專利名稱：氧化還原電勢調控厭氧發酵生產1，3－丙二醇方法
技術領域：
本發明屬于化工原料的生物制備技術范圍，特別涉及一種氧化還原電勢(ORP)調控厭氧發酵生產1，3-丙二醇方法。
背景技術：
1，3-丙二醇(1，3-propanediol，1，3-PD)是一種重要的化工原料，除象其他二元醇一樣除用做溶劑外，主要用做合成聚酯、聚氨酯的單體，以1，3-PD為單體生產的聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)是一種新型聚酯材料，具有易染色、彈性好、優良的柔軟性、懸垂性、低靜電、可生物降解等優點，主要用于生產纖維和紡織品，如地毯、襪褲、運動服等。PTT是目前合成纖維新品種開發的熱點，由于其優良的特性，成為繼PET、PBT后的又一種新型聚酯材料。據Shell公司預測，到2010年，包括非纖維應用在內的全球PTT需求量將達到一百萬噸/年。另外，1，3-PD還可以用來合成清潔劑穩定劑、耐熱容器、耐磨涂料、噴墨打印機墨水、光穩定聚酯、含酚樹脂等。
目前，工業上主要采用化學法合成1，3-PD，包括丙烯醛水合法、環氧乙烷法、環氧丙烷法等，其中德國Degussa公司的丙烯醛水合法、美國Shell公司的環氧乙烷法已投入工業化生產。化學合成法具有設備投資大、技術難度高、需要重金屬催化劑、污染環境、原料不可再生等缺點，因此，各國都致力于開發生物法生產1，3-PD的技術。
生物合成法的主要路線是在生物催化的作用下將甘油轉化為1，3-PD。目前，自然界中能將甘油轉化為1，3-PD的微生物有Klebsiella、Citrobacter、Clostridium、Ilyobacter、Lactobacillus、Enterobatcer，其中研究最多的是Klebsiella pneumoniae(克氏肺炎桿菌)、Citrobacter freundii(弗氏檸檬菌)和Clostridium butyricum(丁酸梭狀芽孢菌)。克氏肺炎桿菌、丁酸梭狀芽孢菌比弗氏檸檬菌具有較高的甘油耐受力，發酵速度較快。克氏肺炎桿菌與弗氏檸檬菌屬于兼性厭氧菌，而丁酸梭狀芽孢桿菌為嚴格厭氧菌。
Biebl H，等人在文獻“production of 1，3-propanediol Appl MicrobiolBiotechnol 1999，52289-297”中研究表明，甘油在微生物體內的厭氧過程主要有兩條基本代謝途徑氧化途徑和還原途徑。氧化途徑主要包括步驟1)甘油經甘油脫氫酶(GDH)催化，生成2-羥基丙酮(DHA)，此酶為厭氧酶，以NAD+為輔酶；2)DHA在ATP及2-羥基丙酮激酶的作用下，生成磷酸二羥基丙酮(DHAP)；3)DHAP進一步代謝生成丙酮酸，然后通過乙酰CoA進入三羧酸循環或經過厭氧酵解生成其他小分子醇、酸等代謝產物。氧化途徑生成生物能ATP和還原當量NADH2，并伴隨著微生物細胞的生長。甘油的還原途徑有兩步酶反應1)甘油脫水酶(GDHt)在輔酶B12存在下將甘油轉化為中間產物3-羥基丙醛(3-HPA)；2)在NADH2存在下，3-HPA在1，3-丙二醇脫氫酶(PDDH)催化下生成1，3-PD。還原途徑消耗氧化途徑生成的過量NADH2，使微生物細胞內的還原物質達到平衡。
生物法生產1，3-PD目前存在產物濃度低、生產周期長和甘油轉化率低等問題，導致缺乏市場競爭力而無法大規模應用。解決上述問題有兩條途徑，一條途徑是S.Abbad-Andaloussi等人在文獻“Isolation and characterization ofClostridium butyricum DSM 5431 with increased resistance to1，3-propanediol and altered production of acids，Appl.Environ.Microbiol.1995，614413-4417”中報導，利用菌種誘變技術和基因工程技術提高菌種的產物耐受能力和轉化能力。另一條途徑是Laffend，等在美國專利US 6025184中報導，采用連續、補料批式、反應分離耦合等培養方式消除底物抑制和產物抑制，并對發酵過程的重要參數進行有效地調控。
為了提高1，3-PD的產量和產率，Zeng AP、楊東、Nemeth A等人在文獻“Pathwayanalysis of glycerol fermentation by Klebsiella pneumoniaeregulation of reducing equivalent balance and product formation.Enzyme Microb Technol 1993，15770-779”、楊東，李春，杜晨字，張延平，曹竹安“兩段雙底物發酵生產1，3-丙二醇過程工程學報2003，3269-273”和“1，3-propanediol oxidoreductase production with Klebsiella pneumoniaeDSM2026 World J Microb Biot.2003，19659-663”中，各自開發了兩段法生產1，3-PD的發酵工藝。Zeng AP等提出用兩種菌耦合直接從葡萄糖生產1，3-PD的工藝，首先利用Osmotolerant yeast Pichia farinosa或者Escherichia coli重組菌從葡萄糖合成甘油，然后利用Klebsiella pneumoniae生產1，3-PD。其中第二個階段1，3-PD的產率可以達到2.0g L-1h-1轉化率為0.53g/g。楊東等開發了兩段雙底物發酵工藝，首先以葡萄糖和甘油為雙底物進行好氧培養，通過控制葡萄糖和甘油的比例，使菌體只利用葡萄糖生長，通過甘油的存在誘導厭氧轉化過程的相關酶。當菌體濃度達到一定濃度后，補加甘油同時通入氮氣使發酵系統轉入厭氧轉化階段，厭氧轉化過程中通過流加甘油使甘油維持在一定范圍內。1，3-PD的濃度達到50.16g L-1，產率為0.836g L-1h-1。Nemeth A等提出利用Klebsiella pneumoniae兩步法發酵生產1，3-PD的工藝，通過好氧期培養，獲得高濃度的菌體和甘油脫氫酶的酶活，然后轉為厭氧工藝，最后得到1，3-PD的濃度為g L-1。修志龍等提出了Klebsiella pneumoniae微好氧發酵生產1，3-PD工藝，縮短了發酵周期，最終濃度，摩爾轉化率和產率分別為59.50g/l，51.75％，and 1.57g L-1h-1。
目前，1，3-PD的生產都是在厭氧條件下進行的，厭氧環境的監控對發酵過程起到重要的作用。對于兩段法的工藝，由一個階段到另一個階段的過渡過程往往決定了后一個階段(1，3-PD生產階段)中菌體適應的時間和1，3-PD的產量。對于微耗氧工藝，由于發酵體系中氧氣的濃度比較低，用溶氧電極檢測不到發酵體系中微量氧氣的變化，而通過氧氣閥門的流量檢測氧氣通入的多少會由于氣體壓力的波動、流量計的精度等問題，會引起較大的誤差。
厭氧發酵具有悠久的歷史，至今在工業生產上仍然廣泛的應用在乳酸、丙酮、乙醇、甘油等化工產品的生產上。除了1，3-PD生物法生產外，厭氧、兼性厭氧發酵工藝還在廢水處理、生物制氫和生物柴油等領域具有重要的研究價值。但長期以來，由于厭氧發酵過程缺少合適的發酵狀態指示參數，而其發酵工藝優化一直難以進行。近期，Riondet C，等在文獻“Extracellular oxidoreductionpotential modifies carbon and electron flow in Escherichia coli JBacteriol 2000，182620-626”中報導，關于氧化還原電勢(ORP，Oxidoreduction potential)研究表明，不同的菌種都有自己合適的ORP范圍，在此范圍內，菌體生長最快，并且，ORP會通過影響一些酶的表達，影響菌體的代謝途徑，從而調整副產物的分布。
文獻中1，3-PD生物法合成工藝，在由氧化過程到還原過程中，通過測定OD，確定發酵時間等方式作為判定好氧、厭氧的標準，在轉入厭氧之后，對發酵體系并不進行調節，或者只是根據經驗進行調控發酵體系中通入空氣的流量。對于微耗氧工藝，由于發酵體系中氧氣的濃度比較低，用溶氧電極檢測不到發酵體系中微量氧氣的變化，而通過氧氣閥門的流量控制氧氣通入的多少會由于氣體壓力的波動、流量計的精度等問題，會引起較大的誤差。
發明內容
本發明的目的是提供一種氧化還原電勢調控厭氧發酵生產1，3-丙二醇方法，其特征在于根據Klebsiella pneumoniae發酵生產1，3-PD性厭氧的特性，在發酵體系中引入了ORP電極，對發酵體系的ORP進行調節，并根據前期實驗測定厭氧發酵過程中ORP變化的規律及ORP的影響，調控ORP以提高目標產物1，3-PD產量、縮短發酵時間為準；具體實施工藝是利用ORP調控克氏肺炎桿菌厭氧合成1，3-丙二醇工藝，其實施步驟如下菌種Klebsiella pneumoniae；步驟1菌種活化由菌種保藏斜面挑取一環Klebsiella pneumoniae菌苔接入LB固體培養基進行活化，在30-40℃下培養20-30小時后，再挑取一環菌苔接入固體LB平板，35-40℃培養24小時后獲得單菌落步驟2種子培養從步驟1的LB平板上挑取一個單菌落，接入250ml搖瓶培養，裝種子培養基液量50ml，在30-40℃，200rpm下，培養8-10小時；步驟3兩段雙底物集成發酵好氧過程裝有2L預先滅菌的集成發酵培養基，將步驟2的種子液接入發酵罐中，ORP電極在紫外燈下照射2小時表面滅菌，再加入電極前用酒精棉球輕輕擦洗表面，在無菌間中用無菌風吹干后，將ORP電極放入發酵罐中，好氧培養過程條件，35-40℃，400rpm，空氣流量2.0L/min，以4N NaOH控制pH值為7，好氧過程在2-3小時，此時ORP為-70～+70之間，因培養基組分以及滅菌條件不同而不同；步驟4ORP調控下的兩段雙底物集成發酵過渡過程過渡過程是指由好氧過程轉為厭氧過程的初始階段，這一階段沒有1，3-丙二醇生成，當菌體濃度(OD)達到1～2之間(即細胞干重達到0.25～0.5g/L之間)時，補加甘油至20g/L，減少空氣通入量，并開始通入氮氣，開始調控ORP，通入氮氣后，ORP由初始迅速下降到-400mV以下，按體積比調節空氣和氮氣的比例(1～20)∶(20～1)和總流量0.05-6L/min，使得ORP穩定到-350mV；過渡過程工藝條件35-40℃，400rpm，以4N NaOH控制pH值為7，過渡過程時間為4-7小時；步驟5多次ORP調控下的兩段雙底物集成發酵厭氧轉化過程厭氧轉化過程指開始1，3-丙二醇生成的過程。轉化過程工藝條件35-37℃，400rpm，在發酵體系中通入氮氣約2.0L/min，同時通入空氣或同時滴加過氧化氫溶液，控制通入發酵體系中的按體積比調節空氣和氮氣的比例(1～20)∶(20～1)和總流量0.05-6L/min，分別在發酵的不同時間調節ORP在-370mV，-450mV，-400mV三個不同條件；在轉化過程，當甘油濃度低于15g/L，向發酵罐中補加甘油至20g/L，從而使發酵液中甘油濃度維持在15-25g/L的范圍內，以4N NaOH控制pH值為7，將ORP恒定在-400mV的兩段雙底物集成發酵工藝中，生產周期為80小時，細胞干重最高達到2.53g/L，1，3-PD達到45.2g/L，主要副產物為乙酸、乙醇和乳酸。
所述流加補料過氧化氫過氧化氫溶液濃度為0.5-3％的H2O2，由30％的H2O2經過稀釋得到，在4℃冰箱遮光保存，實驗時遮光并放在冰水浴中。
本發明的效果是通過ORP電極的監測、調控，可以很好控制兩階段過程的變化，使得菌體在從耗氧階段進入到厭氧階段的過渡過程中，保持較高的比生長速率。同時，以厭氧發酵過程中ORP作為重要參數，可以調節厭氧發酵過程中氧化還原途徑的進行程度，從而調控的厭氧氧化途徑和還原途徑很好的耦合起來，提高發酵體系的氧化還原效率，提高1，3-PD的產量和產率。本發明采用ORP電極測定1，3-PD發酵體系的氧化還原電位，并利用氧化還原電位監控發酵體系的變化，具有重要的理論意義和應用價值。
圖1為ORP調控(多級調控)的兩階段雙底物集成發酵過程菌體生長曲線和ORP變化曲線以及產物1，3-丙二醇積累曲線。
圖2為ORP調控(-400mV)的兩階段雙底物集成發酵過程菌體生長曲線和ORP變化曲線以及產物1，3-丙二醇積累曲線。
圖3為ORP調控(-370mV)的兩階段雙底物集成發酵過程菌體生長曲線和ORP變化曲線以及產物1，3-丙二醇積累曲線。
具體實施例方式
本發明提供利用氧化還原電勢進行調節的一種氧化還原電勢調控厭氧發酵生產1，3-丙二醇方法。根據Klebsiella pneumoniae發酵生產1，3-PD性厭氧的特性，在發酵體系中引入了ORP電極，根據前期實驗測定厭氧發酵過程中ORP變化的規律及ORP的影響，調控ORP以提高目標產物1，3-PD產量、縮短發酵時間為準。具體實施工藝是利用ORP調控克氏肺炎桿菌厭氧合成1，3-丙二醇工藝，其實施步驟如下菌種Klebsiella pneumoniae(克氏肺炎桿菌)；步驟1菌種活化由菌種保藏斜面挑取一環Klebsiella pneumoniae菌苔接入LB固體培養基進行活化，在30-40℃下培養20-30小時后，再挑取一環菌苔接入固體LB平板，35-40℃培養24小時后獲得單菌落；步驟2種子培養從步驟1的LB平板上挑取一個單菌落，接入250ml搖瓶培養，裝種子培養基液量50ml，在30-40℃，200rpm下，培養8-10小時；步驟3兩段雙底物集成發酵好氧過程裝有2L預先滅菌的集成發酵培養基，將步驟2的種子液接入發酵罐中，ORP電極在紫外燈下照射2小時表面滅菌，再加入電極前用酒精棉球輕輕擦洗表面，在無菌間中用無菌風吹干后，將ORP電極放入發酵罐中，好氧培養過程條件，35-40℃，400rpm，空氣流量2.0L/min，以4N NaOH控制pH值為7，好氧過程在2-3小時，此時ORP為-70～+70之間，因培養基組分以及滅菌條件不同而不同；步驟4ORP調控下的兩段雙底物集成發酵過渡過程過渡過程是指由好氧過程轉為厭氧過程的初始階段，這一階段沒有1，3-丙二醇生成。當菌體濃度(OD)達到1～2之間(即細胞干重達到0.25～0.5g/L之間)時，補加甘油至20g/L，減少空氣通入量，并開始通入氮氣，開始調控ORP，通入氮氣后，ORP由初始迅速下降到-400mV以下，按體積比調節空氣和氮氣的比例(1～20)∶(20～1)和總流量0.05-6L/min，使得ORP穩定到-350mV；過渡過程工藝條件35-40℃，400rpm，以4N NaOH控制pH值為7，過渡過程時間為4-7小時；步驟5多次ORP調控下的兩段雙底物集成發酵厭氧轉化過程厭氧轉化過程指開始1，3-丙二醇生成的過程。轉化過程工藝條件35-37℃，400rpm。在發酵體系中通入氮氣約2.0L/min，同時通入空氣或同時滴加過氧化氫溶液，控制通入發酵體系中的按體積比調節空氣和氮氣的比例(1～20)∶(20～1)和總流量0.05-6L/min，分別在發酵的不同時間調節ORP在-370mV，-450mV，-400mV三個不同條件；在轉化過程，當甘油濃度低于15g/L，向發酵罐中補加甘油至20g/L，從而使發酵液中甘油濃度維持在15-25g/L的范圍內，以4N NaOH控制pH值為7，將ORP恒定在-400mV的兩段雙底物集成發酵工藝中，生產周期為80小時，細胞干重最高達到2.53g/L，1，3-PD達到45.2g/L，主要副產物為乙酸、乙醇和乳酸。
所述流加補料過氧化氫過氧化氫溶液濃度為0.5-3％的H2O2。由30％的H2O2經過稀釋得到，在4℃冰箱遮光保存。實驗時遮光并放在冰水浴中。
所述LB固體培養基每升體積培養基含酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl10.0g，瓊脂18.0g，pH7.0。
所述種子培養基每升體積培養基含葡萄糖20g，K2HPO4.3H2O 4.45g，KH2PO4，1.3g，(NH4)2SO42.0g，MgSO4.7H2O 0.2g，CaCO32.0g，酵母粉1.0g，微量元素溶液I2.0ml，Fe2+溶液(5gL-1FeSO4.7H2O加入4ml HCl(37％))1.0ml，pH7.0。本專利中所述微量元素溶液I的組成如下MnSO4·4H2O 100mg/L，ZnCl270mg/L，Na2MoO4·2H2O 35mg/L，H3BO360mg/L，CoCl2·6H2O 200mg/L，CuSO4·5H2O29.28mg/L，NiCl2·6H2O 25mg/L，37％HCl 0.9ml/L。
所述發酵培養基每升體積培養基含葡萄糖2.5g，甘油2.5g，K2HPO4.3H2O4.45g，KH2PO4，1.3g，(NH4)2SO42.0g，MgSO4.7H2O 0.2g，CaCl2.2H2O 0.02g/L，酵母粉1.0g，微量元素溶液I2.0ml，Fe2+溶液1.0ml(5gL-1FeSO4.7H2O加入4mlHCl(37％)，pH7.0。
下面例舉具體實驗對本發明予以進一步說明。
實驗過程一步驟1菌種活化由菌種保藏斜面挑取一環Klebsiella pneumoniae菌苔接入LB固體斜面進行活化，37℃培養24小時后，再挑取一環菌苔接入固體LB平板，37℃培養24小時后獲得單菌落。
步驟2種子培養從步驟1的LB平板上挑取一個單菌落，接入250ml搖瓶培養，裝液量50ml，37℃，200rpm，培養8-10h。
步驟3兩段雙底物集成發酵好氧過程在實驗裝置內，裝有2L預先滅菌的集成發酵培養基，將步驟2的種子液接入發酵罐中。ORP電極在紫外燈下照射2h表面滅菌，再加入電極前用酒精棉球輕輕擦洗表面，在無菌間中用無菌風吹干后，將ORP電極放入發酵罐中。好氧培養過程條件，37℃，400rpm，空氣流量2.0L/min，以4N NaOH控制pH為7.0±0.5。好氧過程在2-3小時。此時ORP為-70～+170之間，因培養基組分以及滅菌條件不同而不同。
步驟4ORP調控下的兩段雙底物集成發酵過渡過程過渡過程是指由好氧過程轉為厭氧過程的初始階段，這一階段沒有1，3-丙二醇生成。當菌體濃度(OD)達到1～2之間(即細胞干重達到0.25～0.5g/L之間)時，補加甘油至20g/L，減少空氣通入量，并開始通入氮氣，開始調控ORP。通入氮氣后，ORP由初始迅速下降到-400mV以下。調節空氣和氮氣的比例和流量，使得ORP穩定到-350mV。過渡過程工藝條件37℃，400rpm，以4N NaOH控制pH7.0。過渡過程時間為4-7小時。
步驟5多次ORP調控下的兩段雙底物集成發酵厭氧轉化過程厭氧轉化過程指開始1，3-丙二醇生成的過程。轉化過程工藝條件37℃，400rpm。發酵體系中通入氮氣約2.0L/min，同時通入空氣，控制通入發酵體系中的氮氣和空氣的流量和比例，分別在發酵的不同時間調節ORP在-370mV，-450mV，-400mV三個不同條件。在轉化過程，當甘油濃度低于15g/L，向發酵罐中補加甘油至20g/L，從而使發酵液中甘油濃度維持在15-25g/L的范圍內，以4N NaOH控制pH為7.0±0.5。
實驗結果ORP恒定在-400mV的兩段雙底物集成發酵工藝中，生產周期為80小時，細胞干重最高達到2.53g/L，1，3-PD達到45.2g/L，主要副產物為乙酸、乙醇和乳酸。其發酵過程曲線及產物生成曲線(如圖1所示)。
實驗過程二步驟1菌種活化由菌種保藏斜面挑取一環Klebsiella pneumoniae菌苔接入LB固體斜面進行活化，37℃培養24小時后，再挑取一環菌苔接入固體LB平板，37℃培養24小時后獲得單菌落。
步驟2種子培養從步驟1的LB平板上挑取一個單菌落，接入250ml搖瓶培養，裝液量50ml，37℃，200rpm，培養8-10h。
步驟3兩段雙底物集成發酵好氧過程在實驗裝置內，裝有2L預先滅菌的集成發酵培養基，將步驟2的種子液接入發酵罐中。ORP電極在紫外燈下照射2h表面滅菌，再加入電極前用酒精棉球輕輕擦洗表面，在無菌間中用無菌風吹干后，將ORP電極放入發酵罐中。好氧培養過程條件，37℃，400rpm，空氣流量2.0L/min，通氣比1vvm，以4N NaOH控制pH為7.0±0.5。好氧過程在2-3小時。此時ORP為-70～+170之間，因培養基組分以及滅菌條件不同而不同。
步驟4ORP調控下的兩段雙底物集成發酵過渡過程過渡過程是指由好氧過程轉為厭氧過程的初始階段，這一階段沒有1，3-丙二醇生成。當菌體濃度(OD)達到1～2之間(即細胞干重達到0.25～0.5g/L之間)時，補加甘油至20g/L，減少空氣通入量，并開始通入氮氣，開始調控ORP。通入氮氣后，ORP由初始迅速下降到-400mV以下。調節空氣和氮氣的比例和流量，使得ORP迅速穩定到-400mV。過渡過程工藝條件37℃，400rpm，以4N NaOH控制pH為7.0±0.5。過渡過程時間為4-7小時。
步驟5ORP調控下的兩段雙底物集成發酵厭氧轉化過程厭氧轉化過程指開始1，3-丙二醇生成的過程。轉化過程工藝條件37℃，400rpm。發酵體系中通入氮氣約2.0L/min，同時通入微量空氣調節ORP在-400±20mV。在轉化過程，當甘油濃度低于15g/L，向發酵罐中補加甘油至20g/L，從而使發酵液中甘油濃度維持在15-25g/L的范圍內，以4N NaOH控制pH為7.0±0.5。
實驗結果ORP恒定在-400mV的兩段雙底物集成發酵工藝中，生產周期為65小時，細胞干重最高達到3.17，1，3-PD達到57.3g/L，主要副產物為乙酸、乙醇和乳酸。其發酵過程曲線及產物生成曲線(如圖2所示)。
實驗過程三步驟1菌種活化由菌種保藏斜面挑取一環Klebsiella pneumoniae.菌苔接入LB固體斜面進行活化，37℃培養24小時后，再挑取一環菌苔接入固體LB平板，37℃培養24小時后獲得單菌落。
步驟2種子培養從步驟1的LB平板上挑取一個單菌落，接入250ml搖瓶培養，裝液量50ml，37℃，200rpm，培養8-10h。
步驟3兩段雙底物集成發酵好氧過程在實驗裝置內，裝有2L預先滅菌的集成發酵培養基，將步驟2的種子液接入發酵罐中。ORP電極在紫外燈下照射2h表面滅菌，再加入電極前用酒精棉球輕輕擦洗表面，在無菌間中用無菌風吹干后，將ORP電極放入發酵罐中。好氧培養過程條件，37℃，400rpm，空氣流量2.0L/min，以4N NaOH控制pH為7.0±0.5。好氧過程在2-3小時。此時ORP為-70～+170之間，因培養基組分以及滅菌條件不同而不同。
步驟4ORP調控下的兩段雙底物集成發酵過渡過程過渡過程是指由好氧過程轉為厭氧過程的初始階段，這一階段沒有1，3-丙二醇生成。當菌體濃度(OD)達到1～2之間(即細胞干重達到0.25～0.5g/L之間)時，補加甘油至20g/L，同時通入氮氣維持厭氧條件發酵轉入兩段雙底物集成發酵。ORP由初始迅速下降到-400mV以下。滴加過氧化氫稀溶液，使得ORP穩定到-370mV。過渡過程工藝條件37℃，400rpm，以4N NaOH控制pH為7.0±0.5。過渡過程時間為4-7小時。
步驟5用過氧化氫調控ORP到-370mV的兩段雙底物集成發酵厭氧轉化過程厭氧轉化過程指開始1，3-丙二醇生成的過程。轉化過程工藝條件37℃，400rpm。發酵體系中通入氮氣約2.0L/min，同時滴加過氧化氫溶液，調節ORP在-370±20mV。在轉化過程，當甘油濃度低于15g/L，向發酵罐中補加甘油至20g/L，從而使發酵液中甘油濃度維持在15-25g/L的范圍內，以4N NaOH控制pH為7.0±0.5。
實驗結果ORP恒定在-370±20mV的兩段雙底物集成發酵工藝中，生產周期為65小時，細胞干重最高達到2.13g/L，1，3-PD達到45.1g/L，主要副產物為乙酸、乙醇和乳酸。其發酵過程曲線及產物生成曲線(如圖3所示)。
從上述三個實驗過程都得到很好的實驗結果來看，本發明具有以下特點①將氧化還原電勢的概念引入到Klebsiella pneumoniae發酵生產1，3-PD當中。②在使用pH電極、溫度電極、溶氧電極檢測、調控的發酵體系中，加入ORP電極調控發酵體系的氧化還原狀態。③在從好氧到厭氧轉化的過程中，通過檢測發酵體系中的ORP來確定發酵過程中通空氣的流量。④在厭氧生產1，3-PD過程中，調節發酵體系中的ORP到-200mV～-450mV。以上特點導致本發明在與其它工藝同等生產水平時，生產時間縮短，對發酵體系的控制更加及時和精確，有利于提高產品的濃度，降低發酵成本。
權利要求
1.一種氧化還原電勢調控厭氧發酵生產1，3-丙二醇方法，其特征在于根據Klebsiella pneumoniae發酵生產1，3-PD性厭氧的特性，在發酵體系中引入了ORP電極，對發酵體系的ORP進行調節，并根據前期實驗測定厭氧發酵過程中ORP變化的規律及ORP的影響，調控ORP以提高目標產物1，3-PD產量、縮短發酵時間為準；具體實施工藝是利用ORP調控克氏肺炎桿菌厭氧合成1，3-丙二醇工藝，其實施步驟如下菌種Klebsiella pneumoniae；步驟1菌種活化由菌種保藏斜面挑取一環Klebsiella pneumoniae菌苔接入LB固體培養基進行活化，在30-40℃下培養20-30小時后，再挑取一環菌苔接入固體LB平板，35-40℃培養24小時后獲得單菌落；步驟2種子培養從步驟1的LB平板上挑取一個單菌落，接入250ml搖瓶培養，裝種子培養基液量50ml，在30-40℃，200rpm下，培養8-10小時；步驟3兩段雙底物集成發酵好氧過程裝有2L預先滅菌的集成發酵培養基，將步驟2的種子液接入發酵罐中，ORP電極在紫外燈下照射2小時表面滅菌，再加入電極前用酒精棉球輕輕擦洗表面，在無菌間中用無菌風吹干后，將ORP電極放入發酵罐中，好氧培養過程條件，35-40℃，400rpm，空氣流量2.0L/min，以4N NaOH控制pH值為7，好氧過程在2-3小時，此時ORP為-70～+70之間，因培養基組分以及滅菌條件不同而不同；步驟4ORP調控下的兩段雙底物集成發酵過渡過程過渡過程是指由好氧過程轉為厭氧過程的初始階段，這一階段沒有1，3-丙二醇生成，當菌體濃度(OD)達到1～2之間(即細胞干重達到0.25～0.5g/L之間)時，補加甘油至20g/L，減少空氣通入量，并開始通入氮氣，開始調控ORP，通入氮氣后，ORP由初始迅速下降到-400mV以下，按體積比調節空氣和氮氣的比例(1～20)∶(20～1)和總流量0.05-6L/min，使得ORP穩定到-350mV；過渡過程工藝條件35-40℃，400rpm，以4N NaOH控制pH值為7，過渡過程時間為4-7小時；步驟5多次ORP調控下的兩段雙底物集成發酵厭氧轉化過程厭氧轉化過程指開始1，3-丙二醇生成的過程，轉化過程工藝條件35-37℃，400rpm，在發酵體系中通入氮氣約2.0L/min，同時通入空氣或同時滴加過氧化氫溶液，控制通入發酵體系中的按體積比調節空氣和氮氣的比例(1～20)∶(20～1)和總流量0.05-6L/min，分別在發酵的不同時間調節ORP在-370mV，-450mV，-400mV三個不同條件；在轉化過程，當甘油濃度低于15g/L，向發酵罐中補加甘油至20g/L，從而使發酵液中甘油濃度維持在15-25g/L的范圍內，以4N NaOH控制pH值為7，將ORP恒定在-400mV的兩段雙底物集成發酵工藝中，生產周期為80小時，細胞干重最高達到2.53g/L，1，3-PD達到45.2g/L，主要副產物為乙酸、乙醇和乳酸。
2.根據權利要求1所述調控克氏肺炎桿菌厭氧發酵生產1，3-丙二醇方法，其特征在于所述流加補料過氧化氫為過氧化氫溶液濃度為0.5-3％，由30％的H2O2經過稀釋得到，在4℃冰箱遮光保存，實驗時遮光并放在冰水浴中。
全文摘要
本發明公開了屬于化工原料的生物制備技術范圍的一種氧化還原電勢調控厭氧發酵生產1，3－丙二醇方法。它根據Klebsiella pneumoniae發酵生產1，3－PD性厭氧的特性，在發酵體系中引入了ORP電極。具體工藝過程包括菌種活化、種子培養和ORP調控下的兩段雙底物集成發酵過渡過程而得到細胞干重最高達到2.13 g/L，1，3－PD達到45.1g/L，主要副產物為乙酸、乙醇和乳酸的好結果。本發明在與其它工藝同等生產水平時，生產時間縮短，對發酵體系的控制更加及時和精確，提高目標產物1，3－PD產量和產品的濃度、縮短發酵時間、降低發酵成本。
文檔編號C12P1/04GK1635122SQ20041008657
公開日2005年7月6日 申請日期2004年10月26日 優先權日2004年10月26日
發明者劉銘, 杜晨宇, 曹竹安 申請人:清華大學