專利名稱：一種分離哺乳動物xy精子的方法
技術領域：
本發明涉及一種分離哺乳動物X精子和Y精子的方法。
背景技術：
在畜牧業生產中，有選擇地繁殖出具有預知性別的畜禽后代將能大大提高畜牧業生產的速度和效率。用X或Y精子給母畜授精，在受精之前便可決定后代的性別，從而顯著地改變后代的性別比例，達到性別控制的目的。以奶牛為例，奶牛農場主希望從其優質高產的核心群中繁殖出更多的小母牛，以增加或更新其奶牛群，通過性別控制就可以達到這一目的。同樣，肉用牛農場主則希望繁殖出更多的小公牛，因為牛的生長速度和肉的品質與性別有關，公牛生長速度比母牛快，而且閹公牛肉的價格較高。在品種繁育方面，如果通過性別控制產下后代的準確率在90％以上，繁育畜群數量和性狀改良的速度將比無性別控制的大大提高，從而可以節省大量的時間、精力和費用。
哺乳動物XY精子分離技術是有效的性別控制方法，如果能預先將X精子和Y精子分離，而后通過人工授精或者體外受精，就能得到預知性別的后代。自1925年Lush首次報道分離兔子的精子以來，許多科學工作者對分離精子的研究做了不懈的努力和嘗試，這其中包括依據精子的密度、形態、大小、活力、表面電荷和免疫原性等特性，發明了各種各樣的方法試圖將決定性別的X精子和Y精分離開，但這些方法都有可靠性差、重復性低和效率不高的問題。直至目前，只有流式細胞儀精子分離法被公認為最科學最可靠，同時也是最高效的精子分離方法。流式細胞儀分離哺乳動物XY精子是根據哺乳動物X精子的DNA含量比Y精子多的原理，熒光染色之后通過分辨熒光差別將二者分開，受精之后達到性別控制的目的。
目前，流式細胞儀分離精子技術的不足之處在于分離精子的效率還較低，成本偏高，精子稀釋液中含有卵黃等影響精子著色的物質，因熒光染色后XY精子分辨率差進而影響了分離精子的純度，而且精子分離之后活力損失大，影響其受精能力。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種適用于哺乳動物精子分離的方法，在保證分離XY精子效率的同時，提高精子分離的準確率和分離后精子的活力，并適用于商業化生產。
本發明以如下技術方案解決上述技術問題(1)、在采集的公畜原精液中加入抗生素混合溶液，24小時內恒溫下保存。
(1)、在采集的公畜原精液中加入抗生素混合溶液，24小時內恒溫下保存。
(2)、用不含卵黃的精子稀釋液將原精液稀釋后加入熒光染色劑、并在水浴鍋中孵育染色，水浴結束后加入色素。
(3)、在恒溫下利用流式細胞儀分離所需的X或Y精子。
(4)、用預裝有含卵黃的精子接收液的試管收集分離后的X精子和Y精子，分離得到的精液經離心濃縮后可直接用于人工授精或體外受精，或低溫平衡后冷凍保存。
公畜原精液加入了抗生素混合溶液后，恒溫保存的溫度為22.5～27.5℃。
精液稀釋液的成分及含量為
稀釋的精液加入熒光染色劑Hoechst33342水浴染色后，加入色素FD&C#40的質量百分比為0.0025％～0.005％。
在10℃～25℃的恒溫下用流式細胞儀分離XY精子。
分離所用的鞘液成分及含量為
精子接收液成分及含量為
使用之前按照體積百分比加入10％～30％的新鮮卵黃。
與目前的精子分離技術相比，本發明的優點在于(1)、采用本發明的方法對精子染色可有效提高XY精子的分辨率。
現有的精子分離技術在精子分離之前，利用含有卵黃的稀釋液對原精液稀釋保存，其最大的缺陷在于卵黃等蛋白物質影響了精子對熒光染料Hoechst33342吸收的均一性，不利于流式細胞儀對X精子和Y精子的分辨。而本發明將新鮮的原精液直接恒溫保存，并加入混合抗生素抑制細菌的生長，在充分利用精漿中保護精子活力作用的物質同時，避免了卵黃等物質對精子染色均一性的影響。本發明利用改進的臺羅氏液，每隔2個小時進行一個批次的精子稀釋染色，染色結束立即進行分離，縮短染色到分離之間的時間間隔，在有效保證精子活力的同時使之得到均勻著色，利于X精子和Y精子的分辨。
(2)、采用本發明的方法分離精子可有效保持精子活力。
現有的精子分離技術在精子染色時，精子的稀釋倍數比較大，精漿中的保護物質被高度稀釋，保護作用下降，對精子活力造成很大影響。本發明在進行精子染色時，根據不同種類的動物將精子稀釋到1.0～1.5億/毫升，加入熒光染色劑、并在水浴鍋中孵育染色。水浴結束后加入色素，去除死亡的精子，僅對細胞膜完整的活精子進行分離。本發明還在分離精子的接收管中添加含有卵黃的精子接收液，具有保護精子膜并保持精子活力的作用。
(3)在現有的精子分離方法中，分離過程一般在室溫或恒溫在4℃下進行；本發明在精子通過流式細胞儀進行分離的整個過程中，包括在流式細胞儀進樣試管、進樣細管通道和接收液試管內，均在稍高的溫度下保持恒溫。這樣既能避免在較高溫度下分離時精子活力的快速損失和細菌的快速繁殖，又能避免溫度的急劇變化對精子造成的冷打擊。
將本發明的技術與人工授精和體外受精等動物繁殖新技術相結合應用于畜牧業，能極大提高畜牧業的生產效率。而且本發明的技術同樣可以適用于人類精液中XY精子的分離，用以盡量避免一些人患上與性別有關的疾病。
圖1本發明中流式細胞儀檢測到的XY精子DNA含量2本發明中分離得到的X精子樣本利用重分析方法檢測的準確率樣3本發明中分離得到的Y精子樣本利用重分析方法檢測的準確率樣圖具體實施方式
實施例1(1)將采集得到的公牛新鮮精液加入抗生素混合溶液，置于22.5℃下水浴恒溫保存。所加入的抗生素濃度如下
(2)、將原精液稀釋到1.5億/毫升，加入熒光染色劑Hoechst33342至40微克/毫升，在35℃的水浴鍋中染色孵育50分鐘。水浴結束后加入色素FD&C#40至質量百分比濃度0.0025％。精液稀釋液的成分和含量為
HEPES的全稱是N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸；
加入去離子水至200毫升；用1摩爾/升氫氧化鈉溶液調節pH7.0；用0.22微米孔徑的濾膜過濾除菌。
(3)、在16℃恒溫下用流式細胞儀對X精子和Y精子進行分離，分離所用的鞘液和接收液成分和含量分別為鞘液
TRIS的全稱是三羥甲基氨基甲烷；加入去離子水至1000毫升；用5摩爾/升的鹽酸調節pH6.8；0.22微米孔徑的濾膜過濾。
精子接收液
加入去離子水至100毫升；用5摩爾/升的鹽酸調節pH7.0；0.22微米孔徑的濾膜過濾；使用前每16毫升加入4毫升新鮮卵黃。
(4)、分離收集得到的精子離心濃縮，在精子圖像分析系統下檢測精子活率，10次重復試驗中得到的精子平均活率為(67±1.6)％。
(5)、分離得到的X精子和Y精子樣本用超聲波斷尾，重新加入Hoechst33342復染精子，通過流式細胞儀重分析精子DNA，利用高斯曲線擬合圖形確定分離精子的準確率。在5次的重復試驗中得到的X精子平均準確率為94％(如圖2)，Y精子平均準確率為89％(如圖3)。
實施例2將采集得到的隆林山羊新鮮精液加入抗生素混合溶液，置于25℃水浴恒溫保存，所加入的抗生素濃度以微克/毫升表示如下太樂菌素、林可霉素、壯觀霉素、慶大霉素分別為200、500、800和800。
將原精液稀釋到1.3億/毫升，加入熒光染色劑Hoechst33342至30微克/毫升，在33℃的水浴鍋中染色孵育60分鐘。水浴結束后加入色素FD&C#40至質量百分比濃度0.003％。
精液稀釋液中，氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、碳酸氫鈉、六水氯化鎂、丙酮酸鈉、葡萄糖、HEPES、牛血清白蛋白、硫酸慶大霉素的濃度以克/200毫升表示分別為1.1、0.04、0.005、0.15、0.01、0.04、0.15、1.5、0.1、0.005，乳酸鈉為0.7毫升/200毫升。加入去離子水至200毫升；用1摩爾/升氫氧化鈉溶液調節pH7.2；用0.22微米孔徑的濾膜過濾。
在10℃恒溫下用流式細胞儀對X精子和Y精子進行分離。分離所用的鞘液成分為TRIS、檸檬酸、果糖、氯化鈉、青霉素、鏈霉素的濃度以克/1000毫升表示分別為22.00、10.0、10.0、1.0、0.05、0.05；加入去離子水至1000毫升；用5摩爾/升的鹽酸調節pH6.8；用0.22微米孔徑的濾膜過濾。
分離后所用的精子接收液成分及含量TRIS、檸檬酸、果糖、太樂菌素、林可霉素、壯觀霉素、慶大霉素的濃度以克/100毫升表示分別為3.0、1.5、1.0、0.015、0.030、0.060、0.070；加入去離子水至100毫升；用5摩爾/升的鹽酸調節pH7.0；0.22微米孔徑的濾膜過濾，每12毫升接收液加入4毫升新鮮卵黃之后使用。
分離收集得到的精子離心濃縮，在精子圖像分析系統下檢測精子活率，10次重復試驗中得到的山羊分離精子平均活率為(73±4.8)％。
分離得到的X精子和Y精子樣本用超聲波斷尾，重新加入Hoechst33342復染精子，通過流式細胞儀重分析精子DNA，利用高斯曲線擬合圖形確定分離精子的準確率。在5次的重復試驗中得到的分離山羊X精子平均準確率為96％，Y精子平均準確率為92％。
實施例3將采集得到的長白公豬新鮮精液加入抗生素混合溶液，置于27.5℃水浴恒溫保存，所加入的抗生素濃度如下太樂菌素、林可霉素、壯觀霉素、慶大霉素的濃度以微克/毫升表示分別為180、400、700、700；
將精液稀釋到1.0億/毫升，加入熒光染色劑Hoechst33342至30微克/毫升，在37℃的水浴鍋中染色孵育45分鐘。水浴結束后加入色素FD&C#40至質量百分比濃度0.0035％。
精液稀釋液中，氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、碳酸氫鈉、六水氯化鎂、丙酮酸鈉、葡萄糖、HEPES、牛血清白蛋白、硫酸慶大霉素的濃度以克/200毫升表示分別為1.2、0.05、0.01、0.18、0.02、0.05、0.20、2.0、0.8、0.01，乳酸鈉為0.75毫升/200毫升。加入去離子水至200毫升；用1摩爾/升氫氧化鈉溶液調節pH7.0，用0.22微米孔徑的濾膜過濾。
在25℃恒溫下用流式細胞儀對X精子和Y精子進行分離；分離所用的鞘液成分為TRIS、檸檬酸、果糖、氯化鈉、青霉素、鏈霉素的濃度以克/1000毫升表示分別為25.00、12.0、9.0、0.9、0.2、0.15。加入去離子水至1000毫升；用5摩爾/升的鹽酸調節pH6.8；用0.22微米孔徑的濾膜過濾。
分離后所用的接收液成分及含量TRIS、檸檬酸、果糖、太樂菌素、林可霉素、壯觀霉素、慶大霉素的濃度以克/100毫升表示分別為4.5、2.5、1.5、0.02、0.050、0.080、0.080；加入去離子水至100毫升；用5摩爾/升的鹽酸調節pH7.0；0.22微米孔徑的濾膜過濾；每12毫升接收液加入1.8毫升新鮮卵黃后使用。
分離收集得到的精子離心濃縮，在精子圖像分析系統下檢測精子活率，10次重復試驗中得到的精子平均活率為(60±5.5)％。
分離得到的X精子和Y精子樣本用超聲波斷尾，重新加入Hoechst33342復染精子，通過流式細胞儀重分析精子DNA，利用高斯曲線擬合圖形確定分離精子的準確率。在5次的重復試驗中得到的X精子平均準確率為90％，Y精子平均準確率為86％。
權利要求
1.一種分離哺乳動物XY精子的方法，根據哺乳動物X精子的DNA含量比Y精子多的原理，通過熒光染色之后使用流式細胞儀進行分離，其特征是(1)、在采集的公畜原精液中加入抗生素混合溶液，24小時內恒溫下保存。(2)、用不含卵黃的精子稀釋液將原精液稀釋后加入熒光染色劑、并在水浴鍋中孵育染色。水浴結束后加入色素。(3)、在恒溫下利用流式細胞儀分離所需的X或Y精子。(4)、用預裝有含卵黃的精子接收液的試管收集分離后的X精子和Y精子，分離得到的精液經離心濃縮后可用于人工授精或體外受精，或低溫平衡后冷凍保存。
2.如權利要求1所述的分離哺乳動物XY精子的方法，其特征是公畜原精液加入了抗生素混合溶液后，恒溫保存的溫度為22.5～27.5℃。
3.如權利要求1或2所述的分離哺乳動物XY精子的方法，其特征是精液稀釋液的成分及含量為成分 克/200毫升氯化鈉 1.0～1.2氯化鉀 0.04～0.05磷酸氫二鈉 0.005～0.010碳酸氫鈉 0.15～0.18六水氯化鎂 0.01～0.02丙酮酸鈉 0.04～0.05葡萄糖 0.15～0.20乳酸鈉 0.70～0.75毫升/200毫升HEPES1.5～2.0牛血清白蛋白 0.1～0.8硫酸慶大霉素 0.005～0.010
4.如權利要求1所述的分離哺乳動物XY精子的方法，其特征是在10℃～25℃恒溫下利用流式細胞儀分離X或Y精子。
5.如權利要求4所述的分離哺乳動物XY精子的方法，其特征是利用流式細胞儀分離X或Y精子時所用的鞘液成分及含量為成分克/1000毫升TRIS22.00～25.00檸檬酸 10.00～13.00果糖8.00～10.00氯化鈉 0.80～1.00青霉素 0.05～0.29鏈霉素 0.05～0.25
6.如權利要求4或5所述的分離哺乳動物XY精子的方法，其特征是接收液成分及含量為成分克/100毫升TRIS3.00～4.50檸檬酸 1.50～2.50果糖1.00～1.50太樂菌素0.010.02林可霉素0.03～0.05壯觀霉素0.06～0.08慶大霉素0.05～0.08使用之前按照體積百分比加入10％～30％的新鮮卵黃。
全文摘要
一種分離哺乳動物XY精子的方法，依據哺乳動物X精子的DNA含量比Y精子多的原理，利用熒光染料Hoechst33342對精子DNA染色之后通過流式細胞儀將其分離。本發明通過改進精子分離之前的保存方法、精子的稀釋液、分離精子的鞘液和接收液，在保證分離XY精子效率的同時，提高了精子分離的準確率和分離后精子的活力，適用于黃牛、水牛、山羊等哺乳動物XY精子的大規模商業化分離生產，并可與人工授精和體外受精等動物繁殖新技術相結合，大大提高畜牧業生產的效率。
文檔編號C12N5/06GK1667118SQ20041006079
公開日2005年9月14日 申請日期2004年8月31日 優先權日2004年8月31日
發明者盧克煥, 陸陽清, 張明 申請人:廣西大學