專利名稱：用于分離組織的中性蛋白酶(np)和使用中性蛋白酶的制品及其制備方法
技術領域：
本發明涉及中性蛋白酶(NP)在組織分離中的應用。
現有技術DE 44 45 891 A1描述了一種來自溶組織梭菌(Clostridium histolyticum)的重組蛋白酶(中性蛋白酶，NP)，以及在其分離細胞和細胞團塊中的應用。由此出發，為了能夠使用中性蛋白酶進行大規模地分離細胞和細胞團塊，需要有可復制性的大量的中性蛋白酶可供使用，通過重組制備法可以做到這點。不過，由于溶組織梭菌的序列基本未公開(Clostripain，兩個膠原酶和一個核糖體RNA-序列)，所以中性蛋白酶的克隆是不可能的。因此，應用密碼子法的推論(Schlüsse auf die Codon usage)和確定可使用的寡核苷酸的簡并性(DieEinengung der Degeneriertheit von verwendbaren Oligonukleotiden)也是不可能的。因此，應使用來自溶組織梭菌以及用其重組制備的中性蛋白酶的DNA-序列，而且運用一個編碼具有中性蛋白酶(來自溶組織梭菌)活性的蛋白質的DNA-序列，其中DNA-序列選自a.)SEQ ID NO1所示的DNA-序列或對此互補的DNA-序列，b.)與SEQ ID NO1所示的序列雜交的核酸序列，c.)遺傳密碼未簡并的、與a.)或b.)所述的序列雜交的核酸序列。
使細胞組織松散并釋放所含細胞和細胞團塊的方法的特征在于，用溶組織梭菌的重組中性蛋白酶溫育細胞組織(該重組中性蛋白酶由SEQ ID NO1或由相同氨基酸序列的遺傳密碼的簡并范圍內的序列編碼，并且是外源性DNA的原核生物細胞或真核生物細胞表達的產物)直到在希望的規模內釋放細胞或細胞團塊，并從細胞組織部分中分離出細胞或細胞團塊。如此獲得的酶的應用不再加以說明。
US 5989888中，制造商從一定比例的膠原酶I和II與中性蛋白酶的混合物中提取制成一種終制品。
根據這種方法，使用含在膠原酶-制劑中的中性蛋白酶進行制備，經此得不到高穩定性的酶。而且，若中性蛋白酶長時間含在膠原酶中，在濕潤的狀態下酶的活性則會降低。
發明概述本發明的目的是提供一種制品、其制備方法及其在組織分離中的應用，其在細胞的產率、存活性和完好性的方面達到了改善的分離分離效果。
通過具有權利要求1特征的產物、根據權利要求3的方法和按照權利要求9的應用來實現該目的。
本發明的產物由分離的組分A和分離的組分B構成，組分A為不含于膠原酶-酶制劑中的來自溶組織梭菌的蛋白酶(NP)，組分B來自膠原酶或膠原酶-酶制劑，其中，開始分離前，每次以需要的量將組分A加入組分B中，以分離組織。
所用的中性蛋白酶未通過重細制備來提供。
本發明方法在于，開始分離組織前，在按兩組分的量比例分別計量加入的情況下，有確定含量的分離的組分A與分離的組分B混合，組分A為不含于膠原酶-酶制劑中，且不通過重組制備產生的來自溶組織梭菌的中性蛋白酶(NP)，組分B為純化的或部分純化的膠原酶或膠原酶-酶制劑。
本發明的應用在于，純化的且不含于膠原酶-酶制劑中的中性蛋白酶(NP)每次以選定的量單獨添加到膠原酶或膠原酶-酶制劑中，以分離組織或者例如從組織中分離出細胞或細胞集合體，在細胞的產率、存活性和完好性方面改善分離效果。
在兩組分的量比例分別計量加入的情況下，中性蛋白酶與有確定中性蛋白酶含量的純化或部分純化的膠原酶一起使用是特別有利的，其中，所用的中性蛋白酶不是通過重組制備產生的。
基于本發明的制品以及中性蛋白酶用于分離組織的本發明的應用，其在細胞的產率、存活性和完好性方面通過以下方式達到了改善的分離效果，即分隔溶組織梭菌的中性蛋白酶(NP)，使其不含在蛋白酶-酶制劑中，而且通過將中性蛋白酶分別加入到一種膠原酶-酶制劑或膠原酶或膠原酶I和II中，用于從組織中分離出細胞或細胞集合體。使用的是溶組織梭菌的中性蛋白酶。其中存在依賴于組織類型和/或狀態的特性。其中這樣處理，使膠原酶和中性蛋白酶的加入分別依賴于組織量。中性蛋白酶不含在膠原酶-制劑中，這樣酶有較高的穩定性。而且，不使用制造商制備完畢的并準備好或儲備中的中性蛋白酶和膠原酶的混合物。開始分離組織前不久，使中性蛋白酶和膠原酶混合。
對于依賴于器官的種類、狀態和器官的貯存的消化方面的功能檢測是特別有利的。令人驚訝地表明，考慮到胰島細胞等價物的產率、胰島細胞或胰島簇的存活性、完好性，僅通過改變加入的中性蛋白酶能夠顯著改善分離效果。其中，膠原酶的加入起著不太重要的作用，這是由于其是一種對細胞毒性相對較小的酶。中性蛋白酶的量是關鍵的，因為酶的量太大會對細胞有損害作用，酶的量太小則分離組織是不完全的，因此分離的胰島細胞和胰島細胞集合體的產率較小。為了能夠個體化配制中性蛋白酶的劑量，使用純化或部分純化的膠原酶也是重要的，其含有少量其它溶蛋白的活性物，如中性蛋白酶。
本發明有利的技術方案是從屬權利要求的主題。
優選實施方案的描述通過針對供體進行的酶的調整，優化豬胰腺和人胰腺的胰島分離。
從胰腺組織中分離出朗氏胰島在酶的細胞分離領域具有特殊的位置。與從不同組織中分離其它細胞類型不同的是，該胰島分離的特征在于，在保持其形態完整性下，希望從一種其它器官，從胰腺，分離多細胞的細胞集合體、胰島。實現該目標對于實用方法學具有特別的要求。
從大動物的胰腺中分離出胰島的標準工藝是半自動化的消化-過濾方法，其結合了酶消化和胰腺(1)的機械分離。一個特別的要求是選擇合適的溶膠原的酶或蛋白酶混合物。理想情況下，在最小分離胰島組織情況下實現外分泌組織的最大分離。在大量以不純的溶膠原的蛋白酶混合物形式存在的酶中，目前證實，膠原酶I和膠原酶II是從大鼠(2，3)和豬(4)的胰腺釋放的胰島的主要部分。由于純的膠原酶只能不完全地分解狗(5)和大鼠(2)的胰腺組織，所以，Dispase(6)、中性蛋白酶(2)或胰蛋白酶(4)形式的其它蛋白酶是有效釋放胰島所必需的。單獨地對豬的胰腺的初步研究結果同樣說明，非特異的“中性蛋白酶”在胰島釋放上存在有利的協同作用。這里，非特異的蛋白酶的作用機理可能在于，通過蛋白多糖的溶蛋白分解，從而釋放膠原纖維，以使溶膠原的活性物容易進入其底物。此外，討論一種通過非特異的蛋白酶增強的膠原碎片的水解(2)。過剩的中性蛋白酶當然能夠自動加快膠原酶的蛋白質降解作用，并通過對蛋白酶敏感的附著分子(CAMs)的溶解，有助于胰島解聚(7)。另一方面，大鼠試驗表明，胰島對于純的膠原酶的溶蛋白作用顯示有相對的抗性(2)。
在評價引用的研究時必須注意，胰島對于中性蛋白酶的分解作用的敏感性是具有物種依賴性的，并且取決于細胞接觸的形態分布模式和膠原基質的結構(8、9)。豬是迄今所有研究物種(狗、人、大鼠、牛)中胰島周圍膠原含量最低的，且保護性結締組織包囊結構(10-12)僅以發育不完全的形式存在。相反，在此物種中發現內分泌和外分泌胰腺細胞(8)之間有最大量的細胞接觸。因此鑒于活性曲線，對于溶膠原的蛋白酶混合物的要求取決于所用的供體物種。這個重要的檢驗結果被Roche公司用于酶混合物的開發和商業應用，所述酶混合物用于從大鼠(Liberase RI)、狗(Liberas)、豬(Liberase pI)和人(Liberase HI)的胰腺中分離出胰島。這些產物主要彼此區別于中性蛋白酶的含量。
除了物種決定的差異外，當然還存在物種內和個體的供體變化性。對于人的胰腺供體，主要是由于年齡決定的表征因素諸如營養狀況、飲食習慣和早期疾病，造成胰島分離后所得產率的變化很大。仍以豬為例，可分離出的胰島量的非常顯著的變化主要歸糾于供體的年齡，＜25歲的年輕供體則顯得很不適于成功的胰島(13-15)分離。由于年老引起的變化，諸如升高的體重值(16)，其經常伴隨著胰腺纖維化(17、18)或胰腺脂肪化(19)，提高了胰島從人的胰腺中的可分離性。雖然這些形態學的改變甚至衰老供體的胰腺顯得適用于胰島分離(20)，但還應考慮由年老引起的胰島功能性的減退(15、21、22)。因此，幼年或青年供體的供體庫的拓寬大大地增加了臨床上胰島移植的潛力。
仍在豬胰腺的情形下，由于成年和幼年動物之間組織學上的差異表明，從幼年胰腺成功地分離胰島非常困難(11、23、24)。對此，最近的研究表明，既使在確定的飼養系內，同齡的個體之間的可分離胰島量上也存在著可證實的顯著差異(25)。
以上論述得出的結論是，在處理供體胰腺時，不同的供體因素的表征要求個體化考慮。鑒于以上討論的組織學因素，合適的分離過程首先應包括修飾所用的溶膠原的蛋白酶混合物。在此可支配的酶或酶混合物必須給使用者有盡可能大的靈活性，而不應苛求個別配料的復雜性。純的膠原酶I/II混合物的可用性，如Nordmark/Serva公司得到的NB-1膠原酶的形式，特別符合這種要求。依賴于各個供體的情況，應調節膠原酶的濃度，其必須分別通過中性蛋白酶分別給予補充。
通過以下的實施方案和實施例闡述本發明。
實施例I中性蛋白酶活性的調整能使長時間冷貯存后的豬的胰島細胞成功地分離。
為了最大程度上節約緊缺的人的器官，使用豬進行初步試驗。為此，首先是膠原酶和中性蛋白酶臨界濃度的滴定，其緊接著用于評估成年(＞24月)豬的胰腺。由于首先只有有限量的NB-1膠原酶以供使用，所以用NB-8膠原酶分離豬的胰島。在此只用最少量的中性蛋白酶和胰蛋白酶，以及用盡可能少量的梭菌蛋白酶配制劑量。初步試驗表明，分解時間和可消化的組織的量與中性蛋白酶的濃度明顯相關。
為保證每一系列試驗有一個穩定的酶濃度，使增加的膠原酶量符合所用組織的量。這與Roche公司宣傳的Liberase-方案相反，該方案中使用與組織量無關的500mg恒定量的酶(26)。在事先憑經驗確定的三個膠原酶濃度(例如，4mg/g器官、6mg/g和8mg/g)的情況下，中性蛋白酶的優化量在約為0.2-0.6DMC-U/g器官的范圍內進行迭代法滴定
相關的分離參數包括分解時間、待分解組織的使用比例、胰島產率、純度和平均胰島尺寸。所述最有效的混合物用6個器官測試。對分離的胰島進行質量控制，包括胰島的功能性和存活性，既可以在體外通過統計學的葡萄糖刺激以及膜完整性著色，也可以在體內借助糖尿病的裸鼠生物實驗進行。通過使用NB-1膠原酶同樣于6個器官上的實驗應能確定NB-8膠原酶和中性蛋白酶可能的最好的組合。
借助積累的經驗能夠將此迭代法的優化實驗調整用于幼年(約6個月)供體豬，并以縮小規模的所述確保成功的酶組合重復進行。
在人的分離過程中，同樣也適用采用NB-1膠原酶的優化實驗。結合實際考慮由于年齡引起的供體因素，對照迄今積累的經驗將胰腺供體分為兩個年齡組＜25歲，≥25歲。使上述的中性蛋白酶的滴定計劃適用于人的胰腺，并在事先憑經驗確定的兩個膠原酶濃度(例如，4mg/g和5mg/g器官)下進行
用可能最有效的NB-1膠原酶和中性蛋白酶組合，對每個年齡組用6個器官進行測試，并對分離的胰島進行體外和體內的質量控制(如上所述)。
通過使用中性蛋白酶和純化或具有經確定的低含量中性蛋白酶的部分純化的膠原酶可以個體化配制劑量。由于特異活性差別很大，以單位而不是以質量制備酶混合物制劑。
中性蛋白酶活性的調整能使長時間冷貯存后的豬的胰島細胞成功地分離。
背景通過膠原酶的酶分解胰腺組織，是分離胰島細胞方法的至關重要的步驟。不同種類的胰腺膠原的變化性導致特異性酶混合物的制備。目前可支配的酶混合物卻不能提供這種可能性，即依據各個供體變化配制各成分的劑量，例如冷-局部缺血。我們設想，為了能夠易于成功地釋放胰島細胞，可以利用中性蛋白酶活性的個別調整作為酶消化胰腺的重要因素。為了證實該假設，在借助Serva的NB-8膠原酶(其特征是含量少量的中性蛋白酶)進行分解前，對豬的胰腺進行長時間的冷貯存(6.5小時)。
方法摘除后，取自不再有應用目的的家畜的胰腺用溶解于冷UW-溶液中的NB-8膠原酶經管內撐脹。確定的溶膠原的活性為4FZ-U/g胰腺的組織。初步實驗后，針對新鮮獲取(n＝5)或貯存的胰腺(n＝5)調配0.6或0.9DMC-U/g或0.14DMC-U/g的中性蛋白酶(Serva)，通過改進的消化-過濾分離胰島細胞，并在Cobe 2991上利用菲可-泛影酸鈉進行純化。質量控制包括錐蟲-藍-排除檢驗和靜態的葡萄糖溫育(2.8相對于20mM葡萄糖)。此外，依據甲產物推測線粒體活性，并在490nm下用四唑化合物(MTS)確定，并表示為每毫克蛋白質的任意單位(AU)。
結果與新鮮獲取的胰腺相比，長期貯存的胰腺的總分解時間明顯變短(48±3比63±3，P＜0.05)。鑒于胰腺重量和分解的組織量方面沒有可確定的差異。胰島細胞純化后，用0.14或0.9DMC-U/g分離，鑒于最后的純度(＞95％)，可以確定，在胰島細胞部分(＞95％)和胰島細胞細織的回收(73±9比72±16)方面沒有明顯的差異。然而長時間貯存后，胰島細胞產率比新鮮分離的制品輕(146000±43000比212000±52000 IEQ，NS)，但沒有明顯變小。用0.14或0.6或0.9DMC-U/g消化后，質量控制表明極好的胰島細胞存活性(99.9±0.1比99.4±0.3％，NS)，保存的細胞內胰島素含量(1720±96比1760±280μU/IEQ，NS)以及可比較的葡萄糖刺激指數(1.7±0.2比1.5±0.1，NS)。線粒體活性在長時間貯存后分離的胰島細胞(0.85±0.06AU/mg)和新鮮獲取的細胞(0.90±0.11AU/mg)之間沒有差別。
結論本研究展示長時間貯存的豬胰腺模型，為了能夠易于釋放胰島細胞，相應于各個供體變化個體化配制酶混合物的各個成分的劑量是有利的。針對熱局部缺血、供體年齡以及胰腺組織的脂化或纖維化衰退方面的考慮個體化調整中性蛋白酶活性也是有用的。
實施例II測定用于分離朗氏-胰島的中性蛋白酶與膠原酶的最佳比例。
目的
測定酶混合物中中性蛋白酶/膠原酶(NPCR)的最佳比例，其用于分離朗氏-胰島。在大鼠模型中，以Liberase和膠原酶V型為對照，彼此比較具有不同NPCR的Serva-膠原酶混合物。
背景Liberase是目前人胰島的分離中廣泛使用的酶混合物。Liberase的開發與粗膠原酶相比，具有明顯的進步，其是純化的，不含內毒素，批次與批次之間在酶活性方面表現出的差異性小。不過，由于胰島移植的成果發展很快，需要進一步改善市場上得到的酶混合物的形態和標準化。例如，鑒于不同酶組份產生每克產物的活性不同，所提供的Liberase批次沒有標準化。由此，在膠原酶活性、中性蛋白酶活性和NPCR方面，批次與批次之間有顯著的差別，這點為制造商的分析證書所證實。因此，胰島分離的最佳NPCR是未知的。同樣可以想象，對于每個胰腺需要相應于其結構、供體年齡和局部缺血時間的經調整的NPCR。一種市場上可買到的新酶，是分裝于梨狀瓶中的Serva膠原酶與中性蛋白酶。這樣允許有兩種組份的特制混合物，以便實現預定的比例，而非用一種被制造商預先固定的且批次與批次之間不同的比例進行分離。在大鼠模型上，確定用于胰島分離的最佳NPCR。
方法用7組Lewis大鼠作為胰島供體。每組有18只大鼠。如下確定該組組1用純Serva膠原酶分離胰島，沒有中性蛋白酶(NPCR＝0％w/w)組2用具有NPCR＝3％w/w的Serva膠原酶分離胰島，組3用具有NPCR＝6％w/w的Serva膠原酶分離胰島，組4用具有NPCR＝12％w/w的Serva膠原酶分離胰島，組5用具有NPCR＝24％w/w的Serva膠原酶分離胰島，組6用Liberase RI分離胰島組7用膠原酶V型(Sigma)分離胰島實施例IIA分離胰島期間中性蛋白酶的作用，用一種新的酶制劑評價目的提供多種酶制劑用于分離胰島。該高度純化的產物具有獨立的組分(膠原酶和中性蛋白酶)，其允許將中性蛋白酶的濃度適應于胰島分離。本研究用于評價分離胰島期間中性蛋白酶的作用。
方法根據酶類型的標準化胰島分離劃分7組Sprague-Daley大鼠(每組18鼠)。對組I使用2mg/ml(sigma Chemical)的膠原酶XI型，對組II使用0.6mg/ml(Roche)的Liberase，對組III至VII使用0.6mg/ml(Serva Elektrophorese)的膠原酶NB1。對組III使用純膠原酶NB1。對組IV、V、VI和VII添加濃度為7.5、15、22和/或30μg/ml的中性蛋白酶(NP)。鑒于胰島產率、編程性細胞死亡(細胞死亡檢測ELISA，Roche和Tune1-染色)、細胞因子(IL-1β、IL-6、TNFα、IFNγ)分泌(Quantikine M，R&D系統)、胰島素分泌(靜態溫育)和胰島形態學(組織學和免疫組織學)，評估結果。
結果組I和II的酶溶液的內毒素含量為173+22和120+11EU/ml。在組III至VII中其含量隨著NP濃度逐漸升高，從0.4到58EU/ml(p＜0.05)。對于組I和/或II每只大鼠的胰島當量-(IE)-產率為1367+522和1755+110。對于組III至VII，根據NP濃度，得到每只大鼠的IE-產率的高斯正態分布，組V的產率較高，為1712+245，較低產率為組III(597+277)和組VII(905+297)(p＝0.05)。NP濃度影響組III至VII的胰島形態，隨著NP含量提高，收獲的胰島的數量減少，碎裂的胰島的數量升高。NP濃度升高伴隨著對胰島的α-細胞環漸進的損害，組VII的損害可以與從組I和II觀察到的相比較。與組I和II相比，組III至VII釋放的細胞因子(IL-1β、IL-6、TNFα、IFNγ)較低，但其不受NP濃度影響。與組I和II相比，組III至VII中胰島細胞壞死和編程性細胞死亡在統計上明顯較小，但其不受NP濃度影響。胰島素分泌的平均刺激指數，組I為2.96，組II為5.17，組III至VII為5.25-5.43。
結論:
鑒于胰島產率，中性蛋白酶添加到膠原酶中對于分離胰島是起決定作用的。鑒于胰島產率和功能，具有適宜的中性蛋白酶濃度的Serva膠原酶與Liberase相當。但其伴隨著較低的胰島細胞-細胞因子的釋放以及編程性細胞死亡，從而改善了胰島形態。
實施例III借助兩層法成功地長時間保存胰腺，來進行以下的豬胰島細胞的分離背景豬的胰島細胞的特別的敏感性妨礙了長時間冷貯存后從胰腺中成功的分離。為了成功分離人的胰島細胞，近來出現了在冷貯存期間采用兩層法(TLM)對胰腺組織進行有氧貯存。迄今還沒有采用TLM長時間保存豬胰腺的數據以供使用。因此，本研究的目標在于，研究TLM對于從豬胰腺中成功分離胰島細胞的有效性，與新鮮獲得的胰腺(n＝5)相比，使之TLM保存6.5小時(n＝5)。
方法摘取后，將不再有應用目的的家畜的胰腺直接管內地用溶解于冷UW-溶液中的濃度為每克胰腺組織4毫克的膠原酶(Serva)撐脹。通過改進的消化-過濾分離胰島細胞，并在Cobe 2991上使用菲可-泛影酸鈉進行純化。質量控制包括錐蟲-藍-排除檢驗和靜態的葡萄糖溫育(2.8相對于20mM葡萄糖)。此外，依據甲產物推測線粒體活性，并在490nm下用四唑化合物(MTS)確定，并表示為每毫克蛋白質的任意單位(AU)。
結果純化后，證實新鮮獲得的胰腺與TLM保存的胰腺在胰島細胞在最終純度(＞95％)、產率(2440±580比1800±250IEQ/g)、存活性(99.4±0.3比100.0±0.0)和葡萄糖刺激指數(1.73±0.19比1.48±0.14，NS)方面沒有明顯差別。與新鮮獲得的相比，TLM保存后的細胞內胰島素含量升高(2250±110比1760±280μU/IEQ，NS)。與新鮮分離的胰島細胞相比，通過TLM在長時間貯存期間保持了線粒體活性(0.96±0.15比1.01±0.17AU/mg，NS)。
結論本研究說明了在成功分離胰島細胞前，長時間保存豬胰腺的TLM的有效性。
實施例IV用全氟烴的兩層法貯存組織(豬胰腺)，通過個體化加入中性蛋白酶分離組織。
全氟烴具有高的結合氧的能力。由此為貯存的細織供氧是較好的方案，這樣可以更好地維持物質交換，使組織更好地經受數小時的保存。為了分離出細胞，所述消化酶溶液或者在貯存前加入(TLM前裝載)，或者在貯存后加入(TLM后裝載)。加入的中性蛋白酶(保持膠原酶濃度為4PZ-U/g器官)的量的變化的可能性再度是重要的前裝載的量較少(0.1DMC-U/g器官，因為貯存的消化時間較長)，后裝載的量較多(0.9DMC-U/g器官)。
在此，通過中性蛋白酶的變化和貯存方法來優化細胞分離的結果。
表I的數據是關于胰島細胞當量的產率、存活性、胰島細胞完好性的詳細數據。
數據表明，如果中性蛋白酶的量相應地調整，則不依賴于貯存(2＝TLM前裝載(4PZ-U；0.1DMC-U)；4＝UW前裝載(4PZ-U；0.1DMC-U)；3＝TLM后裝載(4PZ-U；0.9DMC-U))或不貯存(6＝未貯存(4PZ-U；0.9DMC-U))，在胰島細胞當量的產率、存活性、胰島細胞或胰島細胞集合體完好性方面可以得到可比較的良好的結果。
表I分離結果 純化前 純化后試驗組 IEQ前SEM nIEQ/IN前 SEM nIEQ后 SEM n IEQ/IN后 SEM n IEQ回收(％) SEM nOD/103IE SEM nSI SEMn mU/103IE SEM6 382467 6941560.81 0.0863888771001796 0.90 0.096 97.5 15.660.701 0.04862.76 0.42 6 678 133 245500 5127260.73 0.15623855037398 6 0.69 0.106 104.616.760.760 0.04361.86 0.29 6 648 82 309357 3239470.84 0.08721042922852 7 0.68 0.067 69.1 4.6 70.792 0.03071.47 0.15 7 682 34 192229 2269770.72 0.07710995734669 7 0.68 0.067 83.6 9.2 70.803 0.03471.56 0.15 7 1060 13特征 nsns nsns 3∶2 ns 6∶2 ns6＝未貯存(4PZ-U，0.9DMC-U)3＝TLM貯存，貯存后加入酶(4PZ-U，0.9DMC-U)2＝TLM貯存，貯存前加入酶(4PZ-U，0.1DMC-U)4＝在UW緩沖劑中貯存，貯存前加入酶(4PZ-U，0.1DMC-U)IEQ/IN＝碎裂指數OD＝線粒體活性MU＝胰島素含量
權利要求
1.由分開的組分A和分離的組分B構成的制品，組分A為不含于膠原酶-酶制劑的來自溶組織梭菌的蛋白酶(NP)，組分B為膠原酶或膠原酶-酶制劑，其特征在于，開始分解前，分別按需要的量將組分A加入組分B中用于分離組織。
2.根據權利要求1的制品，其特征在于，所述制品包含一種不是通過重組制備的中性蛋白酶作為組分A。
3.由中性蛋白酶(NP)和膠原酶構成的制品的制備方法，其特征在于，開始分離組織前，按兩組分定量比例個體化配制劑量的情況下，將具有確定含量的分開的組分A與分開的組分B混合，組分A為不含于膠原酶-酶制劑中的，且不通過重組制備產生的溶組織梭菌的中性蛋白酶(NP)，組分B為純化的或部分純化的膠原酶或膠原酶-酶制劑。
4.根據權利要求3的方法，其特征在于，膠原酶和中性蛋白酶的加入取決于組織的量。
5.根據權利要求3或4的方法，其特征在于，膠原酶和中性蛋白酶的加入取決于物種、組織和組織的狀態。
6.根據權利要求3至5之一的方法，其特征在于，膠原酶和中性蛋白酶的加入取決于貯存后組織的狀態。
7.根據權利要求3至6之一的方法，其特征在于，按照兩層法用全氟烴進行貯存。
8.根據權利要求3至7之一的方法，其特征在于，貯存之前或之后加入膠原酶和中性蛋白酶，并相應地調整中性蛋白酶的量。
9.純化的不含于膠原酶-酶制劑中的中性蛋白酶(NP)的應用，分別以選定的量個體化添加到膠原酶或膠原酶-酶制劑中，用于分離組織或者例如從組織中分離出細胞或細胞集合體，以在細胞的產率、存活性和完好性方面改善分離效果。
10.根據權利要求9的應用，按兩組分定量比例個體化配制劑量的情況下，中性蛋白酶(NP)與帶有確定中性蛋白酶含量的純化或部分純化的膠原酶一起使用，其中，所用的中性蛋白酶不是通過重組制備產生的。
11.根據權利要求9和10的應用，其中，膠原酶和中性蛋白酶的加入取決于組織的量。
12.根據權利要求9和10的應用，其中，膠原酶和中性蛋白酶的加入取決于物種類、組織和組織的狀態。
13.根據權利要求9和10的應用，其中，膠原酶和中性蛋白酶的加入取決于貯存后組織的狀態。
14.根據權利要求13的應用，其中，按照兩層法用全氟烴進行貯存。
15.根據權利要求13和14的應用，其中，貯存之前和之后加入膠原酶和中性蛋白酶，并相應調整中性蛋白酶的量。
全文摘要
中性蛋白酶(NP)和膠原酶一起的應用在于，開始分離組織前，一種不含于膠原酶－酶制劑中且不是通過重組制備產生的中性蛋白酶與一種膠原酶或膠原酶－酶制劑，按中性蛋白酶和膠原酶量的針對細胞的產率、存活性和完好性方面的分離效果的改善的個體化的比例分別配制劑量。
文檔編號C12N9/50GK1626653SQ20041010053
公開日2005年6月15日 申請日期2004年6月17日 優先權日2003年7月9日
發明者M·科弗爾斯特, C·拉姆施, N·拉姆施－甘瑟爾, O·弗雷德里馳, S·胡特勒, D·布蘭德赫斯特, T·比爾尼, P·布馳爾 申請人:諾爾瑪克藥物有限責任及股份兩合公司