18nmol并進行干燥得到的樣品，在其中滴加20μl純水，使其溶解。在溶解了探針的探針水溶液中滴加30μl上述探針固定物質。充分攪拌并混合后，靜置60分鐘。
然后，將作為有機溶劑的雙丙甘醇、異丙醇分別滴加500μl、1000μl，混合5分鐘。
然后，與實施例1完全同樣地調制PVA水溶液。在如上所述調制成的探針溶液中，滴加50μl如上所述調制成的PVA水溶液。最后，滴加純水至探針介質總量為2ml，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，調制成探針介質。
(5)基板洗滌與實施例1完全同樣地進行基板洗滌，準備玻璃基板。
(6)探針介質的點樣使用在上述(4)中調制成的探針介質，與實施例1完全同樣地進行點樣，制成探針固定基材。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板時，確認玻璃基板表面上形成矩陣狀的點陣列。將點樣結束后的玻璃基板在加熱至80℃的熱板上靜置5分鐘。將經熱板處理的基板保存在干燥器中。由此制成探針固定基材(探針排列)。
(7)雜交處理與實施例1完全同樣地進行雜交處理。然后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖溶液(pH7.0)洗滌探針陣列，洗去未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去剩余的鹽分，吹入氮氣使探針陣列干燥。然后，使用熒光掃描儀(商品名Gene Pix 4000B，AxonInstruments，Inc.制)評價此探針陣列的點所發出熒光的熒光強度。評價時，將激光強度設定為100％，將PMT設定為400V。
(8)結果解析上述(7)中的熒光掃描評價結果時，對于與標記化的單鏈DNA探針完全匹配的序列號1的DNA探針的點而言，532nm處熒光強度高的部位的輝度為5744。點在532nm處的熒光強度積分值為419192。另外，DNA探針的點部分之外的熒光強度觀察結果為40左右。在用熒光觀察各DNA探針的點的狀態下，各點的形狀大致為圓形，與各實施例相比，點的大小縮小至1/4左右。在點樣相同的探針介質的點間，幾乎確認不到熒光強度的差異。另外，可以觀察到相鄰點的間隔大致均等，點以約300μm的間隔配置成格子狀。
序列表<110>佳能株式會社<120>探針介質及其制造方法<130>CFO17889CN<150>JP2003-031670<151>2003-02-07<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA探針<400>1<>actggccgtc gttttaca 18
權利要求
1.一種探針介質，其中含有能夠特異性結合目標物質的探針、含有有機溶劑的介質和使所述探針在有機溶劑中可溶化的物質。
2.如權利要求1所述的探針介質，其中，所述探針為核酸探針。
3.如權利要求1所述的探針介質，其中，所述有機溶劑為所述探針不溶的溶劑。
4.如權利要求1所述的探針介質，其中，使所述探針在有機溶劑中可溶化的物質為兩親性物質。
5.如權利要求4所述的探針介質，其特征在于，使所述探針在有機溶劑中可溶化的物質為正十六烷基三甲基溴化銨，正十六烷基三甲基氯化銨，十六烷基氯化吡啶鎓中的任一種物質，或至少含有其中任一種的混合物。
6.如權利要求1所述的探針介質，其中，所述探針介質還含有用于將所述探針固定在基材上的物質。
7.如權利要求6所述的探針介質，其中，用于將所述探針固定在基材上的物質為硅烷偶聯劑。
8.如權利要求1所述的探針介質，其中，所述探針介質還含有所述探針可溶的溶劑。
9.如權利要求1所述的探針介質，其中，使所述探針在有機溶劑中可溶化的物質的量被調制在確認上述探針介質出現白色混濁的范圍內。
10.一種制造含有能夠特異性結合目標物質的探針的探針介質的方法，其特征在于，所述方法具有如下步驟使所述探針溶解在所述探針可溶的溶劑中的步驟；利用使所述探針在有機溶劑中可溶化的物質與所述溶劑的作用將所述探針從所述溶劑中分離的步驟；和通過添加有機溶劑使所述探針溶解在有機溶劑中的步驟。
11.如權利要求10所述的制造方法，其中，基于所述探針的長度與所述探針摩爾數的乘積，調整使所述探針在有機溶劑中可溶化的物質的量。
12.如權利要求10所述的探針介質制造方法，其中，基于所述探針從溶劑中分離的量，調整使所述探針在有機溶劑中可溶化的物質的量。
13.一種探針固定方法，是通過將如權利要求1所述的探針介質利用斑點法賦予到基材上而將探針固定在基材上的方法。
14.一種檢測元件，是利用如權利要求13所述的探針固定方法制成的檢測元件。
全文摘要
在將探針介質點樣在基材上時，使探針有效率且穩定地固定在基材上。一種探針介質，所述探針介質具有能夠特異性結合目標物質的探針、含有有機溶劑的介質和使所述探針在有機溶劑中可溶化的物質。
文檔編號C12Q1/68GK1519381SQ20041000312
公開日2004年8月11日 申請日期2004年2月6日 優先權日2003年2月7日
發明者岡田良克 申請人:佳能株式會社