專利名稱：海島棉花粉管通道法轉基因技術的制作方法
技術領域：
本申請涉及一種海島棉品質改良技術，屬于植物基因工程和農業生物技術領域。更具體地，本申請涉及海島棉花粉管通道轉基因方法，及用此方法得到的轉移外源目的基因的海島棉。
背景技術：
棉花在分類上屬于雙子葉植物綱，錦葵科，棉屬(Gossypium L.)，是世界上最重要的栽培農作物之一。原產于高溫、干旱、短日照的熱帶和亞熱帶的荒漠草原，多年生。經過人類長期栽培馴化，才逐步成為一年生的栽培作物。棉花是唯一由種子生產纖維的農作物。棉纖維是紡織工業的主要原料；棉子含油分、蛋白質，是食品工業的原料；棉短絨也是化學工業和國防工業的重要物資。
棉屬中包括許多棉種，其中有4個栽培種草棉、亞洲棉、陸地棉和海島棉。栽培最廣泛的是陸地棉，其產量約占世界棉花總產量的90％；海島棉約占5～8％；亞洲棉約占2～5％；草棉已很少栽培。
海島棉(G.barbadens L)起源于南美洲西北部秘魯等地區。18世紀中葉引進西印度群島種植，稱海島棉。經過栽培馴化，出現一年生類型。海島棉因其優異的纖維品質，使其經濟價值遠遠高于其它栽培種，是特紡工業和高檔織物不可缺少的原料。海島棉在全世界僅有埃及、美國、中國、中亞地區、秘魯等少數國家可以種植。在中國，也僅有新疆有較大面積栽培。海島棉是常異花授粉作物，長期的人工馴化和雜交，使其遺傳背景越來越狹窄，已很難找到抗逆基因和品質改良基因。近緣野生種雖具有一些抗逆基因和品質改良基因，但栽培價值低，并且通過人工雜交實現基因轉移，使雙親的遺傳組成在染色體水平上進行交換和重組，效率低，育種周期長，因此傳統的棉花育種面臨著種質資源匱乏，遠緣雜交困難等難以克服的問題。而利用轉基因技術，將目的基因轉入海島棉，是在DNA分子水平上進行重組和交換，可提高效率，縮短育種周期，無疑將在發展海島棉生產上和對海島棉品種進行遺傳改良具有重要意義。
通過植物遺傳轉化技術，將目的基因導入棉花是棉花基因工程研究的基本環節，在棉花基因轉移研究實踐中應用較廣的方法是花粉管通道法、農桿菌介導法和基因槍轟擊法。后兩種方法的主要不足是必須建立一個良好的體細胞再生體系，但棉花是相對難以進行植物體細胞組織培養的作物，胚胎發生具有明顯的基因型限制，體細胞再生系統在一般品種中難以建立；并且體細胞組織培養過程中容易發生基因型變異；轉化成本相對較高。花粉管通道法是一種借助于植物自身的種質細胞卵細胞或受精卵為轉化對象的直接轉化技術，通過花粉管通道將外源總體DNA或外源基因在自花授粉前后的適當時期導入胚囊，轉化尚不具備正常細胞的卵、合子或早期胚胎細胞。此技術最早由我國學者周光宇提出(周光宇，龔蓁蓁，王自芬，遠源雜交的分子基礎——DNA片段雜交假設的一個論證。遺傳學報，1979，6(4)405-412)，并在長期科學研究中不斷發展。周光宇等在充分調查國內外植物遠緣雜交的變異后，針對那些遠緣雜交所產生的、而在染色體水平上觀察不到的表型變異，認為這些表型變異是染色體水平以下的DNA片段雜交產生的結果，即DNA片段雜交假說。該假說認為，盡管遠源雜交親本間的染色體結構從整體上來看是不能親和的，但從進化的角度來分析，其部分基因間的結構有可能保持一定的親和性。并結合植物開花受精過程的解剖學特征，認為外源基因或DNA可以通過花粉管通道進入受精胚囊，稱為″花粉管通道法(途徑)″(pollen-tube pathway)。已有的實驗證明，遠緣雜交后代基因組中確有DNA片段雜交現象存在，該技術的建立為花粉管導入外源基因的整合奠定了基礎，開創了整株植物活體基因轉化的新途徑。其優點是不受基因型限制、易操作且成本較低。現今利用此方法，已將外源基因導入受體植物，經Southern等分子檢測獲得了外源基因穩定表達的轉基因植物，陸地棉是此技術首先成功的受體植物(Zhou G.Y.，Wengj.，Zheng Y.，et al，Introduction of exogenous DNAinto cotton embryos.Methods in Enzymolofy，1983，101433-448.)。我國于1993年開始，已成功地將主要作用于鱗翅目類害蟲的Bt基因、Bt+CPT1(豇豆胰蛋白酶抑制劑基因)雙價基因、對蚜蟲有控制作用的雪花蓮凝集素基因(sGNA)、抗真菌病害的幾丁質酶基因、葡聚糖酶基因、葡萄氧化酶基因等數種功能基因，及其各種基因的組合，陸續導入我國棉花主栽陸地棉品種之中，如泗棉3號、中棉所12號、中棉所19號、中植372、蘇棉8號、蘇棉12號、泗棉167、泗陽168、石遠321、新陸早4號、新陸早7號、新陸早8號、遼棉15和3517、541、916、C6524、Q0101、蘇引A等多個優良品種(系)，獲得了目標性狀穩定表達的轉基因植株，通過選育形成了不同類型的轉基因抗蟲、抗病陸地棉品系和品種。參見下表1。
表1.花粉管通道途徑轉化獲得的轉基因陸地棉
花粉管通道法在陸地棉上一般的操作方法為首先選擇次日將開放的花蕾進行自交，在開花后12-24小時左右即開花次日，選擇果枝和花位較好的幼子房作為轉化對象。用50μl微量進樣器作為注射的工具，注射時摘除或剝去花瓣，抹平花柱，右手持微量進樣器，左手輕扶摘除花瓣后的幼子房，從抹平花柱處沿子房的縱軸方向進針至子房長度的約2/3處，并后退至1/3處，輕緩操作注射器，將DNA溶液推入受精子房中。若將這種操作應用在生理特性更加敏感的海島棉上，會對幼嫩子房造成極大傷害，導致座鈴率幾乎為零。
由于海島棉與陸地棉相比，其生理特性更加敏感，自然落鈴率較高，并且子房較小(海島棉子房直徑為1-2cm，陸地棉子房直徑為2-3cm)，若受到外力作用，則更易脫落。再則一般陸地棉花粉管在授粉后16小時左右到達胚囊，而海島棉在授粉后12小時左右已伸入胚珠。因此，利用現有的花粉管通道轉基因技術，如文獻CN1229141A及CN1251862A所述，其轉化率遠遠低于陸地棉，幾乎為零。因此，此技術需針對不同的作物采用不同方法細則操作。
發明內容
本發明的目的在于提供一種海島棉花粉管通道轉基因方法，其特征在于包含以下步驟1)去除變成紫紅色的花冠，2)用微量注射器從斷面沿花柱中軸插入子房長度的約1/4處，再退回2毫米左右，3)注入含外源目的基因的緩沖液，4)進行培養，獲得轉基因植株。
本發明提供的方法，其特征在于，另外包含在去除變成紫紅色的花冠后，剪去2/3柱頭的步驟。
本發明提供的方法，其特征在于，另外包含在注入含外源基因的緩沖液后，去處未處理的花的步驟。
本發明提供的方法，其中所述花冠位于海島棉中上部果枝第一或第二個果節位的花上。
本發明所提供的方法中，其中所述含外源基因的緩沖液在注入前于-20℃-0℃預冷卻，和所述注入是在開花授粉后8-16小時內，于15-30℃的溫度下進行。
本發明所提供的方法中，其中所述含外源基因的緩沖液中含有10PPM赤霉素。
本發明的目的在于提供一種用上述方法獲得的轉化了外源目的基因的海島棉。
用于本發明方法的外源基因可以為棉花或非棉花基因，來源可為種間，屬間，科間以至微生物。外源基因可以為各種品質、抗性及其它有益性狀基因。例如蜘蛛絲基因，運轉蛋白基因，伸展蛋白基因等。
用于轉基因的受體為海島棉品種、品系或者中間材料。如海島棉品種新海5號，新海14號，新海15號，新海16號，新海17號，新海18號，新海19號，新海20號和新海21號等。
由于海島棉下部果枝的自然脫落率較高，故在進行海島棉花粉管通道轉化時，選擇海島棉中上部果枝第一或第二個果節位的花，在開花授粉后8-16小時內，天氣晴朗且氣溫在15-30℃時導入外源目的基因，以避開不利生理條件和環境條件的影響。
對受體進行轉基因的生理時間為其自花授粉后8-16小時。
抗性檢測的選擇劑根據載體上所具有的標記基因而定。如對于Npt II基因選用卡那霉素，對于Bar基因選用Basta除草劑，濃度為50-1000PPM，處理時間為3-5天。將經選擇劑選擇后的抗選擇劑單株在幼苗期取葉片提取DNA做PCR等分子標記檢測分析。對轉化植株進行農藝性狀鑒定篩選，株系、品系培育，獲得含目標性狀的優良種質、品系或品種，實現創新和改良。
由于海島棉生理特性更加敏感，用于陸地棉的花粉管通道法會對幼嫩子房造成極大傷害，導致座鈴率幾乎為零。而本發明的方法涉及去除變成紫紅色的花冠，注意不損傷幼嫩子房的表皮層，露出柱頭，用小剪剪去2/3柱頭，用微量注射器(10或50μl)從斷面沿花柱中軸輕柔插入子房長度的約1/4處，再退回2毫米左右，小心注入在-20℃--0℃下預冷的10微升含外源目的基因的緩沖液，該操作有別于陸地棉現有應用技術，是適應海島棉本身的生理特性，并最大程度上減輕了對子房的機械傷害、滲透以及膨脹的傷害，盡可能地提高了成鈴率和轉基因種子的轉化效率。完成該操作后，掛牌標記已轉基因的棉花幼鈴，并在牌子上記載編號或基因供體和時間。另外，在含外源目的基因緩沖液中加入10PPM的赤霉素，以防止和減少幼鈴的脫落。同時去除所作標記果枝上其余未作處理和下部果枝的花，以保證所做處理的花有足夠的養分供給，進一步提高座鈴率。
因此，本發明的方法具有以下優勢1、具有獨創性。目前海島棉轉基因未見有任何方法轉化成功的報道，本發明是在大量實驗的基礎上，得到了花粉管通道轉化技術應用于海島棉的適宜條件，首次實現海島棉品種的轉化改良。
2、座鈴率和轉化率高。通過各種改良措施使座鈴率高達10-15％，轉化率達1--5％。
3、可操作性強。可在田間直接進行，不需要特殊的設備，且無基因型依賴。
4、育種效率高。要獲得一個純系或品種，常規方法至少需要6-8年，本方法僅需要3-5年。可大大縮短育種周期。
5、成本低。與基因槍轟擊法和農桿菌介導法相比，不需要使用昂貴的設備和耗費大量的組織培養化學藥品。
本發明的方法簡便、經濟、有效，改變了現有花粉管通道技術在海島棉上轉化率低的現狀。用此方法向海島棉轉移各種來源的DNA分子，以達到有效改變海島棉遺傳組成，創造海島棉新種質、改良海島棉品種的目的。相對于現有技術，本發明的方法具有轉化效率高、改良時間短、便于推廣等優點。
圖1為轉入運轉蛋白基因(GhABC1)的海島棉品種新海16號的照片，其中如圖中箭頭所示，抗性植株不出現黃斑，而非抗性植株出現黃斑。
圖2為轉化轉運蛋白基因的轉基因植株的PCR鑒定照片，其中(M)代表PCR的MARKER，(+)為以含目的基因GH的質粒載體為模板的陽性對照，(-)代表陰性對照，4911-4、4911-5、4911-9、4911-12、4911-13、4911-17、4911-21均為檢測出的陽性株。
圖3為轉入伸展蛋白基因(Expansin gene)的海島棉品種新海17號的照片，其中如圖中箭頭所示，抗性植株不出現黃斑，而非抗性植株出現黃斑。
圖4為轉化伸展蛋白基因的轉基因植株的PCR鑒定照片，圖中(M)代表PCR的MARKER，(+)為以含目的基因E的質粒載體為模板的陽性對照，(-)代表陰性對照，(BLK)代表空白對照3284-1、3284-2、3284-5均為檢測出的陽性株。
具體實施例方式
以下根據實施例詳細描述本發明。所述實施例僅是用于解釋本發明的目的，而不能以任何方式解釋為對本發明的限制。
實施例1.將運轉蛋白基因(GhABC1)轉入海島棉品種新海16號，培育纖維品質改良的海島棉新品種將新海16號(新疆農業科學院經濟作物研究所提供)種植至開花，按照《分子克隆實驗指南》(金冬雁，黎孟楓等譯，J.薩姆布魯克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著。科學出版社，1992)提取含運轉蛋白基因的質粒DNA。具體如下進行。
含運轉蛋白基因的大腸桿菌菌株由中國科學院植物生理生化研究所提供，將該菌株接種到30ml含相應抗生素的LB液體培養基中(Luria-Bertani)，配制每升培養基，應在950ml蒸餾水中加入胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，NaCl10克，搖動容器直至溶質完全溶解，用5M NaOH調節PH7.0，加入蒸餾水至總體積1升，在1.034×105Pa高壓滅菌20分鐘)，37℃，300rpm培養8hr；取25ml加入含相同抗生素的500mlLB液體培養基中，于37℃，300rpm培養16hr；培養好的菌液于4℃以4000rpm離心15min，棄上清，加入100ml冰預冷的STE液(含0.1M NaCl，1mM EDTA，PH8.0；10mM Tric·HCl，PH8.0)洗滌沉淀；4000rpm，4℃離心15min，棄上清；加入18ml溶液I(50mM葡萄糖；25mM Tric·HCl，PH8.0；10mM EDTA PH8.0；配好后高壓滅菌)，在渦旋震蕩器上渦旋，使細菌沉淀充分散開；加40ml新配制的溶液II(0.2MNaOH，1％SDS)，蓋緊瓶蓋，緩慢顛倒離心瓶數次，以充分混勻內容物，室溫放置6min；加20ml冰預冷的溶液III(5M乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)，封住瓶口，搖動離心瓶數次以混勻內容物，置冰上放置30min，形成白色絮狀沉淀；4℃，4000rpm離心15min，用四層滅菌紗布把上清過濾至另一離心瓶中，加0.6倍體積異丙醇，充分混勻，于室溫放置10min；室溫，5000rpm離心15min，回收核酸；小心倒掉上清，敞開瓶口倒置使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉淀和管壁，倒出乙醇，將瓶倒置放在紙巾上控干，在超凈工作臺上將瓶內乙醇吹干。
用3ml TE(PH8.0)溶解核酸沉淀，轉入一個15ml離心管內，加3ml冰預冷的5M Licl溶液，充分混勻；4℃，1000rpm離心10min，將上清轉至另一個30ml離心管內，加等量異丙醇，充分混勻，室溫下以10000rpm離心10min，回收沉淀的核酸；小心倒掉上清，控干，用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，敞開管口并將管倒置于紙巾上，在超凈工作臺上將管內乙醇吹干。
用500ul含無DNA酶的胰RNA酶(20ul/ml)的TE(PH8.0)溶解沉淀，將溶液轉至一微量離心管中，室溫放置30min；用酚、酚氯仿、氯仿各抽投一次，離心時間分別為12000rpm，6min，6min，10min；將水相轉到另一個1.5ml離心管中，加100ul 10M乙酸銨，充分混勻，加2倍體積(約1ml)乙醇，-20℃放置30min；4℃，12000rpm離心10min，回收沉淀的質粒DNA；吸去上清，加200ul 4℃的70％乙醇，4℃ 12000rpm離心2min；吸去上清，在超凈工作臺上將管內乙醇吹干；取其中1次的質粒DNA用TE(PH8.0)稀釋后測量OD260，計算質粒DNA的濃度，然后將質粒DNA貯存于-20℃。經電泳和紫外分光光度計測定質粒的濃度、純度(濃度為0.02μg/μl，純度為OD260/OD280在1.8-2.0之間)。保存于0℃--20℃。于盛花期，在6:00--10:00的時間，選擇授粉后8-16小時，變成紫紅色的花，去除整個花冠，剪下2/3柱頭，用微量注射器從斷面沿花柱中軸輕柔插入子房長度的約1/4處，再退回2mm左右，小心注入10微升加有10PPM赤霉素的在-20℃--0℃下預冷的含上述外源目的基因的緩沖液。去除所作標記果枝上其余未作處理和下部果枝的花，以保證所做處理的花有足夠的養分供給。做好標記和記載。
按常規方法進行培養，在棉纖維成熟時，按標記進行收獲、人工剝籽，得到轉化棉籽。
將收獲后的種子種植在海南，從幼苗展開第3片真葉時，根據目的基因所攜帶的選擇標記基因，使用卡那霉素作為選擇劑，濃度0.005-0.01g/ml，在葉片上用脫脂棉球棒進行涂抹，五天后觀察變色情況。不抗者出現黃斑，抗者不出現黃斑。第四、第五片真葉依此操作，選擇出抗性植株(參見圖1)。
按常規方法，取抗性植株葉片提取DNA，進行PCR分析。
棉葉總DNA提取采用CTAB法。稱取7-10mg棉花鮮葉片，液氮研磨至粉末狀，加入1mlBuffer I(50mM Tris-HCl pH8.0，5mMEDTA pH8.0，350mM山梨醇，0.1％β-巰基乙醇，10％PEG6000)，混勻后轉入2ml離心管中，4℃，12000rpm離心5分鐘。去掉上清后用500μl的Buffer II(50mMTris-HCl pH8.0，5mM EDTA pH8.0，350mM山梨醇，0.1％β-巰基乙醇，1％SDS，710mM NaCl，0.1％CTAB)重懸沉淀，60℃保溫10分鐘。分別用等體積的苯酚和氯仿各抽提一次。將上清滴入等體積的異丙醇中進行沉淀。4℃，12000rpm離心去除異丙醇。DNA沉淀用70％乙醇洗后，干燥待用。
PCR特異引物由上海生工生物工程有限公司合成，其引物序列為第一輪上游P正(E6-81) 5`--CAC CAT TCA CCA CTT GCTC--3` 19bp(SEQ IDNO1)下游NOS1(AS1) 5`--CGA ATT CCC GAT CTA GTA AC-3` 20bp(SEQ IDNO2)第二輪上游P3(E6-S2) 5`--GCT CCT AAT TGA GTT GAA ATC TTT-3`24bp(SEQID NO3)下游93400(AS) 5`--TTC CCA ATA ACA GTA TCA GCG C-3` 22bp(SEQID NO4)PCR反應條件為
10×PCR Buffer2μl4×dNTP(2mM) 2μlTaq DNA(5u/μl) 0.4μl模板 100ng加水至20μl反應程序為第一輪1 94℃5m 1個循環 3 72℃10m 1個循環第二輪1 94℃2m 1個循環 3 72℃10m1個循環在進行完PCR反應之后，取反應混合物產物，通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及特異性(參見圖2)。轉運蛋白基因(GHABC)片段大小約650bp。經上述試驗證實獲得了轉基因植株(參見圖1)。
將轉化植株進行農藝性狀和纖維品質鑒定篩選(通過田間觀察記載，收獲考種鑒定株型，株高，鈴數，單鈴重，籽棉產量，衣分等農藝性狀。同時利用HVI檢測皮棉纖維品質)，獲得了纖維品質(強度、長度)發生改變的轉基因株系，經株系品系培育，獲得含目標性狀的優良種質、品系或品種，實現海島棉的創新和改良。
實施例2.將伸展蛋白基因(Expansin gene)轉入海島棉品種新海17號，培育纖維品質改良海島棉新品種將新海17號(新疆農一師阿拉爾農科所提供，)種植至開花，按照《分子克隆實驗指南》提取含伸展蛋白基因的質粒DNA。具體如下。
含伸展蛋白基因的大腸桿菌由中國科學院微生物研究所提供，將該菌株接種到30ml含相應抗生素的LB液體培養基中(Luria-Bertani)，配制每升培養基，應在950ml蒸餾水中加入胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，NaCl10克，搖動容器直至溶質完全溶解，用5MnaOH調節PH7.0，加入蒸餾水至總體積1升，在1.034×105Pa高壓滅菌20分鐘)，37℃，300rpm培養8hr；取25ml加入含相同抗生素的500mlLB液體培養基中，于37℃，300rpm培養16hr；培養好的菌液于4℃以4000rpm離心15min，棄上清，加入100ml冰預冷的STE液(含0.1M NaCl，1mM EDTA，PH8.0；10mM Tric·HCl，PH8.0)洗滌沉淀；4000rpm，4℃離心15min，棄上清；加入18ml溶液I(50mM葡萄糖；25mM Tric·HCl，PH8.0；10mM EDTA PH8.0；配好后高壓滅菌)，在渦旋震蕩器上渦旋，使細菌沉淀充分散開；加40ml新配制的溶液II(0.2MNaOH，1％SDS)，蓋緊瓶蓋，緩慢顛倒離心瓶數次，以充分混勻內容物，室溫放置6min；加20ml冰預冷的溶液III(5M乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)，封住瓶口，搖動離心瓶數次以混勻內容物，置冰上放置30min，形成白色絮狀沉淀；4℃，4000rpm離心15min，用四層滅菌紗布把上清過濾至另一離心瓶中，加0.6倍體積異丙醇，充分混勻，于室溫放置10min；室溫，5000rpm離心15min，回收核酸；小心倒掉上清，敞開瓶口倒置使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉淀和管壁，倒出乙醇，將瓶倒置放在紙巾上控干，在超凈工作臺上將瓶內乙醇吹干。
用3ml TE(PH8.0)溶解核酸沉淀，轉入一個15ml離心管內，加3ml冰預冷的5M Licl溶液，充分混勻；4℃，1000rpm離心10min，將上清轉至另一個30ml離心管內，加等量異丙醇，充分混勻，室溫下以10000rpm離心10min，回收沉淀的核酸；小心倒掉上清，控干，用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，敞開管口并將管倒置于紙巾上，在超凈工作臺上將管內乙醇吹干。
用500ul含無DNA酶的胰RNA酶(20ul/m1)的TE(PH8.0)溶解沉淀，將溶液轉至一微量離心管中，室溫放置30min；用酚、酚氯仿、氯仿各抽投一次，離心時間分別為12000rpm，6min，6min，10min；將水相轉到另一洐個1.5ml離心管中，加100ul 10M乙酸銨，充分混勻，加2倍體積(約1ml)乙醇，-20℃放置30min；4℃，12000rpm離心10min，回收沉淀的質粒DNA；吸去上清，加200ul 4℃的70％乙醇，4℃12000rpm離心2min；吸去上清，在超凈工作臺上將管內乙醇吹干；取其中1次的質粒DNA用TE(PH8.0)稀釋后測量OD260，計算質粒DNA的濃度，然后將質粒DNA貯存于-20℃。，經電泳和紫外分光光度計測定質粒的濃度、純度(濃度為0.02μg/μl，純度為OD260/OD280在1.8-2.0之間)，保存于0℃--20℃。
于盛花期，在6:00--11:00的時間，選擇授粉后8-16小時，變成紫紅色的花，去除整個花冠，剪下2/3柱頭，用微量注射器從斷面沿花柱中軸輕柔插入子房長度的約1/4處，再退回2mm左右，小心注入10微升加有10PPM赤霉素的在-20℃--0℃下預冷的含外源目的基因的緩沖液。去除所作標記果枝上其余未作處理和下部果枝的花，以保證所做處理的花有足夠的養分供給。做好標記和記載。
按常規方法進行培養，在棉纖維成熟時，按標記進行收獲、人工剝籽，得到轉化棉籽。
將收獲后的種子種植在海南，從幼苗展開第3片真葉時，根據目的基因所攜帶的選擇標記基因，使用卡那霉素作為選擇劑，濃度0.005-0.01g/ml，在葉片上用脫脂棉球棒進行涂抹，五天后觀察變色情況。不抗者出現黃斑，抗者不出現黃斑。第四、第五片真葉依此操作，選擇出抗性植株(參見圖3)。
按常規方法，將抗性植株取葉片提取DNA，進行PCR分析，從而獲得轉基因植株(參見圖3)。
PCR特異引物由上海生工生物工程有限公司合成，其引物序列為exn55`--GCT AGC TCT TAC TCA AAT-3` 18bp(SEQ ID NO5)exn35`--GTC TTA AAA CTG GCC TCC-3` 18bp(SEQ ID NO6)PCR反應條件為10×PCR Buffer 2μl4×dNTP(2mM)2μlTaq DNA(5u/μl) 0.4μl模板100ng加水至 20μl反應程序為1 94℃3m 1個循環 3 72℃10m1個循環在進行完PCR反應之后，取反應混合物產物，通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及特異性(參見圖4)。伸展蛋白基因(E)片段大小約814bp。
將轉化植株進行農藝性狀和纖維品質鑒定篩選(通過田間觀察記載，收獲考種鑒定株型，株高，鈴數，單鈴重，籽棉產量，衣分等農藝性狀。同時利用HVI檢測皮棉纖維品質。)，獲得了纖維品質(強度、長度)發生改變的轉基因株系，經株系品系培育，獲得含目標性狀的優良種質、品系或品種，實現海島棉的創新和改良。
比較例花粉管通道法在陸地棉上一般的操作方法為首先選擇次日將開放的花蕾進行自交，在開花后12-24小時左右即開花次日，選擇果枝和花位較好的幼子房作為轉化對象。用50μl微量進樣器作為注射的工具，注射時摘除或剝去花瓣，抹平花柱，右手持微量進樣器，左手輕扶摘除花瓣后的幼子房，從抹平花柱處沿子房的縱軸方向進針至子房長度的約2/3處，并后退至1/3處，輕緩操作注射器，將DNA溶液推入受精子房中。若將這種操作應用在生理特性更加敏感的海島棉上，會對幼嫩子房造成極大傷害，導致座鈴率幾乎為零。
由于海島棉下部果枝的自然脫落率較高，故在進行海島棉花粉管通道轉化時，選擇海島棉中上部果枝第一或第二個果節位的花，在開花授粉后8-16小時內，天氣晴朗且氣溫在15-30℃時導入外源目的基因，以避開不利生理條件和環境條件的影響。首先，將變成紫紅色的花，去除整個花冠，剪下2/3柱頭，用微量注射器從斷面沿花柱中軸輕柔插入子房長度的約1/4處，再退回2mm左右，然后小心注入10微升加有10PPM赤霉素的在-20℃--0℃下預冷的含外源目的基因的緩沖液。最后去除所作標記果枝上其余未作處理和下部果枝的花，以保證所做處理的花有足夠的養分供給。做好標記和記載。
2002年分別用陸地棉所采用的花粉管通道法技術和本發明方法對海島棉受體材料新海5號、19號、16號和17號進行了座鈴率和轉化效率的比較。具體結果見下表2。
表2.現有技術與本方法轉化效率的對比
從上述結果可以看出，本發明的優點及積極效果是顯著改變了海島棉的轉化率，原有的轉化方法轉化率為零，而本發明的轉化率在3％左右，有時可達5％。
IN043754-序列表SEQUENCE LISTING<110>新疆溢達農業科技有限公司<120>海島棉花粉管通道法轉基因技術<130>IN043754<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>1caccattcac cacttgctc 19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>2cgaattcccg atctagtaac 20<210>3<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>3gctcctaatt gagttgaaat cttt 24<210>4<211>22<212>DNA<213>人工合成
<400>4ttcccaataa cagtatcagc gc 22<210>5<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>5gctagctctt actcaaat18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>6gtcttaaaac tggcctcc18
權利要求
1.一種海島棉花粉管通道轉基因方法，其特征在于包含以下步驟1)去除變成紫紅色的花冠，2)用微量注射器從斷面沿花柱中軸插入子房長度的約1/4處，再退回2毫米左右，3)注入含外源目的基因的緩沖液，4)進行培養，獲得轉基因植株。
2.權利要求1的方法，其特征在于，另外包含在去除變成紫紅色的花冠后，剪去2/3柱頭的步驟。
3.權利要求1的方法，其特征在于，另外包含在注入含外源基因的緩沖液后，去處未處理的花的步驟。
4.權利要求1的方法，其中所述花冠位于海島棉中上部果枝第一或第二個果節位的花上。
5.權利要求1的方法，其中所述含外源基因的緩沖液在注入前于-20℃-0℃預冷卻，和所述注入是在開花授粉后8-16小時內，于15-30℃的溫度下進行。
6.權利要求5的方法，其中所述含外源基因的緩沖液中含有10PPM赤霉素。
7.權利要求1的方法，其中所述外源基因是棉花或非棉花基因，和來源于種間，屬間，科間或微生物。
8.權利要求7的方法，其中所述外源基因是品質、抗性或其他有益性狀基因。
9.權利要求8的方法，其中所述外源品質基因包括但不僅限于蜘蛛絲基因，運轉蛋白基因或伸展蛋白基因。
10.一種用權利要求1的方法轉化現有海島棉品種所產生的新的海島棉新品系和新品種。
11.權利要求10的現有海島棉品種，包括但不僅限于海島棉品種新海5號，新海14號，新海15號，新海16號，新海17號，新海18號，新海19號，新海20號和新海21號。
全文摘要
本發明涉及一種海島棉品質改良技術。更具體地，本發明涉及一種海島棉花粉管通道轉基因方法，該方法簡便、經濟、有效，改變了現有花粉管通道技術在海島棉上轉化率低的現狀。另外，本發明涉及用此方法獲得的轉化了外源目的基因的海島棉。
文檔編號C12N15/89GK1769466SQ20041009010
公開日2006年5月10日 申請日期2004年11月2日 優先權日2004年11月2日
發明者張玉高, 萬旭中, 劉霞, 楊克銳, 黃全生, 王冬梅, 黃樂平, 李建平 申請人:新疆溢達農業科技有限公司