專利名稱：一種從組織中分離原代細胞的裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種未分化的人類、動物或植物細胞，如細胞系、組織的培養或維持的 技術領域，具體涉及一種從組織中分離原代細胞的裝置。
背景技術：
細胞培養是指從體內組織取出細胞摹擬體內出現環境，在無菌、適當溫度及酸堿 度和一定營養條件下，使期生長繁殖，并維持其結構和功能的一種培養技術。由于醫學科學 迅猛發展，細胞培養技術現已廣泛應用于基礎醫學和臨床醫學的各個領域。機體組織是細 胞的重要來源。從機體組織中獲得細胞進行原代培養是一項重要的實驗技術。目前從機體組織中獲得細胞進行原代培養主要是通常使用酶消化方法。胰蛋白酶 和膠原酶是生物醫學相關領域細胞培養最常用到的酶，其主要作用是使細胞間的蛋白質或 膠原水解，使細胞相互離散。將一定濃度的酶溶解于緩沖液中，在合適溫度(一般是37度) 下，對剪碎的組織塊進行消化，繼而通過過量血清(一般為10%胎牛血清)中止消化反應， 然后低速離心等步驟收集細胞進行原代培養。下面以從大鼠心肌組織中獲得心肌細胞培養為例，對酶消化方法作一說明心肌培養方法主要包括如下步驟1.無菌超凈臺內無菌分離胎鼠(出生后1-3天)的心臟，剪成Imm3的碎塊，清洗 后倒入一個小燒杯中。2.抽取預先配制的0. 1 %胰酶溶液5ml，倒入小燒杯。心臟組織碎塊完全充分浸沒 于胰酶溶液中。放入一個大小合適的磁力攪拌子。3.預先準備一個帶有溫度計大小合適的溫控裝置(一般為水浴裝置)，使溫度穩 定于37度。將盛有心臟碎塊和胰酶溶液及磁力攪拌子的小燒杯放于水浴裝置中，打開磁 力攪拌器電源，調整轉速為60-80轉/分鐘。使磁力攪拌子在磁力攪拌子在小燒杯內自由 轉動，以充分打散組織碎塊，阻止粘連。此時，胰酶溶液中的酶開始對組織進行消化，隨著磁 力攪拌子的轉動，不斷有心肌細胞從組織塊中分離進入胰酶溶液中。消化時間一般設定為 8-10分鐘。4.到達消化時間后，取下小燒杯，關閉磁力攪拌器，用一個吸管輕輕吹打使消化下 來的細胞后，加入10%血清中和胰酶以中止消化反應，防止細胞損傷。5.將消化來的細胞離心后，收集于另外一個離心管中，低速離心(1200轉/分鐘， 約5分鐘)后，收集細胞。6.此時小燒杯中仍有較多量未被消化的組織，再在小燒杯中加入胰酶溶液，重復 2-5步驟操作(一般需要重復6-8次方能將組織充分消化)。7.收集細胞靜置2小時后，移至培養瓶或培養皿進行培養。但是，上述步驟中存在如下缺點1.細胞無謂損傷，影響細胞活力及生存。在步驟3中，較早從組織塊中分離下來的 心肌細胞仍然持續暴露于胰酶作用下。由于胰酶接觸時間的長短與心肌細胞的損傷直接相關，故多余時間的胰酶接觸直接造成細胞無謂損傷，影響細胞活力和生存，減少細胞產量， 影響后續研究。2.操作繁瑣，耗時長。實踐中，步驟2-5需要重復6到8次，才能將組織充分消化。 每次均需要重復關閉磁力攪拌器電源，對消化下來的細胞進行吹打、轉移、離心及收集等步 驟，操作繁瑣。一個熟練技術人員一般需要2-3小時方能全部完成，勞動強度較大，費時費 力。3.增加細胞污染的機會。由于操作步驟繁多，細胞需要反復進出超凈臺，增加了污 染的機率。如果下一步進行干預實驗，因為不能加入抗生素對抗細菌，則可能導致本次細胞 培養完全失敗。
發明內容
本發明的目的是針對現有細胞分離培養裝置操作繁瑣、細胞損傷率高及細胞污染 機率高等不足，提供了一種操作簡單、細胞損傷率低、細胞污染機率低、能持續進行組織消 化的細胞分離裝置。本發明的目的是通過以下技術手段實現的一種從組織中分離原代細胞的裝置， 包括有細胞分離容器，所述的細胞分離容器還通過管道分別連接設置有酶液容器和細胞回 收容器。所述酶液容器的外圍還設置有溫控裝置。所述細胞分離容器底部還設置有磁力攪拌儀，細胞分離容器的內部則相應的設置 有磁力攪拌子。 所述細胞分離容器的內部，連通管道的開口處還設置有濾網。所述酶液容器和細胞分離容器之間的管道上設置有限速開關。所述細胞分離容器和細胞回收容器之間的管道上設置有限速開關。所述細胞回收容器的底部設置有基座。與現有技術相比本發明具有以下明顯的優點1、有助于增強細胞活力，提高細胞產量。由于細胞分離容器消化下來的細胞可迅 速通過管道進入細胞回收容器，而脫離胰酶接觸并得到血清的保護，故心肌細胞的損傷較 傳統方法減少，細胞活力增強。2.避免了反復操作動作，減少操作強度。傳統方法中需要反復對消化下來的細胞 進行吹打、轉移、離心及收集等步驟，操作繁瑣。由于本發明能持續進行組織消化，得到的細 胞可及時脫離胰酶，得到細胞回收容器中血清的保護，故可收集較多量細胞集中進行上述 操作，故減少了勞動強度。3.降低污染風險。由于本發明能收集較多量細胞集中進行吹打、轉移、離心及收集 等步驟，減少了細胞進出超凈臺的次數，降低了污染的機率。4.本發明所獲得的細胞，其均質性優于傳統方法。
圖1為本發明的結構示意圖；圖2為使用本裝置和傳統方法獲得的細胞形態及數量圖片；
圖3為兩種分離方法的細胞活力比較曲線圖；圖1中，1-酶液容器，2-溫控裝置，3-管道，4-限速開關，5_細胞分離容器，6_磁 力攪拌子，7-濾網，8-磁力攪拌儀，9-細胞回收容器，10-基座；圖2中，左圖為使用本裝置獲得的心肌細胞數量及貼壁情況，右圖為使用傳統方 法獲得的心肌細胞數量及貼壁情況。可見，使用本裝置獲得的心肌細胞數量較傳統方法更 高，折光性更強，貼壁情況更理想(胎鼠心肌細胞為貼壁細胞，兩圖均為靜置貼壁36小時后 拍攝)。
圖3中，I為使用本發明分離獲得的細胞活力曲線，II為傳統方法分離獲得的細胞活力 曲線。圖3中，I為使用本發明分離獲得的細胞活力曲線，II為傳統方法分離獲得的細胞活 力曲線。可見，采用本發明裝置收集的細胞活力(0D值)明顯優于傳統方法收集的細胞活 力。
具體實施例方式以下結合
和具體實施方式
對本發明作進一步的詳細描述如圖1所示的 一種從組織中分離原代細胞的裝置，包括有細胞分離容器5，所述的細胞分離容器5還通 過管道3分別連接設置有酶液容器1和細胞回收容器9。這樣設置，細胞回收容器9內放有 高濃度血清，一般為10%的培養基，用以回收從細胞分離容器5中消化下來的細胞，高濃度 血清可迅速中和胰酶，阻斷細胞損傷。所述酶液容器1的外圍還設置有溫控裝置2。酶液容器1內盛有適合濃度胰酶溶 液。溫控裝置2可以為小型水浴或者其它能保證酶液容器1內溶液溫度穩定于37度的加
^^ 直 O細胞分離容器5的外圍還設置有溫控裝置2。溫控裝置2可以為小型水浴或者其 它能保證細胞分離容器5內溶液溫度穩定于37度的加溫裝置。所述細胞分離容器5底部還設置有磁力攪拌儀8，細胞分離容器5的內部則相應的 設置有磁力攪拌子6。這樣設置，磁力攪拌子6可在磁力攪拌儀8的作用下自由轉動，用以 打散細胞分離容器5內的組織碎塊，與酶液充分接觸，并防止粘連。所述細胞分離容器5的內部，連通管道3的開口處還設置有濾網7。濾網7的網眼 大小合適，既能防止組織碎塊堵塞管道3，又能保證分離的單個細胞的通過。所述酶液容器1和細胞分離容器5之間的管道3上設置有限速開關4。所述細胞 分離容器5和細胞回收容器9之間的管道3上設置有限速開關4。這樣設置，用以調節胰酶 溶液以合適的速度依次由酶液容器1進入細胞分離容器5，再進入細胞回收容器9。所述細胞回收容器9的底部設置有基座10。下面以從胎鼠心肌組織分離心肌細胞為例，說明本發明裝置的使用方法一 .裝置準備1.本裝置所有部件都經過消毒滅菌處理后，安置于無菌超凈臺內。2.加液。在酶液容器1中加入適量體積預先配制的合適濃度的消化酶溶液。一般 為0. 胰蛋白酶溶液。由管道3向細胞分離容器5中滴加或者直接向細胞分離容器5內 加入適量體積消化酶溶液。細胞回收容器9中加入適量體積的帶有10%血清的培養基。3.調節溫度及速度。打開溫控裝置2，使酶液容器1及細胞分離容器5中消化液 的溫度穩定于37度。
4.分別調節上下兩個限速度開關4，液體滴速適當，使由酶液容器1進入細胞分離 容器5的液體量與細胞分離容器5進行細胞回收容器9的的液體量保持平衡，從而使細胞 分離容器5中的酶液體積保持穩定。二組織消化1.無菌超凈臺內無菌分離出生后1-3天胎鼠的心臟，剪成Imm3的碎塊，清洗后加 入至細胞分離容器5內，確保組織碎塊完全浸沒于消化液中。2.打開磁力攪拌儀8的開關，使磁力攪拌子6在細胞分離容器5內自由轉動。通 過持續攪拌，可防止組織碎塊粘連，確保其與胰酶充分接觸。在胰酶作用下，心肌細胞從組 織中被消化分離，進入細胞分離容器5內的消化液。由于濾網7的存在，既能防止組織碎塊 堵塞管道，又能保證分離的單個細胞的通過。3.帶有消化下來的細胞的液體通過管道3滴入細胞回收容器9。由于細胞回收容 器9內的高濃度血清可迅速中和胰酶，阻斷細胞損傷。4.根據獲得的細胞數量，進一步微調上下兩個限速度開關4，使液體滴速適當，在 保證細胞分離容器5中的消化液體積始終保持穩定前提下，有較多帶有細胞的液體進入細 胞回收容器9內。等到細胞數量達到要求時，將細胞回收容器9內細胞低速離心，從而收獲 細胞。本裝置可設置如下幾種替代備選方案a)酶液容器1，細胞分離容器5及細胞回收容器9之間增加泵裝置及其它形式的 限速裝置，用以調節消化液流動的速度。b)酶液容器1，細胞分離容器5及細胞回收容器9呈水平安置或者其它形式的空 間位置。c)本裝置外部設置空氣凈化及過濾裝置，從而不依賴于超凈臺可獨立作為工作單 元進行細胞分離。為了驗證這一裝置的效果，我們制作了實物樣品，取出生后1天的胎鼠40只分為 兩組(20只/組)，分別采用傳統方法和本發明裝置進行心肌細胞的分離，分別重復3次。對比數據如下表
權利要求
一種從組織中分離原代細胞的裝置，包括有細胞分離容器(5)，其特征在于所述的細胞分離容器(5)還通過管道(3)分別連接設置有酶液容器(1)和細胞回收容器(9)。
2.根據權利要求1所述的一種從組織中分離原代細胞的裝置，其特征在于所述酶液 容器(1)的外圍還設置有溫控裝置(2)。
3.根據權利要求1所述的一種從組織中分離原代細胞的裝置，其特征在于所述細胞 分離容器(5)底部還設置有磁力攪拌儀(8)，細胞分離容器(5)的內部則相應的設置有磁力 攪拌子(6)。
4.根據權利要求1所述的一種從組織中分離原代細胞的裝置，其特征在于所述細胞 分離容器(5)的內部，連通管道(3)的開口處還設置有濾網(7)。
5.根據權利要求1所述的一種從組織中分離原代細胞的裝置，其特征在于所述酶液 容器(1)和細胞分離容器(5)之間的管道(3)上設置有限速開關(4)。
6.根據權利要求1所述的一種從組織中分離原代細胞的裝置，其特征在于所述細胞 分離容器(5)和細胞回收容器(9)之間的管道(3)上設置有限速開關(4)。
7.根據權利要求1所述的一種從組織中分離原代細胞的裝置，其特征在于所述細胞 回收容器(9)的底部設置有基座(10)。
全文摘要
一種從組織中分離原代細胞的裝置，包括有細胞分離容器(5)，其特征在于所述的細胞分離容器(5)還通過管道(3)分別連接設置有酶液容器(1)和細胞回收容器(9)。所述酶液容器(1)的外圍還設置有溫控裝置(2)。所述細胞分離容器(5)底部還設置有磁力攪拌儀(8)，細胞分離容器(5)的內部則相應的設置有磁力攪拌子(6)。本發明能保護細胞免受長時間胰酶損傷。由于細胞分離容器消化下來的細胞可迅速通過管道進入細胞回收容器，而脫離胰酶接觸并得到胎牛血清的保護，故心肌細胞的損傷較傳統方法減少，有助于增強細胞活力，提高細胞產量。另外，還減少了操作步驟與勞動強度，降低了污染的風險。
文檔編號C12M1/38GK101955884SQ20101015908
公開日2011年1月26日 申請日期2010年4月28日 優先權日2010年4月28日
發明者侯緒偉 申請人:侯緒偉