專利名稱：一種溶菌酶檢測試劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬生物化學分析領域，具體涉及一種溶菌酶檢測試劑及其制備方法背景技術溶菌酶分析通常用于各種體液的檢測。其意義是通過體液中溶菌酶的測定、分析，對疾病的變化、嚴重程度進行判斷。根據Pesce A.J.和Kaplan L.A.主編的權威著作《Methods in Clinical Chemistry》(林其燧 文慶成主校譯)，目前用于臨床溶菌酶分析的方法的主要是平板法和比濁法。其中平板法進行試劑標準化比較困難，操作繁瑣，需要經過特定的培訓才能掌握，而且試驗結果易受操作者主觀誤差的影響；比濁法全部為手工操作，手工比濁法所用菌懸液靜置后菌體將下沉，因而在操作中必須不斷搖動菌懸液，以保持每個測試時所吸取菌懸液濃度的一致性，增加了操作的難度，并且所得試劑穩定性不好。難以適應現代醫學批量標本的檢測要求和自動化分析的發展趨勢，并且其靈敏度較低。
綜上所述，目前臨床醫學檢驗迫切需要一種具有穩定性能的溶菌酶檢測試劑，并且能方便的用于自動化分析檢測的要求。
發明內容
本發明的目的是提供一種性能穩定的溶菌酶檢測試劑，本試劑能用于全自動生化分析，實現溶菌酶活性的批量、自動化檢測。
本發明的另一目的是提供所述檢測試劑的制備方法。
本發明溶菌酶檢測試劑含有滅活微球菌和明膠。本發明檢測試劑采用新的滅活微球菌的方法，同時利用明膠作為分散菌體的介質和穩定劑，制備高度穩定的菌懸液作為溶菌酶檢測試劑。本發明經過4小時以上長時間的靜置，吸取的菌懸液的吸光度無明顯改變，表明所得試劑具有很好的穩定性，可用于各種檢測需要，使得用于自動生化分析儀成為可能。
本發明溶菌酶檢測試劑通過下述方法和步驟制備，1、采用常規培養方法營養瓊脂培養微球菌48～72小時，2、在無菌條件下，用生理鹽水洗下菌苔，3、用活性氯進行滅活，濃度為1000～3000ppm，時間為15～30分鐘，4、將滅活后的微球菌用紗布進行過濾，去除混入的瓊脂碎塊；用生理鹽水洗滌菌體，然后用0.125～0.0625mol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液洗滌，5、用含1.3～1.7‰明膠、1‰疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液進行懸浮，并用相同緩沖液調整菌懸液為1cm光徑、650nm波長吸光度約為1.5A，得應用菌懸液。置于4℃保存，即得本發明溶菌酶測試試劑。
所制備的試劑可供各類帶試劑冷藏槽的自動生化分析儀應用，用于測試各種體液中的溶菌酶活性。本發明所能達到的最低檢測限為0.5μg/ml，完全可以滿足臨床體液標本測試的要求。
本發明涉及的微球菌購自中科院微生物所菌種庫。
所涉及的溶菌酶標準品比活性為20000u/mg蛋白(華美生物工程公司)，將此溶菌酶用含30％甘油的0.9％NaCl溶液配成濃度為1mg/ml的酶溶液，作為標準品工作液，分裝后置于-40℃冰箱中保存備用。
所涉及的其它化學試劑均為AR以上純級，購自上海化學試劑商店。
所涉及的生化分析儀為HITACHI 7060型全自動生化分析儀，(日本)。
圖1 線性范圍圖。
圖2 胸水標本測試數據分布示意圖。
具體實施例方式
實施例1 制備溶菌酶測試試劑1、采用常規培養方法營養瓊脂培養微球菌48小時，2、在無菌條件下，用生理鹽水洗下菌苔，3、用活性氯進行滅活，濃度為1000ppm，時間為30分鐘，4、將滅活后的微球菌用紗布進行過濾，去除混入的瓊脂碎塊；用生理鹽水洗滌菌體，然后用0.125mol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液洗滌，5、用含1.3‰明膠、1‰疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液進行懸浮，并用相同緩沖液調整菌懸液為1cm光徑、650nm波長吸光度約為1.5A，得應用菌懸液。置于4℃保存，即得本發明溶菌酶測試試劑。
實施例2 制備溶菌酶測試試劑采用常規培養方法營養瓊脂培養微球菌72小時，在無菌條件下，用生理鹽水洗下菌苔，用濃度為2000ppm活性氯進行滅活15分鐘，將滅活后的微球菌紗布過濾，去除混入的瓊脂碎塊；用生理鹽水洗滌菌體，然后用0.0625mol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液洗滌，用含1.5‰明膠、1‰疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液進行懸浮，并用相同緩沖液調整菌懸液為1cm光徑、650nm波長吸光度約為1.5A，得應用菌懸液。置于4℃保存，即得本發明溶菌酶測試試劑。
實施例3 臨床檢驗取成人體檢血清標本50例；胸水標本共44例。癌性胸水為21例，均經細胞學檢查證實，其中19例為肺腺癌，1例疑為腺癌，1例為乳腺癌術后；結核性胸水23例。標本采集后，置-40℃凍存。檢測時，置室溫下令復融，顛倒混勻，離心取上清備檢。
利用HITACHI 7060全自動生化分析儀建立溶菌酶活性的自動分析法。方法終點法；波長340/623nm；試劑量250μl；樣品量30μl；測量點31點。將溶菌酶標準品配制成15.6μg/ml的溶液作為定標液，作5點定標。
將所用溶菌酶標準品在0.1μg/ml-50μg/ml之間作15個階度稀釋，作為樣品上機測試，得到反應曲線。顯示，上限直至50μg/ml仍保持滿意的線性，可滿足臨床標本的測試需要。下限自0.6μg/ml以下不能有效測定(讀數紊亂)；取生理鹽水作為“0”標本，測試5次，計算X+3SD＝0.28+3×0.084＝0.532μg/ml，作為檢測下限，所建立的檢測系統的最低檢測限為0.6μg/ml，檢測上限至少可達50μg/ml。
用含20％混合人血清的生理鹽水，添加溶菌酶標準品，配制成高、中、低三種溶菌酶濃度的樣品，分裝，-40℃凍存，作為重復性試驗的樣品。
取上述高、中、低三種濃度的樣品上機連續測定，分別計算批內變異系數為1.7％，1.3％，和3.1％，天間變異系數分別為3.9％，4.7％，和8.7％。
采用2種方法進行回收試驗，即不同胸水標本中添加相同量的LZM標準品和同一個胸水標本中添加不同量的LZM標準品，按公式回收率＝(回收量/加入量)×100％，計算回收率為90.4％～101.3％臨床標本測試結果顯示，其中50例血清標本濃度分布范圍為3.1~8.8μg/ml，X±SD＝4.71±0.92(μg/ml)，44例胸水標本，其中結核性胸水23例，癌性胸水21例。
以肺癌組胸水LZM測定值X+2SD作為cut off值X+2SD＝3.94+0.93×2＝5.8μg/ml，則結核組有21例高于此值，敏感性為91.3％，癌性組僅有1例高于此值，特異性為95.2％。
上述兩組資料經X2檢驗，P＜0.001，表明結核組與肺癌組胸水LZM活性有極顯著差異，結核組胸水LZM活性高于肺癌組。
權利要求
1.一種溶菌酶檢測試劑，其特征在于含有滅活微球菌和明膠，其中明膠作為分散菌體的介質和穩定劑。
2.按權利要求1所述的溶菌酶檢測試劑的制備方法，其特征在于通過以下步驟制備，①采用營養瓊脂培養微球菌48～72小時，②在無菌狀態下，用生理鹽水沖洗菌苔，③用活性氯滅活，時間為15～30分鐘，④將滅活后的微球菌紗布過濾，去除混入的瓊脂碎塊；用生理鹽水洗滌菌體后，用0.125～0.0625mol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液洗滌，⑤用含1.3～1.7‰明膠、1‰疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液懸浮，相同緩沖液調整菌懸液為1cm光徑、650nm波長吸光度約為1.5A，得應用菌懸液，4℃保存。
3.按權利要求1或2所述的溶菌酶檢測試劑，其特征在于所述滅活微球菌的活性氯濃度為1000～3000ppm。
4.按權利要求1或2所述的溶菌酶檢測試劑，其特征在于所述試劑菌懸液含明膠1.5‰。
5.按權利要求2所述的溶菌酶檢測試劑，其特征在于步驟④所述磷酸鹽緩沖液洗滌液為0.0625mol/L pH6.0。
全文摘要
本發明屬生物化學分析領域，具體涉及一種溶菌酶檢測試劑及其制備方法。本發明溶菌酶檢測試劑含有滅活微球菌和明膠。本發明檢測試劑采用新的滅活微球菌的方法，同時利用明膠作為分散菌體的介質和穩定劑，制備高度穩定的菌懸液作為溶菌酶檢測試劑。本發明經過4小時以上長時間的靜置，吸取的菌懸液的吸光度無明顯改變，表明所得試劑具有很好的穩定性，可用于各種檢測需要，能用于全自動生化分析，實現溶菌酶活性的批量、自動化檢測。
文檔編號C12Q1/00GK1587994SQ20041005380
公開日2005年3月2日 申請日期2004年8月16日 優先權日2004年8月16日
發明者于方治, 吳京 申請人:上海市胸科醫院