專利名稱：一種具有防治Ⅰ型糖尿病作用的重組門冬酰胺酶的制作方法
技術領域：
在醫學領域中，本發明是一種重組蛋白，能用于預防和治療I型糖尿病的發生。
背景技術：
大腸桿菌L-門冬酰胺酶是一種臨床上廣泛使用的抗白血病藥物，本實驗室已從大腸桿菌野生株中克隆了該酶基因，工程菌表達的酶蛋白占菌體總蛋白的48％以上，建立了相應的滲透振擾提取新工藝，能以高收率提取獲得高純度重組蛋白。在研究中我們注意到，當門冬酰胺酶基因的C末端區連接上破傷風毒素830-854肽段基因后，再在下游接加適當長度的多肽編碼序列時，所表達的融合蛋白可以分泌到細菌周質腔，并能形成有門冬酰氨酶活性的重組分子，這表明融合的多肽并沒有改變或輕微改變了酶分子的天然構象，換而言之，連接的多肽可能僅游離于酶分子的表面，具有相對的獨立性。
門冬酰胺酶作為有效表位載體有許多優點(1)門冬酰胺酶活力測定的靈敏度高，如果呈現構象化表位的酶依然具有活力，這相當于構象化多肽已被酶標記，并且不影響多肽與抗體的結合活性；(2)門冬酰胺酶由四個相同亞基構成，因此一個酶分子上呈現有四個環狀多肽，能方便地設計“夾心法”等酶免疫測定方法。(3)我們在門冬酰胺酶PAGE電泳時還發現該酶有形成多聚分子的傾向，能形成二聚體、三聚體和四聚體蛋白，這種顆粒化傾向有利于增強免疫原性。該酶在臨床應用中已經顯示有很強的免疫原性，能用于發展疫苗；(4)門冬酰胺酶是血中半衰期較長的藥物。若肌肉注射也能緩慢吸收。有足夠時間供抗原充分發揮免疫刺激作用；(5)門冬酰胺酶也有一個二硫鍵，能分泌到細胞周質腔(periplasm)折疊，在周質腔氧化環境中二硫鍵容易自發形成。(6)將抗原多肽通過T細胞表位肽段與門冬酰胺酶C端融合，在細菌中高效表達并分泌到細胞周質腔中，這種基因工程菌在周質腔中含大量表面呈現有抗原多肽的重組門冬酰氨酶，能夠直接用于發展活菌苗或滅活菌苗。(7)門冬酰氨酶已經在臨床上用于治療白血病和淋巴瘤，其安全性已經得到驗證，用該酶作為呈現載體，開發用于人體的藥物，將是較為安全的。
抗熱休克蛋白60((heat shock protein 60，HSP60)是人I型糖尿病，或稱胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)中極其重要的一個抗原，P277多肽是存在于人HSP60蛋白上437-460的一段特異性多肽，是在IDDM中發揮作用的特異片段，序列為VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED。有文獻報道了一次隨機的、雙盲的二期臨床實驗，實驗結果表明，P277能挽救機體內未受損的胰島β細胞的功能(即使機體已表現出明顯的臨床癥狀)，使其能繼續釋放內源性的胰島素。在鼠和人中，與胰島β細胞決定簇作用的主要為CD4+T細胞，而CD4+T細胞按其分泌的細胞因子不同又分為Th1細胞和Th2細胞。Th1細胞主要分泌IL-2和IFN-γ，前者能有效刺激T細胞增值，后者為炎癥因子，能引起阻止發炎并誘導B細胞產生IgG2α抗體。而且由于77％的Th1細胞具有細胞毒作用，它可以溶解呈遞自身移植抗原的β細胞，從而使抗體生成降低，降低體液免疫。Th2細胞分泌IL-2和IL-10，能降低Th1效應。IL-4促進β細胞產生IgG1抗體，抑制Th1產生前炎癥因子。IL-10通過影響抗原呈遞細胞和巨噬細胞釋放前炎癥因子而抑制Th1活性。P277可以作用于T細胞，誘使Th1向Th2細胞類型的轉化，至于P277為什么能誘導這種變化，現在認為關鍵在于P277本身的抗原特性，結構等，因為T細胞表型的分化受不同抗原刺激產生不同的結果。因此可考慮用此作為免疫疫苗來預防和治療I型糖尿病。疫苗的方法可以克服傳統的口服或注射胰島素及器官移植等方法的諸多缺點，更重要的是它能挽救未損傷的β細胞，使其繼續釋放內源性的胰島素。
由于線性多肽構象不穩定、免疫原性較弱，常不能激發有效的保護性免疫，這是多肽疫苗研究中常遇到的老問題。雖然人們也常用戊二醛等雙功能試劑將多肽聚合，或用化學方法將肽與載體偶聯來彌補多肽免疫原性較弱的不足、有時也通過在肽兩端引入半胱氨酸使多肽通過二硫橋環化的方法來保持肽的特定構象，然而常常不能同時兼顧兩方面的問題。通過基因工程法將四個拷貝的多肽呈現到一個酶分子表面，有望使多肽能激發機體產生抗多肽特異性免疫反應。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種呈現P277肽段的重組門冬酰氨酶基因和蛋白質。
本發明的再一目的是提供生產該該重組蛋白的方法。
本發明的還有一個目的是該重組門冬酰氨酶的用途。
本發明的第一方面，提供了一種呈現多肽P277的重組門冬酰氨酶基因和蛋白。該基因序列編碼具有圖1所示氨基酸序列的重組蛋白質，該蛋白質的DNA序列包括圖1中第1-1218位核苷酸序列。應用基因操作技術將具有強T輔助表位功能的破傷風毒素830-854多肽(QYIKANSKFIGITELIYSYFPSVI，簡稱TTP)、作為連接肽的Ser-Ser-Gly-Thr肽段和作為呈現肽段的P277連接到門冬酰氨酶的C末端，在大腸桿菌中表達出有活性的融合蛋白，具體步驟是(1)用聚合酶鏈反應(PCR)從大腸桿菌染色體DNA中擴增獲得門冬酰氨酶II基因，在大腸桿菌中高效表達；(2)用基因工程方法將具有強T輔助表位功能的破傷風毒素830-854多肽(QYIKANSKFIGITELIYSYFPSVI，以下簡稱TTP)、作為連接肽的Ser-Ser-Gly-Thr肽段和P277肽段(VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED)連接到門冬酰氨酶的C末端，在大腸桿菌中表達出有活性的融合蛋白；這樣，P277肽段就被呈現到了酶的表面，由于門冬酰氨酶是同性四聚體蛋白，因此，每個酶分子表面呈現有四個同形的多肽。通過測定酶活力，能夠觀察到這種新的呈現有P277多肽的重組蛋白在大腸桿菌中表達并分泌到細菌細胞的周質腔中，用滲透振擾法也很容易從周質腔中分離出具有門冬酰氨酶活性的重組酶。本發明所述的重組酶基因適宜在大腸桿菌中表達，將基因引入其他生物體，如腸道習居的各種微生物、各種減毒的病原菌，同樣能表達出相同功能的重組酶。
在本發明的第二方面，是提供生產該抗人I型糖尿病重組蛋白的方法，其技術路線詳述如下1.P277基因的設計與獲得P277是人HSP60上的一段437VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED460，該序列是在HSP60中對IDDM發揮作用的特異片段。我們將442和447位的C(半胱氨酸)用V(纈氨酸)來置換，以增強肽段的穩定性，兩者具有相同的免疫特性。根據多肽P277氨基酸序列，選擇原核和真核生物均適用的密碼子，借助于計算機設計兩條寡核苷酸鏈，分別作為上游、下游引物，并在上游引物5’端加上限制性核酸內切酶BamHI的酶切位點，下游引物5’端加上終止密碼子和限制性核酸內切酶HindIII的酶切位點，兩條引物互補序列為20個堿基，通過聚合酶鏈式反應(PCR)法獲得P277多肽基因的核苷酸序列。
2.門冬酰胺酶-TTP基因的設計與獲得在門冬酰胺酶-TTP堿基序列的前提下，借助于計算機設計兩條寡核苷酸鏈，以本實驗室已構建的pET28-AnsB-TTP質粒為模板，5’端添加了NcoI的識別位點，3’端添加了BclI的識別位點，通過PCR方法獲得AnsB-TTP的核苷酸序列。
3.pET28-P277重組基因工程菌的構建P277基因經BamHI、HindIII切割插入經BamHI、HindIII切割的pET-28(a)質粒載體中，組成融合表達的重組質粒pET28-P277，重組質粒轉化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。
4.pET28-AnsB-TTP-P277重組基因工程菌的構建AnsB-TTP基因經NcoI、BclI切割插入經NcoI、BamHI切割的pET28-P277中，組成融合表達的重組質粒pET28-AnsB-TTP-P277，重組質粒轉化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。
5.工程菌發酵及重組門冬酰胺酶-TTP-P277的獲得以液體LB為基礎培養基，玉米漿培養基為發酵培養基，發酵參數如下溫度37℃，pH6.8-7.2。發酵后離心收集工程菌，經滲透振擾法獲取重組酶。用SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，可以判斷純化的重組酶的純度。
在本發明的第三方面是該重組酶的用途，如上所述，此種重組蛋白能用于防治人I型糖尿病的發生。P277肽段呈現在重組酶的表面，容易被機體的免疫細胞表面的受體識別，重組酶還能憑借強的T輔助表位(如破傷風毒素的830-854多肽)，誘導T輔助細胞的應答，激發機體產生針對P277多肽的特異性抗體，促使機體Th1型免疫反應向Th2型免疫反應的轉化，從而起到預防和治療I型糖尿病的作用。我們選用國際上通用的I型糖尿病的動物模型NOD(non-obese diabetic mouse，NOD)小鼠，隨機分成四組，每組十只，分別是空白對照組，AnsB-TTP-P277腹腔注射組，P277腹腔注射組，門冬酰胺酶對照組。分別于4周齡，7周齡，10周齡3次免疫，每月測小鼠體內血糖水平及相應的抗體滴度。結果顯示，P277和AnsB-TTP-P277都可以不同程度的抑制NOD小鼠糖尿病的發生，AnsB-TTP-P277明顯優于單獨使用P277，更有利于防治I型糖尿病的發生。我們通過初步藥效學實驗表明了此重組蛋白AnsB-TTP-P277對I型糖尿病的發生有明顯的降低作用。
圖1重組蛋白AnsB-TTP-P277的全基因序列(1218bp)及氨基酸序列(406aa)圖2重組質粒pET28-P277和pET28-AnsB-TTP-P277結構圖。
圖3pET28-AnsB-TTP-P277 N端部分基因測序結果。
圖4pET28-AnsB-TTP-P277 C端部分基因測序結果圖5SDS-PAGE電泳結果顯示AnsB-TTP-P277的融合表達。1.標準分子量蛋白；2.載荷pET28-AnsB-TTP-P277質粒的大腸桿BL21細胞全蛋白(乳糖誘導后)；3.載荷pET28-AnsB-TTP-P277質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導前)。
圖6SDS-PAGE電泳顯示AnsB-TTP-P277融合蛋白的純化.1.標準分子量蛋白；純化的AnsB-TTP-P277融合蛋白；3.載荷pET28-AnsB-TTP-P277質粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導后)；4.大腸桿菌BL21細胞全蛋白；5.純化的大腸桿菌門冬酰氨酶。
圖7ELISA測定結果顯示融合蛋白重組門冬酰胺酶-TTP-P277和P277都能誘發小鼠產生抗P277的抗體，其中重組酶激發機體產生的抗體滴度顯著高于多肽P277。圖例■AnsB-TTP-P277組；□P277組圖8Western blot檢測結果顯示重組門冬酰胺酶-TTP-P277能誘發NOD小鼠產生抗P277抗體。1.標準分子量蛋白；2.氧化態rhVEGF-P277；3.還原態rhVEGF-P277；4.rhVEGF。箭頭A顯示rhVEGF-二聚體，箭頭B顯示rhVEGF-P277單體。
圖9各組小鼠免疫后不同月齡血清中血糖的含量。結果顯示AnsB-TTP-P277可以顯著降低NOD小鼠血糖含量，單純注射多肽P277也可降低NOD小鼠的血糖，另單純的門冬酰胺酶也對小鼠血糖有不同程度的降低。圖例■對照組； P277組；□AnsB-TTP-P277組； AnsB組圖10各組小鼠不同時期糖尿病發生率，結果顯示重組酶AnsB-TTP-P27免疫可以顯著降低NOD鼠糖尿病的發生。圖例 對照組； AnsB；-×-P277組； AnsB-TTP-P277組具體實施方式
材料(1)菌株與質粒宿主菌E.coli BL21(Escherichia coli BL21)是基因工程常用工具菌種，在與基因工程研究有關的實驗室一般都有保存。
質粒pET28a-AnsB-TTP由本實驗室構建并保存，門冬酰胺酶也由本實驗室分離純化。
(2)酶和試劑分子克隆工具酶和試劑、細菌基因組、質粒抽提試劑盒為普洛麥格(Promega)公司產品；PCR回收試盒和瓊脂糖膠回收試劑盒為華舜生物工程公司產品。
(3)培養基LB培養基，配方見參考文獻Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。該書是基因工程技術的經典著作，在許多高校圖書館都有收藏。
玉米漿培養基含有玉米漿25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。
(5)Cellouse-DEAE DE-52為Whatman公司產品。
(6)辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠二抗為武漢博士德公司產品。
(7)3、3`、5、5`-四甲基聯苯胺(TMB)、二氨基聯苯胺(DAB)、過氧化氫尿素和牛血清白蛋白(BSA)為美國西格馬(Sigma)公司產品。
(8)96孔酶標板為美國康寧(Corning)公司產品。
(9)硝酸纖維素膜為美國Millipore公司產品。
(10)測定小鼠血糖的儀器為Hitachi Automatic Analyzer(Model-7150，Tokyo，Janpan)。
方法分子生物學操作方法質粒提取、聚合酶鏈反應、限制性核酸內切酶酶切、DNA片斷的回收、連接和轉化大腸桿菌在基因工程研究領域，這些都是常規操作方法，參見Sambrook J，Fristsh E F，ManiatisT.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
重組蛋白表達量的測定參見Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法進行。
實施例1 P277多肽基因的設計、合成和克隆根據P277多肽基因的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛的密碼子，在計算機的輔助下設計出2條寡核苷酸片段。首先通過PCR法合成P277多肽基因，將該基因克隆到pET28-(a)的L-ansB-C基因的C端，轉化大腸桿菌得到重組質粒命名為pET28-P277。具體方法如下2條寡核苷酸P15’-GCTGGATCCAGTTCTGGGTGGTGGCGTTGCTCTGCTGCGCGTTATCCCGGCTCTGG-3’P25’-GTCAAGCTTAATCTTCGTTAGCCGGGGTCAGGGAGTCCAGAGCCGGGATAACGCGC-3’通過PCR獲得P277 27多肽基因將寡核苷酸片段P1和P2按一定比例混合，二者互為引物和模板，94℃，30sec，58℃，30sec，72℃，30sec，共30個循環；72℃，10min。將擴增獲得的PCR產物經試劑盒純化后用限制性核酸內切酶BamH1和HindIII消化，與用相同限制性內切酶消化的pET28-(a)質粒連接，連接產物轉化大腸桿菌BL21，所獲得的轉化子中含連有P277多肽基因的重組質粒pET28-P277。
實施例2門冬酰氨酶-TTP-P277融合蛋白基因的構建、克隆和表達用普洛麥格試劑盒，抽提質粒pET28-AnsB-TTP。據AnsB-TTP基因序列設計并合成一對引物，在引物的兩頭加入酶切位點。上游引物5’-TTCGCCATGGCCAAGAACAATTGCGTACG-3’；下游引物5’-AAAATGATCAGTAGTACCAGAGATTAC-3’。以提取的質粒DNA為模板進行PCR擴增。擴增產物用NcoI和BclI酶切，和用NcoI和BamHI酶切的pED-P277載體連接。載體連接后轉化大腸桿菌E.coli BL21，轉化子涂布于含有卡那霉素的LB平板上培養16小時，通過測定菌體門冬酰氨酶活性進行陽性克隆篩選。從陽性克隆中抽提的質粒用核苷酸自動測序儀進行測定，驗證了基因克隆的正確性，該重組質粒命名為pET28-AnsB-TTP-P277，其結構見圖2。
實施例3門冬酰氨酶-TTP-P277融合蛋白在大腸桿菌中的表達將含重組質粒pET28-AnsB-TTP-P277的基因工程菌單菌落分別種入液體培養基中37℃過夜，按1％比例轉種入新鮮的液體培養基中，37℃培養4小時，加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG誘導大腸桿菌表達T7RNA聚合酶，菌體經離心回收后，用SDS電泳再經薄層掃描顯示重組門冬酰氨酶-TTP-P277融合蛋白占細菌總蛋白的30％左右，結果見圖5。菌體的門冬酰氨酶活力測定顯示重組門冬酰氨酶-TTP-P277融合蛋白的工程菌保持了酶活力，說明TTP的引入不僅能強化免疫原性，也有利于多肽的呈現，維持門冬酰氨酶原有的構像。
實施例4門冬酰氨酶-TTP-P277融合蛋白的制備含pET28-AnsB-TTP-P277質粒的工程菌培養在500ml搖瓶中進行。從新鮮轉接的平皿中挑取單菌落接入LB液體培養基中，37℃培養至對數期作為一級種子，以1％接種量接入到含200ml玉米漿培養基的500ml搖瓶中，37℃，260rpm培養4h后，加入1％乳糖誘導4h，以5000rpm離心25min收集菌體，用滲透休克法，即每1g濕菌體加入10ml滲透休克液(20％蔗糖，1mmol EDTA，10mmol/L，pH7.0磷酸緩沖液)中，在37℃攪拌1小時。8000rpm離心15min，收集上清，用陰離子交換樹脂DEAE纖維素DE52進行柱(2×60cm)層析，用含50mmol/LNaCl的PBS到含300mmol/L NaCl的PBS梯度洗脫，分步收集進行SDS-PAGE電泳檢測，門冬酰氨酶-TTP-P277在80-120mmol/L NaCl處的洗脫峰中，用SDS-PAGE電泳檢查制備樣品的純度(見圖6)。與天然的門冬酰氨酶相比，重組門冬酰氨酶-TTP-P277融合蛋白的比活力也很高，說明TTP-P277呈現在酶表面對酶活力影響較小，門冬酰氨酶能維持原有的構像。
實施例5重組酶AnsB-TTP-P277能誘發動物產生抗P277的特異抗體選用4周齡雌性NOD小鼠，隨機分成4組分別為PBS腹腔注射對照組、AnsB-TTP-P277腹腔注射實驗組、P277腹腔注射實驗組、和門冬酰氨酶腹腔注射對照組，每組各10只。分別腹腔注射對應的蛋白50ug/只(PBS對照組50ulPBS/只)，AnsB-TTP-P277、P277和門冬酰氨酶都用PBS溶解，加入弗氏不完全佐劑。以后每隔3周加強免疫一次，共進行2次加強免疫。每次免疫后3周內眥取血一次，血量為0.5-0.8ml，離心，取血清。
用純化的重組人血管內皮生長因子121和P277的融合蛋白(rhVEGF-P277)4℃過夜包被96孔ELISA酶標板，每孔100ul含50ug融合蛋白。包被后，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃滿孔封閉一小時。免疫后取血所得抗血清，用5％BSA(于pH7.5的PBS中)稀釋50倍，然后每孔加入100μl稀釋后的抗血清于37℃作用1小時。用PBST(含0.1％Tween-20)和自來水間隔洗滌6次后加入100μl以1∶20000稀釋的羊抗小鼠IgG二抗(辣根過氧化物酶標記)，每孔100μl，37℃作用1小時。PBST和自來水間隔洗滌6次，每孔加入100μl過氧化氫尿素和3、3`、5、5`-四甲基聯苯胺(TMB)溶液于37℃顯色30分鐘后，加入50μl 2MH2SO4終止反應，并于450nm波長下，測定各孔吸光度值。結果見圖7。結果表明，AnsB-TTP-P277和P277腹腔注射都能誘發小鼠產生特異的抗P277抗體，AnsB-TTP-P277誘發產生的抗體明顯高于P277。
實施例6抗P277特異抗體的Western檢測將純化后的rhVEGF、還原態和氧化態rhVEGF-P277用15％SDS-PAGE電泳后，于25V電壓電泳過夜轉移到硝酸纖維素膜上，然后以5％BSA溶液室溫封閉2小時。實施例5中所得抗血清稀釋50倍后，與硝酸纖維素膜上的抗原于37℃作用1小時后，以pH7.5 TBS緩沖液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；加入稀釋400倍的羊抗小鼠或兔IgG(辣根過氧化物酶標記)二抗，于37℃作用1小時，再以以pH7.5 TBS緩沖液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；最后，加入二氨基聯苯胺(DAB)溶液顯色。具體操作方法參考Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.888-898。NOD小鼠血清Western blot法檢測結果見圖8。氧化態rhVEGF-P277(泳道2)由于其鏈間二硫鍵的作用，部分蛋白質形成二聚體，在PAGE膠上表現為分子量分別為17kD和34kD的雙條帶，還原態rhVEGF-P277(泳道1)為單體，在膠上表現為分子量為16kD的單條帶。由于NOD小鼠血清中有抗P277抗體的存在，因此可以分別和膜上16kD和32kD的rhVEGF-P277蛋白帶雜交，但不和rhVEGF雜交(泳道4)，證實了AnsB-TTP-P277實驗組能誘發NOD小鼠產生特異的抗P277的抗體。
實施例8 HSP65-P277重組蛋白的藥效學研究選用4周齡雌性NOD小鼠，隨機分成4組，分別為PBS腹腔注射對照組、AnsB-TTP-P277腹腔注射實驗組、P277腹腔注射實驗組、和門冬酰氨酶腹腔注射對照組，每組各10只。分別腹腔注射對應的蛋白50ug/只(PBS對照組50ulPBS/只)，AnsB-TTP-P27、P277和門冬酰氨酶都用PBS溶解，加入弗氏不完全佐劑。以后每隔3周加強免疫一次，共進行2次加強免疫。每次免疫后3周內眥取血一次，以后每月取血一次。血量為0.5-0.8ml，離心，取血清5小時內用全自動生化分析儀測定血糖含量。結果見圖9，在降低NOD血糖方面，AnsB-TTP-P277明顯優于P277。以血糖濃度≥11.1umol/L判為糖尿病。各組小鼠糖尿病的發病率見圖10。結果表明重組蛋白AnsB-TTP-P277可以顯著降低NOD小鼠糖尿病的發生，P277和門冬酰胺酶對NOD小鼠也有不同程度降低作用。
權利要求
1.一種人工構建的呈現有P277肽段具有預防人I型糖尿病作用的門冬酰氨酶，其特征在于通過基因操作將P277肽段通過一段間隔肽和源于破傷風毒素的T輔助表位肽段，連接在L-門冬酰氨酶的C端；形成的融合基因可以表達產生具有門冬酰氨酶活性的融合蛋白，P277多肽被呈現到酶表面，不影響酶自身的折疊。
2.如權利要求1所述呈現有P277肽段的重組門冬酰氨酶，它包括序列表1所示的第1-406位氨基酸序列。
3.如權利要求2所述的DNA序列，其特征在于，該DNA序列包括序列表1中第1-1218位所示的核苷酸序列。
4.根據權利要求1所述呈現有P277肽段的重組門冬酰氨酶，其特征在于免疫動物能誘發機體產生抗P277的抗體。
5.根據權利要求1所述的重組蛋白能預防和治療I型糖尿病。
6.根據權利要求3所述為呈現有P277肽段的重組門冬酰氨酶的基因，其特征在于可直接將該基因引入微生物體內表達，并將表達有該重組酶的微生物體直接作為疫苗。
7.根據權利要求1所述呈現有P277肽段的重組門冬酰氨酶，其特征在于可與其他藥物活性成分組合制成藥物組合物。
全文摘要
本發明提供了一種能用于預防和治療I型糖尿病的重組門冬酰胺酶，通過基因操作，將I型糖尿病特異的一段抗原表位P277和源于破傷風毒素的T輔助表位肽段融合到門冬酰氨酶的C端，形成一種新的重組蛋白和相應編碼基因。該基因在大腸桿菌中高效表達，生成的重組酶能分泌到周質中并保持大部分酶活性，并能通過滲透振擾法快速制備。重組酶將P277多肽呈現到了酶表面，能夠誘發機體產生抗P277多肽的的特異抗體，增強P277的免疫原性，極大地提高了P277預防I型糖尿病的作用。
文檔編號C12N15/52GK1654639SQ200410065969
公開日2005年8月17日 申請日期2004年12月29日 優先權日2004年12月29日
發明者劉景晶, 朱愛華, 劉文濤, 李文佳, 吳潔, 曹榮月 申請人:中國藥科大學