精制濃縮酶溶液的方法

專利名稱：精制濃縮酶溶液的方法
技術領域：
本發明涉及精制濃縮工業酶溶液的方法，通過該方法得到的產品，及基于這樣的溶液的組合物，更特別的是洗滌劑和洗滌用組合物。
現在，特別是那些工業應用場合的酶大多數通過微生物發酵然后從使用的介質中精制生產的。經由通常幾個順次過程步驟得到的濃縮酶溶液通常也稱為“液態的酶”。液態的酶可以認為是精制的原料，所述的精制原料或者以液態形式使用或者有時轉變為干燥的形式再用于適當的應用中。
對于特別以液態形式的酶的重要的工業應用是洗滌劑和洗滌用組合物，所述的洗滌劑和洗滌用組合物越來越多地以液態或者凝膠形式銷售。其他應用場合包括例如化妝品領域，其中酶用作活化劑，如它們用于洗滌劑和洗滌用組合物，紡織品和食品制造和加工，其中主要的原料通過利用酶轉變為最終產品。
獲得濃縮酶溶液的純化或者富集方法在現有技術詳細地進行了描述。在這方面重要的目的是除去生物總量，即，宿主有機體的成分，更特別的高分子成分，除去低分子量的異物和雜質，更特別的介質成分和代謝物，和除去其他蛋白質，更特別的酶。同時，意欲得到大批量的、高純度和具有高活性含量的目標產品。另一方面，培養上層清液通常包含因素，通常為縮氨酸或者蛋白質，其識別通常仍沒有報道過的，但是其提供目標酶的穩定。因此，得到不完全純，即，包含某一百分數這樣的穩定因素的酶溶液具有特定的優點。
基于過濾、沉降或者沉淀的技術是通常用于純化的技術。
例如，已經開發出通常連續施加用于除去生物總量的方法，在現有技術中現在得到認同。這樣的方法包括例如分離、微濾和超濾作用。僅其后在本發明的上下文中實際可能談到酶濃縮物。
例如，國際專利申請WO01/37628A2描述了一種用于從培養和/或酶溶液中回收生物工藝生產的有用物質的方法，所述的方法包括使水不溶性固體與含該有用物質的水溶液分離，隨后過濾得到的該溶液，通過超濾作用濃縮含該有用物質的溶液。該已知的方法特征在于除去的固體要經使用來自濃縮步驟的濾液作為洗滌液的洗滌步驟處理。
然而，至今沒有解決如下問題的方案，即，從生物總量除去的酶濃縮包含特別是以下雜質1、固體，更特別是包括該靶蛋白的不可逆變性蛋白的沉淀，2、著色的、大多數的褐色化合物，所述的化合物在介質成分更特別氮源(Maillard化合物)的預發酵滅菌期間形成的，和3、增加靶蛋白穩定性的因素，常規的精制加工不足以適于從生物總量中分離的酶濃縮物中除去變性蛋白和著色化合物，或者與變性蛋白和著色化合物一起除去大部分的穩定因素。在任一情況，結果是不合格產品質量或者酶濃縮物顏色暗、有條紋和/或包含懸浮物直至包括沉淀物質，或者顏色輕形成透明溶液，但是酶穩定性不能令人滿意，一般說來酶穩定性只通過添加(昂貴的)穩定化合物在一定程度上加以改進。這些缺點最主要的是影響包含所討論的濃縮物的產品。
例如，液體洗滌劑和洗滌用組合物在整個貯藏期應該包含高比例的活性的即穩定的酶。然而，含水量和穩定性彼此成反比。同時，所討論的組合物應該具有吸引消費者的顏色和透明的外觀。
用于使濃縮酶溶液脫色的方法描述在現有技術中。它們包括沉淀過程，例如使用有機溶劑或者聚合物，但是更特別用硫酸鈉鹽析該靶蛋白(描述在H.Ruttloff(1994)“Industrielle Enzyme”，Behr’s Verlag，Hamburg，Chapter 6.3.3.6，376～379頁)。例如，US5405767公開了某些化合物，所述的化合物據說是被加到蛋白質溶液中進行沉淀以得到有利的沉淀物。沉淀蛋白質，異物殘余在上層清液中。然而，部分蛋白質不可逆地變性，總的說來由于沉淀和再懸浮損害了穩定性，相當重要的原因是除去了穩定化合物。提到大約50％的數值作為產率，如在引用教科書的378頁的表中得到的。
另外的方案是吸附純化酶，例如使用離子交換樹脂(H.Ruttloff(1994)“Industrielle Enzyme”，Behr’s Verlag，Hamburg，Chapters 6.3.3.7and 6.3.3.8，379～396頁)。在該方法中，靶蛋白與色譜法物料結合起來，然后用另外的介質使其流出。然而，由于變質和褶層影響得到的產率通常也很差。因此，在378頁表中對于不同的色譜法提到的產率最多為60％(不同之處在于親合色譜法)。特定的色譜法材料更特別親合色譜法材料通常更有效，但是很敏感而且制造昂貴。因此，親合色譜法材料主要用于分析和醫療領域，但是幾乎從不用于工業規模生產酶。
例如，專利申請WO89/05863A1描述從桿菌菌株的發酵液體培養基中回收細胞外酶。該文獻描述通過離子交換色譜法除去細胞壁聚合物的試驗，更特別在淀粉酶的制備中。含酶和聚合物的溶液首先施加到該柱中，然后用緩沖液清洗，隨后用洗脫介質流出。換句話說，要精制的α-淀粉酶起始以與異物同樣的方式與色譜法物料結合，之后隨離子強度增加僅向下洗滌。
相對的方法即有選擇地從液體溶液經由載體除去雜質，迄今為止僅選擇用于食品品質原料。因此，US5972121公開了經由弱酸性的或者弱堿的吸附色譜法從糖液中除去染料。尤其是經由連續的不同的離子交換色譜法步驟糖的脫色描述在指南“DIAION.Manual of ionexchange resins and synthetic adsorbent，Vol.II”，Mitsubishi Kasei Corp.(Tokyo，Japan)，2nd printing，1.5.1993，pages 93 to 100中。相對的方法基本上包括幾個每一個具有極其選擇性的純化步驟，其中特定的可除去的雜質留存在相應的物料上。
US5565348涉及回收某一堿性的桿菌朊酶，包含一個實施例，描述了通過由幾個步驟組成的純化過程的那些酶的純化。這些特別包括，進行離子交換色譜法之前，通過鹽析沉淀蛋白質、吸收另外的介質及滲析的步驟。這緊跟在親合色譜法即色譜法步驟之后，其中朊酶特定結合到該柱填充材料上。關于離子交換色譜法步驟，所討論的文獻指出描述的特別的朊酶沒有與使用的特別的色譜法物料結合，因此穿透。然而，這似乎沒有通用的可應用的純化酶的教導，因為沒有指定特定的柱填充材料，沒有提到酶的濃縮，在前述沉淀步驟中實際除去雜質，或者通過隨后的親合色譜法進行保證。因此，經由它本身沒有被結合的柱填充材料提純酶更特別朊酶，在現有技術中至今被認為最主要的是必須有沉淀步驟。
因此，本發明要解決的問題是從固體中釋放酶濃縮物，更特別不可逆的變性蛋白，以使該濃縮物脫色，因此有選擇地它們在貯藏中仍然保持極其穩定。
通過精制濃縮酶溶液的方法解決該問題，所述的方法包括以下步驟(a)制備濃縮酶溶液，(b)清除固相，更特別外源蛋白和/或非活性的酶，和(c)強堿性的陰離子交換色譜法。
沒有發生沉淀。相反，整個全部過程中目標酶蛋白質殘留在溶液中，為此目的特定的濃度范圍對于要得到的產率是特別有利的，如在以下實施例中的說明。
方法步驟(a)放在其本身已知的在現有技術中描述的方法之后，用于制備基本上沒有生物總量的富含酶水溶液。一般說來，這包括幾個構成步驟比如胞腔斷裂、細胞碎片的顆粒化、傾析和任選進一步離心法步驟。可以使用分離、微濾、超濾作用或者無菌過濾(見下文)和濃縮即除去溶劑得到中等濃度范圍的酶。至于其他的過程(見下文)，如描述的最優工作濃度的約一半范圍的酶濃度值認為是最佳的。同樣有利的是小于1vol％的目標懸浮粒子或者固形物量，其例如通過在臺式離心機上在7,000G下離心10分鐘進行證實。另外，應該調節具體的溶液到酶可容忍的pH，在所述的pH下溶液具有正電荷。
在圖1中步驟(a)稱為“濃縮”同樣基于本領域普通技術人員本身已知的方法。例如旋轉蒸發器或者薄層蒸發器可以用于濃縮。在特別有利的實施方式中，pH處于基本上恒定的預先調節的值，同時酶濃縮物的固形物量保持盡可能低(見下文)。另外，在以下步驟(b)中的損失經受相當大的不希望有的增加。
應該以已知的方式(特別是通過在正確時間停止濃縮過程)控制步驟(a)，以這樣的方式得到的酶濃縮物仍然剛好顯示沒有(定量的)蛋白質沉淀。對于每一種酶必須單獨確定最優工作范圍，不僅涉及溫度、pH和離子強度，而且特別涉及最佳的酶濃度范圍。本發明申請實施例1和2對于來自遲緩芽胞桿菌的堿性朊酶和來自桿菌種A7-7(DSM12368)α-淀粉酶試驗了上述的條件。因此，對于堿性的朊酶最佳的濃度范圍確定為700,000～800,000HPU/g，對于α-淀粉酶為35,000～45,000TAU/g。超出這些值，固體沉淀的百分比取決于活性不久增加超過正常比例，其伴隨有用產品損失顯著地增加。通過實施例在圖2中說明對于提到的酶的這些影響。固形物量對于蛋白質濃縮的依賴性，特別對于酶活性濃縮的依賴性，對于實際上所有的工業酶是可以預期的。在因此通過濃縮、任選本身已知的稀釋方法改性的每一個單一情況和方法中必須試驗確定。
也如實施例中所示，在整個過程中優選保持該操作范圍，一方面為了使該方法在高濃度下操作，由此高效率進行，另一方面由于變質和沉淀引起的損失盡可能少的酶。以這種方法，對于該方法總體上得到最多95％的產率。
如在下文中討論，在圖1中說明任選步驟(a)之后進行除臭(a’)。
在步驟(b)中除去濃縮步驟形成的沉淀(固體)特別施加到外源蛋白和/或非活性的酶，特別在溶度積附近。該步驟在圖1的方框流程圖中稱為“分離”，同樣以已知的方式進行，例如經由分離器(見下文)，也如公開在本發明申請的實施例中的方式。
含目標酶的上層清液應該基本上沒有(見下文)懸浮粒子即固體，所述的固體如上所述可通過臺式離心機確定。這是因為固體蛋白質沉淀不能通過稀釋而二次溶解而沒有相當大的損失(參見上面)及沒有濃度的大幅度減少。另外，如同其他固體，由于阻塞柱它們損害以下的色層分離法步驟。
步驟(c)即經由強堿性的陰離子交換劑(吸附劑)步驟(b)的基本上沒有固體上層清液的脫色，代表本發明的核心。在該步驟中，最主要的是著色雜質，更特別Maillard化合物被吸附在樹脂上，同時帶有正電荷的蛋白質在相應地選擇的條件下，由于交換劑強的正電荷而不與樹脂結合，但是得到基本上透明溶液的洗脫物。因此，步驟(c)代表染料與濃縮酶溶液的選擇性分離。
該方法比現有技術中描述的方法的優點是所討論的有用物質即酶類蛋白質留在溶液中，即不必所其變性及恢復原狀，由此它們的三維結構沒有被改性。因此，它們同樣留在要進一步加工的相中，不從該體系中排出，因此可實現如上所述的高產率。
如通過對應粗線箭頭圖1中表明，與樹脂結合的主要的有色物在分離步驟中隨后洗出，即有用的物料相(有用的產品)和任選尾料排放后。例如用高離子強度溶液例如濃縮NaCl溶液進行。陰離子交換劑物料可經由對應平衡離子例如NaOH進行再生。取決于色層分離法物料其他簡單鹽可能更適當。用這樣的同樣便宜的化合物處理該物料的這一事實導致除凈化效果以外的滅菌效果。因此該體系適于定置洗凈(CIP)。
在工藝步驟(c)之后，液態的酶基本上沒有令人討厭的條痕、沉淀和著色。甚至在不同溫度的延期儲存時它保持淡的、清澈明亮，同時具有高水平的穩定性。根據國際上可接受的CIE色標(在DIN5033-3和DIN6174中定義)獲得的色值例子描述在本發明申請實施例的試驗中。
工藝步驟(c)任選隨后有步驟(d)，以下詳細地描述，其中高度濃縮的色層分離法產品與溶劑混合。這同樣在圖1中說明(“混合”)。
步驟(c)或者(d)之后得到的提純濃縮酶溶液顯然特別對于著色雜質耗盡，但是仍然包含基本上無色的雜質，由于它們的部分穩定效應是極其受歡迎的，不必也不想從濃縮酶溶液中除去。另外可以進行中間步驟，取決于分離問題它們可以預先、插入、加入進行或者與提到的步驟一起進行。以下描述三個這樣任選的中間步驟的例子。
另外的可能性例如是有選擇地從濃縮酶溶液中通過一種或多種另外色層分離法步驟、更特別使用其他充分地描述于現有技術(參見上面)的載體除去其他雜質。這可以在該方法的任何階段進行，看來似乎在每一個單獨的情況下是適當的，在(c)中描述的色層分離法步驟之前或之后立即進行是有利的，任選通過這樣的中間步驟如過濾或者再增溶作用彼此分離。
根據本發明改變溶劑可在該方法的不同的階段進行，優選步驟(d)以前或者代替步驟(d)，例如公開在德國專利申請DE19953870A1中。該申請描述了一種生產基本上沒有水的含有機溶劑的酶制劑的方法，其中含水的酶制劑與沸點大于100℃的有機溶劑混合，隨后蒸餾掉水。
通過本發明的方法得到的液態的酶可以使用或者用已知的方式進一步加工。特別重要是作為結合在洗滌劑和洗滌用組合物中的原料，更特別以液態形式。根據本發明這樣的產品透明的顏色和足夠令人滿意的穩定性之間所需的平衡在實施例3中進行了說明，其結果同樣顯示于圖3中。能夠看出以這種方法提純的產品比未凈化的酶僅稍微不穩定，但是基本上無色，而且另一方面，它仍然比已經傳統脫色即通過沉淀處理的商品具有非常好的穩定性。
在下文中描述本發明的優選實施方式及其他主題。
如上所述，通過描述在現有技術中本身已知的方法除去生物總量富集的含水酶濃縮物被引入工藝步驟(a)。為該目的通常需要幾個構成步驟。根據本發明優選的方法特征在于作為上一步驟進行超濾作用，之后立即進行工藝步驟(a)，因此根據本發明超濾濃縮物被引入步驟(a)。例如在WO01/37628A2中描述了一個這樣的方法。以這種方法得到了已經濃縮到中等濃度值(參看實施例1)的相對純低固體酶溶液。
如已經提到，本身已知的方法例如使用旋轉蒸發器或者薄層蒸發器，優選薄層蒸發器用于濃縮步驟(a)。
在另外的優選實施方式中，步驟(a)經由要調節的特別的參數進行，更特別濃縮過程或者任選稀釋的持續時間，以這樣的方式得到的酶濃縮物含至多4wt％～20wt％，優選至多4.5wt％～15wt，更特別至多5wt～10wt％的干物質。
與上面描述的不合要求的固體雜質相反，干物質是在固態物質濃縮酶溶液中的總內容物，例如通過完全地蒸發該溶液得到。通過本身已知的方法例如通過干燥等分試樣或者通過吸收測量和與校準曲線對比確定這些值。提到的該值被證明是對于進一步加工特別適當的值，因為一方面該溶液應該高度濃縮以免損失，另一方面因為過度地高粘度導致恒定輸送量困難。
在另外的優選實施方式中，根據本發明的方法特征在于，在步驟(a)以后，在步驟(a’)中使濃縮酶溶液除臭。能夠整合到連續過程中的對應除臭方法在現有技術中是已知的。當用于制備該酶類蛋白質的微生物是形成惡臭嗅覺雜質的微生物，或者是非常迅速減少其他成分的分泌蛋白質時，它們是特別優選的。
工藝步驟(b)-分離固體-緊隨(a)或者除臭步驟(a’)，同樣基于本身已知的方法例如過濾。然而，機械分離方法優選基于重力或者離心分離是優選的。
這樣的方法最主要的是使用分離器，優選連續分離器，其可聯合到連續過程中。包括周期性排放沉積的分離過程是特別優選的。這樣的方法同樣公開在本發明申請的例子中。
步驟(b)的目的是減少酶濃縮物中懸浮物質或者固體含量到盡可能低的值。優選的方法特征在于通過步驟(b)在濃縮酶溶液中得到至多1vol％、優選至多0.7vol％、更特別至多0.5vol％的固體。通過已知的方式調節使用的特定設備來進行調節。上述提到的分離器特別提供對應有利的溶液。
根據本發明方法的核心是步驟(c)即強堿性的陰離子交換色層分離法。因此該方法成功的關鍵取決于選擇的色層分離法物料的類型和試驗步驟例如取樣。如已經提到，最主要的是著色雜質應吸附在物料上，同時在對應選擇的條件下該帶正電的蛋白質正好不完全與該樹脂結合。因此，本發明基于強堿性的陰離子交換劑。鑒于大多數的天然水可溶的、更特別分泌性蛋白質在中間pH值更可溶于水這一事實，特別的優點是對于步驟(c)的強堿性的陰離子交換劑在pH為5～9優選6～8下具有最大交換容量。
堿性蛋白質特別是例如嗜堿微生物更特別蛋白酶具有堿性范圍的等電點，因此在該優選的pH范圍帶正電，因此不與特別的物料結合。如已經提到，該方法理想的pH毫無疑問對于每一個蛋白質要試驗確定，對于所述的步驟(c)要進行調節。在實施例1和2中，對于選擇的堿性朊酶和選擇的α-淀粉酶這些值大約為7.5和7。
強堿性的陰離子交換劑含季銨基團作為官能團，優選基團由至少兩個烷基取代的那些，更優選由至少兩個C1或者C2烷基取代的那些，任選由C1或者C2羥烷基取代的那些，鑒于它們的化學性質被證明是特別適于步驟(C)。
通過使用含官能團三甲基銨或者二甲基乙醇銨的強堿性的陰離子交換劑滿足該要求。后者比前者更略顯弱堿性，因此對應蛋白質可特別是通過該變化實現最佳化。
因此，對應色層分離法材料表征優選實施方式。
色層分離法材料另外的特征是它們的交換容量，表示為每單位體積mol當量。它表明該官能團占據該物料的密集程度。特別適當的方法特征在于步驟(c)的強堿性的陰離子交換劑的交換容量為0.7～1.2meq/mL，優選0.8～1.1meq/mL，0.9～1.0meq/mL。
影響層析柱分離效率的另外的標準是有效孔隙尺寸。以這樣的方式進行測量，保留值足夠而物質沒有被沖洗通過，更特別該蛋白質，非常穩固地保持乃至阻塞該物料。有效孔隙尺寸為0.45mm的色層分離法物料被證明是適于在該實施例研究的兩種球狀蛋白質，遲緩芽胞桿菌堿性的朊酶和來自桿菌種7-7(DSM 12368)的α-淀粉酶，它們的分子量分別為大約27kD和大約58kD。對于顯著較大的或者較小蛋白質，選擇的色層分離法材料應該具有對應較大的或者較小的有效孔徑大小。
因此，優選的方法特征在于強堿性的陰離子交換劑的有效孔徑大小為0.2～0.7毫米，優選0.3～0.6毫米，更優選0.4～0.5毫米。
原則上，用于本發明的強堿性的陰離子交換劑適當的載體是為該目的現有技術中描述的包括例如凝膠形式載體的材料。相反，基于多孔聚合物的強堿性的陰離子交換劑由于它們的工藝性能對于步驟(c)是優選的。基于苯乙烯/二乙烯苯共聚物的強堿性的陰離子交換劑被證明是特別有利的。
具有剛才討論特性的色層分離法材料在現有技術中進行了詳細地描述。來自DIAION系列的那些描述在例如在指南“DIAION，Manual of ion exchange resins and synthetic adsorbent，Vol.1”，MitsubishiKasei Corp.(Tokyo，Japan)，June 1995，pp.104 to 108及在“Product LineBrochure DIAION”1.6.2001，pp.4 to 6，其可從制造商或者SummitChemicals Europe GmbH，Düsseldorf，Germany處獲得。在那里描述的強堿性的陰離子交換劑包括系列DIAION SA，DIAION PA andDIAION HPA。一個代表性的例子即DIAIONPA 308L，成功用于本發明申請的實施例中。
用于該色層分離法步驟(c)化學類似的材料可通過上述對優選特性的實驗由本領域普通技術人員生產，或者可從其他工業廠商處得到，同樣表征優選實施方式。例如對于Dow Chemicals的DOW MSAMarathon和Rohm & Haas的Amberlite 900CL得到可比的結果。
該色層分離法步驟(c)在一定條件下有利地進行。這些特別包括特定的床體積，其為施加物質的體積與柱體積的比，特定的駐留時間，其有利地通過酶溶液表示。
被證明是特別有利的而且表征對應優選實施方式的是在床體積為1～10、優選1.5～7、更優選2～4下進行步驟(c)。這些床體積代表在實施例中試驗確定地最適條件，以使濾液清潔同時盡可能濃縮。
表征對應優選實施方式的在步驟(c)適當的平均駐留時間值為0.01～0.2g，優選0.025～0.1g，更優選0.04～0.06g，大多數優選每g載體材料每分鐘0.05g。
特別適當的方法特征在于它們很大程度上自動控制。特別便于合并的控制方式基于確定在臨界狀態下處理物料的電導率(可計量作為μS/cm)，并使用該結果調節該過程。在色層分離法階段以后，例如可以用于分離含有用物料(有用的產品)餾分和其他餾分。因此，在一個優選實施方式中，本發明方法的特征在于步驟(c)，更特別特征在于蒸餾時的最初餾出物和有用的產品和/或有用的產品和尾部餾分之間的分離，通過洗脫物的電導率進行控制。
為了增加產率，專利申請WO01/37628A2已經提出使用濾液用于另外的洗滌步驟。因此，本發明的方法同樣優選特征在于步驟(c)在循環離子交換色譜法的至少部分蒸餾時的最初餾出物和/或尾部餾分下進行。以這種方法，所討論的餾分另外富含接近峰結束仍然沒有被從柱中洗滌出來的酶分子。原則上該步驟受可能從柱內沖洗出的可能的雜質的限制。在每一個單獨的情況，在可獲得濃度和產品質量即純度之間達成平衡。
在就此描述的方法期間，效率利益上考慮使用高酶濃度。然而，對于它們的特別的工業應用濃縮酶溶液通常不需要這樣的高濃度。因此，本發明對應優選的方法特征在于，在步驟(c)以后，通過在步驟(d)中調節相對地低濃度。現有技術已知的混合器，更特別可聯合到連續系統中的類型，可用于該目的。
另一方面，儲藏時所有的液態酶都具有變性傾向，因此損失它們的活性。特別是對于水解其他酶分子的朊酶。因此，本發明優選的方法特征在于在步驟(c)以后加入穩定劑或者穩定劑混合物。現有技術中本身已知這樣的化合物包括例如通過調整水分活性針對生物物理學的溫度變化產生穩定效應的化合物，比如多羥基化合物，及使朊酶可逆去活化的化合物或者提供防氧化的化合物。
穩定劑或者穩定劑混合物作為稀釋劑(d)可任選同時、之前或者之后加入。在特別有利的實施方式中，步驟(d)用于加入穩定劑溶液和稀釋的溶液，或者發揮兩種影響的溶液。
加入的穩定劑優選選自含羥基的液態化合物，例如多羥基化合物比如甘油，在特別優選實施方式中，丙烷-1，2-二醇。所討論的液態化合物同樣可以是水和/或其他穩定化合物的混合物。
為了產生穩定效應，加入基于最終容積量為40～70vol％、優選45～65vol％、更優選50～60vol％的多羥基化合物穩定劑混合物被證明是特別有利的。
如果在這一點上稀釋導致非常弱的濃溶液，可在溶液通過混合器之前、步驟(c)和(d)之間任選插入濃縮步驟。原則上，現有技術中任何已知的方法優選上面描述的方法可以用于該目的。
由于稀釋的強烈影響，為得到對于預計的工業應用仍然足夠的高度濃縮液態的酶，在迄今已知的方法中同樣另外的意見支持使用高度濃縮酶溶液。
稀釋步驟同樣用來調整該方法的最終產品以達到干物質含量為2～15wt％、優選5～13wt％、更優選8～12wt％。可能同樣用來調整該方法最終產品的25℃粘度值為1～20mPas、優選1～15mPas、更優選1～10mPas，和/或泥沙含量小于1vol％、優選小于0.75vol％、更優選小于0.5vol％。這些值通常彼此關聯，被證明特別適于進一步貯藏和/或處理液態的酶。如上所述，在色層分離法階段以后或者加入穩定劑以前必須考慮調整。因此，滿足這些要求的本發明方法是優選的。
本發明說明書指一種酶，所述的酶濃溶液通過本發明方法進行提純。酶代表優選實施方式，因為一方面它們具有特別的工業重要性，另一方面可通過它們的比活性進行檢測，所述的比活性可特別被用于確定實施例1和2和圖2的最適工作范圍。盡管如此，該方法可以施加到任何提供適當溶劑體系的水可溶的蛋白質中，確定它們的色層分離法材料，形成適當的探測反應。例如這適用于縮氨酸，例如肽類激素、藥理學顯著的低聚肽，和抗體。抗體例如對于探測同樣是適當的。在本發明上下文中所有這些蛋白質意欲被理解為酶。
然而，在傳統意義上工業有用的酶是集中所考慮的，優選水解酶或者氧化還原酶、更優選朊酶、淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶、cutinase或者過氧化物酶。設計通過確定和形成適當的工藝操作條件(參見上面)特別是用于處理這樣的酶溶液的方法代表本發明對應的優選實施方式。
朊酶是主要關心的，更特別用于生產洗滌劑和洗滌用組合物，堿性的朊酶是優選的，因為它們具有特別的活性，可包含在堿性的制劑中。因此，對應優選的方法是特征在于使用適當的朊酶的那些。
在這樣的方法之中，由于提到的堿性朊酶的生物化學特性，特別是特征在于步驟(c)在pH值為5～9、優選6～8.5、更優選7～8下進行的那些是優選的。
在實施例1和3中同樣研究了一個這樣的朊酶，其中表明為實施本發明方法以使存在的固體含量最低，保持關鍵的活性值是必要的。因此，用于精制提到的該濃縮朊酶溶液對應優選的方法特征在于調節步驟(a)的產品到活性值為600,000～900,000、優選650,000～850,000、更優選700,00～800,000HPU/g。作為已知的現有技術，上述提到構成步驟的參數適于所述的調整，即濃縮或者任選稀釋。
根據上述實驗，為隨后的使用設計的最終產品有利地具有相對低的活性值，特別的其可通過用穩定溶液進行稀釋得到所述的活性值。基于朊酶，將最終產品調節到活性值為150,000～500,000、優選175,000～300,000、更優選200,000～260,000HPU/g的方法代表優選實施方式。
另外的工業重要的酶類型是α-淀粉酶。例如它們用于食品行業用于生產糖果，或者由于它們的淀粉水解活性，被加到洗滌劑和洗滌用組合物中。如同朊酶的情況一樣，堿性的α-淀粉酶是特別優選的。因此，對應優選的方法是設計成用于處理α-淀粉酶的那些，其特征在于它們優選用于或者通過在堿性的pH最適條件下處理的那些。
如在實施例2和3中所述的，本發明用于處理α-淀粉酶優選的方法特征在于將步驟(a)的產品調節到活性值為30,000～50,000TAU/g，優選35,000～45,000TAU/g。
因為α-淀粉酶通常同樣以對應的低濃度使用，另外，應該同樣被穩定，本發明方法其他優選實施方式的特征在于將最終產品調節到活性值為4,000～14,000，優選6,000～12,000，更優選8,000～10,000TAU/g。
另外特別重要的酶類型是纖維素酶，其例如用于洗滌劑行業和紡織品生產中用于紡織品表面處理。因此，特征在于纖維素酶、優選具有堿性的pH最適條件的方法代表對應本發明的優選實施方式。
迄今提到所有的工藝參數反映在特定的工藝產品中，例如酶的類型、純度水平、分離的化合物的性質、活性或者得到的穩定性值。因此，通過這些本發明方法得到的產品同樣是優選的。因此，除該方法以外，本發明同樣涉及通過上述描述方法得到的濃縮酶溶液。
本發明同樣涉及含根據本發明得到的濃縮酶溶液形式的中間體產品酶的組合物。例如，根據本發明得到的濃縮酶溶液不必以液態形式使用，但是作為替代可以轉變為干燥的高純形式。這例如可通過冷凍干燥或者通過結合在固體顆粒中實現。對應的方法詳細地描述在現有技術中。以這種形式，它們可長時間存儲，或者包含在其他固體組合物中，例如在固體洗滌劑和洗滌用組合物中。
因此，本發明實施方式同樣包括所有不同的可能類型的洗滌用組合物-不用稀釋就可使用的濃縮物和組合物用于工業規模的洗滌設備或者用于手洗滌或者清潔中。這些包括例如用于織物、地毯或者天然纖維的洗滌劑，對于此本發明說明書使用術語“洗滌劑”；用于餐具洗滌設備的餐具洗滌劑或者人工餐具洗滌劑或者用于硬表面比如金屬、玻璃、瓷器、陶瓷、瓷磚、石頭、涂抹表面、塑料、木頭或者皮革的清潔劑，用于哪些本發明說明書使用術語“清潔組合物”。任何類型的洗滌劑或清潔組合物代表本發明的實施方式，條件是它富含通過本發明方法已經提純的酶，并根據所述的本發明特定方面進行進一步加工。
根據本發明，本發明實施方式包括所有熟知的和/或適當的供應形成的洗滌劑或清潔組合物。這些包括特別是固體粉末形式組合物，任選具有幾個濃縮或者未濃縮的相；擠出物；顆粒；片劑或者小袋，包裝在大容器中或者以份額包裝。同樣包括液態的、漿糊形式或者凝膠形式的實施方式，條件是根據本發明處理的酶以進一步加工的形式引入用于這樣的實施方式。
在優選實施方式中，本發明洗滌劑或清潔組合物包含活性酶的量為2μg～20mg、優選5μg～17.5mg、更優選20μg～15mg、大多數的優選50μg～10mg/每克組合物。
除根據本發明制備的酶以外，根據本發明可能的其他酶、洗滌劑或清潔組合物任選包含其他成分，比如酶穩定劑；表面活性劑例如非離子的、陰離子的和/或兩性表面活性劑；漂白試劑；漂白活化劑；漂白催化劑；增效劑；溶劑；增稠劑和-任選作為另外典型的成分-多價螯合劑、電離質、熒光增白劑、再沉積抑止劑、染料遷移抑止劑、泡沫抑止劑、著色和/或香料、殺菌劑和/或紫外線吸收劑，僅提及最重要類別的成分。對應制劑詳細地描述在現有技術中。
相反，由于根據本發明得到的液態酶有利的特性，特別是由于它們透明的外觀和它們不需另外的操作就可使用，包含適當濃縮酶溶液的組合物是優選的。總的來說以液態、漿糊或者凝膠形式存在的組合物是特別重要的。它們容易劑量，包含所需活性的酶，外表美觀，至少只要酶組份是所關心的。如所希望在開始就進行了強調。
這特別適用于設計用于最終用戶的洗滌劑和洗滌用組合物。因此，在一個特別優選的形式中，該實施方式的組合物是洗滌劑或者洗滌用組合物。這些歸入上述定義中，可能包含在那里提到的物質。另外，在該實施方式中，總的來說組合物為液態、凝膠狀或者漿糊狀的稠度，其中根據本發明的精制產品可容易地通過本身已知的方法被包含。
實施例實施例1精制濃縮朊酶溶液分離生物總量在通過如描述于91/02792A1中的發酵方法生產有用的物料朊酶之后，通過已知的分離、微濾和無菌過濾方法可幾乎完全分離生物總量。如WO01/37628A2描述，其隨后為濃縮，即通過超濾除去溶劑直到朊酶濃縮物的活性為300,000～400,000HPU/g，所述的活性通過如在van Raay，Saran和Verbeek題目為“Zur Bestimmung derproteolytischen Aktivitt in Enzymkonzentraten und enzymhaltigenWasch-，Spül-und Reinigungsmitteln[Determining Proteolytic Activity inEnzyme Concentrates and Enzyme-containing Laundry Detergents，Dishwashing Detergents and Cleaners]”in Tenside(1970)，Vol.7，pp.125-132的論文中描述的方法確定。另外，用30％氯化鈣溶液調節pH為7.5。溶液固形物量小于1vol％，如通過離心法用桌面或者實驗室離心機在7,000G測量10分鐘確定。另外，得到的朊酶顯示正電荷，離子強度為20mS/厘米。
確定最優工作范圍在分離生物總量之后得到的溶液樣品在超濾步驟(值直至400,000HPU)期間采取，或者如如下所述通過分離器進行進一步濃縮，及如上所述根據特別的活性確定固形物量。在pH為7.5、在溫度為20℃和離子強度為10mS/cm下進行活性測量。在表1和圖2中說明了活性朊酶的濃度與固形物量的依從關系。
表1固形物量與活性朊酶濃度的依從關系
如從表1可見，濃縮朊酶溶液的固形物量增加超過正常比例，超過大約900,000HPU/g，因此大約為700,000～800,000HPU/g的范圍認為是最優工作范圍，具有最大的活性和最小固形物量。
步驟(a)將酶溶液濃縮到工作范圍基于該結果，在前述步驟通過超濾最后得到的酶溶液在薄層蒸發器中在以下條件下被濃縮到值為800,000HPU/g產品溫度大于35℃、真空大約20毫巴、基本上恒定的pH為7.5、酶濃縮物的固形物量保持小于3vol％，因此在下面步驟中損失仍然是最小的。
步驟(b)分離形成的該(固體)沉淀基于重力或者離心分離的原理通過機械分離進行由濃縮形成的固體(沉淀)的分離。使用具有周期性排放沉淀物的分離器分離該固體(ALFA LAVAL BTPX 205，∑值為11,700m2，在G值為12,800和生產量為200l/h下進行操作)。因此得到很大程度上沒有固體的酶濃縮物(固形物量小于0.2vol％，如上所述進行確定)。活性仍然大約為800,000HPU/g。
步驟(c)強堿性的陰離子交換色譜法。
使用強堿性的陰離子交換劑DIAIONPa308L類型在固定床中進行色譜的脫色，所述的陰離子交換劑從Mitsubishi，Tokyo，Japan得到，或者從Mitsubishi Chemical Europe GmbH，Düsseldorf，Germany可獲得。通過床體積比例(BV-酶濃縮物與樹脂的體積比)和駐留時間控制脫色質量由此酶的穩定性。調整到2～5BV的比例、每公斤樹脂每分鐘0.05公斤酶的劑量。基于的原理是通過載體材料排斥酶并夾帶進入液流中，同時染料與固定載體結合起來。為了增加產率，部分尾部餾分也通過該柱。吸附在柱上的化合物、更特別染料，然后通過用NaCl和NaOH溶液沖洗洗滌出來，以這種方法再生固定床。
步驟(d)混合、穩定和用溶劑調整活性活性值大約為700,000HPU/g的濾液在靜止混合器中直接在線與同時具有穩定效應的丙烷-1，2-二醇混合。取出大約55vol％的溶劑。
通過這些四個步驟提純的液態的酶具有以下特性(活性按如上定義進行確定，顏色使用國際上采用的在DIN 5033-3和DIN 6174中定義的CIE色標進行確定)活性260,000HPU/g顏色L值＞96B*值＜14粘度＜10mPasPH值大約7得到液體基本上是透明的，在方法之后沒有立即顯示任何沉淀。另外的穩定性描述在實施例3中。
實施例2精制濃縮淀粉酶溶液如在實施例1中制備根據本發明提純的淀粉酶溶液，不同之處在于以下差異。使用含描述在申請WO02/01036A2中有用物料α-淀粉酶的發酵罐批次。因為α-淀粉酶具有與朊酶不同的等電點，步驟(a)之前調節pH為6.25，在整個過程中保持pH為6～6.5以使淀粉酶保持為正電荷。
確定活性使用改性的對硝基苯基麥芽七糖苷(maltoheptaoside)確定以TAU表示的淀粉分解活性，麥芽七糖苷的端基葡萄糖單元通過芐叉二氯基團封端；通過淀粉酶進入自由的對硝基苯基寡糖而使對硝基苯基麥芽七糖苷分裂，其隨后在輔酶葡糖淀粉酶和α-葡(萄)糖苷酶作用下轉化為葡萄糖和對硝基苯酚。釋放的對硝基苯酚的量因此與淀粉酶活性成比例。測量可以例如用Abbott Quick-Start試驗箱(廠商Abbott，AbbottPark，Illinois，USA)進行。通過光度計相對空白試驗值在37℃在3分鐘內檢測試驗混合物的吸收(405納米)增加。基于已知活性標準酶進行校準(例如Genencor，Palo Alto，CA，USA的MaxamylPurastar2900，活性2,900TAU/g)。通過繪制相對標準酶濃度的吸收DE(405納米)/每分鐘的差別進行評價。
確定最優工作范圍如在實施例1中，在超濾步驟期間取出不同濃度的樣品，隨后分離，也根據特別的活性確定固形物量。在pH為6.25、在溫度為20℃和離子強度為10mS/cm下進行測量。結果顯示于表2和圖2中。
表2固形物量與活性α-淀粉酶濃度的依從關系
如從表2可見，在固形物量與活性酶濃度的依從關系曲線中淀粉酶與朊酶可比(參見上面)；這以100TAU/g表示在圖2中。因此，濃縮淀粉酶溶液的固形物量增加超過正常比例，超過大約50,000HPU/g，因此大約為35,000～45,000HPU/g的范圍認為是最優工作范圍，具有最大的活性和最小固形物量。因此，本發明工作范圍應該低于所述的范圍。
因此，如在實施例1中通過步驟(a)調節活性值為35,000～45,000TAU/g，如在實施例1中即使用相同的陰離子交換色層分離法物料進行另外的步驟。在步驟(d)中，通過與丙烷-1，2-二醇混合類似地調節濃度值為9,000TAU/g。
通過這些步驟提純的液體酶具有以下特性活性9,000TAU/gpH大約6.25得到液體基本上是透明的，在過程之后如同實施例1的朊酶沒有立即顯示任何沉淀。
實施例3朊酶在液體洗滌劑基質中的儲藏穩定性為確定本發明提純的朊酶儲藏穩定性，與未經純化的酶和商品在相同的液體洗滌劑基質中相比，制備以下三個樣品(1.)在實施例1中超濾之后步驟(a)之前，存在非精制的朊酶，(2.)從Novozymes，Bagsvaerd，Denmark可獲得的充分精制的商品Savinase16.0LEX和(3.)根據實施例1的提純的朊酶。所有的三個樣品以活性260,000HPU/g置于55vol％丙烷-1，2-二醇的水溶液中，以0.4vol％的量包含在典型成分的液體洗滌劑基質中。
被引入該基質中的朊酶樣品的L值在CIE色標上為(1.)78、(2.)99和(3.)97。換句話說，本發明提純的朊酶幾乎如充分精制產品一樣透明。在12周時間內定期取出樣品，如上所述地確定殘余活性。得到所述列于表3中的值，并顯示為圖3中的圖表。
表3液體洗滌劑基質中朊酶的儲藏穩定性(表示為HPU％的殘余活性)
能夠看出根據本發明提純的朊酶，不管實際上相同的色值，比充分精制產品更加穩定，而且根據本發明提純的朊酶與深色的未經純化的酶相比較，在洗滌劑基質中僅僅損失一點兒活性。


圖1根據本發明的提純濃縮酶溶液的方框流程圖以下步驟顯示是(a)濃縮該酶溶液到工作范圍為止，排干上層清液溶液；(a’任選的除臭；(b)分離形成的該(固體)沉淀；(c)強堿性的陰離子交換色層分離法，將化合物吸附在柱上，更特別染料上，通過用適當的介質在分離步驟沖洗而洗滌出來，之后再生柱；和(d)穩定和通過添加溶劑調整活性。
圖2如在實施例1和2中確定的固形物量與活性酶濃度的依從關系用實驗室離心機在7,000G下測定10分鐘確定固形物量，表示為vol％。朊酶活性表示為1,000HPU/g，α-淀粉酶活性表示為100TAU/g。強調了用于本發明目的的認為是最佳的工作范圍。
圖3如在實施例3中確定的液體洗滌劑中朊酶的儲藏穩定性確定1、非精制的朊酶；2、Savinase 16.0 LEX(Novozymes的產品)和3、根據實施例1的提純的朊酶。
權利要求
1.一種用于精制濃縮酶溶液的方法，特征在于以下步驟(a)制備濃縮酶溶液，(b)分離固體，更特別分離外源蛋白和/或非活性酶，和(c)強堿性的陰離子交換色層分離法。
2.如權利要求1的方法，特征在于在步驟(a)中引入超濾濃縮物。
3.如權利要求1或者2的方法，特征在于使用薄層蒸發器進行步驟(a)。
4.在權利要求1～3任一項的方法中，特征在于在步驟(a)中制備含至多4～20wt％、優選至多4.5～15wt％、更優選至多5～10wt％干物質的酶濃縮物。
5.在權利要求1～4任一項的方法中，特征在于在步驟(a)以后，在步驟(a’)中使濃縮酶溶液除臭。
6.如權利要求1～5任一項的方法，特征在于通過機械分離方法、優選基于重力或者離心分離進行步驟(b)。
7.如權利要求6的方法，特征在于在分離器、優選連續分離器、更特別具有周期性排出樣品的分離器進行步驟(b)。
8.如權利要求1～7任一項的方法，特征在于通過步驟(b)在濃縮酶溶液中得到至多1vol％、優選至多0.7vol％、更優選至多0.5vol％的固體。
9.如權利要求1～8任一項的方法，特征在于用于步驟(c)的強堿性陰離子交換劑在pH為5～9、優選6～8下顯示出最大的交換容量。
10.如權利要求1～9任一項的方法，特征在于用于步驟(c)的強堿性陰離子交換劑含季銨基團作為官能團，優選基團由至少兩個烷基取代的那些，更優選由至少兩個C1或者C2烷基取代的那些，任選由C1或者C2羥烷基取代的那些。
11.如權利要求10的方法，特征在于用于步驟(c)的強堿性陰離子交換劑包含三甲基銨或者二甲基乙醇銨基團作為官能團。
12.如權利要求1～11任一項的方法，特征在于步驟(c)的強堿性陰離子交換劑的交換容量為0.7～1.2meq/mL，優選為0.8～1.1meq/mL，及更優選0.9～1.0meq/mL。
13.如權利要求1～12任一項的方法，特征在于強堿性陰離子交換劑的有效孔徑大小為0.2～0.7毫米，優選為0.3～0.6毫米，更優選為0.4～0.5毫米。
14.如在權利要求1～13任一項的方法中，特征在于用于步驟(c)的強堿性陰離子交換劑基于多孔聚合物，優選苯乙烯/二乙烯苯共聚物。
15.如權利要求1～14任一項的方法，特征在于步驟(c)在床體積為1～10、優選1.5～7、更優選2～4下進行。
16.如權利要求1～15任一項的方法，特征在于步驟(c)的平均駐留時間為0.01～0.2g，優選為0.025～0.1g，更優選為0.04～0.06g，大多數優選每g載體材料每分鐘0.05g酶。
17.如權利要求1～16任一項的方法，特征在于步驟(c)，更特別特征在于蒸餾時的最初餾出物和有用產品和/或有用產品和尾部餾分之間的分離，通過洗脫物的電導率進行控制。
18.如權利要求1～17任一項的方法，特征在于在步驟(c)中再循環至少部分離子交換色譜法蒸餾時的最初餾出物和/或尾部餾分。
19.如權利要求1～18任一項的方法，特征在于在步驟(c)以后，通過在步驟(d)中稀釋形成相對低的濃度值。
20.如權利要求1～19任一項的方法，特征在于在步驟(c)以后，在根據權利要求19稀釋期間、之前或之后任選加入穩定劑，優選與步驟(d)同時進行。
21.如權利要求20的方法，特征在于穩定劑是多羥基化合物，優選丙烷-1，2-二醇。
22.如權利要求21的方法，特征在于穩定劑加入量，基于最終容積為40～70vol％、優選45～65vol％、更優選為50～60vol％。
23.如權利要求19～23任一項的方法，特征在于稀釋步驟用來調整該方法的最終產品以達到干物質含量為2～15wt％、優選5～13wt％、更優選8～12wt％。
24.如權利要求19～18任一項的方法，特征在于將該方法的最終產品調節到25℃粘度為1～20mPas、優選1～15mPas、更優選1～10mPas。
25.如權利要求19～24任一項的方法，特征在于將該方法的最終產品調節到沉積物含量小于1vol％、優選小于0.75vol％、更優選小于0.5vol％。
26.如權利要求1～25任一項的方法，特征在于酶是工業可用的酶，優選水解酶或者氧化還原酶，更優選為朊酶、淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶、cutinase或者過氧化物酶。
27.如權利要求26的方法，特征在于酶是朊酶，優選堿性的朊酶。
28.如權利要求27的方法，特征在于，特別在步驟(c)中在pH為5～9、優選6～8.5、更優選7～8下進行。
29.如權利要求27或者28的方法，特征在于調節步驟(a)的產品到活性為600,000～900,000、優選650,000～850,000、更優選700,00～800,000HPU/g。
30.如權利要求22～24任一項的方法，特征在于調節最終產品到活性為150,000～500,000、優選175,000～300,000、更優選200,00～260,000HPU/g。
31.如權利要求26的方法，特征在于酶是α-淀粉酶，優選具有堿性的pH最適條件。
32.如權利要求26或者31的方法，特征在于將步驟(a)的產品調節到活性為30,000～50,000TAU/g，優選35,000～45,000TAU/g。
33.如權利要求31～32任一項的方法，特征在于調節最終產品到活性為4,000～14,000、優選6,000～12,000、更優選8,000～10,000TAU/g。
34.如權利要求26的方法，特征在于酶是纖維素酶，優選具有堿性的pH最適條件。
35.一種濃縮酶溶液，通過權利要求1～34任一項的方法得到。
36.一種含酶組合物，所述的酶作為中間產物以權利要求35的濃縮酶溶液的形式得到。
37.一種含權利要求34的酶溶液的組合物，優選整體為液體、漿糊或者凝膠形式。
38.如權利要求37的組合物，特征在于它是洗滌劑或者清潔組合物。
全文摘要
本發明涉及一種用于改進濃縮工業酶溶液的穩定性、純度和因此它們的外觀質量的方法。所述的方法包括以下步驟a)生產濃縮酶溶液，b)分離固體，特別是與外源蛋白和/或非活性酶的分離，和c)高堿性的陰離子交換色層分離。任選步驟(a′)除臭和(d)稀釋插入所述的方法中。本發明同樣涉及通過本發明方法已經提純的濃縮酶溶液，同樣涉及基于本發明溶液的試劑，特別是清潔劑和洗滌劑。
文檔編號C12N9/00GK1745093SQ200480003136
公開日2006年3月8日 申請日期2004年1月23日 優先權日2003年1月31日
發明者迪特爾·鮑爾, 維爾納·皮希勒, 維爾弗里德·雷澤, 延斯·萬霍爾特 申請人:漢高兩合股份公司