專利名稱：一種辣椒游離小孢子細胞團培養方法
技術領域：
本發明涉及一種辣椒游離小孢子細胞團培養方法。
背景技術：
目前，由于植物具有的雜種優勢，使目前的作物育種側重在雜交育種上。這一方面可以利用雜種的生長優勢形成高產，另一方面由于雜種的復雜遺傳背景，使其不宜留種使用，從而能保護雜種研制者的利益。在雜交育種中，所用父母本材料的遺傳背景必須是純合的，經配種后才能得到性狀一致的雜種。而要得到遺傳背景純合的親本材料，在許多作物中都必須通過人工輔助自交授粉，經5-8年時間才能達到相對純合。這種傳統的雜交育種手段非常費時、費力。植物的雄性生殖細胞——花粉，由于經減數分裂后只帶有一套母體的染色體，是單倍性細胞，通過花藥或未成熟花粉(小孢子)培養可以獲得單倍體植株，進而通過染色體加倍成為雙單倍體材料，這樣可以達到該植株遺傳背景的完全純合狀態。這一方面可以克服雜合狀態時，顯性基因對隱性基因的屏蔽作用，有利于隱性突變或基因重組性狀的表達，另一方面可以直接獲得純合材料，從而作為親本材料應用于雜交育種。通常由小孢子培養來獲得純合材料僅需要1-2年時間，能大大加速育種進程，提高育種效率。因此國際上對作物的單倍體育種研究非常重視，已在小麥、大麥、油菜、白菜等許多作物上建立了良好的單倍體育種技術體系。
辣椒(Capsicum annuum L.)的雜種優勢明顯，目前雜交育種成為主要的育種手段。辣椒的花藥培養已經有很多研究，最早成功于1973年王玉英及George等人的工作(Wang Y Y，Sun C S，Wang C C，et al.The induction of the pollenplantlets of triticale and Capsicum annuum from anther culture.Sci.Sinica，1973，16147-151；George L，Narayanswamy S.Haploid Capsicum throughexperimental androgenensis.Protoplasma，1973，78467-470)。之后1981年Dumas等對花藥培養體系進行了較大的改進，提高了出胚率(Dumas de Vaulx，R.，D.Chambonnet，E.Pochard.Culture in vitro d’anthères de piment(Capsicum annuumL.)Amélioration des taux d’obtention de plantes chez différents genotypes par destraitements à+35C.Agronomie，1981，1859-864)。在此基礎上又有許多相關試驗(Morrison R A，Koning R E，Evans D A.Anther culture of an interspecifichybrid of Capsicum.J.Plant Physiol.，1986，1261-9；Kell K，Andersen S B，Effectsof donor plant temperature，photoperiod，and age on anther culture response ofCapsicum annuum L.Euphytica，1993，67105-109；MitykóJ，Andrasfalvy A，Csillery G，Fári M，Anther-culture response in different genotypes and F1 hybridsof pepper(Capsicum annuum L).Plant Breeding，1995，11478-80；王立浩，張寶璽，郭家珍，等.辣椒花藥培養中若干影響因素的研究.園藝學報，2004，31(2)199-204.)。1997年Ramon等建立了固液相雙層培養體系，簡化了培養操作并進一步提高了出胚率(Ramon Dolcet-sanjuan，Elisabet Claveria，Agustin Huerta.Androgenesis in Capsicum annuum L-Effects of carbohydrate and carbon dioxideenrichment.J.Amer.Soc.Hort.Sci，1997，122(4)468-475)。但是所有這些都是在花藥培養上的研究成果。
完整花藥連同其內部的未成熟花粉粒(小孢子)一起進行體外培養，稱作花藥培養。由于花藥壁細胞是二倍體細胞，因此通過花藥培養獲得的再生植株有可能來自單倍性的花粉粒，也可能來自藥壁的二倍體細胞，這樣會造成再生植株的混雜，大大影響該方法的育種應用。將未成熟花粉粒(小孢子)自花藥中分離出來，單獨培養，稱為游離小孢子培養。由于游離小孢子的單細胞性、單倍性以及大群體特性，使得它在雄性生殖的研究及應用上，具有比花藥培養更多的優點如可以完全避免花藥壁二倍體細胞的干擾，獲得大量完全真實的單倍體或雙單倍體植株，有利于育種應用；此外，單細胞培養系統可以用于基因導入，基因表達，雄核發育的調控研究，細胞的分裂、分化和發育等理論研究。人們一直很關注該技術的建立，但是辣椒的游離小孢子培養系統卻一直沒有成功報道。說明可能由于辣椒小孢子的特異性，需要一個非常規的培養技術體系。
發明內容
本發明的目的是提供一種辣椒(Capsicum annuum L.)游離小孢子細胞團培養方法。
為實現上述目的，本發明采取以下方案先對花藥進行預培養，然后進行小孢子的游離培養。
具體地說，該方法采用以下步驟(1)花藥預培養摘取小孢子處于單核后期的花蕾，剝去花萼部分。以70％乙醇浸10秒后，0.1％升汞振蕩滅菌10分鐘。無菌水清洗4次，剝取花藥接種于PAC培養基上，之后給以35℃或32℃高溫暗處理8天，轉入26℃暗培養。
(2)游離小孢子及其細胞團培養將在固體培養基上預培養15天后的無菌花藥轉接入盛有2ml PMC液體培養基的培養皿(φ6cm)中，每皿12個花藥，用鑷子輕夾花藥，釋放出小孢子及其細胞團，然后將花藥壁等碎片夾出。干凈的小孢子懸浮液于26℃暗培養，4周后即可獲得小孢子胚狀體。
可用以下方法進行鑒定(1)植株誘導將具胚狀體的培養皿自暗室中移至光照條件下，二周后，將魚雷期及子葉期的胚狀體轉接入植株誘導培養基PPI中，2000Lux，16小時光照，25℃下培養，誘導植株形成。
(2)倍性鑒定取各瓶苗中齡葉片約150mg，在2ml LB01(Dolezel et al.Analysis of nuclear DNA content in plant cells by flow cytometry.Biol.Plant.，1989.31113-120)細胞裂解液中用鋒利刀片切碎后，經50μm尼龍膜過濾，濾液收集在BD流式細胞儀上樣管中。1000rpm離心5分鐘后，倒去上清液，沉淀中加入200μl濃度為50μg/ml的PI(propidium iodide)核染色劑，避光冷藏20分鐘后，采用流式細胞儀測定植株的倍性水平。激發光波長488nm。對照材料為二倍體的供體母株葉片。
本發明的優點是本發明在辣椒的游離小孢子培養體系上另辟蹊徑，通過游離培養經預培養后的花藥中的小孢子細胞及細胞團，獲得了胚狀體及其植株，顯微鏡檢提供了胚狀體的單細胞、單倍體發育途徑的細胞學證據。該技術體系的建立，不僅是辣椒單倍體育種技術上的突破，而且該游離小孢子培養胚狀體誘導體系還可能成為進行植物細胞分化、發育研究的良好實驗體系。
圖1為35℃下預培養5-8天后花藥中的小孢子DAPI熒光染色揭示發育中小孢子的細胞核發生對稱分裂，未發育小孢子細胞核消失。
圖2為懸浮培養中的游離小孢子細胞團。
圖3為細胞團分化出子葉端及胚根端。
圖4為形成胚狀體的TTC活力染色。
圖5為游離小孢子細胞團培養形成的處于不同發育時期的胚狀體。
圖6為自胚狀體形成的完整植株。
具體實施例方式
1材料與方法辣椒(包括甜椒、辣椒品種，Capsicum annuum L)供體母株生長于具防蟲網的塑料大棚內，試驗在5月至9月下旬間進行。
花藥培養摘取小孢子處于單核后期的花蕾，剝去花萼部分。以70％乙醇浸10秒后，0.1％升汞振蕩滅菌10分鐘。無菌水清洗4次，剝取花藥接種于固體培養基PAC(表1，參照CP培養基(Dumas，1981)，有改動)上，之后給以35℃或32℃高溫暗處理8天，轉入26℃暗培養。
游離小孢子及其細胞團培養自預培養15天后的花藥中采用直接擠壓法游離小孢子及其細胞團，培養于液體培養基PMC(表1，參照CP培養基，有改動)中，每皿(φ6cm)2ml，12個花藥，26℃暗培養，4周后調查胚狀體形成情況。
在花藥培養及游離細胞培養過程中，采用FDA檢查細胞的活力(Heslop HJ，Heslop H Y.Evalution of pollen viability by enzymatically-induced fluorescenceIntracellular hydrolysis of fluorescein diacetate.Stain Technol，1970，45115-120)。DAPI染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞核的分裂情況(Colemen AW，Goff L J.Application of fluorochrome to pollen biology I.Mithramycin and4’，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)as vital stain and for quantification ofnuclear DNA.Stain Technol，1985，60145-154)。對形成的胚狀體采用0.5％氯化三苯基四氮唑(TTC)染色觀察胚狀體活力情況(國際種子檢驗協會，國際種子檢驗規程，顏啟傅等譯，技術標準出版社，1976，P24-26，31-32)。
植株誘導將具胚狀體的培養皿自暗室中移至光照條件下，二周后，將魚雷期及子葉期的胚狀體轉接入植株誘導培養基PPI(表1，參照NT培養基)中，2000Lux，16小時光照，25℃下培養，誘導植株形成。
倍性鑒定取各瓶苗中齡葉片約150mg，采用流式細胞儀(FACSCalibur，美國BD公司)測定植株的倍性水平。核染色劑為碘化丙啶(propidium iodide)，濃度50μg/ml，激發光波長488nm。對照材料為二倍體的供體母株葉片。DNA數據獲取軟件為CellQuest，倍性分析軟件為ModFit。
表1 辣椒小孢子植株誘導所用培養基
2結果與分析2.1胚狀體發育的細胞學證據實驗鏡檢了自花藥預培養開始至游離細胞的培養，胚狀體形成的全部發育過程。
35℃高溫處理5天后，自花藥中游離小孢子。FDA檢查顯示，約25％的小孢子仍具有較好的活力，這些小孢子細胞膨大飽滿并成圓形，而其它細胞不發出綠色熒光，失去活力，細胞仍然保持剛游離時具明顯萌發溝的狀態。DAPI檢查顯示，膨大細胞內，細胞核發生了均等分裂(圖1)，而一直培養在26℃下的對照材料小孢子細胞核基本為非對稱分裂，形成在染色深淺，大小上有差異的營養細胞及生殖細胞核。
35℃培養10天時，小孢子細胞核已經發生了2-多次分裂，發育極不同步；細胞壁形成或未形成，從而形成了多核細胞或多細胞團。細胞壁的形成有在一次核分裂后隨即產生并導致細胞分裂的，也有在核分裂多次后才形成細胞壁，產生細胞分裂的，甚至在一個細胞內有12個左右的細胞核而尚沒有發生細胞分裂的。觀察也可見，發生了分裂的細胞已經脫出了花粉壁，而沒有分裂的細胞盡管已經有多核，仍尚處于花粉壁中，在后期發生了細胞分裂，形成細胞團后才能脫出花粉壁。
培養15天后，將小孢子及其細胞團自花藥中游離出來進行液體培養。觀察發現細胞的分裂仍然很不同步，有多細胞團，也有僅處于二次分裂的細胞(圖2)。細胞團在液體培養基中能夠繼續生長分化，在游離培養10天后，可以觀察到一些細胞團已經有極性形成，產生子葉和胚根的分化(圖3)。游離培養25天后，自球形期胚至子葉期胚的各級胚狀體逐步形成，胚狀體的發育程度表現出極其不同步特性(圖5)，這與早期細胞分裂的不同步性是相一致的。
在暗培養條件下，液體培養基中形成的胚狀體顏色為白色或灰白色。對其采用TTC染色法進行了活力檢查，可見大部分胚狀體具較好活力(圖4)。
2.2自胚狀體的植株再生懸浮培養獲得的小孢子胚狀體在轉接入植株誘導培養基后，經二次繼代培養(約40天)，得到了株型正常的植株(圖6)。表2列出了國際上辣椒單倍體誘導技術的有關工作及其結果。可以看出我們建立的游離小孢子培養技術，不管是在出胚率還是在胚的質量(與再生植株能力密切相關)上，都比以前報道的工作有了較大的提高。
表2 辣椒(Capsicum annuum L)單倍體育種不同技術及其效果*
*表中所列數值全部為該報道中最好結果的數值辣椒的花藥培養中始終存在一個胚狀體發育很不同步，發育不正常，質量差，成苗率低的問題。其正常胚僅占全部胚狀體的1/20-1/10，而最后的植株成苗率僅為胚狀體總數的1/10-1/100[8]。因此辣椒花藥培養的限制因素不是在分裂細胞頻率以及胚狀體的數目上，而是在胚狀體的進一步正常發育，特別是原胚的正常發育從而提高具子葉，生長點的正常胚狀體的比例上。本研究自預培養15天后的花藥中游離小孢子細胞及細胞團，一方面，證明了對這些發育程度不等的細胞團的培養能夠獲得小孢子胚狀體，另一方面可能由于細胞團在懸浮培養中的營養供給及生長空間較花藥中好，本研究中獲得了最高為12個花藥產生22個胚狀體的結果，且子葉期胚的的比例約為23％，與常規花藥培養比較，表現較好。
無疑，本發明中游離小孢子細胞團培養路線，對于研究培養基因素或其它因素對于小孢子細胞分裂、分化的影響，研究植物細胞的發育及形態建成，優化辣椒的雄性單性生殖技術，提高正常胚狀體頻率是一個很好的研究體系。
2.3再生植株的倍性鑒定取生長良好的葉片，采用流式細胞儀進行染色體倍性分析。結果表明，在再生株中，存在著單倍體，二倍體及混倍體植株。由于胚狀體發育的早期鏡檢顯示分裂細胞團來自小孢子，因此后二者應該是在小孢子細胞團的分裂分化過程中，染色體自然加倍形成的雙單倍體材料，以及可能同一細胞團中，部分細胞染色體發生了加倍，而部分細胞沒有發生染色體加倍產生的混倍體材料。
權利要求
1.一種辣椒游離小孢子細胞團培養方法，其特征在于先對花藥進行預培養，然后進行進行小孢子的游離培養。
2.根據權利要求1所述的辣椒游離小孢子細胞團培養方法，其特征在于，包括如下步驟(1)花藥培養摘取小孢子處于單核后期的花蕾，剝去花萼部分；以70％乙醇浸10秒后，0.1％升汞振蕩滅菌10分鐘；無菌水清洗4次，剝取花藥接種于PAC培養基上，之后給以35℃或32℃高溫暗處理8天，轉入26℃暗培養；(2)游離小孢子及其細胞團培養自預培養15天后的花藥中采用直接擠壓法游離小孢子及其細胞團，培養于PMC培養基中，每皿2ml，12個花藥，26℃暗培養，4周后即可獲得小孢子胚狀體；(3)倍性鑒定取各瓶苗中齡葉片約150mg，在2ml LB01細胞裂解液中用鋒利刀片切碎后，經50μm尼龍膜過濾，濾液收集在BD流式細胞儀上樣管中；1000rpm離心5分鐘后，倒去上清液，沉淀中加入200μl濃度為50μg/ml的PI核染色劑，避光冷藏20分鐘后，采用流式細胞儀測定植株的倍性水平，激發光波長488nm，對照材料為二倍體的供體母株葉片。
全文摘要
本發明公開了一種辣椒游離小孢子細胞團培養方法。該方法先對花藥進行預培養，然后進行小孢子的游離培養。本發明在辣椒的游離小孢子培養體系上另辟蹊徑，通過游離培養經預培養后的花藥中的小孢子細胞及細胞團，獲得了胚狀體及其植株，顯微鏡檢提供了胚狀體的單細胞、單倍體發育途徑的細胞學證據。該技術體系的建立，不僅是辣椒單倍體育種技術上的突破，而且該游離小孢子培養胚狀體誘導體系還可能成為進行植物細胞分化、發育研究的良好實驗體系。
文檔編號C12N5/04GK1769428SQ20041008670
公開日2006年5月10日 申請日期2004年10月28日 優先權日2004年10月28日
發明者劉凡, 趙泓, 陳彬, 耿三省, 張月云 申請人:北京市農林科學院