專利名稱：新多抗菌素及制備方法和所產生的農作物病害防治藥物的制作方法
技術領域：
本發明屬于新抗生素及其制備和應用，尤其是屬于一種新多抗菌素及其制備方法，以及以該抗生素為有效成份的園藝和農作物病害的防治藥物。
背景技術：
長期以來，化學農藥的使用對人體、土壤、植物及環境所造成的污染危害及殘留問題已引起人們的高度重視。隨著農用抗生素的應用已取得了一定的效果。本發明為了尋找出新的有效的農用抗生素，從以往已知微生物菌種中篩選并改進了發酵培養及提取分離方法，然后對這些抗生素分別進行精制、鑒定和開發應用，以增加在作物病害防治中可選擇的生物農藥的新種類。
發明內容
本發明的目的在于提供一種以鏈霉菌屬的微生物為產生菌的新抗菌素及其培養、分離、制取的方法，進而開發出一種對植物多種病害有效、低毒、低殘留，并能促進作物正常生長的生物農藥。
使用的微生物本發明使用的微生物屬不吸水鏈霉菌(S.ahygroscopicus Yan ea al.1962)。該菌種在中國科學院微生物研究所和浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所均有保存并能獲得。
使用菌種的性質形態特征基內菌絲體呈分枝狀，在合成培養基上孢子絲為單搓分枝，起初為直狀后波曲，成熟后形成不同圈數的螺旋，孢子大小不等，近圓形至長方形，3.5～6.5×0.8～1.1微米，孢子表面有短刺。
培養特征在合成培養基上氣生菌絲淺褐色至褐灰色，孢子呈絨粉狀有時為堆粉狀，基內菌絲為淺黃褐色，逐步加深呈黃褐色或葵黃色，在馬鈴薯培養基上能產生茶褐色的可溶性色素。
生理生化特性菌種能使牛奶胨化，使明膠液化，尤其是分解淀粉的能力強，但不分解纖維素，不產生硫化氫和黑色素。有藥香味。
碳源利用特點在碳源利用方面，淀粉的利用能力強，也能利用果糖、半乳糖、肌醇、飴糖和七葉苷等。對蔗糖利用可疑，不能利用乳糖、棉子糖、鼠李糖和山梨糖等。
細胞壁成分分析特征(1)氨基酸分析 以2，6-二氨基庚二酸和甘氨酸為對照，以菌種細胞壁的水解物進行氨基酸分析，結果含有2，6-二氨基庚二酸和甘氨酸，所以該菌的細胞壁類型屬于細胞壁I型。
(2)糖份分析 菌種細胞壁的水解物進行糖份分析，結果證明細胞含有葡萄糖，未發現有半乳糖、阿拉伯糖、馬杜拉糖和木糖等有特征性的糖成份，表明該菌細胞壁屬糖C型，根據細胞壁的成份分析，該菌屬鏈霉菌。
使用菌種的發酵培養方法可以采用常規設備發酵生產，也可以采用電腦程控系統進行發酵生產。為了有利工業化生產，通常可以采用液體培養，將該菌種的孢子懸浮液或菌絲體進行接種，在發酵過程中要求進行通氣攪拌。
發酵所采用的培養基，可由碳源、氮源以及其他營養成份和礦物元素等配制而成。其中碳源可用甘油、糊精、飴糖、淀粉、肌醇、半乳糖和七葉苷等；氮源可為花生餅粉、豆餅粉、蛋白胨、米糠、麩皮、銨鹽、硝酸鹽、尿素、硫酸銨等；其它無機元素，適當加入鈣、磷、錳、鋅、鐵、鉛和鈷等；同時為了防止發酵泡沫還可以加入一定量的動、植、礦物油等作為消泡劑。若受設備條件限制，也可采用固體培養發酵，培養基主要成份同液體培養基。
對菌種的培養溫度、時間、通氣量以及發酵周期并無嚴格的限制，以在不同的生產條件下，菌種能正常生長為準，對其各種發酵條件可以作適當的調整。例如，培養基的pH范圍可為5～9，培養溫度宜在25～35℃，通氣量在1∶0.2～1∶1.5。
新多抗菌素的分離、提純新多抗菌素的分離菌種的發酵產物經過酸化后，進行固液分離，含有多抗菌素的液體通過吸附法或用732等樹脂進行分離，用不同濃度的NH4OH洗脫，也可用其他稀堿液洗脫，濃縮，然后用硅膠柱進一步提純，即以異丙醇裝柱、濕法上樣，用異丙醇∶水分級梯度洗脫，分部收集，通過檢測以富含新多抗菌素的254nm～282nm部分合并濃縮，可得含量較高的新多抗菌素的粗品。
新多抗菌素的純化新多抗菌素正相制備薄層層析法，以粗品上樣，用異丙醇∶水加少量堿為展開劑，自鋪硅膠板(16克硅膠加40毫升0.5％CMC-Na雙蒸水，鋪20×20cm硅膠板3-4塊，室溫干燥)，展開4小時后刮取新多抗菌素部分，用異丙醇洗脫，濃縮獲得粗晶品干燥備用。
結晶的取得將上述粗晶品以乙醚洗滌，干燥后加少量的異丙醇溶解，滴入乙酸乙酯，靜置，即可以慢慢地析出結晶，抽濾去母液可得脫色結晶。
用反相色譜提純上述結晶物，以極少量的雙蒸水溶解，然后加入到反相制備色譜柱中，以2-5％的甲醇溶液洗脫，以紫外260nm檢測之，分部收集，揮去甲醇溶液就可以得到多抗菌素的純品，進行光譜分析。
新多抗菌素理化特性、光譜特征1、具有典型的脲核苷酸的紫外吸收峰(220～320nm之間)，λmax(in MeOH)min為261.8±1nm和207.6±1nm為脲嘧啶類核苷酸所特有的吸收峰。
2、從1HNMR譜和1H-1Hcosy看在5.7-5.9ppm處一個異頭質子峰，為堿基和糖戊甙的質子峰，從偶合常數判斷為α構型，在3.8-4.4ppm間五個典型的糖環質子，并通過1H-1Hcosy光譜可以看出之間相互聯接，和已知的五碳糖比較它是屬于呋喃環的糖。
3、從光譜分析特征來看，其紅外光譜和紫外光譜和多氧霉素有相似之處，因為有類似的堿基，但從1HNMR光譜、1H-1Hcosy光譜以及ESI-MS光譜發現和多氧霉素有區別。
4、從已經新建立的新多抗菌素分離流程，可以得到純度為99％以上的新多抗菌素。其穩定性試驗表明新多抗菌素對熱、對光均穩定，可以結晶，結晶為針狀或白色粉末，易溶于水，少量溶于乙醇、甲醇、丙酮中，不溶于苯、乙酸乙酯、石油醚、正己烷等有機溶劑。對酸穩定在pH2-3之間，可保存2-3年，但對堿不穩定。
5、從其ESI-MS、1HNMR、13CNMR、1H-1Hcosy光譜以及紅外光譜、紫外光譜等，確定其分子量為243.06±1，分子式為C9H10O6N2，化學結構為一新的多氧嘧啶核苷類物質。
6、推定結構式 新多抗菌素的加工配制本發明在用作瓜果蔬菜以及糧、棉、油等作物作抗菌劑時，可同樣使用該技術領域中已知農藥所通用的液相，固相載體及乳化分散劑等助劑。并可以配制成液劑、顆粒劑、粉劑、乳油、可濕性粉劑、片劑、油劑、噴霧劑等任意的劑型。這些載體中固相載體可以是粘土、高嶺土、皂土、酸性土、硅藻土、硝化纖維素、淀粉、阿拉伯膠等，液相載體可以是水、含水乙醇、甲醇、丙酮、異丙醇等，也可以是甲基甲酰胺、乙二醇、二甲苯等。同時，在制劑中一般可以適當添加一些助劑，如高級醇的硫酸脂、聚氧化乙烯、烷基烯丙基醚、烷基烯丙基、乙二醇醚、烷基烯丙基無水山梨糖醇、月桂酸脂、烷基烯丙基磺酸鹽、季胺鹽、聚烯化氧等，通常在各種制劑中有效成分的配比，在乳劑及可濕性粉劑中為1～90％，在液體劑型中為1～20％，油劑中為0.1～10％，還可以根據不同的使用目的而適當加以增減。
另外，本發明的制劑還可以和其他殺菌劑，尤其和多抗靈生物農藥在一起防治效果更顯著，其次還可和除草劑、殺蟲劑、肥料物質、土壤改良劑等配合使用，但與堿性農藥如波爾多液、石硫合劑等不能混配。
本發明的有益效果是，以不吸水鏈霉菌(S.ahygroscopicus Yan et al.1962)為產生菌，經培養發酵所產生的新多抗菌素，對園藝、蔬菜、農作物的立枯病、炭疽病、霜霉病、白粉病、紋枯病及枯萎病等多種真菌性病害有顯著的防效；在防治作物病害的同時，兼有促進作物生長的作用；此外，該抗菌素對使用環境和人、畜均較為安全。
圖1為新多抗菌素UV(紫外光譜)圖譜圖2為新多抗菌素IR(紅外光譜)圖譜圖3為新多抗菌素ESI-MS(質譜)圖譜圖4為新多抗菌素1HNMR(氫譜)圖譜圖5為新多抗菌素13CHNMR(碳譜)圖譜圖6為新多抗菌素1H-1Hcosy(二維核磁共振)圖譜。
具體實施例方式
以下，就本發明的制造實施、試驗事例做具體的說明，但這并不是意味著對本發明有所限定。
制造例按淀粉7％、蛹粉1.5％、餅粉2％、NaCl 0.15％、KH2PO40.05％、MgSO40.005％、余量為水的重量比配制成25噸發酵罐裝量為60-70％的培養基，pH為6～9。將新多抗菌素生產菌種不吸水鏈霉菌接種到經過常規方法滅菌并冷卻到28～30℃的發酵罐培養基中，29℃經過60小時通氣攪拌發酵，通氣量1∶0.4～1∶1.5。發酵產品固液分離，再經過真空薄膜濃縮可以制成1％-20％的液體劑型，也可以通過上述的精制方法提取結晶，制成乳劑、油劑等，也可以通過固相載體制成粉劑、可濕性粉劑、顆粒劑、片劑等。
實施例1液體劑型將發酵產物通過板框壓濾進行固液分離，所得液以酸性水為液相載體，經加工配制后用真空薄膜濃縮器濃縮。通過發酵效價檢測分別可以控制制成1％、2％、3％、5％到20％的液體產品，裝瓶，封口即成。
實施例2粉劑及精品發酵液通過上述新多抗菌素的精制方法制成粗晶，以高嶺土為固相載體，分別配制成有效成份含量達到20-45％的粉劑，也可以精制成98％的精品。
實施例3可濕性粉劑將10份新多抗菌素的粗晶與5.8份十二烷基磺酸鈉、2.2份二苯甲烷二磺酸鈉甲醛聚合物及82分陶土混合，粉碎過200目即可得到100份制劑。
實施例4顆粒劑將10份新多抗菌素粗晶品加入16份硅藻土、72份皂土以及2份十二烷基硫酸混合，造粒即得100份制劑。
試驗例藥劑按實施例1制成的新多抗菌素的1％液體制劑，分別用水稀釋50倍、100倍、150倍，另以60％百菌清500倍與20％粉銹寧800倍及清水作對照。
處理分別以感染有立枯病與白粉病的基質稀釋液噴布于黃瓜植株葉和莖稈進行人工接種；每處理3次重復；接種后即噴藥一次，間隔一周后再噴藥一次。
調查發病程度分為6級，得出發病指數后分析防治效果見下表1 對黃瓜立枯病的防治試驗結果處理 發病率％ 防治效果％清水CK100 --60％百菌清500倍 21.5 78.5新多抗菌素50倍 0100新多抗菌素100倍0100
表2 對黃瓜白粉病的防治試驗結果處理 發病率％防治效果％清水CK 70 --20％粉銹寧800倍 15.1 84.9新多抗菌素50倍 0 100新多抗菌素100倍0 100新多抗菌素150倍 10 90表3 對感染立枯病黃瓜的防治及促生長作用稀釋倍數株高mm 葉寬mm 備注CK 144 6050 387.080.7 結實率高100 377.590.2 結實率高150 341.576.0 結實率高表4 對感染白粉病黃瓜的防治及促生長作用稀釋倍數株高mm 葉寬mm 備注CK 335.08550 618.5102.7 結實率高100 696.5108.88結實率高150 585.3110.8 結實率高田間防治試驗結果表明，新多抗菌素能夠防治多種農作物病害，并有促進農作物生長的作用。
權利要求
1.一種新多抗菌素，其特征在于該抗菌素的有效成分為新多氧嘧啶核苷類活性物質，具有專有光譜分析特征，其分子式為C9H10O6N2，分子量為243.06±1，結構式為
2.一種制備如權利要求1所述新多抗菌素的方法，包括以下步驟(1)菌種培養A、所用菌種屬已知的不吸水鏈霉菌(S.ahygroscopicus Yan et al.)；B、培養基為常用碳源、氮源類，再加無機鹽類；C、將孢子懸浮液或菌絲體培養液接種到培養基上，可用發酵罐液體通氣攪拌培養或固體培養，溫度為25～35℃，pH為5～9，經過40～96小時得到發酵液。(2)抗菌素的提取將發酵液固液分離，用常規離子交換、萃取和/或層析以及色譜分離技術，提取出抗菌素精品。
3.如權利要求2所述制備新多抗菌素的方法，其特征是所述新多抗菌素的色譜分離富集部分為254nm～282nm。
4.一種農作物病害的防治藥物，其特征在于該藥物的有效成分為權利要求1所述的新多抗菌素，并以通用的液相或固相載體為輔料，配制成任意的劑型，其有效成份抗菌素的重量百分比，在乳劑及可濕性粉劑中為1～90％，在液體劑型中為1～20％，油劑中為0.1～10％。
全文摘要
本發明公開了一種新多抗菌素及其制備方法和由此產生的農作物病害防治藥物。該抗生素的產生菌為不吸水鏈霉菌(Sereptomyces ahygroscopicus)，分子式為C
文檔編號C12P17/16GK1563000SQ200410032099
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月2日 優先權日2004年4月2日
發明者夏湛恩, 俞曉平, 呂仲賢, 陳建明, 鄭許松, 徐紅星, 陳列忠, 張玨鋒, 吳文娟 申請人:浙江省農業科學院