本發明涉及一組環介導等溫擴增技術檢測銅綠假單胞菌的引物和試劑盒，屬于生物檢測技術領域。
背景技術：
銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)原稱綠膿桿菌，是一種高致死率、溶血性、抗藥性強的革蘭氏陰性桿菌，在分類上屬假單胞菌科中的假單胞菌屬，此菌屬種類多達200種以上，在自然界分布廣泛，是土壤中存在的最常見的細菌之一。本菌最主要的生長條件是潮濕環境，其它條件要求不高。紡織品極易吸潮，具備銅綠假單胞菌生長的所有因素，能夠提供其繁殖的理想環境，包括合適的ph，溫度及水營養，也能提供其繁殖所需的大表面積。因此紡織品中一旦污染銅綠假單胞菌，該菌會頑強地吸附在纖維上，一般的清洗、曝曬是消滅不了的。
銅綠假單胞菌可暫時寄生于皮膚，因此接觸性體表感染率相當高，能引起人中耳炎、角膜炎、尿道炎和下呼吸道感染，亦可引起心內膜炎、胃腸炎、膿胸，甚至通過血流導致敗血癥，可引起病人死亡。
銅綠假單胞菌檢測有多種方法，常見的主要有傳統標準方法、全自動微生物分析系統分析法、分子生物學方法(常規pcr法、多重pcr法、pcr-dhplc法、real-timepcr法、基因芯片技術)、免疫學方法(免疫磁性分離法、熒光激活細胞分離法、酶聯免疫吸附法)、蛋白多肽檢測方法等。傳統檢測方法程序繁瑣、周期長、靈敏度低。免疫學方法制備抗體較困難、不能同時檢測多種成分，對實驗人員技巧性要求高，易出現交叉污染。分子生物學方法具有高靈敏度、準確、快速等優點，但需要專門儀器設備，易污染，對檢驗人員要求較高。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是：提供一種環介導等溫擴增技術檢測銅綠假單胞菌的引物和試劑盒。
環介導等溫擴增技術檢測銅綠假單胞菌的引物，引物序列如下：
外側引物對f3和b3：
上游引物f3：gctcgtacggagatacagcc；
下游引物b3：tgttcaccgtttgtattggcg；
內側引物對fib和bip：
上游引物fip：
gtcgaatccctttaggacggagaccctttcgaacgcggggaatggcc；
下游引物bip:
aagttcacactgtggaggagcaacccaatagacccgagccatgtttcc
利用上述引物，本發明還提供一種銅綠假單胞菌基因快速診斷試劑盒，包括bstdna聚合酶、反應液、樣品預處理液、顯色液和陽性對照液組成。
反應液：每1l反應液中含有1.6～2mmoldntp、20～25mmoltris-hcl、10～12.5mmol氯化鉀、10～12.5mmol硫酸銨、8～10mmol硫酸鎂、1～1.25mltritonx-100、0.8～1mol甜菜堿、內引物fip/bip各1.6～2mol和外引物f3/b3各0.2～0.25mol。
每1l樣品預處理液中含有10～20mmolph8.0的tris-hcl、1～2mmoledta和10～12mltritonx-100。
顯色劑：為10％的熒光染料sybrgreeni。
陽性對照液：銅綠假單胞菌基因組dna。
本發明的有益效果：
現有技術中國專利cn102134601a公開了一種種銅綠假單胞菌的環介導等溫擴增檢測引物、檢測方法和檢測試劑盒，該發明針對銅綠假單胞菌的ecfx基因，設計和篩選了一套特異性檢測引物組以及含有該檢測引物組的檢測試劑盒和利用該檢測試劑盒通過lamp的檢測。
與現有技術相比，本發明在其基礎上，也是利用ecfx基因設計了一組新的引物。通過兩組引物的對比實驗，本發明的引物具有更好的靈敏度高。
具體實施方式
實施例1
環介導等溫擴增技術檢測銅綠假單胞菌的引物，引物序列如下：
外側引物對f3和b3：
上游引物f3：gctcgtacggagatacagcc；
下游引物b3：tgttcaccgtttgtattggcg；
內側引物對fib和bip：
上游引物fip：
gtcgaatccctttaggacggagaccctttcgaacgcggggaatggcc；
下游引物bip:
aagttcacactgtggaggagcaacccaatagacccgagccatgtttcc
利用上述引物，本發明還提供一種銅綠假單胞菌基因快速診斷試劑盒，包括bstdna聚合酶、反應液、樣品預處理液、顯色液和陽性對照液組成。
反應液：每1l反應液中含有1.6～2mmoldntp、20～25mmoltris-hcl、10～12.5mmol氯化鉀、10～12.5mmol硫酸銨、8～10mmol硫酸鎂、1～1.25mltritonx-100、0.8～1mol甜菜堿、內引物fip/bip各1.6～2mol和外引物f3/b3各0.2～0.25mol。
每1l樣品預處理液中含有10～20mmolph8.0的tris-hcl、1～2mmoledta和10～12mltritonx-100。
顯色劑：為10％的熒光染料sybrgreeni。
陽性對照液：銅綠假單胞菌基因組dna。
實施例2特異性驗證
收集銅綠假單胞菌20株及非銅綠假單胞菌30株，將這些菌株分別在營養肉湯(副溶血性弧菌在3.5％氯化鈉營養肉湯)37℃培養24h后，取1ml菌液，按照實施例1的提供的引物和現有技術中的環介導等溫擴增技術提取各個細菌的dna，并分別進行lamp擴增和加入顯色劑觀察。
結果如下：本發明的檢測引物具有較好的特異性，只有銅綠假單胞菌菌株擴增陽性，其他非銅綠假單胞菌菌株為陰性。
實施例3靈敏度對比驗證
按照現有技術中國專利cn102134601a公開的檢測方法和檢測引物進行實驗，并與本發明提供的引物進行靈敏度對比實驗。
以銅綠假單胞菌pseudomonasaeruginosaatcc27853為參考菌株，將其在lb培養基中37℃培養24h后，取1ml菌液，用滅菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋，選取5個稀釋度進行平板計數。
取經平板計數細菌數分別為：
0.01cfu/ml、0.05cfu/ml、0.25cfu/ml、1.25cfu/ml、6.25cfu/ml。
按照現有技術中國專利cn102134601a公開的檢測方法提取細菌dna，進行lamp擴增，加入顯色劑顯色觀察，驗證靈敏度。
經過5次重復實驗，其中現有技術中國專利cn102134601a公開的檢測方法和檢測引物，5次實驗結果靈敏度為1.25cfu/ml。
本發明提供的引物，3次實驗結果靈敏度為0.25cfu/ml，2次實驗結果靈敏度為1.25cfu/ml。
與現有技術的引物相比，靈敏度更高。
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<110>趙吉光
<120>環介導等溫擴增技術檢測銅綠假單胞菌的引物和試劑盒
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