專利名稱：抑制hif－1表達的反義寡核苷酸的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的反義寡核苷酸化合物RX-0047和RX-0149，它們抑制人類蛋白質HIF-1的表達并且能在一些癌細胞系中誘導細胞毒性。
背景技術：
沒有血管為腫瘤細胞提供氧氣和營養，腫瘤就不能生長(Blagosklonny，International J.Oncol.，2001 19257-262)。轉錄因子HIF-1控制哺乳動物細胞中低氧應答，是癌細胞生長的主要調節劑之一。HIF使得細胞能夠從低氧幸存并且刺激內皮生長并且在一系列癌癥中被上調(Zhong等人，Cancer Res.1999 595830-5835)。HIF在血管生成和腫瘤發展中的最顯著的實例之一是蛋白質VHL的功能喪失，VHL是腫瘤抑制基因，其在多數散發性透明細胞腎癌和VHL基本中突變。因此，HIF-1途徑的破壞抑制腫瘤生長，表明HIF-1是潛在的抗癌靶標。HIF-1的抑制是基于機理的抗血管生成途徑，因為是HIF-介導的應答驅動腫瘤血管生成。2001年4月24日出版的Semenza的美國專利號6,222,018涉及編碼HIF-1的核苷酸序列。在那篇專利中沒有公開本發明中公開和申請保護的特定寡核苷酸。
附圖簡述
圖1.RX-0047和RX-0149抑制HIF-1 mRNA在多種癌細胞中的表達。
圖2.RX-0047和RX-0149抑制HIF-1蛋白質表達的蛋白質印跡分析。
發明概述本發明涉及反義寡核苷酸，其靶向編碼HIF-1(低氧可誘導的因子1)的核酸，并且調節HIF-1的表達。還提供了抑制細胞中HIF-1表達的方法，該方法包括將細胞與本發明的寡核苷酸化合物和組合物接觸。當前描述的寡核苷酸的優點是除了抑制HIF-1的表達，它們還對幾種不同的癌細胞系具有細胞毒性效果。本發明的優點可以通過將多種癌細胞系的細胞與反義化合物接觸得到，所述反義化合物可以與HIF-1基因上具有如下序列的部位雜交HIF-1基因的2,772位點5′ttggacactggtggctcatt 3′(Genban#NM001530)(Seq.Id.No.1)。尤其優選地為RX-0047，其包含5′aatgagccaccagtgtccaa 3′(Seq.Id.No.2)。用與HIF-1基因的1,936位上5′gacttggagatgttagctcc 3′(Seq.Id.No.3)反義的化合物可以得到類似的優點。尤其優選RX-0149，其包含5′ggagctaacatctccaagtc 3′(Seq.Id.No.4)。接觸在能使寡核苷酸與編碼HIF-1的基因雜交的條件下進行。雜交后，細胞產生HIF-1的能力受到抑制，并且癌細胞生存力降低。
發明詳述HIF(低氧可誘導的因子)是關鍵異二聚體轉錄因子并且受到低氧的激活。它不僅介導哺乳動物中對低氧的內環境穩定應答，包括紅細胞生成、血管生成和糖酵解，還促進腫瘤新血管生成和生長。HIF由兩種不同的亞單位HIF-1α和HIF-1β組成，HIF-1β也被稱為ARNT(芳基受體核易位體)。這兩種亞單位屬于bHLH(堿性螺旋-環-螺旋)和PAS(Per，ARNT，Sim)家族。這些因子的bHLH結構域負責通過這兩個螺旋的二聚體化并且通過它們的基本結構域進行DNA結合。HIF-1α和HIF-2α內的兩個單獨的結構域負責低氧信號途徑。第一種途徑是依賴氧的降解(ODD)，其在常氧下受到依賴氧的脯氨酰羥化酶的翻譯后修飾(Jaakkola等人，Science，2001，292468-472)。經羥化的脯氨酸促進HIF與VHL(von Hippel-Lindau)泛素連接酶復合體的相互作用，啟動快速泛素化和隨后通過蛋白酶體的HIF蛋白質破壞。最近的報導表明HIF COOH-末端反式激活結構域(CAD)中的天冬酰胺羥化也通過抑制與p300/CBP共活化劑的相互作用而在蛋白酶體-介導的HIF降解中起重要作用并且減小常氧期間HIF-1的轉錄活性(Lando等人，Science，2002.295858-861)。因此，天冬酰胺羥化酶與脯氨酰羥化酶一起作為受到細胞中O2水平調節的低氧開關。低氧期間，p42/p44 MAPK活性誘導HIF-1的翻譯后磷酸化并且促進HIF-1的轉錄活性。最近的報導表明除羥基化、泛素化和磷酸化之外，乙酰化在HIF-1穩定性的調節中也起重要作用(Jeong等人，Cell，2002，111709-720)。
低氧時，HIF-1α不被羥基化，因為羥化酶(其活性需要分子氧)沒有活性，從而HIF-1α不被pVHL識別并在細胞中積累。然后HIF-1α轉移到細胞核中并與組成性存在的HIF-1β亞單位聚合成二聚體(Semenza，Genes & Development，1985，141983-1991)。然后該二聚體結合靶基因中的低氧應答元件(HRE)，導致基因如促紅細胞生成素、VEGF(Forsythe等人，Mol.Cell.Biol.，1996 164604-4613)、血小板來源的生長因子-β(PDGF-β)、葡萄糖轉運蛋白(GLUT1)和一氧化二氮合成酶(Neckers，J.Natl.Cancer Ins.1999，91106-107)的反式激活。某些激素和生長因子也導致HIF-1α的水平增加以及某些癌基因和腫瘤抑制基因，如VHL的突變，導致HIF-1α水平增加(Ivan和Kaelin，Current Opinion in Genetics & Development，2001，1127-34)。有趣的是確定羥基化或者其它機制是否與該獨立于低氧的HIF活化有關。
使用低氧微環境和應答來進行癌癥治療的一些當前的策略如下1)依賴低氧的藥物或者基因治療載體；2)抑制HIF穩定性；3)抑制HIF的反式激活和4)VEGF抑制劑。
考慮到HIF轉錄因子在腫瘤的發展中的關鍵角色，希望抑制腫瘤發生期間HIF轉錄因子的作用。然而，還希望盡可能地避免中斷該家族在細胞代謝的其他方面的角色。一種方法是鑒定編碼在低氧期間高度表達的可能的轉錄因子的基因，并設計反義寡核苷酸，其用于抑制正確背景中該基因的活性。本發明人已經發現兩種反義寡核苷酸既顯示出抑制HIF-1基因產生蛋白質的能力的增強的活性，還在許多癌細胞系中誘導細胞毒性。
反義化合物是可以用于將修飾導入活細胞中發現的核酸的工具。術語“反義”指核酸“編碼”蛋白質這一概念。即，給定核酸中發現的核苷酸的序列確定將產生什么蛋白質。完整基因的“有義”序列將應答給定刺激產生通常量的正常蛋白質。“有義”寡核苷酸將與正常基因序列雜交，并且將不影響所述蛋白質的量、或者性質。“無義”序列將不產生產物，或者可以產生無功能的產物。例如，如果“無義”密碼子或者寡聚體插入基因中，可以產生截短的、無功能蛋白質。“反義”寡核苷酸將與正常基因雜交，但是將產生結構或者量改變的蛋白質。已經發現反義寡聚體，即相對短的反義化合物，可以容易地插入細胞中，在細胞中它們改變基因功能。
反義化合物通常用作研究檢測基因功能的試劑，因為它們能夠以高度特異性改變基因表達，并且可用于闡明特定基因的功能。例如，反義化合物可用于區分生物途徑的多種成員的功能。
反義寡核苷酸可用于選擇性阻斷致病基因，從而抑制疾病相關蛋白質的產生。某些反義寡核苷酸已經被安全而有效地施用于人類，并且許多臨床試驗正在進行中。可能寡核苷酸用于治療細胞、組織、和動物，特別是人類。在本發明的上下文中，術語“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或者脫氧核糖核酸(DNA)或者它們的模擬物的寡聚體或者多聚體。該術語包括由天然發生的核堿基、糖和共價核苷間(主鏈)鍵組成的寡核苷酸以及具有類似功能的包含非天然發生的部分的寡核苷酸。這些經修飾的或者經取代的寡核苷酸因為具有所希望的性質而通常比天然形式優選，所述所希望的性質為例如，增強的細胞攝入、對核酸靶標的增加的親和性和存在核堿基時穩定性增加。本發明使用寡聚核苷酸化合物，尤其反義寡核苷酸，它們靶向編碼HIF-1的核苷酸的部分，并且調節HIF-1的表達。設計所述寡核苷酸化合物與編碼HIF-1的一種和多種核酸特異雜交。一種寡核苷酸RX-0047靶向HIF-1基因上的部位，該部位具有下面的序列HIF-1基因的2,772位上的5′ttggacactggtggctcatt 3′(Genebank#NM001530)(Seq.Id.No.1)。RX-0047的主鏈序列與該部位互補。另一種寡核苷酸RX-0149靶向HIF-1基因的編碼區，其具有下面的序列HIF-1基因的1,936位上的5′gacttggagatgttagctce 3′(Genebank#NM001530)(Seq.Id.No.3)。RX-0149的主鏈序列與該部位互補。本發明人已經發現包含RX-0047和RX-0149的20聚體所來源的序列上游和下游5或者10個核苷酸的寡聚體表現出對HIF-1 mRNA表達的可測量的抑制。然而，本發明人已經發現，該寡核苷酸對變異性更敏感，并且盡管RX-0149的18聚體表現出對HIF-1 mRNA表達的一定抑制，但是從任一末端的進一步截短導致HIF-1 mRNA表達抑制的大量喪失。包含RX-0047和RX-0149的20聚體所來源的序列上游和下游5或者10個核苷酸的寡聚體表現出對癌細胞增殖的抑制。表現出對HIF-1 mRNA表達的一定抑制的RX-0047和RX-0149的截短形式也表現出對癌細胞增殖的抑制。
靶向特定基因的反義化合物指確定目標核酸序列，并選擇該核酸序列內將要修飾的一個和多個位點。一旦確定了靶標位點，選擇與該靶標位點足夠互補的寡核苷酸，從而其將與該位點特異雜交，即，足夠好并且足夠特異地雜交以得到所希望的效果。
本文中所用的短語“編碼HIF-1的核酸”包括編碼HIF-1的DNA、從該DNA轉錄的RNA(包括前-mRNA)，和從該RNA衍生的DNA。反義寡聚化合物與其靶標核酸的特異雜交干擾該核酸的正常功能。所要干擾的DNA的功能包括復制和轉錄。所要干擾的RNA的功能包括所有重要的功能，如RNA向蛋白質翻譯位點的易位、蛋白質從該RNA的轉錄、該RNA的剪接產生一種和多種mRNA種類，和RNA參加或者促進的催化活性。對靶核酸功能的這種干擾的總體效果是調節蛋白質的表達或者產生。在本發明的上下文中，“調節”指基因表達的增加(刺激)或者減小(抑制)。為了本發明目的，調節編碼HIF-1的基因從而抑制HIF-1的表達。
在本發明的上下文中，“雜交”指互補核苷或者核苷酸堿基之間的氫鍵，其可以通過Watson-Crick、Hoogsteen或者反轉Hoogsteen氫鍵形成。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互補核堿基，它們通過氫鍵成對。本文中所用的“互補的”指兩個核苷酸之間精確配對的能力。例如，如果寡核苷酸的某個位置上的核苷酸能夠與DNA或者RNA分子的相同位置上的核苷酸氫鍵結合，那么認為該寡核苷酸和DNA或者RNA在該位置相互互補。當寡核苷酸和DNA或者RNA的每個分子中足夠數目的相應位置被可以相互氫鍵結合的核苷酸占據時，該寡核苷酸和DNA或者RNA是互補的。從而，術語“可特異雜交的”和“互補的”用于表明足夠程度的互補性或者精確配對，從而在寡核苷酸和DNA或者RNA靶標之間發生穩定而特異的結合。在本領域中理解反義化合物的序列不需要與其將特定雜交的靶標核酸100％互補。當反義化合物與靶DNA或者RNA分子的結合干擾該靶DNA或者RNA的正常功能而導致效用損失時，該反義化合物是可特異雜交的，并且具有足夠程度的互補性以避免在特異結合所希望的條件下反義化合物與非靶標序列的非特異結合，所述條件即對于體內測定或者治療性治療為在生理條件下，對于體外測定為實施測定的條件下。
盡管反義寡核苷酸是反義化合物的優選形式，但是本發明還包括其他寡聚體反義化合物，包括但不限于如下所述的寡核苷酸模擬物。根據本發明的反義化合物優選包括約10到約30個核堿基。尤其優選的為包含約20個核堿基(即約20個連接的核苷)的反義寡核苷酸。本領域中公知核苷是堿基-糖聯合。核苷的堿基部分通常是雜環堿基。兩類最常見的這種雜環堿基是嘌呤和嘧啶。核苷酸是還包括共價連接到該核苷的糖部分的磷酸基團的核苷。對于包括呋喃戊糖苷糖的那些核苷，磷酸基團可以連接到糖的2’、3’或者5’羥基部分。在形成寡核苷酸中，磷酸基團將相互相鄰的核苷共價連接形成線性聚合化合物。該線性聚合物結構的各自末端又可以進一步連接形成環狀結構，然而，通常優選線性結構。在寡核苷酸結構內，通常將磷酸基團稱作形成寡核苷酸的核苷間骨架。RNA和DNA的正常鍵或者骨架為3’到5’磷酸二酯鍵。
用于本發明的優選反義化合物的特定實例包括包含經修飾的骨架或者非天然核苷間鍵的寡核苷酸。如本申請書中定義的，具有經修飾的骨架的寡核苷酸包括在主鏈中保留磷原子的那些寡核苷酸和在主鏈中不具有磷原子的那些寡核苷酸。為了本說明書的目的，并且如有時在本領域中參考的，也可以將在它們的核苷間主鏈中不具有磷原子的經修飾的寡核苷酸認為是寡核苷。
優選的經修飾的寡核苷酸主鏈包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸，包括3’-亞烴基膦酸酯和手性膦酸酯、亞膦酸酯、亞磷酰胺，包括3’-氨基亞磷酰胺和氨基烷基亞磷酰胺、硫逐亞磷酰胺、硫逐烷基膦酸酯、硫逐烷基膦酸三酯，和具有正常3’-5’鍵的硼烷基磷酸酯，和這些的2’-5’連接的類似物，和具有倒轉極性的那些化合物，其中相鄰核苷單位對3’-5’到5’-3’或者2’-5’或者5’-2’連接。還包括多種鹽、混合鹽和游離酸形式。
優選的經修飾的其中不包括磷原子的寡核苷酸主鏈由短鏈烷基或者環烷基核苷間鍵、混合的雜原子或者烷基或者環烷基核苷間鍵、或者一個或多個短鏈雜原子或者雜環核苷間鍵形成。這些主鏈包括具有嗎啉代鍵(部分從核苷的糖部分形成)的主鏈；硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主鏈；亞甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主鏈；包含烯的主鏈；氨基磺酸酯主鏈；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基主鏈；磺酸酯和磺酰胺主鏈；酰胺主鏈；和具有混合的N、O、S和CH2組成部分的其他主鏈。
在其他優選的寡核苷酸模擬物中，核苷酸單位的糖和核苷間鍵，即主鏈都被新的基團取代。堿基單位被保留以便與適宜的核酸靶標化合物雜交。一種這樣的寡聚化合物是已經表現出優良的雜交性質的寡核苷酸模擬物，其被稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，用包含酰胺的主鏈，尤其氨基乙基甘氨酸主鏈置換寡核苷酸的糖主鏈，核堿基得到保留并且直接或者間接結合主鏈的酰胺部分的氮雜氮原子。
本發明的最優選的實施方案是具有硫代磷酸酯主鏈的寡核苷酸和具有雜原子主鏈的寡核苷酸，尤其-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-[稱為亞甲基(甲基亞氨基)或者MMI主鏈]、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-[其中天然磷酸二酯主鏈以-O-P-O-CH2-給出]。還優選具有嗎啉代基主鏈結構的寡核苷酸。
修飾的寡核苷酸也可以包含一種或多種取代的糖部分。優選的寡核苷酸在2’位包含下列之一OH；F；O-，S-，或N-烷基；O-，S-，或N-鏈烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、鏈烯基和炔基可以是取代或者未取代的C1到C10烷基或者C2到C10鏈烯基和炔基。尤其優選的是O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m為1到約10。其他優選的寡核苷酸在2’位包含下列之一C1到C10低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或者O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基團、報告基團、嵌入劑、改善寡核苷酸的藥物代謝動力學性質的基團、或者改善寡核苷酸藥物動力學性質的基團，和具有相似性質的其他取代基。優選的修飾包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O-CH2CH2OCH3，也叫做2’-O-(2-甲氧基乙基)或者2’-MOE)(Martin等人，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)，即烷氧基烷氧基。進一步優選的修飾包括2’-二甲氨基氧乙氧基，亦即O(CH2)2ON(CH3)2基團也稱為2’DMAOE，如下面的實施例所述。其他優選的修飾包括2-甲氧基(2’-O-CH3)、2-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2’-F)。類似的修飾也可以在寡核苷酸的其他位置上進行，尤其在3’-末端核苷酸上糖的3’位，或者2’-5’-連接的寡核苷酸中和5’-末端核苷酸的5’位。寡核苷酸還可以是糖模擬物，如環丁基部分代替呋喃戊糖基糖。寡核苷酸還可以包括核堿基(在文獻中通常簡稱為“堿基”)修飾或者取代。本文中所用的“未修飾的”或者“天然“核堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，和嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核堿基包括其他合成的和天然核堿基，如5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵素、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵素，尤其5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤、和8-氮雜腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤和7-去氮腺嘌呤和3-去氮雜鳥嘌呤和3-去氮雜腺嘌呤。某些核堿基尤其可用于增加本發明的寡聚體化合物的結合親和性。這些核堿基包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2，N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶、已經表明5-甲基胞嘧啶取代增加核酸雙鏈體穩定性0.6-1.2℃，是本發明優選的堿基取代，當與2’-O-甲氧基乙基糖修飾組合時尤其優選。
本發明的寡核苷酸的另一修飾包括化學連接寡核苷酸的一個或多個部分或者綴合物，其增強寡核苷酸的活性、細胞分布或者細胞攝取。這些部分包括但不限于脂質部分，如膽固醇部分、膽酸、硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇、硫代膽固醇、脂肪族鏈，例如，癸二酸或者十一烷基殘基，磷脂，例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或者三乙基銨1，2-二-鄰-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸脂，多胺或者聚乙二醇鏈，或者金剛烷乙酸、棕櫚基部分，或者十八胺或者己基氨基-羰基-氧膽固醇部分。
給定化合物中所有位置不必都被統一修飾，實際上多于一個的上面提到的修飾可以摻入單一化合物或者甚至寡核苷酸內的單個核苷。本發明還包括反義化合物，其是嵌合化合物。在本發明的背景中“嵌合”反義化合物或者“嵌合體”是反義化合物，尤其寡核苷酸，它們包含兩個或多個化學上不同的區域，每個區域由至少一個單體單位組成，即，對于寡核苷酸，單體單位為核苷酸。這些寡核苷酸通常包含至少一個區域，其中該寡核苷酸被修飾從而賦予該寡核苷酸對核酸酶降解的更大抗性、更強的細胞攝取，和/或對靶核酸的更大結合親和性。該寡核苷酸的額外區域可作為能夠切割RNADNA或者RNARNA雜種分子的酶的底物。作為實例，RNA酶H是切割RNADNA雙鏈體的RNA鏈的細胞內切核酸酶。因此，RNA酶H的激活導致切割RNA靶標，從而極大地增強寡核苷酸抑制基因表達的效率。因此，與雜交相同靶標區域的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸相比，當使用嵌合寡核苷酸時，用較短的寡核苷酸通常可以得到相當的結果。RNA靶標的切割可以常規地通過凝膠電泳檢測，如果必要，可以聯合本領域中公知的核酸雜交技術。
本發明的嵌合反義化合物可以形成兩種或者多種寡核苷酸、修飾的寡核苷酸、寡核苷和/或如上文描述的寡核苷酸模擬物的復合結構。這些化合物在本領域中已經被稱作雜合體或者gapmer。
通過眾所周知的固相合成技術可以方便而常規地合成根據本發明使用的反義化合物。用于這種合成的設備由若干銷售商出售，這些銷售商包括例如，Applied Biosystems(Foster City，CA)。可以額外或者備選地使用本領域中公知的用于這種合成的任何其他方法。使用相似的技術制備寡核苷酸，如硫代磷酸酯和烷基化衍生物是眾所周知的。
本發明的反義化合物在體外合成并且不包括生物來源，或者經設計用于指導反義分子的體內合成的基因載體構建體的反義組合物。本發明的化合物還可與其它分子、分子結構或化合物的混合物，例如脂質體，受體靶分子，以及口腔的、直腸的，局部的或其它制劑混合、包裹，綴合或發生其它關聯，以便輔助攝取，分布和/或吸收。
本發明的反義化合物包括任何藥學上可接受的鹽、酯、或者這些酯的鹽，或者任何其他化合物，其當施用于包括人的動物時，能夠提供(直接或者間接)生物活性代謝物或者其殘基。因此，例如，本公開還涉及本發明化合物的前藥和藥學上可接受的鹽，這些前藥的藥學上可接受的鹽，和其他生物等價物。
術語“前藥”指以無活性形式制備的治療劑，其在身體或者身體的細胞內通過內源酶或者其他化學物質和/或條件的作用轉化成活性形式(即，藥物)。具體地，將本發明的寡核苷酸的前藥形式制備為SATE[(S-乙酰基-2-硫代乙基)磷酸酯]衍生物。
術語“藥學上可接受的鹽”指本發明化合物的生理上和藥學上可接受的鹽，即保持親本化合物的所希望的生物學活性并且不賦予其不希望的毒理學作用的鹽。
對于寡核苷酸，藥學上可接受的鹽的優選實例包括但不限于(a)與陽離子如鈉、鉀、銨、鎂、鈣、多胺如精胺和亞精胺等形成的鹽；(b)與無機酸，例如，鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸和硝酸等形成的酸加成鹽；(c)與有機酸，例如，乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、延胡索酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸、棕櫚酸、藻酸、聚谷氨酸酸、萘磺酸、甲磺酸、對-甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸、等等形成的鹽，和(d)由基本陰離子，如氯、溴和碘形成的鹽。
通過將有效量反義化合物加入適宜的藥學上可接受的稀釋劑或者載體中可以將本發明化合物用于藥物組合物中。本發明的反義化合物和方法還可用以預防，例如，防止或者延遲感染、炎癥或者腫瘤形成。
本發明的反義化合物可用于研究和診斷，因為這些化合物與編碼HIF-1的核酸雜交，使得易于構建能利用該事實的三明治或者其他測定法。通過本領域中公知的方法可以檢測本發明的反義寡核苷酸與編碼HIF-1的核酸的雜交。這些方法包括將酶綴合到該寡核苷酸，放射標記該寡核苷酸，或者任何其他適宜的檢測方法。還可以制備使用這些方法檢測樣品中HIF-1水平的試劑盒。
本發明還包括包含本發明的反義化合物的藥物組合物和制劑。本發明的藥物組合物可以以多種方法施用，取決于是否希望局部或者全身性治療和所要治療的部位。施用可以是局部的(包括經眼的和經粘膜，包括陰道和直腸遞送)、經肺，例如，通過吸入或者吹入粉劑或者氣溶膠，包括通過霧化器；氣管內、鼻內、表皮和透皮)、經口或者腸胃外。腸胃外施用包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或者肌內注射或者輸液；或者顱內，例如，鞘內或者室內施用。認為具有至少一種2’-O-甲氧基乙基修飾的寡核苷酸尤其可用于經口施用。
用于局部施用的藥物組合物和制劑可以包括透皮貼劑、膏劑、洗劑、乳劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液劑和粉劑。常規藥物載體、水性、粉劑或者油性基質、增稠劑等等可以是必要的或者所希望的。
用于經口施用的組合物和制劑包括粉劑或者粒劑、水或者非水性介質中的懸浮劑或者溶液劑、膠囊劑、囊劑或者片劑。增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或者結合劑也可以是需要的。
用于腸胃外、鞘內或者室內施用的組合物和制劑可以包括無菌水性溶液，其還可以含有緩沖劑、稀釋劑和其他適宜的添加劑，如，但不限于，滲透增強劑、載體化合物和其他藥學上可接受的載體或者賦形劑。
本發明的藥物組合物包括，但不限于，溶液劑、乳劑、和含有脂質體的制劑。這些組合物可以從多種組分產生，這些組分包括，但不限于預形成的液體、自乳化固體和自乳化半固體。
實施例下面的實施例闡明本發明的多個方面的實施。它們不限制本發明或者所附權利要求。
實施例1-癌細胞系的生長用于確定寡核苷酸化合物的效果的癌細胞從下面的來源得到來自美國典型培養物保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)的人OVCAR-3(卵巢)，MCF-7(乳腺，依賴激素的)，HeLa(子宮頸)，PC3(前列腺)，HepG2(肝臟)，和A549(肺)，HT-29(結腸)，PANC-1(胰臟)，Caki-1(腎)；來源于Riken Cell Bank(日本)的U251(腦)；德國微生物和細胞培養物中心(DSMZ)(德國)MKN-45(胃)；來自美國國家癌癥研究所(Bethesda，MD)UMRC2(腎)和Lox IMVI(黑素瘤)。除了UMRC2、Caki-1和PANC-1之外，所有細胞系都生長在補加10％胎牛血清(FBS)，1mM丙酮酸鈉，10mM HEPES和100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(P/S)的RPMI 1640培養基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。UMRC2、Caki-1和PANC-1細胞保持在補加10％胎牛血清、10mM HEPES和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco氏改良的Eagle培養基(“DMEM”，Invitrogen)中。所有細胞都生長在37℃下濕潤5％CO2中。
實施例2-寡核苷酸的合成選擇稱作可讀框(“ORF”)的人HIF-1α基因編碼區和3’非翻譯區(“3’UTR”)中發現的多種核苷酸作為靶標，并合成相應的互補寡核苷酸。合成期間修飾每種寡核苷酸的主鏈以便在核苷酸之間(除了3’和5’末端之外)導入硫代磷酸酯鍵，從而得到反義寡核苷酸。
使用Applied Biosystems，Foster City，CA(″ABI″)的8909Expedite DNA合成儀合成HIF-1α的編碼區中的寡核苷酸。使用關于相應磷酸二酯寡核苷酸相同的方式進行硫代磷酸酯的合成，只是標準氧化瓶由乙腈中的0.2M 3H-1，2苯并二硫醇(benzodithiole)-3-酮1，1二氧化物以逐步硫雜化亞磷酸酯鍵。從可控孔度玻璃柱切割并在濃氨水中去封閉后，將寡核苷酸化合物在氨水存在下在55℃下過夜加熱。將上清液轉移到新管中并通過Speedvac plus和UVS400 UniversalVacuum System(Thermo Savant，Holbrook，NY)蒸發氨水。用75mM NaOAc，pH7.2和2.5體積乙醇沉淀寡核苷酸并用乙醇洗滌一次。將寡核苷酸溶于水中并通過紫外分光光度計測量寡核苷酸濃度。
實施例3-轉染轉染前一天，將細胞胰蛋白酶處理，計數，并鋪平板。將2.5×105個細胞鋪在6孔板中的每個孔中，從而這些細胞在轉染當天達到50-90％匯合。用于轉染實驗的所有試劑和培養基都來自Invitrogen(Carlsbad，CA)。在無菌管中制備下面的溶液溶液A對于每次轉染，將2μl(0.5μg)DNA、100μl無血清的培養基(“Opti-MEM”)和3μl PLUS試劑的混合物在室溫孵育15分鐘。溶液B對于每次轉染，2.5μl Lipofectamine試劑和100μl無血清培養基(Opti-MEM)的混合物。將溶液A和B合并并在室溫孵育15分鐘。為了轉染，用2ml無血清的培養基或者PBS洗滌細胞一次并向每孔加入800μl無血清培養基(Opti-MEM)。向每孔加入所合并的溶液A和B并輕微混合。隨后，細胞在37℃孵育3小時，將培養基用常規培養基代替并孵育所指定的時間。對于標準LIPOFECTAMINE 2000方案(其用于RT-PCR和細胞毒性實驗)，在100μl生長培養基中轉染前一天將細胞鋪在96孔板中。對于每孔，將寡核苷酸樣品在25μl OPTI-MEM血清減少的培養基中稀釋。單獨將LIPOFECTAMINE 2000試劑在25μl OPTI-MEM中室溫下稀釋5分鐘。將寡核苷酸和試劑混合并在室溫下孵育20分鐘以允許復合物形成，然后將復合物直接加入到生長培養基中的細胞并輕輕混合。隨后，細胞在37℃孵育4小時，然后用常規培養基替換所述培養基并孵育所指定的時間。
實施例4-通過反義寡核苷酸抑制HIF-1α mRNA表達然后試驗反義寡核苷酸下調、或者抑制編碼HIF-1α的mRNA的表達的能力。通過RT-PCR分析測量用反義寡核苷酸轉染的細胞中HIF-1α的mRNA的表達水平。轉染后2小時時(改變培養基)采集樣品，分離RNA并將其進行RT-PCR分析。
用實驗寡核苷酸轉染6孔板上的UMRC2細胞(2.5×105個細胞/孔)并用轉染的細胞分離總RNA。使用RNA-STAT試劑盒(TEL-TEST，Inc.，Friendswood，TX)，根據供應商手冊[也參見Chomczynski，P.和Sacchi，N，Anal.Biochem.162156-159(1987)]分離總RNA。簡言之，從兩個6孔板除去培養基并加入共0.5mlRNA-STAT溶液，并通過吸液混合數次，并轉移到eppendorf管中。向管中加入0.1ml氯仿，并劇烈搖動該管15秒，然后在室溫下孵育3分鐘后以14,000rpm在4℃下離心15分鐘。將頂層轉移到新管中并加入0.3ml異丙醇并且在室溫下孵育10分鐘。隨后，以14,000rpm離心RNA沉淀10分鐘。所得沉淀用70％乙醇洗滌，快速干燥，并用20μl水重構。通過分光光度計確定RNA濃度。用M-MLV酶試劑盒(Invitrogen)實施RT反應。5μg總RNA用于合成20μl RT反應中的cDNA。通過將總RNA、寡聚dT(0.5mg)和dNTP(0.5mM)混合物在65℃孵育5分鐘并在冰上快速冷卻合成第一條鏈cDNA。將第一條鏈緩沖液、7.4mM DTT和1μl M-MLV反轉錄酶(200單位)加入上面的反應混合物并在37℃孵育50分鐘，然后在70℃下酶失活15分鐘。通過PCR測量RT反應合成的HIF-1 cDNA，該測量使用Sapphire RCR混合物(SuperBio Inc.，Seoul，韓國)和適宜的引物。對于HIF-1αmRNA檢測，引物為5′GCACAGGCCACATTCACG 3′(Seq.Id No.5)和5′TGAAGATTCAACCGGTTTAAGGA 3′(Seq.IdNo.6)。β-肌動蛋白用作PCR內對照。β-肌動蛋白的引物為5′CCCATGCCATCCTGCGTCTG 3′(Seq.Id.No.7)和5′ACGGAGTACTTGCGCTCAG 3′(Seq.Id.No.8)。在1.5％瓊脂糖凝膠上通過電泳分析PCR產物。
最初共篩選了124種寡核苷酸，來自優選的4種核苷酸的結果在下面的表1中顯示。再次檢驗每種寡核苷酸以證實mRNA表達水平的下調。一式兩份地進行每種反應。
表1.HIF-1α mRNA表達的抑制
*Genbank# NM001530RX-0047、RX-0073、RX-0149和RX-0158是發明人設計的新序列。選擇它們作為對照中發現的兩個區域，根據用于對照的試驗，HIF-1α基因的3’UTR和ORF區域都顯示出對于那一區域的最高％抑制。使用此處描述的試驗，所有新序列都顯示出比對照增加的％抑制。然而，發現％抑制不與細胞毒性相關，如實施例6中所討論。隨后，選擇顯示出HIF-1 mRNA表達的高％抑制和UMRC2細胞中細胞毒性的兩種寡核苷酸在12種其他癌細胞系中試驗。所試驗的核苷酸列表如下面的表2中所示。
表2.HIF-1S-寡核苷酸列表
圖1顯示了用0.3μM RX-0047和RX-0149轉染后13種癌細胞系(UMRC2、OVCAR-3、MKN-45、A549、PC3、U251、Lox IMVI、HeLa、HepG2、HT-29、Caki-1、PANC-1和MCF-7)中HIF-1mRNA水平的下調。在UMRC2、PANC-1、OVCAR-3、MCF-7、LoxIMVI、A549和PC3細胞系中觀察到HIF-1的高水平下調，在HT-29和Caki-1細胞中觀察到適度水平的下調，在HeLa、HepG2、MKN-45、和U251中觀察到低水平下調。如圖1中所示，RX-0047和RX-0149對HIF-1mRNA表達的下調的水平是相似的，只是在一些細胞系中，RX-0047處理的細胞顯示出比RX-0149稍高的下調水平。
實施例5-HIF-1蛋白質水平的蛋白質印跡分析用濃度為0.3μM優選的RX-0047和RX-0149寡核苷酸如實施例3描述的轉染多種癌細胞系。在轉染后24小時之前6小時用離子螯合劑-deferroxiamine以終濃度100μM處理細胞。對于核提取物制備，使用下面的方法。對于10cm培養皿，用含有0.1mm NaVO4(2×6ml)的冰冷PBS溫和地洗滌細胞，將其重懸浮在含有0.1mM NaVO4的冰冷卻的PBS中并以2000轉/分鐘離心5分鐘。將沉淀重懸浮在0.3-0.5mlCE緩沖液，pH7.6(10mM HEPES，60mMKCl，1mM EDTA，1mMDTT，1mM PMSF，1x蛋白酶抑制劑混合物和0.1mM NaVO4)，該緩沖液含有0.5％NP40，允許細胞在冰上膨脹5分鐘。將制備物以2000轉/分鐘離心5分鐘。從沉淀除去細胞質提取物并將其轉移到新管中。用0.5ml不含NP40的CE緩沖液輕輕洗滌細胞核。如上以2,000轉/分鐘離心細胞核5分鐘。將50μl NE緩沖液，pH 8.0(20mM Tris-HCl，420mM NaCl，1.5mMMgCl2，0.2mM EDTA，1mM PMSF，25％甘油，0.1mM NaVO4，和1x蛋白酶抑制劑混合物)加入核沉淀中并渦旋處理以重懸浮該沉淀。將提取物在冰上孵育40分鐘，定期渦旋以重懸該沉淀，并且將CE和ME級分以最大速度離心15分鐘以沉淀任何細胞核。將上清液轉移到新管(可溶的核級分)并在-70℃保存。用BCA蛋白質測定試劑(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)測量蛋白質濃度。用粗細胞提取物通過SDS-PAGE并隨后使用抗-HIF1抗體(Transduction Labs，Lexington，KY)實施蛋白質印跡分析確定HIF-1蛋白質表達。抗β-肌動蛋白抗體(Santa Cruz Biotechnology)用作內對照。結果在圖2中顯示。RX-0047和RX-0149都顯示出在所有細胞系中HIF-1蛋白質表達的或多或少的抑制。
實施例6-細胞的細胞毒性試驗用人癌細胞系檢驗實驗寡核苷酸的細胞的細胞毒性。用硫羅丹明B(″SRB″)方法[Skehan等人，J.National Cancer Institute，821107-1112(1990)]評估RX-寡核苷酸轉染后細胞的存活。
將細胞置于96孔板上并在第二天用所述寡核苷酸轉染。孵育72小時后，用硫羅丹明B對存活細胞染色并使用微量培養板讀出器測量。簡言之，將1,000-10,000個細胞置于96孔板的每孔中并用實驗寡核苷酸使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)轉染。孵育4小時后，除去轉染劑并向每孔加入新鮮培養基。孵育72小時后，除去培養基。將細胞用10％三氟乙酸(“TCA”)固定，4℃下孵育1小時，并用自來水洗滌4次。隨后，將細胞用1％乙酸中的0.4％硫羅丹明B染色，用1％乙酸洗滌4次，再次空氣干燥。在10mM Tris溶液中攪拌5分鐘后，用Benchmark Plus微量培養板讀出器(Bio-RadLaboratories，Hereules，CA)在530nm下讀出樣品的光密度。
將表現出HIF-1 mRNA下調的實驗化合物用于試驗它們對UMRC2細胞存活力的影響。下面的oligo化合物RX-0047、RX-0073、RX-0149和RX-0158用于細胞毒性試驗。RX-0047和RX-0149與試驗的其他寡核苷酸相比表現出最強的細胞毒性作用。有趣的是，RX-0118和RX-0121是已經顯示出對mRNA的分別74和45％抑制的新的寡核苷酸，但是它們沒有顯示出和RX-0047和RX-0149一樣大的細胞毒性。因此，mRNA抑制試驗不與細胞毒性相關。
從mRNA抑制研究得到的兩種最好的候選者RX-0047和RX-0149用于篩選針對多種癌細胞系的細胞毒性。RX-0047在下面的人癌細胞系中降低了細胞存活力PC3(前列腺)、U251(腦)、HeLa(宮頸)、OVCAR-3(卵巢)、LoxIMVI(黑素瘤)、HepG2(肝臟)、MCF-7(乳腺)、UMRC2(腎)、MKN-45(胃)、PANC-1(胰腺)、HT-29(結腸)、Caki-1(腎)和A549(肺)。在所試驗的不同的細胞系中，RX-0047的細胞毒性隨著RX-0047的濃度增加而增加。0.1μM RX-0047在所試驗的所有13種細胞系中導致50％以上的細胞死亡。RX-0149得到類似結果。RX-0149再次在所有細胞系中表現出細胞毒性，該細胞毒性在不同細胞系中隨著濃度不同程度地增加，在PC3，U251、HeLa、OVCAR-3、LoxIMVI、MCF-7、MKN-45、A549、Caki-1和UMRC2中0.1μM RX-0149導致50％以上的細胞死亡。但是PANC-1、HT-29和HepG2中50％以上的細胞在0.1μM時幸存下來。
實施例7-RX-0047和RX-0149寡核苷酸的細胞毒性的IC50測量對試驗寡核苷酸篩選相對有效劑量。用濃度為0.01μM到1μM的RX-0047或RX-0149轉染13種不同的癌細胞系，轉染72小時后，將細胞用硫羅丹明B染色并使用Bio-Rad微量培養板讀出器(Bio-RadLaboratories)計數存活細胞。用KaleidaGraph軟件(SynergySoftware，Reading，PA)程序計算IC50值，或者殺死半數細胞所需的藥物濃度。
表3
為了比較，注意到UMRC2的IC50對于RX-0047為8nM，對于RX-0149為17nM。在U251、OVCAR-3、和A549中觀察到細胞毒性作用的相似水平。
實施例8序列變異性為了確定是否需要RX-0047和RX-0149的完整20聚體主鏈來下調HIF-1 mRNA表達，合成18-、16-、14-和10-聚體寡核苷酸并分析它們對mRNA表達和細胞毒性的效果。RT-PCR分析數據表明RX-0047的18聚體形式表現出對HIF-1 mRNA表達的一定抑制。而16-、14-和10聚體形式表現出對HIF-1 mRNA表達的稍弱的抑制。這表明RX-0047的序列截短到16-、14-和10-聚體對HIF-1 mRNA表達的所希望的抑制具有一定效果。對于RX-0149，RX-0149的18-和16-聚體形式表現出和RX-0149的20聚體形式對HIF-1 mRNA表達的相似的抑制。然而，當將該序列截短到RX-0149的14-和10聚體形式時，抑制變得不明顯。這表明對于RX-0047，18-和16-聚體形式和20-聚體形式一樣有效。對于RX-0149，需要20聚體全長序列實現對HIF-1mRNA表達的最大抑制。
與上面的數據聯合，我們觀察到含有RX-0047的20聚體所來源的序列的上游和下游的5或10個核苷酸的寡聚體顯示出對HIF-1mRNA表達的可測量的抑制。
用含有RX-0047的20聚體所來源的序列的上游和下游的5或10個核苷酸的相同寡聚體在UMRC2細胞系中試驗細胞毒性。所有4種經修飾寡聚體都表現出與RX-0047的20聚體相當的細胞毒性作用，這與RT-PCR數據吻合。上述RX-0047和RX-0149的截短形式也表現出和在RT-PCR分析中觀察到的類似的癌細胞增殖的抑制模式。
實施例9體外異種移植研究為了觀察腫瘤生長的抑制，使用當前發明的化合物之一RX-0047在動物模型中進行裸鼠的體外異種移植研究。A549人肺癌細胞系生長在Dulbecco改良的Eagle氏培養基和補加10％cosmic牛血清(HyClone，Logan，UT)的培養基199的4∶1混合物中生長。細胞保持在在37℃5％CO2中。
將標記基因螢光素酶導入腫瘤細胞。利用下面的方法。使用含有螢光素酶基因和G418/neo選擇標記的慢病毒載體感染細胞。在病毒上清液的存在下將細胞孵育24小時。感染后更換培養基，并在感染后3-4天開始G418選擇。用發光計證實螢光素酶陽性細胞。
免疫缺陷小鼠(Nu/Nu；Harlan Sprague Dawley，Inc.，Indianapolis，IN)保持在University of Texas Southwestern MedicalCenter的動物資源中心(ARC)的無病原條件下，并根據ARC和IACUC指導處理。
對于A549肺癌異種移植模型，將細胞(4×106個細胞)皮下注射到每只小鼠的兩個側腹中。通過Alzet泵系統施用受試物品14天。將Alzet微滲透泵(Alza，Palo Alto，CA)皮下(sc)植入10g小鼠和腹膜內植入20g小鼠中。泵動速度保持在0.25μl/小時(±0.05μl/小時)，連續灌輸14天。在填充和處理泵和手術移植期間使用無菌技術。
對于A549肺癌轉移模型，對小鼠進行γ-照射并通過尾靜脈靜脈內導入1×106個細胞。按照ARC/IACUC指導，每周用基于螢光素酶的生物發光成像對動物成像。將小鼠基于陰性結果(3-4個月后)終止或者每周成像直到腫瘤負擔超過宿主動物正常體重的10％(對于成年小鼠，腫瘤直徑1-2cm)。
表4顯示了基于螢光素酶的生物發光作為腫瘤生長的指示劑，對對照和用RX-0047處理的A549人肺癌異種移植物皮下移植的無胸腺裸鼠的檢測。RX-0047處理后1周，與對照小鼠相比，觀察到腫瘤大小減小3倍。RX-0047處理后2周，觀察到腫瘤大小減小2倍。這表明RX-0047是腫瘤異種移植模型中的有效抗腫瘤劑。
表4
rlu*＝相對光單位在A549轉移模型中，每天用RX-0047腹膜內劑量(60mg/kg/天處理9天，然后30mg/kg/天再處理5天)處理動物。14天的RX-0047腹膜內施用后在第2和3周進行轉移腫瘤的成像。如表5中所示，用RX-0047處理后2周，沒有檢測到肺轉移，而在對照組中觀察到肺轉移。RX-0047處理后3周，肺轉移與對照組相比減小了60倍。這表明RX-0047是肺轉移的潛在的強抑制劑。
表5
rlu*＝相對光單位序列表<110>Yoon，HeejeongAhn，Chang-HoLee，Young BokMao，LingjunJiang，Xiaoming<120>抑制HIF-1表達的反義寡核苷酸<130>REX 7034<160>130<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人<400>1ttggacactg gtggctcatt 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>2aatgagccac cagtgtccaa 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人<400>3gacttggaga tgttagctcc 20
<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>4ggagctaaca tctccaagtc 20<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5gcacaggcca cattcacg18<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6tgaagattca accggtttaa gga 23<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7
cccatgccat cctgcgtctg 20<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8acggagtact tgcgctcag 19<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>9attgtgcaat tgtggctacc 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>10gtgatgatgt ggcactagta 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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<223>反義寡核苷酸
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<223>反義寡核苷酸<400>30tatgttcata gttcttcctc 20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>反義寡核苷酸<400>33cagtattgta gccaggcttc 20<210>34<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>34ttgaactaac caagtttgtg 20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>35gctgtctgtg atccagcatt 20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>36atgctactgc aatgcaatgg 20<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>37aaaggttact gccttcttac 20
<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>38tcaactgcct atgatcatga 20<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>39gtactgctgg caaagcatta 20<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>40attccatgag taactgctgg 20<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>41
gattaacaat gtcatgttcc 20<210>42<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>42ataataaacc atacagcatt 20<210>43<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>43tattatgtaa atggctttac 20<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>44ttctagatat atgcatatct 20<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>45atcagatgat ttctctgaat 20<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>46aacttccaca actacatagg 20<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>47gtttaatatc agttacacaa 20<210>48<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>48tataccaaca gggtaggcag 20<210>49<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>49ctgccttgta taggagcatt 20<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>50caccctgcag taggtttctg 20<210>51<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>51taacttgatc caaagctctg 20<210>52<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>52aaaattagat gtagaaaata 20
<210>53<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>53agtagaaagg ggatcaaaaa 20<210>54<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>54aaagagcatt aatgtaaatt 20<210>55<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>55ccaaaaaact gagaaaatga 20<210>56<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>56
aaattatatt ggcatcttct 20<210>57<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>57atttcttctt aaaaactagt 20<210>58<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>58ggtttaacaa tttcataggc 20<210>59<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>59ccaaataaat gccacatacc 20<210>60<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>60tttgagctgg caaagtgact 20<210>61<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>61tcttgtttac agtctgctca 20<210>62<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>62atgcttctaa aattactcaa 20<210>63<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>63aacaagatat ttactgtgac 20<210>64<211>21<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>64cagttagtgt tagatccaac c21<210>65<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>65ataaaaaggt gcatttttta 20<210>66<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>66ccctagccaa aaataaataa 20<210>67<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>67attcgaaaaa gggataaact 20
<210>68<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>68aaaaggtgta aaaatttttc 20<210>69<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>69atttatgtaa aatgtgaaaa 20<210>70<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>70aattttgcta agaatgcatg 20<210>71<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>71
agcaaattaa catactaggc 20<210>72<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>72aaatcaaaca ttgtattttg 20<210>73<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>73taatagcgac aaagtgcata 20<210>74<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>74ctacatgaaa aaaaggatgt 20<210>75<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>75aactatatat tcctaaaata 20<210>76<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>76tgaatgtggc ctgtgcagtg 20<210>77<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>77tgaggttggt tactgttggt 20<210>78<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>78cagcaccaag caggtcatag 20<210>79<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>79tcttctggct catatcccat 20<210>80<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>80ttggtcagat gatcagagtc 20<210>81<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>81tgtcctgtgg tgacttgtcc 20<210>82<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>82acccagacat atccacctct 20
<210>83<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>83tggttgagaa ttcttggtgt 20<210>84<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>84ttcacacata caatgcactg 20<210>85<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>85tgctgaataa taccactcac 20<210>86<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>86
aggacacatt ctgtttgttg 20<210>87<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>87ttcatatctg aagattcaac 20<210>88<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>88tcaactttgg tgaatagctg 20<210>89<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>89ggctacttgt atcttctgat 20<210>90<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>90catcaggttc cttcttaagt 20<210>91<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>91gctggggcca gcaaagttaa 20<210>92<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>92agatatgatt gtgtctccag 20<210>93<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>93ctggtcatca gtttctgtgt 20<210>94<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>94aatggtactt cctcaagttg 20<210>95<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>95atttatattc tgtaattttt 20<210>96<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>96ggtaatggag acattgccaa 20<210>97<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>97gtgcagggtc agcactactt 20
<210>98<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>98taatgcaact tcttgattga 20<210>99<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>99ctctggattt ggttctaatt 20<210>100<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>100gtaaaagaaa gttccagtga 20<210>101<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>101
tgtctgatcc tgaatctggg 20<210>102<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>102actttgtcta gtgcttccat 20<210>103<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>103ggactattag gctcaggtga 20<210>104<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>104gaccatatca ctatccacat 20<210>105<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>105ccaattccaa cttgaattca 20<210>106<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>106gttctttgct tctgtgtctt 20<210>107<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>107taaatctgtg tcctgagtag 20<210>108<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>108tgctttctaa tggtgacaac 20<210>109<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>109aactgtgctt tgaggacttg 20<210>110<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>110tgagtctgct ggaatactgt 20<210>111<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>111ttagcagtag gttcttgtat 20<210>112<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>112ttaattcatc agtggtggca 20
<210>113<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>113atattttaat gtcttccata 20<210>114<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>114aggagatgga gatgcaatca 20<210>115<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>115gtttctttat gtatgtgggt 20<210>116<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>116
actttgagta tctctatatg 20<210>117<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>117ctctgtttgg tgaggctgtc 20<210>118<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>118ctgtctggttc tatgactcct 20<210>119<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>119tagggcttct tggatgagat 20<210>120<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>120ttcctcagga actgtagttc 20<210>121<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>121attctgcaaa gctagtatct 20<210>122<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>122agtgaaccat catgttccat 20<210>123<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>123tccaattcct actgcttgaa 20<210>124<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>124tctggctgct gtaataatgt 20<210>125<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>125tgatgtagta gctgcatgat 20<210>126<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>126tagatttgca tccttttaca 20<210>127<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>127cagtctacat gctaaatcag 20
<210>128<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>128tcatccattg attgccccag 20<210>129<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>129tcagctgtgg taatccactt 20<210>130<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>130aacttcacaa tcataactgg 20
權利要求
1.化合物RX-0047，其具有包含Seq.Id.No.25′aatgagccaccagtgtccaa 3′的序列，其靶向編碼人HIF-1的核酸分子，其中所述寡核苷酸化合物抑制人HIF-1的表達。
2.權利要求1的化合物，其中該化合物是反義寡核苷酸。
3.權利要求2的反義寡核苷酸，其具有至少一個是硫代磷酸酯鍵的經修飾的核苷間鍵。
4.抑制人細胞或者組織中HIF-1表達的方法，該方法包括將所述細胞或者組織與權利要求1的化合物接觸。
5.在癌細胞中誘導細胞毒性的方法，該方法包括向該細胞中導入與人HIF-1序列雜交的寡核苷酸的步驟，所述寡核苷酸包含RX-0047，Seq.Id.No.2，5′aatgagccaccagtgtccaa 3′。
6.化合物RX-0149，5′ggagctaacatctccaagtc 3′，Seq.Id.No.4，該化合物靶向編碼HIF-1的核酸分子，其中所述化合物抑制人HIF-1的表達。
7.權利要求6的化合物，其中該化合物是反義寡核苷酸。
8.權利要求7的反義寡核苷酸，其具有至少一個是硫代磷酸酯鍵的修飾的核苷間鍵。
9.抑制HIF-1在人細胞或者組織中表達的方法，該方法包括將所述細胞或者組織與權利要求6的化合物接觸。
10.在癌細胞中誘導細胞毒性的方法，該方法包括向該細胞中導入與人HIF-1序列雜交的寡核苷酸的步驟，所述寡核苷酸包含Seq.Id.No.4 RX-0149，5′ggagctaacatctccaagtc 3′。
全文摘要
新的反義寡核苷酸化合物RX－0047和RX－0149，它們抑制HIF－1的表達并且還在一些癌細胞系中誘導細胞毒性。
文檔編號C12Q1/68GK1809583SQ200480003233
公開日2006年7月26日 申請日期2004年1月28日 優先權日2003年1月31日
發明者尹喜貞, 毛凌峻, 李永福, 安昌浩, 蔣曉鳴 申請人:雷克珊公司