一種微生物培養基及其用途的制作方法

專利名稱：一種微生物培養基及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物培養基及其用途，特別是一種改進的硫乙醇酸鹽培養基，該培養基適用于厭氧菌或兼性厭氧菌的菌落形成單位(Colony Forming Units，CFU)計數，特別是生孢子梭狀芽孢桿菌(簡稱生孢梭菌)菌落形成單位(ColonyForming Units，CFU)計數，并用于無菌試驗培養基靈敏度試驗，屬于生物制品領域。
背景技術：
微生物培養基(簡稱培養基)作為科學研究和應用科學的重要支撐條件，發揮著其他手段不可替代的作用。除專門規定的之外，藥品、生物制品、敷料、縫合線、無菌器具以及藥典中要求無菌檢查的品種都需要進行無菌檢查。無菌試驗培養基是藥品、生物制品無菌檢驗的重要手段。如果無菌試驗培養基本身存在質量問題，將影響被測藥品、生物制品的無菌檢查結果，而臨床上一旦使用含菌的藥品、生物制品，將可能導致十分嚴重的后果。無菌試驗培養基質量的優劣直接關系被檢測藥品、生物制品的質量，并進一步關系到用藥的安全性。
目前我國進行無菌檢測的培養基主要為《中華人民共和國藥典》(2000年版，簡稱《藥典》)和《中國生物制品規程》(2000年版，簡稱《規程》)中公開的硫乙醇酸鹽流體培養基I&II、改良馬丁培養基、選擇性培養基、營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基和改良馬丁瓊脂培養基。
需氧性和厭氧性雜菌的無菌檢查常用硫乙醇酸鹽培養基，現有技術中公開的硫乙醇酸鹽培養基都是流體狀，主要成分為酪胨(胰酶水解)15.0g酵母浸出粉5.0g葡萄糖5.0g 氯化鈉2.5g
L-胱氨酸0.5g瓊脂 0.5～0.7g硫乙醇酸鈉 0.5g新配制的0.1％刃天青溶液1.0ml(或硫乙醇酸0.3ml) (或新配制的0.2％亞甲基藍溶液0.5ml)水 1000ml現有技術中認為，由于上述培養基具有一定的黏度，不適宜檢測某些被測樣品，如粘稠供試品，在這種情況下，通常去除上述配方中的瓊脂和刃天青，在美國，這種不含有瓊脂和刃天青的硫乙醇酸鹽培養基也叫做選擇性硫乙醇酸鹽培養基，國內則稱為不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養基。此培養基應在厭氧條件下培養。
現有技術中，無菌試驗培養基靈敏度檢查法是質控無菌試驗用培養基的手段，其方法主要公開在2000年版的《藥典》和《規程》中，《藥典》中規定的需氧菌和厭氧菌無菌試驗培養基靈敏度試驗法都包括菌液的制備和接種，并基本上通過接種培養基管數的2/3以上呈現生長的最高稀釋度為該培養基的靈敏度，3次試驗中，以2次達到的最高靈敏度為判定標準。
2005版《藥典》的征求意見稿中公開了如下的無菌試驗培養基靈敏度試驗方法，其中涉及需氧菌、厭氧菌的檢查方法為將某一菌種的新鮮培養物分別接種于被檢的培養基中養培一定時間，上述培養物用0.9％無菌氯化鈉溶液制成每毫升含菌10～100菌落形成單位(cfu)的菌懸液。取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養基7支，分別接種菌種各2支，每支接種量為1ml(含菌10～100cfu)，另1支不接種作為空白對照，培養3天，逐日觀察結果。若空白對照管無菌生長，加菌的培養基管均生長良好，則該培養基的靈敏度檢查符合規定。
歐洲、美國、英國等發達國家和地區的藥典中主要采用微生物促生長試驗法，在液體培養基中接種少量(10-100CFU)菌，培養一定時間后觀察是否出現清晰可見的微生物生長。對于需氧菌和厭氧菌，所采用的培養基亦為液體硫乙醇酸鹽培養基或選擇性硫乙醇酸鹽培養基。
現有的研究證明，《規程》中無菌試驗培養基靈敏度試驗法的準確性欠佳(參見高尚先等人“對無菌試驗培養基靈敏度試驗法準確性的初步研究”，《藥物分析雜志》，2004，24(1)52-58)。而《藥典》中，采用比濁稀釋法制備菌懸液，誤差較大，難以準確加入質控菌的活菌數。2005版《藥典》中公開的質控菌的CFU計數為稀釋法，并非真實的CFU計數，生孢梭菌的CFU計數缺乏可操作性。國外亦未見生孢梭菌的CFU計數方法。
此外，培養基也是疾病診斷的重要手段之一。盡管分子和免疫學診斷技術不斷發展，采用微生物培養法鑒定某些致病菌仍然是至關重要的手段。
如果培養基含有某種或多種細菌生長所需要的營養成分時，將菌株接種于培養基上，在合宜溫度下培養，1-2天內菌體即能通過很多次細胞分裂而進行繁殖，形成一個可見的細胞群體的集落，稱為菌落。每一種細菌所形成的菌落都有它自己的特點，例如菌落的大小，表面干燥或濕潤、隆起或扁平、粗糙或光滑，邊緣整齊或不整齊，菌落透明或半透明或不透明，顏色以及質地疏松或緊密等。因此，現有技術中，通過平板或平皿培養來檢查細菌的數量和類型。
菌落形成單位(Colony Forming Units，CFU)計數是在活菌培養計數時，由單個菌體或聚集成團的多個菌體在固體培養基上生長繁殖形成肉眼可見的菌落，稱為菌落形成單位，這種使用菌落形成單位表達樣品中活菌的數量被稱為菌落形成單位計數(CFU)。也就是說，采用CFU計數時，樣品中活菌含量總數為在一定的培養條件下單位容量中的菌落形成單位，縮寫可表示為CFU/mL，CFU/25cm2，CFU/皿；而不是樣品中絕對菌數。目前，菌落形成單位計數廣泛應用于采用微生物培養基診斷疾病，參見中國專利申請01117809.4。
因此開發能夠用于無菌試驗培養基靈敏度試驗中質控菌CFU計數的培養基或疾病診斷的培養基是非常迫切而又具有實際意義的。

發明內容
本發明目的在于提供一種微生物培養基，該培養基適宜于厭氧或兼性厭氧菌，特別是生孢子梭狀芽孢桿菌(簡稱生孢梭菌)菌落形成單位(Colony Forming Units，CFU)計數，其CFU計數能夠接近最大活菌數，大大提高無菌試驗培養基靈敏度試驗中質控菌生孢梭菌CFU計數的準確性，以及疾病診斷的準確性，具有良好的可操作性。
本發明的另一目的在于提供上述微生物培養基在無菌試驗培養基靈敏度試驗中生孢梭菌CFU計數以及疾病診斷中的用途。
為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種微生物培養基，其在1000重量份的水中含有胰酪蛋白胨5-30重量份，酵母浸出粉0.5-20重量份，葡萄糖0.5-20重量份，氯化鈉1-15重量份，L-胱氨酸0.1-5重量份，硫乙醇酸鈉或硫乙醇酸0.1-8重量份，，其特征在于所述微生物培養基中，還含有瓊脂，瓊脂的含量為使所述的微生物培養基的凝膠強度為50-500g/cm2。
優選瓊脂的含量為使所述的微生物培養基的凝膠強度為100-400g/cm2。更優選瓊脂的含量為使所述的微生物培養基的凝膠強度為140-350g/cm2。
優選其他組分的含量為胰酪蛋白胨12-18重量份，酵母浸出粉3-8重量份，葡萄糖3-8重量份，氯化鈉2-4重量份，L-胱氨酸0.2-0.8重量份，硫乙醇酸鈉或硫乙醇酸0.2-0.8重量份。
更優選在1000重量份水中含有胰酪蛋白胨15.0重量份，酵母浸出粉5.0重量份，葡萄糖5.0重量份，氯化鈉2.5重量份，L-胱氨酸0.5重量份，硫乙醇酸鈉或硫乙醇酸0.5重量份。
本發明的微生物培養基還包括0.0005-0.01重量份的刃天清或新配制的0.2％亞甲基藍溶液0.2---0.8重量份。
在本發明的另一種實施方式中，所述微生物培養基為在1000重量份的水中含有胰酪蛋白胨5-30重量份，酵母浸出粉0.5-20重量份，葡萄糖0.5-20重量份，氯化鈉1-15重量份，L-胱氨酸0.1-5重量份，硫乙醇酸鈉或硫乙醇酸0.1-8重量份，其特征在于所述微生物培養基中，還含有2-10重量份的瓊脂。
其中瓊脂的含量優選為4-6重量份；更優選為5重量份。
優選其他組分的含量為在1000重量份水中，胰酪蛋白胨12-18重量份，酵母浸出粉3-8重量份，葡萄糖3-8重量份，氯化鈉2-4重量份，L-胱氨酸0.2-0.8重量份，硫乙醇酸鈉或硫乙醇酸0.2-0.8重量份。
更優選在1000重量份水中含有胰酪蛋白胨15.0重量份，酵母浸出粉5.0重量份，葡萄糖5.0重量份，氯化鈉2.5重量份，L-胱氨酸0.5重量份，硫乙醇酸鈉或硫乙醇酸0.5重量份。
上述培養基中還進一步包括0.001-0.003g刃天清或新配制的0.2％亞甲基藍溶液0.2-0.8ml。
本發明的培養基的制備方法為除葡萄糖、刃天青外，取上述成分加入水中，在低于40度下溶解后，調節PH為弱堿性，煮沸，濾請，加入葡萄糖和/或刃天青，搖勻，調節PH6.5-7.5，滅菌并分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應符合培養結束后培養基氧化層(粉紅色)不超過培養基深度的1/2。滅菌。在供試品接種前，培養基氧化層的顏色不得超過培養基深度的1/3，否則，須經100℃水浴加熱至粉紅色消失(不超過20分鐘)，迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。
本發明的培養基可以用于厭氧菌或兼性厭氧菌的菌落形成單位(ColonyForming Units，CFU)計數，特別是生孢子梭狀芽孢桿菌(簡稱生孢梭菌)菌落形成單位(Colony Forming Units，CFU)計數，以及在無菌試驗培養基靈敏度試驗上的應用。
本發明的研究人員在對生孢梭菌CFU計數試驗的研究中意外地發現，與現有技術中的教導相反，當硫乙醇酸鹽培養基中瓊脂的用量增加至使該培養基的凝膠強度為50-500時，在各組分的綜合作用下，本發明的培養基為軟固體狀并具有良好的成型性，成型后富有彈性和韌性，厭氧菌或兼性厭氧菌的活菌在該培養基上分布和生長良好；這使得采用該培養基進行生孢梭菌CFU計數成為可能。進一步研究發現，采用該培養基可使該菌的CFU計數接近最大活菌數，菌落直徑較大、形態良好、呈單個典型菌落。因此，采用本發明培養基進行生孢梭菌CFU計數，具有更高的靈敏度、準確性及可操作性。
本發明中的菌落形成單位(colony forming unit，CFU)計數，是指在活菌培養計數時，由單個菌體或聚集成團的多個菌體在固體培養基上生長繁殖所形成的集落，稱為菌落形成單位，以此表達活菌的數量。
大量的實驗證明，生孢梭菌在本發明的微生物培養基中的CFU計數結果，明顯優于現有技術中公開的其它各種培養基，包括但不限于厭氧菌瓊脂培養基、硫乙醇酸鹽(1.4％瓊脂)固體培養基、營養瓊脂培養基、含瓊脂濃度為0.5％的營養瓊脂培養基等。特別是凝膠強度為140-250g/cm2或瓊脂含量為4-8重量份的微生物培養基，效果遠遠好于現有技術中公開的任何一種培養基，這可能是由于當凝膠強度過低時，瓊脂僅僅起到增稠的作用，而不能凝固，當凝膠強度過高時，不利于菌的生長。
雖然本發明的培養基在有氧條件下的菌落形成單位計數結果優于現有技術中的其他微生物培養基，但厭氧條件下培養的結果明顯優于有氧條件。
本發明還涉及一種厭氧菌或兼性厭氧菌CFU計數的方法，包括以下步驟(1)制備菌含量為1×10-6菌/ml的厭氧菌或兼性厭氧菌菌液；(2)將菌液加入無菌培養皿中，用本發明的微生物培養基澆注，(3)厭氧條件下25-38℃培養，12-72小時內進行平皿CFU計數。
步驟(1)中，菌液的制備方法為將菌種接種于不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養基中，經30-35℃培養12-72小時后，將其置于裝有無菌生理鹽水的試管內并稀釋至均勻菌液，再將菌液稀釋至與標準比濁管相同之濃度，并作10倍稀釋至菌含量為1×10-6菌/mL。
其中的稀釋液也可以采用0.1％蛋白胨水。
菌液的制備也可以采用《規程》和《藥典》中公開的方法。
步驟(2)中，取上述菌液1mL，置直徑約90mm的平皿中，注入室溫至50℃左右的滅菌后的本發明的培養基約15mL，混勻。
菌株可采用澆注法或L棒涂抹法接種于本發明的微生物培養基上。優選澆注法。
步驟(2)中待培養基凝固后再進行培養，倒置培養。同時用未接種的平皿做對照。
步驟(3)中，分別在12、14、18、24、48、72小時點計菌落數。
本發明還進一步涉及一種厭氧菌或兼性厭氧菌無菌試驗培養基靈敏度的檢查方法，包括以下步驟(1)制備菌含量約相當于10-100菌/mL的菌液；(2)將菌液接種到至少兩管被檢培養基中，培養；其特征在于同時將菌液接種于平皿進行菌落計數，當平皿菌落形成單位計數結果為10-100CFU/mL時，根據該菌株接種后接種管內是否均呈現生長判定該無菌試驗用培養基的靈敏度檢查是否符合要求。
其中所述的平皿菌落計數是將菌液置于適宜菌落計數的相應培養基制成的平皿中或平板上，培養、計數。
進一步，所述的平皿菌落計數是將菌液各1mL，置直徑約90mm的平皿中，再注入約45℃的相應培養基約15mL。
其中的培養基為凝膠強度為50-500g/cm2的微生物培養基。優選本發明的微生物培養基及其優選的組成。
在進行平皿菌落計數時，還包括將菌液與培養基混勻，凝固和倒置培養。培養溫度為25-38℃，培養時間為12-72小時，并分別在12、14、18、24、48、72小時點計菌落數。優選在厭氧條件下培養18h計數，此時菌落呈單個典型菌落，無融合和擴散，CFU計數最多，菌落形態良好，最接近最大活菌數。
本發明中的厭氧菌包括破傷風梭菌、胨鏈球菌、胨球菌，或兼性厭氧菌包括生孢子梭狀芽孢桿菌(簡稱生孢梭菌，Clostridium sporogenes，CMCC 64941株)、白喉棒狀桿菌、短棒狀桿菌。
上述無菌試驗培養基靈敏度檢查方法中，菌液的制備方法為將菌種接種于被檢培養基，經30-35℃培養10-48小時后，將其置于裝有無菌生理鹽水的試管內并稀釋至均勻菌液，再將菌液稀釋至與標準比濁管相同之濃度，然后用生理鹽水作10倍系列稀釋或稀釋至10-100CFU/mL的菌液。菌液的制備也可以采用《規程》和《藥典》中公開的方法。
接種時，通常取上述菌液1mL，接種到9mL被檢培養基中。菌株可采用澆注法或L棒涂抹法接種于本發明的微生物培養基上。優選澆注法。
本發明所述的培養基可用于生孢梭菌及其它兼性或厭氧菌的CFU計數等，最適宜生孢梭菌CFU計數。
本發明中，在菌液接種培養的同時，還要用未接種的被測培養基相同培養條件下對照，并逐日記錄結果。平皿進行菌落計數的同時，至少應同時作2個平皿的計數，并同時進行平皿未接種的對照。
在平皿計數結果均為10-100CFU/mL的情況下，以該菌株接種被測培養基后2管均呈現生長為該培養基的靈敏度檢查符合要求。若該菌株接種后2管均不呈現生長，為該培養基的靈敏度檢查不符合要求，若該菌株接種后1管呈現生長，1管不呈現生長，按上述方法重試。
采用本發明的方法進行無菌檢查時，應保證菌種分散度良好，如果必要，本發明的菌液制備過程還包括離心和取上層菌液。并用生理鹽水作為稀釋液。
CFU計數的高低及菌落形態直接反映了某種培養基是否適宜進行相應質控菌的CFU計數。采用本發明的微生物培養基并結合所述的菌落計數及無菌試驗培養基靈敏度檢查法，在澆注混勻及厭氧培養條件下的CFU計數最多，菌落形態良好，CFU計數最接近最大活菌數，使現有的無菌試驗培養基靈敏度檢查法中生孢梭菌的CFU計數有了標準、保證和可操作性，保證了被檢無菌試驗用培養基的質量，進而保證了被檢藥品或生物制品的質量。
具體實施例方式
下面結合實施例進一步描述本發明，但所述實施例用于說明本發明而不是限制本發明。
實施例1將胰酪蛋白胨15.0g、酵母浸出粉5.0g、氯化鈉2.5g、L-胱氨酸0.5g、硫乙醇酸鈉或硫乙醇酸0.5g、葡萄糖8.0、瓊脂5g加入1000ml水中混合，微溫溶解，調節pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖5.0g，搖勻，調節pH值使滅菌后為7.1±0.2，滅菌、分裝，瓊脂濃度為0.5％。
實施例2同實施例1，不同的是，瓊脂為6g，瓊脂濃度為0.6％。
實施例3同實施例1，不同的是，瓊脂為7g，瓊脂濃度為0.7％。
實施例4同實施例1，不同的是，還包括0.001g刃天清。
實施例5同實施例1，不同的是培養基中包括胰酪蛋白胨18.0g，酵母浸出粉3.0g，葡萄糖8.0g，氯化鈉1g，L-胱氨酸0.8g，硫乙醇酸鈉或硫乙醇酸0.8g，瓊脂5g，0.003g刃天清或新配制的0.2％亞甲基藍溶液0.2-0.8ml，1000ml水。
實施例6同實施例1，不同的是培養基包括胰酪蛋白胨，酵母浸出粉g，葡萄糖3.0g，氯化鈉4g，L-胱氨酸0.2g，硫乙醇酸鈉或硫乙醇酸0.4g，瓊脂6g，1000ml水。
實施例6-9參照實施例1，按照表1的配比制備培養基表1.

實驗例1采用中國科學院青島海洋研究所生產的凝膠強度測定儀測定凝膠強度，結果見表2。
表2.本發明微生物培養基CFU的凝膠強度

結果3個培養基的凝膠強度有顯著性差異(p＜0.05)。
其它實施例的凝膠強度為50-500g/cm2。
實驗例2本實驗例在于研究所述的微生物培養基的CFU計數及菌落形態。
1.材料和方法1.1菌種生孢梭菌(菌種號CMCC64941)，由中國藥品生物制品檢定所提供。
1.2培養基硫乙醇酸鹽培養基(不含瓊脂)為北京三藥科技開發公司產品、按照實施例1-3制備瓊脂濃度為0.5％、0.6％和0.7％的三個本發明的微生物培養基。營養瓊脂培養基由美國Difco公司生產。瓊脂由美國Difco公司生產。
1.3方法1.3.1將生孢梭菌接種于硫乙醇酸鹽培養基(不含瓊脂)，置35℃培養24-48h；將生孢梭菌的新鮮培養物置無菌離心管中，500rpm離心5min。取上層菌液，用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋至與標準比濁管相同濃度，并作10倍系列稀釋至約1×10-6備用。
1.3.2制備瓊脂濃度為0.5％、0.6％和0.7％的3個三個本發明的微生物培養基，將滅菌后的3個本發明的微生物培養基冷至45℃左右，將稀釋好的生孢梭菌菌液1mL加入直徑為90mm的無菌培養皿中，再用約20mL培養基澆注，混勻10s，待培養基凝固后(簡稱澆注法)置厭氧條件下35℃培養。于第12h、14h、16h、18h、24h、30h、48h和72h進行CFU/mL計數，并觀察菌落形態。
2結果參見表3，瓊脂濃度為0.5％與0.6％的本發明的微生物培養基CFU計數結果比較無顯著性差異(P＞0.05)，但其菌落直徑差異明顯(P＜0.05)，在瓊脂濃度為0.5％的本發明的微生物培養基上，生孢梭菌的菌落直徑較大，形態良好；瓊脂濃度為0.5％與0.7％的生孢梭菌CFU計數培養基CFU計數結果比較有顯著性差異(P＜0.05)；瓊脂濃度為0.6％與0.7％的生孢梭菌CFU計數培養基CFU計數結果比較有顯著性差異(P＜0.05)。12h時，菌落很小且少。18h時，呈單個典型菌落，無融合和擴散。24h時，有明顯融合和擴散，不宜計數，且未見新生菌落形成。30h之后，呈大片融合，無法計數，故生孢梭菌在瓊脂濃度為0.5％的本發明的微生物培養基上培養18h時最適宜CFU計數。
表3三個本發明的微生物培養基CFU計數及菌落形態(18h)

注1#本發明的微生物培養基(0.5％瓊脂)，2#本發明的微生物培養基(0.6％瓊脂)，3#本發明的微生物培養基(0.7％瓊脂)。
△P＜0.05，2#、3#與1#比較
■P＞0.05，2#與1#比較▲P＜0.05，3#與2#比較實驗例3本實驗例的目的在于研究生孢梭菌在不同培養基、不同培養條件及時間的CFU計數結果，以確定本發明微生物培養基在CFU計數及確定無菌檢查培養基靈敏度上的用途。
1.材料和方法1.1菌種生孢梭菌(菌種號CMCC64941)，由中國藥品生物制品檢定所提供。
1.2培養基厭氧菌瓊脂培養基(參見《中華醫學檢驗全書》97年8月版，李影林主編，人民衛生出版社出版)、硫乙醇酸鹽培養基(不含瓊脂，見中國生物制品規程2000年版第32頁)、硫乙醇酸鹽(1.4％瓊脂)固體培養基(同上述硫乙醇酸鹽培養基，但瓊脂含量1.4％)、營養瓊脂培養基(參見中華人民共和國藥典2000年版二部附錄P89)、含瓊脂濃度為0.5％的營養瓊脂培養基均由北京三藥科技開發公司制備。按照實施例1制備瓊脂濃度為0.6％的本發明的微生物培養基。
1.3方法1.3.1將生孢梭菌接種于硫乙醇酸鹽培養基(不含瓊脂)，置35℃培養24-48h；將生孢梭菌的新鮮培養物置無菌離心管中，500rpm離心5min。取上層菌液，用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋至與標準比濁管相同濃度，并作10倍系列稀釋至1×10-6備用。
1.3.2取稀釋好的生孢梭菌菌液1mL，(1)以澆注法分別接種于本發明的培養基和含瓊脂濃度為0.5％的營養瓊脂培養基，(2)以L棒涂抹分別接種(0.25mL菌液/平皿)(下稱L棒涂抹法)厭氧菌瓊脂培養基、硫乙醇酸鹽(1.4％瓊脂)固體培養基、營養瓊脂培養基。將厭氧菌瓊脂培養基、本發明的培養基、硫乙醇酸鹽(1.4％瓊脂)固體培養基、營養瓊脂培養基、含瓊脂濃度為0.5％的營養瓊脂培養基置厭氧條件下，同時營養瓊脂培養基和本發明的培養基置有氧條件下，35℃培養。于12h、14h、16h、18h、24h、30h、48h和72h進行CFU/mL計數并觀察菌落形態。每種培養基同時重復接種10份并設培養基空白對照。重復3次試驗。
2.結果生孢梭菌在厭氧菌瓊脂培養基、本發明的培養基、硫乙醇酸鹽(1.4％瓊脂)固體培養基、營養瓊脂培養基、含瓊脂濃度為0.5％的營養瓊脂培養基上厭氧培養及在本發明的培養基和營養瓊脂培養基上有氧培養，于第12h、14h、16h、18h、24h、27h、30h、48h和72h進行CFU/mL計數并觀察菌落形態。
12h、14h時，菌落很小且少。16h時，菌落有所增大，但菌落數目較18h時為少，18h時呈單個典型菌落，無融合和擴散，且與24h相比菌落數未見增加，而24h時及之后，有明顯融合和擴散，不宜計數。故18h為最佳計數時間，表3為18h的計數結果。表明用本發明的培養基對生孢梭菌進行CFU/mL計數，其結果明顯優于其他培養基(P＜0.05)且厭氧條件培養明顯優于有氧條件(P＜0.05)。
表3生孢梭菌在5個不同培養基及不同培養條件的CFU/mL計數結果

注1厭氧菌瓊脂培養基，2營養瓊脂(Difco)，3營養瓊脂，4硫乙醇酸鹽固體培養基，5本發明的培養基。
按照上述方法試驗，本發明其它實施例(2-9)培養基的生孢梭菌CFU/mL計數以及對于其他厭氧菌或兼性厭氧菌的CFU/mL計數結果也都高于現有技術的結果。
*代表有氧條件下培養，其它均在厭氧條件下培養。
▲P＜0.05與3比較■P＜0.05與6比較上述結果說明，本發明的培養基可以用于厭氧菌或兼性厭氧菌的菌落形成單位(Colony Forming Units，CFU)計數，尤其用于生孢梭菌CFU計數，并進一步用于無菌試驗培養基靈敏度的試驗。
權利要求
1.一種微生物培養基，其在1000重量份的水中含有胰酪蛋白胨5-30重量份，酵母浸出粉0.5-20重量份，葡萄糖0.5-20重量份，氯化鈉1-15重量份，L-胱氨酸0.1-5重量份，硫乙醇酸鈉0.1-8重量份，其特征在于所述微生物培養基中，還含有瓊脂，瓊脂的含量為使所述的微生物培養基的凝膠強度為50-500g/cm2。
2.根據權利要求1所述的培養基，其特征在于，優選瓊脂的含量為使所述的微生物培養基的凝膠強度為100-400g/cm2，更優選凝膠強度為140-350g/cm2。
3.一種微生物培養基，所述微生物培養基為在1000重量份的水中含有胰酪蛋白胨5-30重量份，酵母浸出粉0.5-20重量份，葡萄糖0.5-20重量份，氯化鈉1-15重量份，L-胱氨酸0.1-5重量份，硫乙醇酸鈉或硫乙醇酸0.1-8重量份，其特征在于所述微生物培養基中還含有2-10重量份的瓊脂。
4.根據權利要求3所述的培養基，其特征在于，瓊脂的含量優選為3-7重量份；更優選為4-6重量份，更優選5重量份。
5.根據權利要求1-4任何一項所述的培養基，其特征在于含有胰酪蛋白胨12-18重量份，酵母浸出粉3-8重量份，葡萄糖3-8重量份，氯化鈉2-4重量份，L-胱氨酸0.2-0.8重量份，硫乙醇酸鈉0.2-0.8重量份。
6根據權利要求1-4任何一項所述的培養基，其特征在于胰酪蛋白胨15.0重量份，酵母浸出粉5.0重量份，葡萄糖5.0重量份，氯化鈉2.5重量份，L-胱氨酸0.5重量份，硫乙醇酸鈉或硫乙醇酸0.5重量份。
7.根據權利要求1-4任何一項所述的培養基，其特征在于所述培養基中還進一步包括0.001-0.003重量份的刃天清或新配制的0.2％亞甲基藍溶液0.2-0.8重量份。
8.權利要求1-7所述培養基的制備方法，包括除葡萄糖、刃天青外，按比例將培養基的成分加入水中溶解，調節PH為弱堿性，煮沸，濾清，再加入葡萄糖和/或刃天青，搖勻，調節PH6.5-7.5，滅菌并分裝至適宜的容器中。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其中滅菌后其pH值為6.9-7.4。
10.權利要求1-7所述培養基在厭氧菌或兼性厭氧菌的菌落形成單位(ColonyForming Units，CFU)計數，尤其在生孢梭菌CFU計數上的用途，以及在無菌試驗培養基靈敏度試驗上的用途。
全文摘要
本發明公開了一種微生物培養基，在1000ml水中包括胰酪蛋白胨5－30重量份，酵母浸出粉0.5－20重量份，葡萄糖0.5－20重量份，氯化鈉1－15重量份，L－胱氨酸0.1－5重量份，硫乙醇酸鈉或硫乙醇酸0.1－8重量份，其特征在于所述微生物培養基中還含有瓊脂，瓊脂的含量為使所述的微生物培養基的凝膠強度為50－500g/cm
文檔編號C12N1/20GK1746289SQ200410074538
公開日2006年3月15日 申請日期2004年9月7日 優先權日2004年9月7日
發明者高尚先, 孫彬裕, 康國華 申請人:中國藥品生物制品檢定所