專利名稱：酒精產品生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及從粒狀淀粉制備酒精(alcohol)產品的工藝(process)，包括在低于膠質化溫度的升高的溫度預處理粒狀淀粉，然后同時進行糖化和發酵。
背景技術：
粒狀淀粉見于谷粒，谷物或植物塊莖中。粒狀淀粉是顯微顆粒的形式，其在室溫不溶于水。當加熱含水淀粉漿時，所述顆粒膨脹并最終破裂，漿淀粉分子分散入溶液。在該“膠質化”過程中，粘度明顯增加。由于固體水平在常規工業工藝中為30-40％，所述淀粉必須被稀釋(thinned)或“液化”使得其可在隨后的工藝步驟中得以處理。粘度的降低通常通過稱為液化(liquefaction)的工藝中的酶降解實現。在液化中，長鏈淀粉被α-淀粉酶降解成較小的葡萄糖單位(糊精)的分支以及線性鏈。
常規酶促液化工業可作為三步熱漿工藝實施。所述漿被加熱到80-85℃并加入熱穩定α-淀粉酶以啟動液化。隨后將所述漿在室溫蒸氣熱壓蒸煮(jet-cook)到105-125℃以完成所述漿的膠質化，冷卻到60-95℃，并通常將另外的α-淀粉酶加入以終止水解。所述液化工藝通常在pH 5-6進行。磨細的并液化的完整谷粒已知為醪液(mash)。
在糖化過程中，來自液化的糊精進一步水解以生成低分子量糖DP1-3，其可被酵母代謝。所述水解通常利用葡糖淀粉酶完成，可選或除外葡糖淀粉酶，可以使用α-葡糖苷酶和/或酸性α-淀粉酶。完整的糖化步驟通常持續達72小時，然而，通常僅僅進行例如50℃以上、40-90分鐘的預糖化，然后在發酵過程中，在已知為同時糖化與發酵(SSF)的工藝中進行完全糖化。
發酵可利用酵母例如來自糖酵母屬進行，所述酵母被加入醪液。當酒精產物是回收的乙醇例如燃料乙醇、飲用乙醇或工業乙醇時，在通常約32℃發酵通常35-60小時。當所述酒精產物是啤酒時，在通常約14℃發酵通常達8天。
發酵后，醪液可用作例如啤酒，或經蒸餾以回收乙醇。乙醇可用作例如燃料乙醇，飲用乙醇，和/或工業乙醇。
從上述討論明顯可見，常規酒精產物中的淀粉水解由于不同步驟的不同溫度需要而非常耗能。美國專利4,316,956提供了將粒狀淀粉轉化成乙醇的發酵工藝。歐洲專利EP0140410B2提供淀粉水解用酶組合物。本發明的目的是提供將粒狀淀粉轉化成酒精產物的改進的工藝。
發明概述本發明提供從粒狀淀粉制備酒精產物而無需預先膠質化所述淀粉的方法。第一方面中，本發明提供用于制備酒精產物的方法，包括以下步驟(a)將含有水和粒狀淀粉的漿液保持在低于所述淀粉初始膠質化溫度0℃-20℃的溫度5分鐘-12小時，和(b)將步驟(a)的漿液與酵母在10℃-35℃發酵20-250小時以生成乙醇，其中步驟(a)和(b)在存在酸性α-淀粉酶活性，麥芽糖生成酶活性和α-葡糖苷酶活性的條件下進行。步驟(a)和(b)以所述順序進行；然而，所述工藝包括本說明書中沒有說明的其它步驟，其可在步驟(a)和(b)之前、之間和之后進行。
盡管不限于任何操作理論之一，本發明具體步驟(a)據信導致植物細胞中所含淀粉顆粒的膨脹導致細胞壁破壞并釋放淀粉顆粒，從而導致所述淀粉顆粒更容易進一步發生水合并受到酶的作用。經步驟(a)的水合，酸性α-淀粉酶降解所述淀粉顆粒以產生糊精，其可被麥芽糖生成酶降解成麥芽糖，麥芽糖最終被α-葡糖苷酶降解成葡萄糖。該過程在步驟(b)中持續，其中所述葡萄糖被酵母持續發酵成乙醇，從而在整個發酵中將可發酵糖的濃度維持在相對低濃度。不限于任何一種操作理論，據信由于發酵過程中糖的低濃度，由于滲透調節對于甘油的需要有限，酵母的甘油生產減少。在此方面，本發明用于制備與常規工藝相比具有降低的甘油和/和甲醇含量的酒精產品。
本發明提供低耗能工藝以替代必須利用大量能量以膠質化所述淀粉漿的常規工藝。本發明的其它優勢包括但不限于，在整個工藝中采用低pH的能力，減少不需要的微生物生長的幾率，以及降低和消除對昂貴設備以膠質化所述淀粉的需要，所述設備諸如噴射裝置和鍋爐房(steam plant)設備。
本發明第二方面涉及酶組合物，其包含酸性α-淀粉酶活性，麥芽糖生成酶活性和α-葡糖苷酶活性，其中存在其它酶活性；所述酶活性選自支鏈淀粉酶，纖維素酶，木聚糖酶和肌醇六磷酸酶(phytase)組成的組。
本發明第三方面涉及第二方面的酶組合物在酒精產品工藝和淀粉水解工藝中的用途。
本發明第四方面涉及包含酸性α-淀粉酶活性，麥芽糖生成酶活性和α-葡糖苷酶活性的酶組合物在酒精產品工藝中的用途，包括粒狀淀粉的水解。
發明內容
術語″酒精產品″指包含乙醇，例如燃料乙醇，可飲用以及工業乙醇的產品。然而所述酒精產品也可為啤酒，其可為任何類型的啤酒。優選的啤酒類型包括愛兒啤酒(ales)，上面發酵的濃烈黑啤酒(stouts)，英國黑啤(porters)，陳貯啤酒(lagers)，苦味酒(bitter)，麥芽酒(mait liquor)，happoushu，高酒精啤酒，低酒精啤酒，低熱量啤酒和清淡啤酒。
術語″粒狀淀粉″的意思是生的未蒸煮的淀粉，即谷物，塊莖或谷粒中發現的天然形式的淀粉。淀粉在植物細胞中形成的不溶于水的微小顆粒。當加入冷水時，淀粉顆粒吸收少量液體并膨脹。在達50℃-75℃的溫度，所述膨脹是可逆的。然而，在更高溫度條件下，開始稱為膠質化(gelatinization)的可逆膨脹。
術語″初始膠質化溫度″指淀粉的膠質化開始的最低溫度。在水中加熱的淀粉在50℃-75℃開始膠質化；膠質化的確切溫度有賴于具體的淀粉，并可由本領域技術人員輕易測定。因此，初始膠質化溫度可根據植物品種，植物品種的具體變種，以及生長條件而變化。在本發明中，給定淀粉的初始膠質化溫度是利用Gorinstein.S.and Lii.C.，Starch/Starke，Vol.44(12)pp.461-466(1992)所述的方法，淀粉顆粒的雙折射損失5％的溫度。
多肽“同源性”的意思是兩條氨基酸序列之間的同一性程度。同源性可適宜通過本領域已知的計算機程序測定，諸如GCG程序包中的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal ofMolecular Biology，48，443-453)。多肽序列比較利用以下設定GAP生成罰分3.0，GAP延長罰分0.1。
酸性α-淀粉酶術語″酸性α-淀粉酶″的意思是以有效量加入的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，其在pH 3.0-7.0，優選3.5-6.0，或更優選4.0-5.0具有活性。
任何適宜的酸性α-淀粉酶可用于本發明。優選的酸性α-淀粉酶可源自真菌和細菌菌株。
優選的酸性真菌α-淀粉酶是Fungamyl-樣α-淀粉酶。在本文的公開中，術語″Fungamyl樣α-淀粉酶″表示這樣的α-淀粉酶，其與WO96/23874中的SEQ ID No.10和/或本文的SEQ ID NO5的氨基酸序列具有高度同源性，即超過50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％或甚至90％同源性。當用作麥芽糖生成酶時，真菌α-淀粉酶可以0.001-1.0AFAU/gDS，優選0.002-0.5AFAU/g DS，優選0.02-0.1AFAU/g DS的量加入。
優選所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，其與具有SEQ ID NO1所述氨基酸序列的酸性真菌α-淀粉酶具有至少70％，優選至少75％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，至少97％，至少98％，或至少99％同源性。最優選所述酸性α-淀粉酶是酸性真菌α-淀粉酶，其具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相比其中一或多個氨基酸殘基被缺失、取代和/或插入，其中所述變體具有α-淀粉酶活性。
優選用于本發明的酸性細菌α-淀粉酶可源自菌株地衣芽孢桿菌(B.lichenformis)，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，和嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)。還優選具有這樣的氨基酸序列的酸性α-淀粉酶，所述氨基酸序列與SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示序列具有至少50％同源性，優選至少60％，70％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，97％，98％，或至少99％，諸如100％同源性。優選用于本發明工藝的酸性α-淀粉酶是WO96/23874，WO97/41213和WO99/19467所述的酸性α-淀粉酶變體以及雜合體之一，諸如與SEQ ID NO2所示野生型氨基酸序列相比具有突變delta(181-182)+N193F(也表示為I181*+G182*+N193F)的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)變體。所述酸性細菌α-淀粉酶也可為雜合α-淀粉酶，其包含SEQ ID NO3所示地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的445C-末端氨基酸殘基以及SEQ ID NO4所示的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的37N-末端氨基酸殘基，其還可包含取代G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(利用WO 99/19467的SEQ ID NO5中的編號，在本文中顯示為SEQ ID NO3)。還優選解淀粉芽孢桿菌來源的α-淀粉酶變體，其與SEQ ID NO4所示序列具有至少50％同源性，諸如至少60％，至少70％，至少80％，或甚至90％同源性。具體是優選這樣的變體，其具有突變突變H154Y，A181T， N190F，A209V及Q264S中的一或多種突變和/或位置176與179之間的兩個殘基缺失，優選缺失E178和G179。
優選的商品化組合物包含酸性α-淀粉酶，包括來自DSM(Gist Brochades)的Mycolase，BANTM，TERMAMYLTMSC，FUNGAMYLTM，LIQUOZYMETMX和SAN SUPER，SANTMEXTRA L(Novozymes A/S)以及Clarase L-40,000，DEX-LOTM，Spezyme FRED，SPEZYMETMAA，和SPEZYMETMDELTA M(Genencor Int.)。
麥芽糖生成酶本發明的麥芽糖生成酶可為產麥芽糖α-淀粉酶，β-淀粉酶或真菌α-淀粉酶。
產麥芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麥芽糖水解酶)能將直鏈淀粉和支鏈淀粉水解成α-構型的麥芽糖。此外，產麥芽糖α-淀粉酶能水解麥芽三糖以及環糊精。具體涉及的產麥芽糖α-淀粉酶可源自芽孢桿菌屬，優選源自嗜熱脂肪芽孢桿菌，最優選源自嗜熱脂肪芽孢桿菌C599，諸如EP120.693中所述。該具體的產麥芽糖α-淀粉酶具有顯示為US6162628中SEQ ID NO1的氨基酸1-686的氨基酸序列。優選的產麥芽糖α-淀粉酶具有與US6162628中SEQID NO1的氨基酸1-686有至少70％，優選至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或具體至少99％同一性的氨基酸序列。產麥芽糖α-淀粉酶最優選的變體包含WO99/43794中公開的變體。
產麥芽糖α-淀粉酶可以以0.01-40.0MANU/g DS，優選0.02-10MANU/g DS，優選0.05-5.0MANU/g DS的量加入。
另一種用于本發明的麥芽糖生成酶可為β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)。β-淀粉酶是通常給予外-作用型(exo-acting)產麥芽糖淀粉酶的名稱，其催化淀粉、支鏈淀粉以及相關葡萄糖聚合物中1，4-α-葡糖苷鍵的水解。
β-淀粉酶已經從各種植物和微生物中分離(W. M.Fogarty and C.T.Kelly，Progress in Industrial Microbiology，vol.15，pp.112-115，1979)。這些β-淀粉酶的特征在于具有40℃-65℃的最適溫度范圍以及4.5-7.0的最適pH范圍。優選β-淀粉酶源自絲狀真菌，諸如源自微小根毛霉(Rhizomucorpusilis)β-淀粉酶。涉及的β-淀粉酶包括來自大麥SpezymeBBA1500，SpezymeDBA和OptimaltTMME，Genencor Int.的OptimaltTMBBA以及Novozymes A/S的Novozym WBA的β-淀粉酶。
用于本發明工藝中的另一種麥芽糖生成酶可以是真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，諸如fungamyl-樣α-淀粉酶。本發明的公開中，術語″fungamyl-樣α-淀粉酶″表示這樣的α-淀粉酶，其與WO96/23874中氨基酸序列SEQ ID No.10具有高同源性，即超過50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％或甚至90％同源性。當用作麥芽糖生成酶時，真菌α-淀粉酶可以以0.001-1.0AFAU/g DS，優選0.002-0.5AFAU/g DS，優選0.02-0.1AFAU/g DS的量加入。
α-葡糖苷酶用于本發明工藝中的α-葡糖苷酶或麥芽糖酶(EC 3.2.1.48)可源自微生物，諸如細菌或真菌，或源自植物。優選的真菌來源的α-葡糖苷酶諸如源自酵母和絲狀真菌的α-葡糖苷酶。優選的α-葡糖苷酶源自念珠菌屬(Candida)菌株諸如源自菌株C.edax，優選菌株CBS 6461。還優選源自畢赤酵母屬(Pichia sp.)菌株的α-葡糖苷酶，所述畢赤酵母屬的菌株諸如菌株P.amylophilia，P.missisippiensis，威克畢赤酵母(P.wicherhamii)和羅丹畢赤酵母(P.rhodanensis)。還涉及源自曲霉屬諸如構巢曲霉(A.nidulans)的α-葡糖苷酶(Kato et al.2002，Appl EnvironMicrobiol.681250-1256)的α-葡糖苷酶，源自囊軸霉屬(Rhizobium sp.)的α-葡糖苷酶(Berthelot etal.1999，ApplEnvironMicrobiol.652907-2911)或植物來源的的α-葡糖苷酶，諸如源自谷物，諸如小麥，裸麥(rye)，大麥玉米或稻。
優選的細菌α-葡糖苷酶包括源自芽孢桿菌屬諸如嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株的α-葡糖苷酶。優選的α-葡糖苷酶具有與本文SEQ ID NO6所示序列的成熟部分有至少50％同源性，優選至少60％，70％，80％，85％或至少90％，例如，至少95％，97％，98％，或至少99％，諸如100％同源性的氨基酸序列。涉及的可購得的α-葡糖苷酶是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-葡糖苷酶，其購自SIGMA(Sigma cat.No.G3651)。植物來源的α-葡糖苷酶可來自谷物，諸如來自小麥，裸麥，大麥玉米或稻。
α-葡糖苷酶也可以以0.1-10000麥芽糖酶單位/kg DS，1-1000麥芽糖酶單位/kg DS，或更優選10-100麥芽糖酶單位/kg DS，諸如和更優選1-10麥芽糖酶單位/kg DS的量加入。
其它酶根據本發明使用的木聚糖酶可源自任何適宜的生物體，包括真菌和細菌生物體，諸如曲霉屬，Disporotrichum，青霉屬(Penicillium)，脈孢霉屬(Neurospora)，鐮孢屬(Fusarium)和木霉屬(Trichoderma)。
木聚糖酶也可以1-50000FXU/kg DS，優選5-5000FXU/kg DS，或更優選10-500FXU/kg DS的量加入。
優選可購得的制劑包括木聚糖酶，包括SHEARZYME PLUS，BIOFEED WHEAT，CELLUCLAST，ULTRAFLO，VISCOZYME(來自Novozymes A/S)和SPEZYMECP(來自Genencor Int.)。
纖維素酶活性(E.C.3.2.1.4)可以是微生物來源的纖維素酶，諸如可衍生自絲狀真菌菌株(例如，曲霉屬，木霉屬，腐質霉屬(Humicola)，鐮孢屬)。纖維素酶可以以0.01-500000EGU/kg DS，優選0.1-10000EGU/kg DS，優選1-5000EGU/kg DS，更優選10-500EGU/kg DS，最優選100-250EGU/kgDS的量使用。
可使用的包括纖維素酶的商品化制劑包括SHEARZYME PLUS，CELLUCLAST，CELLUZYME，CEREFLO和ULTRAFLO(來自Novozymes A/S)，LAMINEXTM和SPEZYMECP(來自Genencor Int.)和ROHAMENT7069W(來自Rohm GmbH)。
用于該工藝的另一種酶可為脫支酶，諸如支鏈淀粉酶(E.C.3.2.1.41).脫支酶可以以本領域技術人員已知的有效量加入。
第一方面的第一個優選實施方案中，本發明提供制備乙醇的工藝，包括以下步驟(a)將含有水和粒狀淀粉的漿液保持在低于所述粒狀淀粉的初始膠質化溫度0℃-20℃的溫度5分鐘-12小時，(b)將步驟(a)的漿液與酵母一起在10℃-35℃發酵20-250小時以制備乙醇；其中步驟(a)和(b)在酸性α-淀粉酶活性，麥芽糖生成酶活性和α-葡糖苷酶活性存在的條件下進行。
步驟(a)和(b)按所述順序進行；然而，所述工藝包括本發明中未說明的步驟，其在步驟(a)和(b)以前，中間和之后進行。
第一方面的第一個優選實施方案中，步驟(b)中的溫度為28℃-36℃，優選29℃-35℃，更優選30℃-34℃，諸如約32℃，并保持所述漿液與α-淀粉酶，葡糖淀粉酶和酵母接觸足夠的時間，以允許步驟(b)中所述淀粉的水解以及釋放的糖的發酵，優選25-190小時，優選30-180小時，更優選40-170小時，甚至更優選50-160小時，更優選60-150小時，甚至更優選70-140小時，最優選80-130小時，諸如85-110小時。
第一方面的第二個優選實施方案中，本發明提供制備啤酒的工藝，包括以下步驟(a)將含有水和粒狀淀粉的漿液保持在低于所述粒狀淀粉的初始膠質化溫度0℃-20℃的溫度5分鐘-12小時，(b)將步驟(a)的漿液與酵母一起在10℃-18℃發酵20-200小時以制備乙醇；其中步驟(a)和(b)在酸性α-淀粉酶活性，麥芽糖生成酶活性和α-葡糖苷酶活性存在的條件下進行。步驟(a)和(b)按所述順序進行；然而，所述工藝包括本發明中未說明的步驟，其在步驟(a)和(b)以前，中間和之后進行。
第一方面的第二個優選實施方案中，步驟(b)中的溫度為10℃-18℃，優選11℃-17℃，更優選12℃-16℃，諸如13℃-15℃，例如約14℃，并保持所述漿液酸性α淀粉酶活性，麥芽糖生成酶活性，α-葡糖苷酶活性和酵母接觸足夠的時間，以允許步驟(c)中所述淀粉的水解以及釋放的糖的發酵，優選100-230小時，優選150-210小時，更優選170-200小時。
酸性α-淀粉酶以有效量加入，所述有效量為足以實現將淀粉漿中的粒狀淀粉轉化成糊精的意圖目的的酸性α-淀粉酶濃度。
麥芽糖生成酶以有效量加入，所述有效量為足以實現將淀粉漿中生成的糊精轉化成麥芽糖的意圖目的的麥芽糖生成酶濃度。
α-葡糖苷酶以有效量加入，所述有效量為足以實現將淀粉漿中生成的麥芽糖轉化成葡萄糖的意圖目的的α-葡糖苷酶濃度。
本發明第一方面的優選實施方案中，步驟(a)和/或步驟(b)在選自下組的其它酶活性存在下進行木聚糖酶，纖維素酶和肌醇六磷酸酶。所述其它酶優選與α-淀粉酶，麥芽糖生成酶和α-葡糖苷酶一同加入。
本發明第一方面的具體實施方案中，步驟(a)和/或步驟(b)在葡糖淀粉酶存在和缺乏的條件下進行。
所述酶活性的劑型優選為本發明第二方面的組合物。
優選實施方案中，所述淀粉漿包括水和5-60％DS(干固體)粒狀淀粉，優選10-50％DS粒狀淀粉，更優選15-40％DS，具體是約20-25％DS粒狀淀粉.將在本發明工藝中加工的粒狀淀粉可具體獲自塊莖，根，莖，玉米穗軸(cobs)，豆莢類(legume)，谷物或完整谷粒(grain)。更具體地，所述粒狀淀粉可得自玉米，玉米穗軸，小麥，大麥，裸麥，買羅高梁(milo)，西米(sago)，木薯(cassava)，木薯(tapioca)，高梁，稻，豌豆(pea)，菜豆(bean)，香蕉或馬鈴薯。優選糯型和非糯型(waxy)玉米及大麥。待加工的粒狀淀粉可優選包含粉碎的完整谷粒或可以含有更精制的淀粉質量，優選超過90％，95％，97％或99.5％純淀粉。含有淀粉的原料物質優選被粉碎以開放其結構并允許進一步加工。可以采用干性碾磨(dry milling)以及濕性(wet)碾磨。當應用濕性碾磨時，可先進行浸泡和浸漬步驟。干性和濕性碾磨都是酒精生產領域已知的并為本發明的工藝所優選。在所述酒精產品時啤酒的本發明第一方面的第二個實施方案中，所述粒狀淀粉可優選包含至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或甚至至少90％粒狀淀粉，所述粒狀淀粉來自發芽谷物，例如大麥芽。
步驟(a)和/或(b)過程中的pH優選在3.0-7.0，更優選3.5-6.0，或最優選4.0-5.0，諸如4.3-4.6。
所述漿液在低于初始膠質化溫度的升高的溫度條件下與酶接觸一段時間，以有效使得所述淀粉顆粒容易被酶降解(步驟b)，優選5分鐘-12小時，優選10分鐘-6小時，更優選15分鐘-3小時，甚至更優選20分鐘-1.5小時，諸如30分鐘-1.25小時，40-70分鐘，甚至50-60分鐘。步驟(a)過程中的溫度應一直被調節到低于待加工特定粒狀淀粉的初始膠質化溫度，并通常為45℃-75℃。根據本發明，步驟(a)在比待加工具體淀粉初始膠質化溫度低0℃-20℃，優選0℃-15℃，更優選0℃-10℃，或甚至更優選0℃-5℃的溫度進行。實際溫度可為45℃-75℃，但優選55℃-65℃。優選步驟(a)進行的溫度是至少45℃，46℃，47℃，48℃，49℃，50℃，51℃，52℃，53℃，54℃，55℃，56℃，57℃，58℃或優選至少55℃，優選所述溫度不超過74℃，73℃，72℃，71℃，70℃，69℃，68℃，67℃，66℃，65℃，64℃，63℃或優選不超過62℃。
經過本發明第一方面的加工后，所述粒狀淀粉的干固體的至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或優選99％被轉化成乙醇。
所述乙醇可選被回收。所述乙醇可通過任何常規方式諸如蒸餾回收，并可用作燃料乙醇和/或飲用乙醇和/或工業乙醇。
在具體優選的實施方案中，待加工的粒狀淀粉源自干或濕粉碎的谷物，諸如小麥，大麥，裸麥，和/或玉米，所述淀粉漿具有20-40％的DS，步驟(a)中的溫度為50℃-60℃，諸如55℃，步驟(a)的持續時間是30分鐘-75分鐘，諸如60分鐘，步驟(b)進行60-90小時。
本發明第二方面的組合物的優選實施方案中，存在其它酶活性；所述酶活性選自纖維素酶，木聚糖酶和肌醇六磷酸酶組成的組。
材料和方法α-淀粉酶活性(KNU)所述淀粉分解活性可利用馬鈴薯淀粉作為底物測定。所述方法基于酶對經修飾的馬鈴薯淀粉的分解，所述反應后將淀粉/酶溶液樣品與碘溶液混合。開始，形成藍黑色，但在淀粉分解過程中，藍色變淺并逐漸變成紅棕色，將其與有色玻璃(glass)標準品進行比較。
1公斤(kilo)Novoα淀粉酶單位(KNU)定義為在標準條件(即37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；pH 5.6)下，糊精化5260mg淀粉干物質MerckAmylum solubile的酶量。
更詳細描述所述分析方法的文件EB-SM-0009.02/01可向NovozymesA/S，Denmark索取獲得，所述文件包含在本文作為參考。
酸性α-淀粉酶活性當根據本發明使用時，任何酸性α-淀粉酶的活性可以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶單位)測定。可選，酸性α-淀粉酶活性可以AAU(酸性α-淀粉酶單位)測定。
酸性α-淀粉酶單位(AAU)酸性α-淀粉酶活性可以AAU(酸性α-淀粉酶單位)測定，其是絕對方法。一個酸性淀粉酶單位(AAU)是標準條件下每小時將1g淀粉(100％干物質)轉化成某種產物的酶的量，所述產物在與具有等于已知等同于顏色參比物之一的強度的碘溶液反應后具有620nm發射光譜(transmission)。
標準條件/反應條件底物 可溶淀粉，濃度大約20g DS/L。
緩沖液 檸檬酸，大約0.13M，pH＝4.2碘溶液 40.176g碘化鉀+0.088g碘/L城市水(city water) 15°-20°dH(German degree hardness)pH 4.2保溫溫度 30℃反應時間 11分鐘波長 620nm酶濃度 0.13-0.19AAU/mL酶工作范圍 0.13-0.19AAU/mL所述淀粉應為Lintner淀粉，其為用于實驗室作為比色指示劑的輕沸淀粉。Lintner淀粉通過用稀鹽酸處理天然淀粉使其保持與碘呈藍色的能力而獲得。進一步詳細說明見EP0140410B2，其公開包含在本文中作為參考。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)酸性α-淀粉酶活性可以以AFAU(酸性真菌A-淀粉酶單位)測定，其相對于酶標準品測定。1FAU定義為在上述標準條件下降解5.260mg淀粉干物質每小時的酶的量。
酸性α-淀粉酶，內-α-淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)水解淀粉分子內部區域中的α-1，4-葡糖苷鍵以形成鏈長各異的糊精和寡糖。同碘形成的顏色強度與淀粉濃度成正比。利用逆比色法測定淀粉酶活性，其為規定的分析條件下淀粉濃度的降低。
λ＝590nm藍/紫羅蘭t＝23sec.脫色標準條件/反應條件
底物可溶淀粉，大約0.17g/L緩沖液 檸檬酸，大約0.03M碘(12) 0.03g/LCaCl2 1.85mMpH 2.50±0.05保溫溫度40℃反應時間23秒波長590nm酶濃度 0.025AFAU/mL酶工作范圍 0.01-0.04AFAU/mL更詳細描述該分析方法的文件EB-SM-0259.02/01可向Novozymes A/S，Denmark索取獲得，該文件包含在本文中作為參考。
產麥芽糖α-淀粉酶活性(MANU)一個產麥芽糖淀粉酶Novo單位(MANU)定義為在標準條件下每分鐘切割1微摩爾麥芽三糖的酶的量。標準條件是10mg/ml麥芽三糖，37℃，pH5.0，和反應時間30分鐘。在NADH形成的條件下，形成的葡萄糖通過葡萄糖脫氫酶(GlucDH，Merck)轉化成葡糖酸內酯，其在340nm由光譜儀分析。更詳細描述該分析方法的文件(EAL-SM-0203.01)可向Novozymes A/S，Denmark索取獲得，該文件包含在本文中作為參考。
β-淀粉酶活性(DP°)SPEZYMEBBA 1500的活性以分解淀粉力(Degree of Diastatic PowerDP°)程度表示。當所述樣品與100ml底物在20℃保溫1小時的情況下，0.1ml 5％樣品酶制備物溶液中所含的酶的量將產生足夠的還原型糖，可還原5ml Fehling′s溶液。
支鏈淀粉酶活性(新支鏈淀粉酶單位Novo(NPUN))支鏈淀粉酶活性可相對于支鏈淀粉底物測定。支鏈淀粉是線性D-葡萄糖聚合物，基本由1，6-α-鍵連接的麥芽三糖單位組成。內-支鏈淀粉酶隨機水解1，6-α-鍵，釋放麥芽三糖，63-α-麥芽三糖基-麥芽三糖，63-α-(63-α-麥芽三糖基-麥芽三糖基)-麥芽三糖。
一個新支鏈淀粉酶單位Novo(NPUN)是內-支鏈淀粉酶活性單位并相對于Novozymes A/S Promozyme D標準品測定。標準條件是反應時間30分鐘，40℃、pH 4.5；以0.7％支鏈淀粉作為底物。紅色底物降解的量通過光譜儀在510nm測定，并與樣品中的內-支鏈淀粉酶活性成比例。更詳細描述所述分析方法的文件(EB-SM.0420.02/01)可向Novozymes A/S，Denmark索取獲得，所述文件包含在本文作為參考。
在標準條件下，一個NPUN大約等于每分鐘釋放還原能力等于2.86微摩爾葡萄糖的還原型碳水化合物的酶的量。
α-葡糖苷酶活性α-葡糖苷酶活性可以以實施例1-5中所用的麥芽糖酶單位(形成的g葡萄糖/L麥芽糖酶制備物/小時)表示。麥芽糖酶制備物在60℃、20％w/v麥芽糖溶液中、于50mM檸檬酸pH＝4.5中保溫60分鐘(1小時)。釋放的葡萄糖的量利用GOD-PERID實驗，Boehringer Mannheim測定。
α-葡糖苷酶活性可選以實施例6-9所用α-葡糖苷酶單位表示。一個單位在37℃、pH 6.8，每分鐘從p-硝基苯基-α-D-葡糖苷釋放1.0微摩爾D-葡萄糖。
一個麥芽糖酶單位大約等于100α-葡糖苷酶單位。
木聚糖分解(xylanolytic)活性木聚糖分解活性可以以FXU-單位表達，所述FXU-單位在pH 6.0用remazol-木聚糖(用Remazol Brilliant Blue R，Fluka染色的4-O-甲基-D-葡糖醛酸-D-木聚糖)作為底物測定。
木聚糖酶樣品與remazol-木聚糖底物一同保溫。未降解的、染色的底物的背景通過乙醇沉淀。上清液中殘留的藍顏色(如光譜計在585nm測定的)與木聚糖酶活性成比例，并且隨后相對于酶標準品在標準反應條件測定木聚糖酶單位，所述標準條件即50.0℃，pH 6.0，反應時間30分鐘。
更詳細描述所述分析方法的文件EB-SM.352.02/01可向Novozymes A/S，Denmark索取獲得，所述文件包含在本文作為參考。
纖維素溶解活性纖維素溶解活性以內-葡聚糖酶單位(EGU)測定，所述測定在pH 6.0用羧甲基纖維素(CMC)作為底物進行。制備底物溶液，其含有34.0g/l CMC(Hercules 7LFD)(0.1M磷酸鹽緩沖液中、pH 6.0)。待分析酶樣品溶解于所述緩沖液中。混合5ml底物溶液和0.15ml酶溶液并轉移到震動粘度計(vibration viscosimeter)(例如MIVI 3000，來自Sofraser，France)中，在40℃熱穩定30分鐘。一個EGU定義為在這些條件下將粘度減少到二分之一的酶的量。酶樣品的量應調節到在反應混合物中為0.01-0.02EGU/ml。主要(arch)標準定義為880EGU/g。
更詳細描述所述分析方法的文件EB-SM-0275.02/01可向NovozymesA/S，Denmark索取獲得，所述文件包含在本文作為參考。
肌醇六磷酸酶活性肌醇六磷酸酶活性以FYT單位測定，一個FYT是在以下條件釋放1微摩爾無機正磷酸鹽每分鐘的酶的量pH 5.5；溫度37℃；底物肌醇六磷酸鈉(C6H6O24P6Na12，濃度0.0050摩爾/l。
酶制備物使用以下酶制備物酸性細菌α-淀粉酶；酶制備物，其包含具有嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶活性(E.C.3.2.1.1)并具有WO99/19467中公開的氨基酸序列SEQ.NO4的多肽。活性120KNU/g(比重＝1.20-1.25g/mL)。
酸性真菌α-淀粉酶；酶制備物，其源自黑曲霉，包含酸性真菌α-淀粉酶以及一些葡糖淀粉酶。活性114AFAU/g，25AGU/g(比重＝1.2g/mL)。
酸性真菌α-淀粉酶，源自米曲霉，活性為800FAU/g(比重＝1.25g/mL)。
產麥芽糖α-淀粉酶，其具有WO9/943794中SEQ ID No1所示的氨基酸，活性為3200MANU/g(1，25g/mL)。
提取自小麥谷粒的植物β-淀粉酶，活性1250DP/g(1，2g/ml)。
真菌β-淀粉酶，其源自微小根毛霉(Rhizomucor pusilus)。
α-葡糖苷酶，其源自Candida edax。活性0.14麥芽糖酶單位/g。
酶制備物，其源自木霉和曲霉，包含木聚糖酶和纖維素酶活性。活性140FXU/g+350EGU/g(比重(density)＝1.2g/mL)。
支鏈淀粉酶，其源自Bacillus acidopullulyticus并在EP 63,909中描述。
α-葡糖苷酶BS嗜熱脂肪芽孢桿菌α-葡糖苷酶，得自SIGMA(Sigmacat.No.G3651)。該酶具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列。
實施例制備可飲用酒精的傳統非加壓批蒸煮工藝在題為″Use of Novozymesenzymes in alcohl production″的Novozymes公開出版物2001-10782-01中描述。
粉碎谷粒的20％D.S.漿液在室溫(RT)自來水中制備。對于每個參數，將2×250g置于500mL藍蓋發酵瓶中。pH利用6N HCL調節到4.5。對于本發明的工藝，將酶按照下述內容配制，并在震搖水浴中、55℃預處理1小時。目前將搖瓶冷卻到32℃，將0.25g干面包酵母加入每只燒瓶中(這對應約5-10百萬有活力的細胞/g醪液)，并稱重燒瓶。在預設定在32℃的震搖水浴中進行保溫。然后給燒瓶配備氣塞，并在震搖水浴中開始在32℃進行發酵。
進行同時糖化和發酵(SSF)工藝并持續72小時。在第48和72小時，稱重所述燒瓶并測定CO2重量損失(g)以監測發酵進程。CO2損失量與乙醇重量之間的關系為CO2損失(g)×1.045＝EtOH(g)。
實施例1如上制備的粉碎的完整大麥谷粒漿液在細菌α-淀粉酶，真菌α-淀粉酶，和α-葡糖苷酶存在下在55℃，pH＝4.5保持60分鐘。
可使用以下劑量
隨后將溫度調節到32℃，并將3×250g醪液分配到帶有氣塞的500mL藍蓋發酵瓶中。如上述進行并監測發酵。
實施例2如上制備的粉碎的完整大麥谷粒漿液在木聚糖酶和纖維素酶，細菌α-淀粉酶，產麥芽糖α-淀粉酶，以及α-葡糖苷酶存在下在55℃，pH＝4.5保持60分鐘。
可使用以下劑量
隨后將溫度調節到32℃，并將3×250g醪液分配到帶有氣塞的500mL藍蓋發酵瓶中。如上述進行并監測發酵。
實施例3如上制備的粉碎的完整大麥谷粒漿液在酸性真菌α-淀粉酶，植物β-淀粉酶和α-葡糖苷酶存在下在55℃，pH＝4.5保持60分鐘。
可使用以下劑量
隨后將溫度調節到32℃，并將3×250g醪液分配到帶有氣塞的500mL藍蓋發酵瓶中。如上述進行并監測發酵。
實施例4如上制備的粉碎的完整大麥谷粒漿液在酸性真菌α-淀粉酶，真菌β-淀粉酶，和α-葡糖苷酶存在下在55℃，pH＝4.5保持60分鐘。
可使用以下劑量
隨后將溫度調節到32℃，并將3×250g醪液分配到帶有氣塞的500mL藍蓋發酵瓶中。如上述進行并監測發酵。
實施例5如上制備的粉碎的完整大麥谷粒漿液在酸性真菌α-淀粉酶，產麥芽糖α-淀粉酶，α-葡糖苷酶和支鏈淀粉酶存在下在55℃，pH＝4.5保持60分鐘。
可使用以下劑量
隨后將溫度調節到32℃，并將3×250g醪液分配到帶有氣塞的500mL藍蓋發酵瓶中。如上述進行并監測發酵。
實施例6.
如上制備的粉碎的完整大麥谷粒漿液在來自芽孢桿菌的細菌α-淀粉酶，來自米曲霉的真菌α-淀粉酶以及來自Candida edax的α-葡糖苷酶存在的條件下在55℃，pH＝4.5保持60分鐘。隨后將溫度調節到32℃，并將3×250g醪液分配到帶有氣塞的500mL藍蓋發酵瓶中。如上述進行并監測發酵。
該實施例表明，包含細菌α-淀粉酶和真菌α-淀粉酶的麥芽糖形成酶系統通過增加α-葡糖苷酶的劑量而得以改善。大麥淀粉含量為54-65％，乙醇產量是34-41升每100kg或37-44升每100kg干物質。因此，該實驗顯示，所得乙醇產量接近理論可得值。
實施例7.
如上制備的粉碎的完整大麥谷粒漿液在來自芽孢桿菌的細菌α-淀粉酶，產麥芽糖α-淀粉酶以及來自Candida edax的α-葡糖苷酶存在的條件下在55℃，pH＝4.5保持60分鐘。隨后將溫度調節到32℃，并將3×250g醪液分配到帶有氣塞的500mL藍蓋發酵瓶中。如上述進行并監測發酵。
該實施例表明，包含細菌α-淀粉酶和產麥芽糖α-淀粉酶的麥芽糖形成酶系統通過增加α-葡糖苷酶的劑量而得以改善。所得乙醇產量接近理論可得值。
實施例8如上制備的粉碎的完整大麥谷粒漿液在來自芽孢桿菌的細菌α-淀粉酶，植物β-淀粉酶以及來自Candida edax的α-葡糖苷酶存在的條件下在55℃，pH＝4.5保持60分鐘。隨后將溫度調節到32℃，并將3×250g醪液分配到帶有氣塞的500mL藍蓋發酵瓶中。如上述進行并監測發酵。
該實施例表明，包含細菌α-淀粉酶和植物β-淀粉酶的麥芽糖形成酶系統通過增加α-葡糖苷酶的劑量而得以改善。所得乙醇產量接近理論可得值。
實施例9在室溫(RT)自來水中制備12-14％D.S.粉碎的小麥谷粒漿液。對于每個參數，將2×250g置于500mL藍蓋發酵瓶中。pH調節到6.0。本發明的工藝使用來自芽孢桿菌的α-淀粉酶、植物β-淀粉酶，來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-葡糖苷酶(Sigma-產品號G3651)。將酶按照下述配制，并在震搖水浴中、55℃預處理60分鐘。將搖瓶冷卻到32℃，將0.25g干面包酵母加入每只燒瓶中(對應10百萬有活力的細胞/g醪液)，并稱重燒瓶。所述燒瓶在預設定在32℃的震搖水浴中進行保溫，并進行同時糖化和發酵(SSF)工藝步驟大約67小時。稱重燒瓶并測定CO2重量損失(g)以監測發酵進程。CO2損失量與乙醇重量之間的關系為CO2損失(g)×1.045＝EtOH(g)。乙醇產量如下計算
發酵醪液(mash)中的％乙醇通過HPLC利用離子緩沖的分配(Ionmoderated partitioning)測定。
增加α-葡糖苷酶的劑量可改善發酵后獲得的乙醇產量以及基于重量平衡計算的經發酵的淀粉的百分含量。地生(ground)小麥的淀粉含量為58-62％，乙醇產量幾乎為36-39升每100kg或39-42升每100kg干物質。因此，所述實驗顯示，所得乙醇產量與通常實際獲得的接近，甚至經發酵的淀粉的百分比沒有達到完全(completeness)。將支鏈淀粉酶包含在酶組合物中可獲得更高的產量。
序列表<110>諾維信公司(Novozymes A/S)<120>酒精產品生產工藝<130>10483<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>484<212>PRT<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>1Leu Ser Ala Ala Ser Trp Arg Thr Gln Ser Ile Tyr Phe Leu Leu Thr1 5 10 15Asp Arg Phe Gly Arg Thr Asp Asn Ser Thr Thr Ala Thr Cys Asn Thr20 25 30Gly Asn Glu Ile Tyr Cys Gly Gly Ser Trp Gln Gly Ile Ile Asp His35 40 45Leu Asp Tyr Ile Glu Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro50 55 60Ile Thr Glu Gln Leu Pro Gln Asp Thr Ala Asp Gly Glu Ala Tyr His65 70 75 80Gly Tyr Trp Gln Gln Lys Ile Tyr Asp Val Asn Ser Asn Phe Gly Thr85 90 95Ala Asp Asn Leu Lys Ser Leu Ser Asp Ala Leu His Ala Arg Gly Met100 105 110Tyr Leu Met Val Asp Val Val Pro Asp His Met Gly Tyr Ala Gly Asn115 120 125Gly Asn Asp Val Asp Tyr Ser Val Phe Asp Pro Phe Asp Ser Ser Ser130 135 140Tyr Phe His Pro Tyr Cys Leu Ile Thr Asp Trp Asp Asn Leu Thr Met145 150 155 160Val Glu Asp Cys Trp Glu Gly Asp Thr Ile Val Ser Leu Pro Asp Leu165 170 175Asp Thr Thr Glu Thr Ala Val Arg Thr Ile Trp Tyr Asp Trp Val Ala180 185 190Asp Leu Val Ser Asn Tyr Ser Val Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ser Val195 200 205
Leu Glu Val Gln Pro Asp Phe Phe Pro Gly Tyr Asn Lys Ala Ser Gly210 215 220Val Tyr Cys Val Gly Glu Ile Asp Asn Gly Asn Pro Ala Ser Asp Cys225 230 235 240Pro Tyr Gln Lys Val Leu Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro Ile Tyr Trp245 250 255Gln Leu Leu Tyr Ala Phe Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ile Ser Asn Leu260 265 270Tyr Asn Met Ile Lys Ser Val Ala Ser Asp Cys Ser Asp Pro Thr Leu275 280 285Leu Gly Asn Phe Ile Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Ala Lys Tyr290 295 300Thr Ser Asp Tyr Ser Gln Ala Lys Asn Val Leu Ser Tyr Ile Phe Leu305 310 315 320Ser Asp Gly Ile Pro Ile Val Tyr Ala Gly Glu Glu Gln His Tyr Ala325 330 335Gly Gly Lys Val Pro Tyr Asn Arg Glu Ala Thr Trp Leu Ser Gly Tyr340 345 350Asp Thr Ser Ala Glu Leu Tyr Thr Trp Ile Ala Thr Thr Asn Ala Ile355 360 365Arg Lys Leu Ala Ile Ala Ala Asp Ser Ala Tyr Ile Thr Tyr Ala Asn370 375 380Asp Ala Phe Tyr Thr Asp Ser Asn Thr Ile Ala Met Ala Lys Gly Thr385 390 395 400Ser Gly Ser Gln Val Ile Thr Val Leu Ser Asn Lys Gly Ser Ser Gly405 410 415Ser Ser Tyr Thr Leu Thr Leu Ser Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Thr420 425 430Lys Leu Ile Glu Ala Tyr Thr Cys Thr Ser Val Thr Val Asp Ser Ser435 440 445Gly Asp Ile Pro Val Pro Met Ala Ser Gly Leu Pro Arg Val Leu Leu450 455 460Pro Ala Ser Val Val Asp Ser Ser Ser Leu Cys Gly Gly Ser Gly Arg465 470 475 480
Leu Tyr Val Glu<210>2<211>514<212>PRT<213>嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)<400>2Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu1 5 10 15Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala ASn Glu Ala Asn Asn20 25 30Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys35 40 45Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp50 55 60Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Ala Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr65 70 75 80Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met85 90 95Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly100 105 110Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln115 120 125Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe130 135 140Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His145 150 155 160Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr165 170 175Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu180 185 190Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His195 200 205Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Ser Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn210 215 220Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Asp Val Arg Ser Gln Thr Gly245 250 255Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys260 265 270Leu His Asn Tyr Ile Met Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp275 280 285Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Thr290 295 300Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro305 310 315 320Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln325 330 335Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala340 345 350Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp355 360 365Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile370 375 380Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His385 390 395 400Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val405 410 415Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro420 425 430Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val435 440 445Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser450 455 460Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp465 470 475 480Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Trp Ser Ile Thr Thr485 490 495Arg Pro Trp Thr Asp Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val500 505 510
Ala Trp<210>3<211>483<212>PRT<213>地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)<400>3Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro1 5 10 15Asn Asp Gly Gln His Trp Arg Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu20 25 30Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly35 40 45Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu50 55 60Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys65 70 75 80Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn85 90 95Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr100 105 110Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val115 120 125Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro130 135 140Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe145 150 155 160Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys165 170 175Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn180 185 190Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val195 200 205Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe225 230 235 240Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met245 250 255Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn260 265 270Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu275 280 285His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met290 295 300Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser305 310 315 320Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu325 330 335Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu340 345 350Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly355 360 365Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile370 375 380Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His385 390 395 400Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp405 410 415Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro420 425 430Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr435 440 445Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser450 455 460Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr465 470 475 480Val Gln Arg
<210>4<211>480<212>PRT<213>解淀粉曲霉(Aspergillus amyloliquefaciens)<400>4Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp1 5 10 15Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp20 25 30Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Leu Ser35 40 45Gln Ser Asp Asn Gly Tyr Gly Pro Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu50 55 60Phe Gln Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ser Glu65 70 75 80Leu Gln Asp Ala Ile Gly Ser Leu His Ser Arg Asn Val Gln Val Tyr85 90 95Gly Asp Val Val Leu Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp100 105 110Val Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg Asn Gln Glu Thr Ser115 120 125Glu Glu Tyr Gln Ile Lys Ala Trp Thr Asp Phe Arg Phe Pro Gly Arg130 135 140Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly145 150 155 160Ala Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Ile Ser Arg Ile Phe Lys Phe Arg165 170 175Gly Glu Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn180 185 190Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Tyr Asp His Pro Asp Val195 200 205Val Ala Glu Thr Lys Lys Trp Gly Ile Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Ser210 215 220Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Lys His Ile Lys Phe Ser Phe225 230 235 240Leu Arg Asp Trp Val Gln Ala Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asn Ala Gly Lys Leu Glu Asn260 265 270Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Phe Asn Gln Ser Val Phe Asp Val Pro Leu275 280 285His Phe ASn Leu Gln Ala Ala Ser Ser Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met290 295 300Arg Arg Leu Leu Asp Gly Thr Val Val Ser Arg His Pro Glu Lys Ala305 310 315 320Val Thr Phe Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu325 330 335Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu340 345 350Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly355 360 365Thr Lys Gly Thr Ser Pro Lys Glu Ile Pro Ser Leu Lys Asp Asn Ile370 375 380Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Glu Tyr Ala Tyr Gly Pro Gln His385 390 395 400Asp Tyr Ile Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp405 410 415Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro420 425 430Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly Glu Thr435 440 445Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile Gly Ser450 455 460Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser Ile Tyr465 470 475 480<210>5<211>498<212>PRT<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<400>5Met Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala Ala1 5 10 15
Pro Ala Leu Ala Ala Thr Pro Ala Asp Trp Arg Ser Gln Ser Ile Tyr20 25 30Phe Leu Leu Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Ser Thr Thr Ala35 40 45Thr Cys Asn Thr Ala Asp Gln Lys Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln Gly50 55 60Ile Ile Asp Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile65 70 75 80Trp Ile Thr Pro Val Thr Ala Gln Leu Pro Gln Thr Thr Ala Tyr Gly85 90 95Asp Ala Tyr His Gly Tyr Trp Gln Gln Asp Ile Tyr Ser Leu Asn Glu100 105 110Asn Tyr Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ala Leu Ser Ser Ala Leu His115 120 125Glu Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met Gly130 135 140Tyr Asp Gly Ala Gly Ser Ser Val Asp Tyr Ser Val Phe Lys Pro Phe145 150 155 160Ser Ser Gln Asp Tyr Phe His Pro Phe Cys Phe Ile Gln Asn Tyr Glu165 170 175Asp Gln Thr Gln Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Asn Thr Val Ser180 185 190Leu Pro Asp Leu Asp Thr Thr Lys Asp Val Val Lys Asn Glu Trp Tyr195 200 205Asp Trp Val Gly Ser Leu Val Ser ASn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg210 215 220Ile Asp Thr Val Lys His Val Gln Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr Asn225 230 235 240Lys Ala Ala Gly Val Tyr Cys Ile Gly Glu Val Leu Asp Gly Asp Pro245 250 255Ala Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Asn Val Met Asp Gly Val Leu Asn Tyr260 265 270Pro Ile Tyr Tyr Pro Leu Leu Asn Ala Phe Lys Ser Thr Ser Gly Ser275 280 285
Met Asp Asp Leu Tyr Asn Met Ile Asn Thr Val Lys Ser Asp Cys Pro290 295 300Asp Ser Thr Leu Leu Gly Thr Phe Val Glu Asn His Asp Asn Pro Arg305 310 315 320Phe Ala Ser Tyr Thr Asn Asp Ile Ala Leu Ala Lys Asn Val Ala Ala325 330 335Phe Ile Ile Leu Asn Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ala Gly Gln Glu340 345 350Gln His Tyr Ala Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Thr Trp355 360 365Leu Ser Gly Tyr Pro Thr Asp Ser Glu Leu Tyr Lys Leu Ile Ala Ser370 375 380Ala Asn Ala Ile Arg Asn Tyr Ala Ile Ser Lys Asp Thr Gly Phe Val385 390 395 400Thr Tyr Lys Asn Trp Pro Ile Tyr Lys Asp Asp Thr Thr Ile Ala Met405 410 415Arg Lys Gly Thr Asp Gly Ser Gln Ile Val Thr Ile Leu Ser Asn Lys420 425 430Gly Ala Ser Gly Asp Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Ser Gly Ala Gly Tyr435 440 445Thr Ala Gly Gln Gln Leu Thr Glu Val Ile Gly Cys Thr Thr Val Thr450 455 460Val Gly Ser Asp Gly Asn Val Pro Val Pro Met Ala Gly Gly Leu Pro465 470 475 480Arg Val Leu Tyr Pro Thr Glu Lys Leu Ala Gly Ser Lys Ile Cys Ser485 490 495Ser Ser<210>6<211>555<212>PRT<213>嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)<400>6Met Lys Lys Thr Trp Trp Lys Glu Gly Val Ala Tyr Gln Ile Tyr Pro1 5 10 15Arg Ser Phe Met Asp Ala Asn Gly Asp Gly Ile Gly Asp Leu Arg Gly20 25 30
Ile Ile Glu Lys Leu Asp Tyr Leu Val Glu Leu Gly Val Asp Ile Val35 40 45Trp Ile Cys Pro Ile Tyr Arg Ser Pro Asn Ala Asp Asn Gly Tyr Asp50 55 60Ile Ser Asp Tyr Tyr Ala Ile Met Asp Glu Phe Gly Thr Met Asp Asp65 70 75 80Phe Asp Glu Leu Leu Ala Gln Ala His Arg Arg Gly Leu Lys Ile Ile85 90 95Leu Asp Leu Val Ile Asn His Thr Ser Asp Glu His Pro Trp Phe Ile100 105 110Glu Ser Arg Ser Ser Arg Asp Asn Pro Lys Arg Asp Trp Tyr Ile Trp115 120 125Arg Asp Gly Lys Asp Gly Arg Glu Pro Asn Asn Trp Glu Ser Ile Phe130 135 140Gly Gly Ser Ala Trp Gln Tyr Asp Glu Arg Thr Gly Gln Tyr Tyr Leu145 150 155 160His Leu Phe Asp Val Lys Gln Pro Asp Leu Asn Trp Glu Asn Ser Glu165 170 175Val Arg Gln Ala Leu Tyr Asp Met Ile Asn Trp Trp Leu Asp Lys Gly180 185 190Ile Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ile Ser His Ile Lys Lys Lys Pro195 200 205Gly Leu Pro Asp Leu Pro Asn Pro Lys Gly Leu Lys Tyr Val Pro Ser210 215 220Phe Ala Ala His Met Asn Gln Pro Gly Ile Met Glu Tyr Leu Arg Glu225 230 235 240Leu Lys Glu Gln Thr Phe Ala Arg Tyr Asp Ile Met Thr Val Gly Glu245 250 255Ala Asn Gly Val Thr Val Asp Glu Ala Glu Gln Trp Val Gly Glu Glu260 265 270Asn Gly Val Phe His Met Ile Phe Gln Phe Glu His Leu Gly Leu Trp275 280 285Lys Arg Lys Ala Asp Gly Ser Ile Asp Val Arg Arg Leu Lys Arg Thr290 295 300
Leu Thr Lys Trp Gln Lys Gly Leu Glu Asn Arg Gly Trp Asn Ala Leu305 310 315 320Phe Leu Glu Asn His Asp Leu Pro Arg Ser Val Ser Thr Trp Gly Asn325 330 335Asp Arg Glu Tyr Trp Ala Glu Ser Ala Lys Ala Leu Gly Ala Leu Tyr340 345 350Phe Phe Met Gln Gly Thr Pro Phe Ile Tyr Gln Gly Gln Glu Ile Gly355 360 365Met Thr Asn Val Gln Phe Ser Asp Ile Arg Asp Tyr Arg Asp Val Ala370 375 380Ala Leu Arg Leu Tyr Glu Leu Glu Arg Ala Asn Gly Arg Thr His Glu385 390 395 400Glu Val Met Lys Ile Ile Trp Lys Thr Gly Arg Asp Asn Ser Arg Thr405 410 415Pro Met Gln Trp Ser Asp Ala Pro Asn Ala Gly Phe Thr Thr Gly Thr420 425 430Pro Trp Ile Lys Val Asn Glu Asn Tyr Arg Thr Ile Asn Val Glu Ala435 440 445Glu Arg Arg Asp Pro Asn Ser Val Trp Ser Phe Tyr Arg Gln Met Ile450 455 460Gln Leu Arg Lys Ala Asn Glu Leu Phe Val Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu465 470 475 480Leu Leu Glu Asn His Pro Ser Ile Tyr Ala Tyr Thr Arg Thr Leu Gly485 490 495Arg Asp Arg Ala Leu Ile Ile Val Asn Val Ser Asp Arg Pro Ser Leu500 505 510Tyr Arg Tyr Asp Gly Phe Arg Leu Gln Ser Ser Asp Leu Ala Leu Ser515 520 525Asn Tyr Pro Val Arg Pro His Lys Asn Ala Thr Arg Phe Lys Leu Lys530 535 540Pro Tyr Glu Ala Arg Val Tyr Ile Trp Lys Glu545 550 55權利要求
1.制備酒精產品的工藝，包括以下步驟(a)在低于所述粒狀淀粉的初始膠質化溫度0℃-20℃的溫度，將含有水和粒狀淀粉的漿液保持5分鐘到12小時，(b)將步驟(a)的漿液與酵母一起在10℃-35℃之間的溫度發酵20-250小時以制備乙醇，其中步驟(a)和(b)在酸性α-淀粉酶活性、麥芽糖生成酶活性以及α-葡糖苷酶活性存在的條件下進行。
2.權利要求1的工藝，包括回收所述乙醇。
3.前述權利要求任一的工藝，其中所述產品是燃料乙醇，飲用乙醇和/或工業乙醇。
4.前述權利要求任一的工藝，其中步驟(b)中的溫度為28℃-36℃，諸如29℃-35℃，諸如30℃-34℃，諸如約32℃。
5.權利要求1或2的工藝，其中所述產品是啤酒。
6.權利要求1或5的工藝，其中步驟(b)中的溫度為11℃-17℃，諸如12℃-16℃，諸如13℃-15℃，諸如約14℃。
7.前述權利要求任一的工藝，其中所述酸性α-淀粉酶是酸性真菌α-淀粉酶。
8.前述權利要求任一的工藝，其中所述酸性真菌α-淀粉酶得自曲霉屬的菌株，優選得自黑曲霉菌株。
9.前述權利要求任一的工藝，其中所述酸性α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，其具有與SEQ ID NO1有至少70％，優選至少75％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，至少97％，至少98％，或至少99％同源性的氨基酸序列。
10.前述權利要求任一的工藝，其中所述酸性α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，其具有與SEQ ID NO5有至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％或甚至90％同源性的氨基酸序列。
11.前述權利要求任一的工藝，其中所述酸性α-淀粉酶是酸性細菌α-淀粉酶。
12.前述權利要求任一的工藝，其中所述酸性α-淀粉酶是源自地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，以及嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌株的α-淀粉酶。
13.前述權利要求任一的工藝，其中所述酸性細菌α-淀粉酶是源自地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，以及嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌株的α-淀粉酶。
14.前述權利要求任一的工藝，其中所述酸性細菌α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，其具有與SEQ ID NO2或SEQ ID NO3中所示序列有至少50％同源性，優選至少60％，70％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，97％，98％或至少99％同源性的氨基酸序列。
15.前述權利要求任一的工藝，其中所述酸性細菌α-淀粉酶源自嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株，所述酸性細菌α-淀粉酶與SEQ ID NO2中所示野生型氨基酸序列相比具有突變I181*+G182*+N193F。
16.前述權利要求任一的工藝，其中所述酸性細菌α-淀粉酶是雜合α-淀粉酶，其包含SEQ ID NO3所示地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的445C-末端氨基酸殘基，以及SEQ ID NO4所示解淀粉芽孢桿菌來源的α-淀粉酶的37N-末端氨基酸殘基，并具有取代G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
17.前述權利要求任一的工藝，其中所述酸性細菌α-淀粉酶是α-淀粉酶，其具有氨基酸序列SEQ ID NO4，并具有突變H154Y、A181T、N190F、A209V、Q264S和/或在位置176和179之間的兩個殘基缺失，優選E178和G179缺失。
18.前述權利要求任一的工藝，其中麥芽糖生成酶活性是產麥芽糖α-淀粉酶。
19.前述權利要求任一的工藝，其中麥芽糖生成酶活性是產麥芽糖α-淀粉酶，其具有與US6162628中SEQ ID NO1的氨基酸1-686有至少70％同一性的氨基酸序列。
20.前述權利要求任一的工藝，其中麥芽糖生成酶活性是β-淀粉酶。
21.前述權利要求任一的工藝，其中所述α-葡糖苷酶活性源自念珠菌屬菌株，諸如來自C.edax菌株。
22.前述權利要求任一的工藝，其中所述α-葡糖苷酶活性源自芽孢桿菌屬菌株，諸如來自嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株，尤其是SEQ ID NO.6所示的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-葡糖苷酶。
23.前述權利要求任一的工藝，其中步驟(a)和(b)在支鏈淀粉酶存在的條件下進行。
24.前述權利要求任一的工藝，其中步驟(a)和/或步驟(b)在存在選自木聚糖酶，纖維素酶或肌醇六磷酸酶的酶活性的條件下進行。
25.前述任一權利要求的工藝，其中所述淀粉漿含有5-60％DS粒狀淀粉，優選10-50％DS粒狀淀粉，更優選20-40％DS，尤其是約30％DS粒狀淀粉。
26.前述任一權利要求的工藝，其中步驟(a)和/或(b)中的pH范圍是3.0-7.0，優選3.5-6.0，或更優選4.0-5.0，諸如4.3-4.6。
27.前述任一權利要求的工藝，其中所述粒狀淀粉得自塊莖，根，莖，果實，種子或完整谷粒。
28.前述任一權利要求的工藝，其中所述粒狀淀粉得自玉米，玉米穗軸，小麥，大麥，裸麥，買羅高梁，西米，木薯，樹薯，木薯(tapioca)，高梁，稻或馬鈴薯。
29.前述任一權利要求的工藝，其中所述粒狀淀粉得自谷物。
30.前述任一權利要求的工藝，其中所述粒狀淀粉得自對完整谷粒的干性碾磨或濕性碾磨。
31.前述權利要求任一的工藝，其中步驟(a)中的保持時間為5分鐘-12小時，優選10分鐘-6小時，更優選15分鐘-3小時，甚至更優選20分鐘-11/2小時，諸如30分鐘-11/4小時，40-70分鐘，甚至50-60分鐘。
32.前述權利要求任一的工藝，其中步驟(b)中的保持時間是25-190小時，優選30-180小時，更優選40-170小時，甚至更優選50-160小時，更優選60-150小時，甚至更優選70-140小時，最優選80-130小時。
33.前述權利要求任一的工藝，其中步驟(a)中的溫度是45℃-75℃。
34.一種酶組合物，其包含酸性α-淀粉酶活性，麥芽糖生成酶活性和α-葡糖苷酶活性，其中存在另一種酶活性；所述酶活性選自支鏈淀粉酶，纖維素酶，木聚糖酶或肌醇六磷酸酶。
35.前述任意權利要求的酶組合物在酒精產品工藝和淀粉水解工藝中的用途。
36.包含酸性α-淀粉酶活性，麥芽糖生成酶活性以及α-葡糖苷酶活性的酶組合物在酒精產品工藝中的用途，包括粒狀淀粉的酶促水解。
全文摘要
本發明涉及從粒狀淀粉制備酒精產品的工藝，包括在低于所述粒狀淀粉的初始膠質化溫度的升高的溫度進行預處理，然后同時進行糖化和發酵。
文檔編號C12N9/28GK1798847SQ200480015139
公開日2006年7月5日 申請日期2004年5月28日 優先權日2003年5月30日
發明者漢斯·S·奧爾森, 巴里·E·諾曼, 莫根斯·沃姆普爾曼, 杰普·W·塔姆斯 申請人:諾維信公司