專利名稱：：低氧誘導微生物表達載體及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及基因工程領域中一種低氧誘導微生物表達載體及其構建方法與應用。
背景技術：
：大腸桿菌外源基因表達系統廣泛應用于真核與原核蛋白的表達，是動植物生長因子、基因工程藥物、疫苗等生物轉化技術產品研究開發的關鍵技術之一。但這些微生物培養過程中，尤其是大規模生產和高密度發酵都遇到了不可避免的一些矛盾生產菌株對氧的需求量和發酵設備的供養能力，連續發酵和質粒不穩定遺傳，目的蛋白表達條件和發酵成本等。含有天然質粒的細胞是長期自然選擇的結果，這些包含在細菌體內的自然質粒一般都能穩定地傳給子代，從而保持種群中質粒的穩定性，自然丟失率很低。其原因主要在于這些質粒帶有很多控制因子。對低拷貝數質粒而言，有二個主要的控制因子，一個是par位點，具有控制質粒分離的功能，能協調細胞分裂與質粒復制，以保證每個細胞至少獲得一個拷貝；二是“抑制細胞分裂系統”(Controlofcelldivision，簡稱ccd)，這個系統可以使沒有獲得質粒的子代細胞的分裂受到抑制，從而保證含有質粒的細胞在細胞群體中處于優勢地位。對高拷貝數質粒而言，主要是通過多拷貝的隨機分配，保證子細胞獲得質粒，但高拷貝數質粒往往會聚合成多聚體，影響分配，因此許多高拷貝的自然質粒往往還有多聚體解離系統(multimerresolutionsystem)，使質粒在分配之前分解成單體，以保證每個子細胞都能獲得質粒，從而實現質粒的穩定遺傳(毛牧靈，LassanaTB，沈萍，彭珍榮。含par位點的重組質粒pSJM3的構建及其穩定性研究。生物工程學報，1998，14(1)64-69)。質粒pSC101的par位點是一個大小為300bp的順式作用位點，能和細胞內的某些因子以特定方式結合并把質粒在細胞分裂時平均分配到子細胞中，起到穩定質粒的作用(MeacockPA，CohenSN.Partitioningofbacteriaplasmidduringcelldivisionacis-actinglocusthataccomplishesstableplasmidinheritance.Cell，1980，20529-542)。該位點在不同的質粒中，例如pACYC184，R1，oriC，miniF，p15A，RK2等，也有穩定質粒遺傳的作用(ConleyDL，CohenSN.IsolationandcharacterizationofplasmidmutationsthatenablepartitioningofpSC101repliconslackingthepartition(par)locus.J.Bacteriol，1995，1771086-1089)。將par位點插入質粒pBR327(質粒pBR322的衍生物帶有ColE1復制起始位點)，得到的質粒pBR327par的穩定性大為提高(ZuritaM，BolivarF，SoberonX.ConstructionofplasmidpBR327par，acompletelysequenced，stablederivativeofpBR327containingtheparlocusofpSC101.Gene，1984，28119-122)。然而par位點對于質粒的不相容性也有作用(MillerCA，CohenSN.Thepartition(par)locusofpSC101isanenhancerofplasmidincompatibility.MolMicrobiol，1993，9695-702)。細菌Vitreoscilla(透明顫菌)是嚴格好氧的，但多生長在貧氧環境中，這是因為它能合成一種可溶性的血紅素蛋白(Vitreoscillahemoglobin，VHb)(DikshitKL，WebsterDA.Cloning，characterizationandexpressionofthebacteriaglobingenefromVitreoscillainEscherichiacoli.Gene，1988，70377-386)以適應貧氧環境，編碼該蛋白的基因即為透明顫菌血紅蛋白基因(Vitreoscillahemoglobingene，vgb)(FishPA，WebsterDA，StarkBC.Vitreoscillahemoglobinenhancesthefirststepin2，4-dinitroluenedegradationinvitroandatlowaerationinvivo，JournalofMolecularCatalysisBEnzymatic，2000，975-82)。VHb以氧合態參與和氧有關的代謝，通過將氧傳遞給呼吸鏈，來調節末端氧化酶的活性，改變氧化磷酸化的效率，進而改變低氧條件下的代謝途徑，以至影響到某些基因的表達。它能夠從分子水平上提高重組菌對氧氣的利用能力(JacobsenJR，KhoslaC.Newdirectionsinmetabolicengineering.CurrentOpinioninChemicalBiology1998，2133-137)。一些文獻報導了vgb基因的應用實例，表明它具有促進細胞生長，提高細胞培養密度和外源基因表達的作用。如vgb基因在金色鏈霉菌中的表達可將產物合成提高40％-60％(孟春，葉勤，石賢愛，邱荔，宋思揚，郭養浩。透明顫菌血紅蛋白基因在金色鏈霉菌中的克隆與表達。微生物學報，2002，42(3)305-310)；vgb基因在鏈霉菌(Stretomyceslividans)中的表達可促進菌體生長(朱怡非，朱春寶，朱寶泉。透明顫菌血紅蛋白基因在鏈霉菌中的克隆與表達。中國醫藥工業雜志，1998，29(6)253-258)；vgb基因在生產聚羥基丁酸[poly(β-hydroxybutyrate)，PHB]的重組大腸桿菌E.coli中表達，有效的提高了細胞生長密度和PHB的產量(YuHM，ShiY，ZhangYP，YangSL，ShenZY.EffectofVitreoscillahemoglobinbiosynthesisinEscherichiacolionproductionofpoly(β-hydroxybutyrate)andfermentativeparameters.FEMSMicrobiologyLetters，2002，214223-227)等。目前已有多種不同調控模式的大腸桿菌外源基因表達載體，包括(1)基于來源于lac操縱子的啟動子的表達系統，啟動子tac、trc和lac受到乳糖及其類似物誘導調控；(2)受T7噬菌體RNA聚合酶調控的表達系統，例如在pET系列載體中，利用天然T7RNA聚合酶啟動子或者所謂的T7lac啟動子的控制，lac阻抑物的結合能阻斷轉錄起始；(3)帶有λ噬菌體PL啟動子的調控系統，由于該啟動子受溫度敏感性阻遏物cIts857調控，所以在高溫時可以起始轉錄，對于表達對大腸桿菌有毒的產物非常有用。在產業化生產中，對外源基因表達調控模式的選擇是十分重要的。化學誘導模式由于誘導劑的加入將導致生產成本大大上升。溫度調控模式在大體積發酵罐中使用時，會因為發酵罐升溫緩慢，而導致調控不夠靈敏。相比之下溶氧濃度調控模式更適合于生產過程。VHb及其啟動子已經在大腸桿菌中成功表達(DikshitKL，WebsterDA.Cloning，characterizationandexpressionofthebacteriaglobingenefromVitreoscillainEscherichiacoli.Gene，1988，70377-386)。在大腸桿菌中，可以有效起始VHb蛋白以及其他外源基因的表達(DikshitKL，DikshitRP，WebsterDA.StudyofVitreoscillaglobin(vgb)geneexpressionandpromoteractivityinE.colithroughtranscriptionalfusion.NucleicAcidsRes，1990，184149-4155)。當環境溶氧降至5％-2％飽和氧濃度時，vgb啟動子的起始轉錄能力可以被絕大部分激活(KhoslaC，BaileyJE.CharacterizationoftheoxygendependentpromoteroftheVitreoscillahemoglobingeneinEscherichia.coli.J.Bacteriol，1989，1715990-6004)。在大腸桿菌中vgb啟動子的全力誘導下，β-半乳糖苷酶的表達可以達到整個細胞總量的10％(KhoslaC，CurtisJE，BydalekP，SwartzJR，BaileyJE.ExpressionofrecombinantproteinsinEscherichia.coliusinganoxygen-responsivepromoter.Bio/Technology，1990，8554-558)。發明創造內容本發明的目的是提供一種低氧誘導微生物表達載體。本發明所提供的低氧誘導微生物表達載體，是含有vgb啟動子序列或大腸桿菌中受富馬酸鹽和硝酸鹽還原酶調解子FNR調控的nar啟動子序列的微生物質粒表達載體。為了增加低氧誘導效果，上述低氧誘導微生物表達載體還含有vgb操縱子序列或結核桿菌血紅蛋白基因操縱子序列。為了增加上述低氧誘導微生物表達載體的穩定性，所述低氧誘導微生物表達載體還含有下述序列之一par位點序列、來自質粒R100的pemK/pemI基因序列、來自質粒F的ccdA/ccdB基因序列、來自質粒R1的hok/sok基因序列或來自IncPα質粒RK2的parDE序列。其中，上述par位點序列可為來自質粒pSC101的par位點序列、來自質粒原噬菌體P1、P7的par位點序列或來自質粒pTAR的par位點序列，優選為來自質粒pSC101的par位點序列。上述微生物表達載體可為原核細胞表達載體和真核細胞表達載體。所述原核細胞表達載體為可在大腸桿菌或芽孢桿菌中表達的載體；所述真核細胞表達載體為可在酵母中表達的載體。上述低氧誘導微生物表達載體優選為低氧誘導大腸桿菌表達載體pKVp，pKVpP，pKVpV，pKVpPV，pKVpPII，pKVpPIII，pKVpPIV、pKVpPVI或pKVpPVII。本發明的第二個目的是提供一種構建上述低氧誘導微生物表達載體的方法。本發明所提供的構建上述低氧誘導微生物表達載體的方法，是將vgb啟動子序列或大腸桿菌中受富馬酸鹽和硝酸鹽還原酶調解子FNR調控的nar啟動子序列連接入微生物質粒表達載體的多克隆位點，得到低氧誘導微生物表達載體。上述vgb啟動子序列或大腸桿菌中受富馬酸鹽和硝酸鹽還原酶調解子FNR調控的nar啟動子序列可由常規PCR擴增得到。在本發明中，透明顫菌血紅蛋白基因vgb操縱子表達的透明顫菌血紅蛋白VHb可改善細胞生長情況，提高外源目的蛋白的表達量和活性；vgb啟動子Pvgb可在低溶氧環境條件下，誘導下游基因轉錄表達；par位點可在有或沒有抗生素加入的微生物培養基的中，保持表達載體的穩定遺傳；vgb啟動子Pvgb也可用大腸桿菌中受富馬酸鹽和硝酸鹽還原酶調解子FNR調控在低溶氧下表達的啟動子來代替；來自質粒原噬菌體P1、P7的par位點、來自質粒pTAR的par位點、來自質粒R100的pemK和pemI基因、來自質粒F的ccdA和ccdB基因、來自質粒R1的hok和sok基因、來自IncPα質粒RK2的par操縱子(parDE)也可以保持表達表達載體的穩定遺傳。實驗證明，用本發明的低氧誘導大腸桿菌質粒表達載體進行發酵時，在低溶氧條件下，外源目的蛋白的表達活力明顯高于高溶氧條件；含有par位點的低氧誘導大腸桿菌質粒表達載體，在無抗生素加入的條件下，可以在大腸桿菌中穩定遺傳至少100代；含有vgb操縱子的低氧誘導大腸桿菌質粒表達載體，菌濃度以及目的外源蛋白甲苯雙加氧酶的活力有較大的提高。以包含tac啟動子和同類復制子的載體作為對照，pKVpP載體所能達到的最大綠色熒光蛋白活力大約是對照的1.7倍，從而在啟動子強度上要明顯高于此類啟動子。在綠色熒光蛋白及甲苯雙加氧酶活力檢測中可以發現，vgb啟動子的啟動明顯受環境溶氧的調節在高溶氧條件下，由其啟動的目的蛋白表達大約在對數后期；在低溶氧條件下，由其啟動的目的蛋白表達大約在對數前中期。由上可以得到在大腸桿菌中一種新的表達外源目的蛋白的調控方式在搖瓶培養中，通過調節搖床轉速及接種量，目的蛋白的表達可以在細胞生長對數期的任意階段被起始，在對數生長期大腸桿菌對于外部環境及自身變化的應變能力是較強的；在大規模發酵生產中，通過調節轉子的轉速、通入空氣或者氧氣的速度、起始接種量以及采用二次接種的方式，目的蛋白的表達可以在細胞生長對數期的任意階段被起始，如果通入一定量的純氧，目的蛋白的表達還可以在大腸桿菌生長的穩定期，這對于生產對宿主菌有一定毒害作用的蛋白或其產物有非常重要的應用價值。應用本發明低氧誘導微生物表達載體發酵，可以達到不需加入抗生素仍舊保持質粒穩定遺傳的效果；可以滿足細胞生長對高溶氧的需求，降低了對攪拌和通氣的要求；并且可以方便經濟地誘導外源目的蛋白的表達；具有廣闊的工業應用前景。圖1為質粒pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV構建過程示意2為質粒pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV的穩定性分析曲線圖3為質粒pKVp-E，pKVpP-E，pKVpV-E和pKVpPV-E的綠色熒光蛋白活性檢測柱狀4為質粒pKVp-E，pKVpP-E，pKVpV-E和pKVpPV-E的穩定性分析曲線圖5為質粒pKVp-T，pKVpP-T，pKVpV-T和pKVpPV-T甲苯雙加氧酶活性曲線圖6為質粒pKVpPV-TII的甲苯雙加氧酶活性曲線具體實施方式實施例1、低氧誘導大腸桿菌表達載體pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV的構建及其穩定性、透明顫菌血紅蛋白VHb表達檢測菌種大腸桿菌E.coliJM83培養基1為(g/l)蛋白胨10，酵母浸出物5，NaCl10，氨卞青霉素60μg/l。1、低氧誘導大腸桿菌表達載體pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV的構建低氧誘導大腸桿菌表達載體pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV的組成如表1所示，其構建過程如圖1所示，具體步驟如下表1大腸桿菌表達載體pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV的組成表達載體系統重要組成部分pKVpvgb啟動子pKVpPvgb啟動子，來自質粒pSC101的par位點pKVpVvgb啟動子，vgb操縱子pKVpPVvgb啟動子，來自質粒pSC101的par位點，vgb操縱子1)如圖1所示，在標準的聚合酶鏈反應條件下，以vgb基因的啟動子序列(KhoslaC，BaileyJE.CharacterizationoftheoxygendependentpromoteroftheVitreoscillahemoglobingeneinEscherichia.coli.J.Bacteriol，1989，1715990-6004)為模板，以Pvgb-upGCACATATG(NdeI)ACAGGACGCTGGGGTTAAAAG和Pvgb-doGGCGAATTC(EcoRI)GAGGGTCTTCCTTAAGTT為引物得到143bp的DNA擴增片斷，該片斷含有vgb基因的啟動子，用限制性內切酶EcoRI，NdeI酶切處理后，插入到質粒pKK223-3的EcoRI，NdeI位點之間，得到質粒pKVp。2)如圖1所示，在標準的聚合酶鏈反應條件下，以質粒pSC101中的par位點為模板(ZuritaM，BolivarF，SoberonX.ConstructionofplasmidpBR327par，acompletelysequenced，stablederivativeofpBR327containingtheparlocusofpSC101.Gene，1984，28119-122)，以par-upGTACATATG(NdeI)GACAGTAAGACGGGTAAGCC和par-doGACCATATG(NdeI)CGGGCAAATCGCTGAATATT為引物得到367bp的DNA擴增片斷，該片斷含有質粒pSC101的par位點，用限制性內切酶NdeI酶切處理后，插入到經過去磷酸化處理的質粒pKVp的NdeI位點，得到質粒pKVpP。3)如圖1所示，在標準的聚合酶鏈反應條件下，以vgb操縱子為模板(KoslaC，BaileyJE.TheVitreoscillahemoglobingenemolecularcloning，nucleotidesequenceandgeneticexpressioninEscherichiacoli.Mol.Gen.Genet，1988，214158-161)，以vgb-upGCACATATG(NdeI)ACAGGACGCTGGGGTTAA和vgb-doGCAATTAAT(AseI)GGTGAAGCGCAACGGGT為引物得到993bp的DNA擴增片斷，該片斷含有完整的vgb操縱子，用限制性內切酶AseI和NdeI酶切處理后，插入到經過去磷酸化處理的質粒pKVp的NdeI位點，得到質粒pKVpV。4)如圖1所示，在標準的聚合酶鏈反應條件下，以質粒pSC101中的par位點為模板(ZuritaM，BolivarF，SoberonX.ConstructionofplasmidpBR327par，acompletelysequenced，stablederivativeofpBR327containingtheparlocusofpSC101.Gene，1984，28119-122)，以par-upGTACATATG(NdeI)GACAGTAAGACGGGTAAGCC和par-doGACCATATG(NdeI)CGGGCAAATCGCTGAATATT為引物得到367bp的DNA擴增片斷，該片斷含質粒pSC101的par位點，用限制性內切酶NdeI酶切處理后，插入到經過去磷酸化處理的質粒pKVpV的NdeI位點，得到質粒pKVpPV。2、質粒穩定性實驗1)參照文獻(EasterCL，SobeckyPA，HelinskiDR.Contributionofdifferentsegmentoftheparregiontostablemaintenanceofthebroad-host-rangeplasmidRK2.J.Bacteriol，1997，1796472-6479)進行質粒穩定性實驗將步驟1中構建的4種表達載體按CaCl2處理法分別轉化大腸桿菌E.coliJM83，得到含有上述四種質粒的重組大腸桿菌，將含有上述四種質粒的重組大腸桿菌接種于液體培養基1中37℃培養12小時。部分培養液在預熱的培養基1中梯度稀釋106倍，然后接種到無抗生素的培養基1中，培養至對數中期。這一個循環，定義為大腸桿菌對數生長20代。如此培養直至重組菌對數生長100代。部分培養液適當稀釋后涂布LB平板。所得菌落利用影印平板到含有或者沒有抗生素的LB平板上培養16-20小時，來檢測保留質粒細胞在總細胞中所占的百分比。其中的培養條件設定為在250ml無擋板三角瓶中，加入50ml液體培養基，200轉每分鐘作為氧氣供應充分條件；在250ml無擋板三角瓶中，加入150ml液體培養基，100轉每分鐘作為氧氣供應貧乏條件。質粒穩定性檢測結果如圖2所示，A代表氧氣供應充分條件，B代表氧氣供應貧乏條件。圖2表明帶有質粒pSC101par位點的質粒pKVpP、pKVpPV，無論氧氣供應充分條件和氧氣供應貧乏條件下，經過100代時仍然保持近100％細胞包含有外源質粒。3、透明顫菌血紅蛋白VHb表達檢測參照文獻(DikshitKL，WebsterDA.Cloning，characterizationandexpressionofthebacteriaglobingenefromVitreoscillainEscherichiacoli.Gene，1988，70377-386)的方法檢測透明顫菌血紅蛋白VHb的表達將離心后的過夜培養物重懸于磷酸鹽緩沖液(100mmol/L，pH7.5)中，并分別加入過量的(0.1g/ml)Na2S2O3，進行還原處理。CO差光譜分析CO差光譜是VHb的CO絡合態與還原態光譜之差，在紫外分光光度計UV-8500的參比端和樣品端分別加入1ml經還原處理的樣品，在樣品端通入5minCO氣，再分光光度計下掃描400-460nm的差光譜。VHb濃度檢測結果表明在含有質粒pKVpV和pKVpPV的重組大腸桿菌E.coliJM83中，透明顫菌血紅蛋白濃度分別為65.55±3.56nmol/g和66.53±3.81nmol/g。其中，VHb的摩爾消光系數為定義c0為濕菌質量濃度(mg/ml)，cv為濕菌中所含VHb的量(nmol/g)，則有實施例2、利用低氧誘導大腸桿菌表達載體pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV表達綠色熒光蛋白菌種大腸桿菌E.coliJM83外源基因綠色熒光蛋白培養基1為(g/l)蛋白胨10，酵母浸出物5，NaCl10。氨卞青霉素60μg/l。1、以pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV為載體表達綠色熒光蛋白所需質粒的構建質粒pEGFP-N1含綠色熒光蛋白基因(egfp)。在標準的聚合酶鏈反應條件下，以質粒pEGFP-N1為模板(購自Clontech公司)，以eGFP-upGTAGAATTC(EcoRI)ATGGTGAGCAAGGGCGAGG和eGFP-doGACAAGCTT(HindIII)TTACTTGTACAGCTCGTCC為引物擴增得到717bp的綠色熒光蛋白DNA片斷，片斷兩端帶有EcoRI和BamHI酶切位點。將其插入到載體pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV相應的酶切位點處，構建出質粒pKVp-E，pKVpP-E，pKVpV-E和pKVpPV-E。2、綠色熒光蛋白活性檢測用Hitachi熒光分光光度計檢測單位OD600的熒光強度。將質粒pKVp-E，pKVpP-E，pKVpV-E和pKVpPV-E按CaCl2處理法分別轉化大腸桿菌E.coliJM83。包含有質粒pKVp-E，pKVpP-E，pKVpV-E和pKVpPV-E的E.coliJM83在氧氣供應充分條件和氧氣供應貧乏條件下培養，24小時時取樣檢測。以包含pKVp-E的大腸桿菌E.coliJM83在氧氣供應充分條件下，單位菌濃度OD600激發熒光強度作為相對熒光強度1。結果如圖3所示，表明在包含質粒pKVpP-E大腸桿菌E.coliJM83中，在氧氣供應貧乏條件下的單位菌濃度的綠色熒光蛋白活性最高。其中，培養條件設定為在250ml無擋板三角瓶中，加入50ml液體培養基，200轉每分鐘作為氧氣供應充分條件；在250ml無擋板三角瓶中，加入150ml液體培養基，100轉每分鐘作為氧氣供應貧乏條件。3、質粒穩定性實驗方法同實施例1中的步驟2。質粒穩定性檢測結果如圖4所示，A代表氧氣供應充分條件，B代表氧氣供應貧乏條件。圖4表明帶有par位點的質粒pKVpP-E、pKVpPV-E，無論氧氣供應充分條件和氧氣供應貧乏條件下，經過100代時仍然保持近100％細胞包含有外源質粒。其中，培養條件設定為在250ml無擋板三角瓶中，加入50ml液體培養基，200轉每分鐘作為氧氣供應充分條件；在250ml無擋板三角瓶中，加入150ml液體培養基，100轉每分鐘作為氧氣供應貧乏條件。實施例3、利用低氧誘導大腸桿菌表達載體pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV表達甲苯雙加氧酶所需質粒的構建及蛋白活性檢測菌種大腸桿菌E.coliJM83外源基因甲苯雙加氧酶培養基1為(g/l)蛋白胨10，酵母浸出物5，NaCl10。氨卞青霉素60μg/l。1、構建以pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV為載體表達甲苯雙加氧酶的質粒質粒pKST11含甲苯雙加氧酶基因(tod)。在標準的聚合酶鏈反應條件下，以質粒pKST11為模板(ZylstraGJ，GibsonDT.ToluenedegradationbyPseudomonasputidaF1nucleotidesequenceofthetodC1C2BADEgenesandtheirexpressioninEscherichiacoli.JBC，1989.26414940-14946.)，以TDO-upGACGAATTC(EcoRI)CTAATGAATCAGACCGACACATC和TDO-doGAOGGATOC(BamHI)TCACGTTAGGTCTCCTTCAT為引物擴增得到3.6Kb的甲苯雙加氧酶DNA片斷，片斷兩端帶有EcoRI和BamHI酶切位點。將其插入到載體pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV相應的酶切位點處，構建得到質粒pKVp-T，pKVpP-T，pKVpV-T和pKVpPV-T。2、甲苯雙加氧酶活性檢測參照文獻(WooHJ，SanseverinoJ，CoxCD，RobinsonKG，SaylerGS.ThemeasurementoftoluenedioxygenaseactivityinbiofilmcultureofPsedomonasputidaF1.JournalofMicrobiologicalMethods，2000，40181-191)的方法檢測雙加氧酶酶活在檢測過菌濃度后，1ml培養液立刻被轉移到離心管中。離心(14,000rpm離心1分鐘，在4℃)后，去上清，用pH值7.2的磷酸緩沖液重懸。加入25μl0.1M吲哚溶于二甲基甲酰胺的溶液。用分光光度計檢測OD600，未加入吲哚的樣品作為對照，確定靛藍的生成量。在開始半小時內靛藍的生成速度定義為重組菌的酶活力(靛藍mg/min)。將質粒pKVp-T，pKVpP-T，pKVpV-T和pKVpPV-T按CaCl2處理法分別轉化大腸桿菌E.coliJM83。包含有質粒pKVpP-T，和pKVpPV-T的大腸桿菌在氧氣供應充分條件和氧氣供應貧乏條件下培養，每隔2小時取樣檢測。結果如圖5所示，可見在包含質粒pKVpPV-T大腸桿菌中，單位菌濃度的甲苯雙加氧酶活性最高。圖5中，A代表氧氣供應充分條件，B代表氧氣供應貧乏條件。其中，培養條件設定為在250ml無擋板三角瓶中，加入50ml液體培養基，200轉每分鐘作為氧氣供應充分條件；在250ml無擋板三角瓶中，加入150ml液體培養基，100轉每分鐘作為氧氣供應貧乏條件。實施例4、vgb啟動子Pvgb與結核桿菌血紅蛋白操縱子序列組成低氧誘導表達載體及其檢測1、穩定遺傳的低氧誘導大腸桿菌表達載體pKVpPVII的構建1)在標準的聚合酶鏈反應條件下，以glb0操縱子為模板(CoutureM，YehSR，WittenbergBA，WittenbergJB，OuelletY，RousseauDL，GuertinM.Acooperativeoxygen-bindinghemoglobinfromMycobacteriumtuberculosis.ProcNatlAcadSciUSA.1999，9611223-8))，以glbO-upGCACATATG(NdeI)AGTAGGTTGAGGCCG和glbO-doGCAATTAAT(AseI)TGGCGAGAAAGGAAG為引物得到956bp的DNA擴增片斷，該片斷含有完整的glb0操縱子，用限制性內切酶AseI和NdeI酶切處理后，插入到經過去磷酸化處理的質粒pKVp的NdeI位點，得到質粒pKVpVII。2)在標準的聚合酶鏈反應條件下，以質粒pSC101中的par位點為模板(ZuritaM，BolivarF，SoberonX.ConstructionofplasmidpBR327par，acompletelysequenced，stablederivativeofpBR327containingtheparlocusofpSC101.Gene，1984，28119-122)，以par-upGTACATATG(NdeI)GACAGTAAGACGGGTAAGCC和par-doGACCATATG(NdeI)CGGGCAAATCGCTGAATATT為引物得到367bp的DNA擴增片斷，該片斷含質粒pSC101的par位點，用限制性內切酶NdeI酶切處理后，插入到經過去磷酸化處理的質粒pKVpVII的NdeI位點，得到質粒pKVpPVII。2、質粒穩定性實驗1)參照文獻(EasterCL，SobeckyPA，HelinskiDR.Contributionofdifferentsegmentoftheparregiontostablemaintenanceofthebroad-host-rangeplasmidRK2.J.Bacteriol，1997，1796472-6479)進行質粒穩定性實驗將步驟1中構建的表達載體pKVpPVII按CaCl2處理法轉化大腸桿菌E.coliJM83，得到含有目的質粒的重組大腸桿菌，將重組大腸桿菌接種于液體培養基1中37℃培養12小時。部分培養液在預熱的培養基1中梯度稀釋106倍，然后接種到無抗生素的培養基1中，培養至對數中期。這一個循環，定義為大腸桿菌對數生長20代。如此培養直至重組菌對數生長100代。部分培養液適當稀釋后涂布LB平板。所得菌落利用影印平板到含有或者沒有抗生素的LB平板上培養16-20小時，來檢測保留質粒細胞在總細胞中所占的百分比。其中的培養條件設定為在250ml無擋板三角瓶中，加入50ml液體培養基，200轉每分鐘作為氧氣供應充分條件；在250ml無擋板三角瓶中，加入150ml液體培養基，100轉每分鐘作為氧氣供應貧乏條件。質粒穩定性檢測結果表明帶有質粒pSC101par位點的質粒pKVpPVII，無論氧氣供應充分條件和氧氣供應貧乏條件下，經過100代時仍然保持近100％細胞包含有該外源質粒。3、利用低氧誘導大腸桿菌表達載體pKVpPVII表達甲苯雙加氧酶所需質粒的構建及蛋白活性檢測1)構建以pKVpPVII為載體表達甲苯雙加氧酶的質粒質粒pKST11含甲苯雙加氧酶基因(tod)。在標準的聚合酶鏈反應條件下，以質粒pKST11為模板(ZylstraGJ，GibsonDT.ToluenedegradationbyPseudomonasputidaF1nucleotidesequenceofthetodC1C2BADEgenesandtheirexpressioninEscherichiacoli.JBC，1989.26414940-14946)，以TDO-upGACGAATTC(EcoRI)CTAATGAATCAGACCGACACATC和TDO-doGACGGATCC(BamHI)TCACGTTAGGTCTCCTTCAT為引物擴增得到3.6Kb的甲苯雙加氧酶DNA片斷，片斷兩端帶有EcoRI和BamHI酶切位點。將其插入到載體pKVpPVII相應的酶切位點處，構建得到質粒pKVpPV-TII。2)甲苯雙加氧酶活性檢測參照文獻(WooHJ，SanseverinoJ，CoxCD，RobinsonKG，SaylerGS.ThemeasurementoftoluenedioxygenaseactivityinbiofilmcultureofPsedomonasputidaF1.JournalofMicrobiologicalMethods，2000，40181-191)的方法檢測雙加氧酶酶活在檢測過菌濃度后，1ml培養液立刻被轉移到離心管中。離心(14,000rpm離心1分鐘，在4℃)后，去上清，用pH值7.2的磷酸緩沖液重懸。加入25μl0.1M吲哚溶于二甲基甲酰胺的溶液。用分光光度計檢測OD600，未加入吲哚的樣品作為對照，確定靛藍的生成量。在開始半小時內靛藍的生成速度定義為重組菌的酶活力(靛藍mg/min)。將質粒pKVpPV-TII按CaCl2處理法分別轉化大腸桿菌E.coliJM83。包含有質粒pKVpPV-TII的大腸桿菌在氧氣供應充分條件和氧氣供應貧乏條件下培養，每隔2小時取樣檢測。結果如圖6所示，可見在包含質粒pKVpPV-TII大腸桿菌中，單位菌濃度的甲苯雙加氧酶活性較高。圖6中，A代表氧氣供應充分條件，B代表氧氣供應貧乏條件。其中，培養條件設定為在250ml無擋板三角瓶中，加入50ml液體培養基，200轉每分鐘作為氧氣供應充分條件；在250ml無擋板三角瓶中，加入150ml液體培養基，100轉每分鐘作為氧氣供應貧乏條件。實施例5、包含來自質粒R100的pemK和pemI基因、來自質粒F的ccdA和ccdB基因、來自質粒R1的hok和sok基因、來自IncPα質粒RK2的parDE對于表達載體穩定遺傳的影響1、穩定遺傳的低氧誘導大腸桿菌表達載體pKVpPII，pKVpPIII，pKVpPIV和pKVpPVI的構建1)在標準的聚合酶鏈反應條件下，以質粒R100的pemK/pemI基因序列(TsuchimotoS，OhtsuboH，OhtsuboE.TwogenespemKandpemI，responsibleforstablemaintenanceofresistanceplasmidR100.J.Bacteriol，1988，1701461-1466)為模板，pR100-upGTACATATG(NdeI)GAAGCAACCACGCTGG和pR100-doGTCCATATG(NdeI)GCTGCGCTTGGAATT為引物得到847bp的DNA擴增片斷，該片斷含有pemK/pemI基因序列，用限制性內切酶NdeI酶切處理后，插入到經過去磷酸化處理的質粒pKVp的NdeI位點，得到質粒pKVpPII。2)在標準的聚合酶鏈反應條件下，以質粒F的ccdA/ccdB基因序列(OguraT，HiragaS.Mini-Fplasmidgenesthatcouplehostcelldivisiontoplasmidproliferation.ProcNatlAcadSciUSA，1983，804784-4788)為模板，pF-upGTACATATG(NdeI)AATACATAAGGCTTAC和pF-doATCCATATG(NdeI)AACGGAGCCTGACAT為引物得到651bp的DNA擴增片斷，該片斷含有ccdA/ccdB基因序列，用限制性內切酶NdeI酶切處理后，插入到經過去磷酸化處理的質粒pKVp的NdeI位點，得到質粒pKVpPIII。3)在標準的聚合酶鏈反應條件下，以質粒R1的hok/sok基因序列(GerdesK，ThistedT，MartinussenJ.Mechanismofpost-segregationalkillingbythehok/soksystemofplasmidR1sokantisenseRNAregulatesformationofahokmRNAspeciescorrelatedwithkillingofplasmid-freecells.Mol.Microbiol.1990，41807-1818)為模板，pR1-upATCCATATG(NdeI)AACAAACTCCGGGAGG和pR1-doGTCCATATG(NdeI)ACAACATCAGCAAGG為引物得到596bp的DNA擴增片斷，該片斷含有hok/sok基因序列，用限制性內切酶NdeI酶切處理后，插入到經過去磷酸化處理的質粒pKVp的NdeI位點，得到質粒pKVpPIV。4)在標準的聚合酶鏈反應條件下，以IncPα質粒RK2的parDE基因序列(EasterCL，SobeckyPA，HelinskiDR.Contributionofdifferentsegmentsofthebroad-host-rangeplasmidRK2.J.Bacteriol，1997，1796472-6479)為模板，pRK2-upGTACATATG(NdeI)ACGCAATTTAAATGC和pRK2-doGTCCATATG(NdeI)AGTACGCCATCAGGAC為引物得到712bp的DNA擴增片斷，該片斷含有parDE基因序列，用限制性內切酶NdeI酶切處理后，插入到經過去磷酸化處理的質粒pKVp的NdeI位點，得到質粒pKVpPVI。2、質粒穩定性實驗1)參照文獻(EasterCL，SobeckyPA，HelinskiDR.Contributionofdifferentsegmentoftheparregiontostablemaintenanceofthebroad-host-rangeplasmidRK2.J.Bacteriol，1997，1796472-6479)進行質粒穩定性實驗將步驟1中構建的4種表達載體按CaCl2處理法分別轉化大腸桿菌E.coliJM83，得到含有上述四種質粒的重組大腸桿菌，將含有上述四種質粒的重組大腸桿菌接種于液體培養基1中37℃培養12小時。部分培養液在預熱的培養基1中梯度稀釋106倍，然后接種到無抗生素的培養基1中，培養至對數中期。這一個循環，定義為大腸桿菌對數生長20代。如此培養直至重組菌對數生長100代。部分培養液適當稀釋后涂布LB平板。所得菌落利用影印平板到含有或者沒有抗生素的LB平板上培養16-20小時，來檢測保留質粒細胞在總細胞中所占的百分比。其中的培養條件設定為在250ml無擋板三角瓶中，加入50ml液體培養基，200轉每分鐘作為氧氣供應充分條件；在250ml無擋板三角瓶中，加入150ml液體培養基，100轉每分鐘作為氧氣供應貧乏條件。質粒穩定性檢測結果表明新型大腸桿菌表達載體pKVpPII，pKVpPIII，pKVpPIV和pKVpPVI(前面的實施例1中已有名為pKVpPV的質粒，現將其改為pKVpPVI)，無論氧氣供應充分條件和氧氣供應貧乏條件下，經過100代時仍然保持近100％細胞包含有外源質粒。上述實施例的實驗結果表明以有par位點的質粒pKVpP，pKVpPV，pKVpPVII，pKVpPII，pKVpPIII，pKVpPIV和pKVpPVI為表達載體，在無抗生素加入的條件下，該質粒可以在大腸桿菌中穩定遺傳至少100代而沒有明顯丟失(誤差范圍內小于4％)。在大規模工業發酵中應用帶有par位點的質粒pKVpP，pKVpPV，pKVpPVII，pKVpPII，pKVpPIII，pKVpPIV和pKVpPVI，可以避免為保持質粒穩定遺傳而加入抗生素所帶來的投入。通過vgb啟動子的作用滿足了目的蛋白大量生產所需要的細胞內高溶氧條件，降低了對攪拌和通氣的要求，為大規模工業化生產提供了可行性。實施例2表明低氧誘導大腸桿菌表達載體pKVp，pKVpP，pKVpV和pKVpPV在低溶氧條件下表達的外源目的蛋白活力明顯高于高溶氧條件，利用pKVpP作為表達載體表達綠色熒光蛋白，在低溶氧條件下可以達到最高活力。質粒pKVpP中并不含有vgb基因，而表達效果卻優于pKVpPV，原因可能是VHb蛋白對于綠色熒光蛋白活力的增強要小于兩種蛋白對于低物和能量競爭的負影響。由實施例3可見，以有vgb操縱子的質粒pKVpV和pKVpPV為表達載體，菌濃度以及目的外源蛋白甲苯雙加氧酶的活力有進一步提高，可能的原因是VHb蛋白對于甲苯雙加氧酶酶活力的增強要大于兩種蛋白對于底物和能量競爭的負影響。因為par位點對于質粒不相容性也有作用，所以在與包含pSC101復制起始位點的質粒進行共表達時，質粒pKVp，pKVpV將會有優勢的作用。當用vgb啟動子Pvgb與結核桿菌血紅蛋白操縱子序列組成低氧誘導表達載體進行甲苯雙加氧酶酶活力表達時，該酶活力也有一定的提高。利用包含來自質粒R100的pemK和pemI基因、來自質粒F的ccdA和ccdB基因、來自質粒R1的hok和sok基因、來自IncPα質粒RK2的parDE片段構建新表達載體pKVpPII，pKVpPIII，pKVpPIV和pKVpPVI，并進行穩定性檢測。該系列質粒無論氧氣供應充分條件和氧氣供應貧乏條件下，在無抗生素加入的條件下，可以在大腸桿菌中穩定遺傳至少100代而沒有明顯丟失(誤差范圍內小于4％)。序列表<110>清華大學<120>低氧誘導微生物表達載體及其構建方法與應用<130>CGGNA40356<160>2<210>1<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1gcacatatgacaggacgctggggttaa17<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2gcaattaatggtgaatcgcaacgggt1權利要求1.一種低氧誘導微生物表達載體，是含有vgb啟動子序列或大腸桿菌中受富馬酸鹽和硝酸鹽還原酶調解子FNR調控的nar啟動子序列的微生物質粒表達載體。2.根據權利要求1所述的低氧誘導微生物表達載體，其特征在于所述低氧誘導微生物表達載體還含有vgb操縱子序列。3.根據權利要求1所述的低氧誘導微生物表達載體，其特征在于所述低氧誘導微生物表達載體還含有結核桿菌血紅蛋白基因操縱子序列。4.根據權利要求1、2或3所述的低氧誘導微生物表達載體，其特征在于所述低氧誘導微生物表達載體還含有下述序列之一par位點序列、來自質粒R100的pemK/pemI基因序列、來自質粒F的ccdA/ccdB基因序列、來自質粒R1的hok/sok基因序列、來自IncPα質粒RK2的parDE序列。5.根據權利要求4所述的低氧誘導微生物表達載體，其特征在于所述par位點序列為來自質粒pSC101的par位點序列、來自質粒原噬菌體P1、P7的par位點序列或來自質粒pTAR的par位點序列。6.根據權利要求1、2或3所述的低氧誘導微生物表達載體，其特征在于所述微生物表達載體為原核細胞表達載體和真核細胞表達載體。7.根據權利要求6所述的低氧誘導微生物表達載體，其特征在于所述原核細胞表達載體為可在大腸桿菌或芽孢桿菌中表達的載體；所述真核細胞表達載體為可在酵母中表達的載體。8.根據權利要求7所述的低氧誘導微生物表達載體，其特征在于所述低氧誘導微生物表達載體為pKVp，pKVpP，pKVpV，pKVpPV，pKVpPII，pKVpPIII，pKVpPIV、pKVpPVI或pKVpPVII。9.一種構建權利要求1所述低氧誘導微生物表達載體的方法，是將vgb啟動子序列或大腸桿菌中受富馬酸鹽和硝酸鹽還原酶調解子PNR調控的nar啟動子序列連接入微生物表達載體的多克隆位點，得到低氧誘導微生物表達載體。10.權利要求1所述低氧誘導微生物表達載體在生產外源目的蛋白中的應用。全文摘要本發明公開了一種低氧誘導微生物表達載體及其構建方法與應用。本發明所提供的低氧誘導微生物表達載體是含有vgb啟動子序列或大腸桿菌中受富馬酸鹽和硝酸鹽還原酶調解子FNR調控的nar啟動子序列的微生物質粒表達載體。一種構建上述低氧誘導微生物表達載體的方法，是將vgb啟動子序列或大腸桿菌中受富馬酸鹽和硝酸鹽還原酶調解子FNR調控的nar啟動子序列連接入微生物表達載體的多克隆位點，得到低氧誘導微生物表達載體。應用本發明低氧誘導微生物表達載體發酵，可以達到不需加入抗生素仍舊保持質粒穩定遺傳的效果；可以滿足細胞生長對高溶氧的需求，降低了對攪拌和通氣的要求；并且可以方便經濟地誘導外源目的蛋白的表達，具有廣闊的工業應用前景。文檔編號C12N15/79GK1560256SQ20041000612公開日2005年1月5日申請日期2004年3月3日優先權日2004年3月3日發明者陳國強,劉濤,陳晶瑜,汪天虹申請人:清華大學