牙周炎發病的判斷方法

專利名稱：牙周炎發病的判斷方法
技術領域：
本發明涉及牙周炎發病判斷方法及種植體周圍炎發病判斷方法。更為詳細地說，涉及以檢測出或測定γ-GTP(γ-谷氨酰轉肽酶)為特征的牙周炎發病判斷方法及種植體周圍炎發病判斷方法。
背景技術：
所謂牙周組織是指位于牙齒周圍并承擔支持牙齒的作用的組織，由牙齦、牙周膜、牙骨質、牙槽骨構成。在該牙周組織炎癥當中，將局限于牙齦內的炎癥稱為“牙齦炎”，將炎癥部位超過牙齦并波及牙周膜或牙槽骨遭到損傷、破壞稱為“牙周炎”。
牙齦炎和牙周炎都是由于牙垢(細菌等附著在口腔內的食物殘渣等上并繁殖形成的塊)中的細菌增殖，加上其他因素的影響，引起牙周組織的炎癥而發生的。但是，在是牙齦炎的情況下，即使牙齦出現炎癥，但因炎癥沒有波及到牙周膜或牙槽骨，所以通過口腔內清洗，是可以治愈的；但當癥狀由牙齦炎向牙周炎進展時，因牙齒松動，牙周膜或牙槽骨損傷、破壞，所以即使口腔內清洗也很難恢復到原來狀態。
牙周疾病通常根據牙周袋的測定、附著程度(attachment level)、X線圖像診斷等來進行診斷。所謂“牙周袋”是指因牙齦炎或牙周炎導致牙齒和牙齦分離，在牙齒和牙齦之間所形成的溝(牙齦溝)，通過測定牙周袋的深度，可以在某種程度上知道牙周組織的破壞程度。所謂“附著程度”是指從牙骨質和牙釉質交界的部分到牙周袋底部的距離，成為知曉牙周支持組織的破壞程度的指標。在“X線圖像診斷”中，通過X線照相可以發現牙槽骨的吸收等。
此外，在發生牙齦炎或牙周炎時有滲出液(牙齦溝滲出液)漏出上述牙齦溝中，提出幾個將測定上述滲出液中含有的各種酶用到牙周疾病診斷中的方法。例如，因為在發炎時白細胞增加，所以公開有通過測定伴隨白細胞的增加而增加的過氧化物酶的酶活性而有助于牙周病的診斷的方法(專利文獻1)。
另外，還公開有利用因牙周組織炎癥或損傷導致ALT(丙氨酸轉氨酶)在牙齦溝滲出液中的濃度上升來診斷牙周疾病的方法(專利文獻2)。
進而，也有關于通過特異性地檢測出牙齦擬桿菌(bacteriodesgingivalis)等牙周疾病的致病菌釋放的酶ALP(堿性磷酸酶)來客觀地診斷牙周疾病的進展狀態的方法的現有文獻(專利文獻3)。在該方法中，把從唾液等采集的ALP進行熱處理等，去除患者細胞來源的ALP，由此特異性地只測定細菌來源的ALP。
專利文獻1特開昭60-222768號公報專利文獻2特表平3-501447號公報專利文獻3特開平5-176796號公報但是，以往的技術中存在以下需要解決的課題。
通常具有下述問題，當通過視診等確認牙齦的炎癥時，在區別牙齦炎和牙周炎方面需要很多經驗和熟練技巧，很難明確區分診斷牙齦炎和牙周炎。另外具有下述問題，牙齦炎和牙周炎的區分大多根據牙科醫生的經驗和技能來判斷，所以牙科醫生的判斷標準有個體差異。進而，關于以往的測定各種酶用于診斷牙周疾病的方法，也很難明確區分牙齦炎和牙周炎，另外，還存在操作程序復雜、敏感度不高、需要高技術等課題。
例如，在專利文獻1的發明中，通過測定酶/過氧化物酶的活性的上升，來判斷牙周組織的炎癥的程度，因為在牙齦炎的情況下和在牙周炎的情況下過氧化物酶的酶活性均上升，所以很難明確判斷牙齦炎和牙周炎的區別。
在專利文獻2的發明中，通過測定酶/ALT的濃度的上升，來判斷牙周組織的炎癥或損傷，因為和上述一樣，在牙齦炎的情況下和在牙周炎的情況下過ALT的酶活性均上升，盡管可以在某種程度上預測牙周疾病的癥狀的進展，但是很難明確判斷牙齦炎和牙周炎的區別。
關于專利文獻3的發明，以牙周疾病的病因菌釋放的酶為指標，盡管也許能夠在某種程度上預測牙周疾病的進展，但是很難明確判斷牙齦炎和牙周炎的區別。另外，因為在牙周疾病的進展和細菌增殖的相關性中存在個體差異，所以即使多個患者的細菌釋放的酶的測定值相同，也很難明確區分各患者是牙齦炎還是牙周炎。
如上所述，存在下述問題，即在以往的技術中沒有簡單且明確地區分牙齦炎和牙周炎的方法。當癥狀從牙齦炎向牙周炎進展時，需要早期發現以進行治療，所以需要明確區分牙齦炎和牙周炎并判斷是否引起牙周炎的方法。

發明內容
因此，本發明主要目的在于，提供簡單且明確地區分牙齦炎和牙周炎的方法。
為了解決上述技術課題，在本發明中提供了以下方法。
首先，起初，本發明涉及的酶/γ-GTP(γ-谷氨酰轉肽酶)是大量存在于腎臟、胰腺、肝臟等的酶，因在酒精代謝更新時或黃疸時游出到血液中，所以被用于肝臟疾病的診斷等。
如今，本發明者有如下的新發現，即在牙齦炎發病患者的牙齦溝滲出液中不含γ-GTP，但在經過該牙齦炎而發病的牙周炎的患者的牙齦溝滲出液中卻含有γ-GTP。此外還確認了除了該新發現之外，在牙周組織中發現γ-GTP，此時在牙周組織中破骨細胞被誘導。這些新發現已明確顯示出γ-GTP與伴有牙槽骨吸收或破壞的牙周炎的發病具有很強的相關性。其中，在牙齦溝滲出液中含有γ-GTP的時點，是牙周組織中破骨細胞處于被誘導的狀態，牙槽骨的吸收或破壞可以認為處于沒有開始或剛剛開始的階段，即牙周炎的初期階段。
因此，γ-GTP作為區分牙齦炎和牙周炎的標志物是有用的，通過檢測出或測定牙齦溝滲出液中的γ-GTP，可以判斷癥狀是否要從牙齦炎向牙周炎進展。
因此，以上述發現為基礎，在本發明中，首先提供對牙齦溝滲出液中含有的γ-GTP(γ-谷氨酰轉肽酶)進行檢測或測定的牙周炎發病判斷方法。
如上所述，當發生牙齦炎時，牙齦溝滲出液中幾乎不含γ-GTP，但當發生牙周炎時，因為在牙齦溝滲出液中流出γ-GTP，所以通過檢測或測定牙齦溝滲出液中的γ-GTP，能夠明確判斷牙周疾病是牙齦炎還是癥狀要進展到牙周炎。這里，所謂“牙齦溝”是指因牙齦的炎癥導致牙齒和牙齦分離而產生的在牙齒和牙齦間所夾的溝的部分(牙周袋)。另外，所謂“牙齦溝滲出液”是指向牙齦溝中漏出的組織液。其中，牙齦溝在牙齦有炎癥時才出現，所以當牙周組織健康時，幾乎不存在明確的牙齦溝(牙周袋)，因此也幾乎不能采集到牙齦溝滲出液。
作為采集牙齦溝滲出液的方法，例如有使用紙尖(paper point)使滲出液滲入的方法，使用吸管(吸引器)的方法，用微量移液管(毛細玻璃管)的方法，在牙齦溝內流過緩沖液然后回收該液體的方法等。
作為檢測或測定γ-GTP的方法，可以使用在肝臟疾病等的檢查診斷中通常所使用的公知的方法，只要是能夠檢測或測定γ-GTP的方法，就沒有特別的限定。例如，可以采用測定γ-GTP的酶活性的方法、使用針對γ-GTP抗體的直接定量法、通過PCR法確認對γ-GTP進行編碼的mRNA的表達的基因檢測法等。
當使用酶活性測定法檢測、測定γ-GTP的酶活性時，例如可以使用上述推薦的方法(參照臨床化學、24，106-121，1995)。γ-GTP為轉移酶，具有從作為供體底物的L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝酰苯胺向作為受體底物的甘氨酰甘氨酸轉移γ-葡萄糖基、生成L-γ-谷氨酰甘氨酰甘氨酸和5-氨基-2-硝基苯甲酸的作用。在推薦的方法中，通過測定由該反應生成的5-氨基-2-硝基苯甲酸的吸光度的變化，檢測、測定γ-GTP的酶活性。其中，作為同樣使γ-GTP作用于底物來檢測、測定酶活性的方法，有使用合成底物/L-γ-谷氨酰-對硝酰苯胺的方法(SSCC法)等。
所謂直接定量法，是充分利用抗γ-GTP抗體(與γ-GTP特異性結合的抗體)來直接檢測、測定γ-GTP的方法。例如，通過使用作為常規方法的夾心ELISA法(酶聯免疫吸附測試法Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay)，可以高度敏感地檢測γ-GTP。
另外，本發明也可以應用于判斷種植體周圍炎的發病。
所謂“種植體周圍炎”是牙周炎的一種，是指由于在牙周組織中埋入種植體而導致在牙周組織地種植體周圍產生炎癥。所謂“種植體”是指埋入到牙周組織中的支持體，將種植體的下部埋入到牙周組織中，將該種植體的上部鑲嵌在義齒上，由此在周圍組織內安裝義齒。種植體周圍炎是由于牙科種植體的普及而發病正在增加的新的牙周炎，其特征在于，因為不是牙齦炎癥狀出現進展而產生的疾病，所以未必以牙周袋為主要癥狀而發生牙周炎。
當發生種植體周圍炎時，因為癥狀不是由牙齦炎發生進展而發病，所以大多數情況下難以通過視診來確認發病，也很難通過酶活性進行判斷。γ-GTP因為與牙齦炎沒有關系，僅當發生牙周炎時(出現牙槽骨的吸收等時)漏出到牙齦溝滲出液、組織液、牙周組織周邊的血液中等，所以可以簡單地判斷種植體周圍炎的發病。
其中，當發生種植體周圍炎時，因為未必以牙周袋為主要癥狀，所以大多數情況下患者無法采集到牙齦溝滲出液。在這種情況下，也可以通過注射針等采集已埋入種植體的部位周圍的血液，作為γ-GTP的檢測、測定的試樣。牙齦溝滲出液是因炎癥導致從牙齦滲出的淋巴液，其內容成分與血清的大致相同，因此，即使是來自血液的樣品，也可以檢測、測定γ-GTP。其中，γ-GTP的檢測、測定的方法可以使用與上述相同的方法。


圖1是用γ-GTP抗體對LPS致敏3天后的大鼠牙槽骨進行染色的代替附圖的相片。
圖2是用非特異性抗體對LPS致敏3天后的大鼠牙槽骨進行染色的代替附圖的相片。
圖3是對LPS致敏3天后的大鼠牙槽骨進行TRAP染色后的代替附圖的相片。
具體實施例方式
實施例實施例1在實施例1中，采集牙齦溝滲出液測定γ-GTP的酶活性，來區分牙齦炎和牙周炎，按照以下步驟進行如上所述的實驗。其中，本發明并不限于實施例。
首先，從3位被檢體(牙周炎的既往已治愈的患者、牙齦炎的患者、牙周炎的患者)中分別采集牙齦溝滲出液。牙齦溝滲出液的采集是在各被檢體的牙齦溝中插入紙尖1分鐘，然后通過使牙齦溝滲出液滲入紙尖后進行檢測。其中，在牙周炎的既往已治愈的患者中，從牙齦溝淺的牙周袋和位于其他處的深的牙周袋的兩處分別采集牙齦溝滲出液。另外，在牙周炎的患者中，從當前炎癥發生的牙齦溝的部分(牙周袋)、和已抑制牙齦炎癥的部位的淺牙周袋、和位于其他處的已抑制牙齦炎癥的部位的深牙周袋的3處，分別采集牙齦溝滲出液。
然后，回收已滲入牙齦溝滲出液的紙尖，立即浸泡在70μl的PBS緩沖液(或蒸餾水)中1分鐘，以使紙尖的頂端(插入到牙周袋的部分)不會干燥。然后丟棄紙尖，在4℃下僅保存已浸泡紙尖1分鐘后的PBS緩沖液。其中，該步驟中，也可以切斷已滲入牙齦溝滲出液的紙尖的頂端，浸泡在PBS緩沖液等中，在4℃下且在將紙尖浸泡于PBS緩沖液等中的狀態下進行保存。
在4℃下保存牙齦溝滲出液已洗脫的PBS緩沖液等的理由是，在牙齦滲出液中還存在雜菌，當在室溫下保存時，這些雜菌增殖并分泌蛋白質分解酶等，有分解γ-GTP的可能性。另外，作為去除這些問題的方法，可以使用在PBS緩沖液等中添加0.1％BSA(用于使微量γ-GTP穩定化)和0.2％疊氮化鈉(防腐劑)。通過采用以上的任何一種方法，在4℃(低溫)或室溫下可以不破壞γ-GTP的情況下保存、運送樣品。其中，上述的步驟主要是保存、運送樣品時所必需的步驟。因此，當通過上述樣品可以即刻測定γ-GTP時，可以不在4℃下保存。
此外，通過酶活性測定法，測定在牙齦溝滲出液已洗脫的PBS緩沖液中含有的γ-GTP活性。結果如表1所示。
表1

在牙齦炎或牙周炎經過治療而當前沒有發生炎癥的患者中，在從牙齦溝(牙周袋)淺的患者和深的患者所采集的牙齦溝滲出液中，均沒有檢測出γ-GTP(樣品1、樣品2)。
在從牙齦炎患者采集的牙齦溝滲出液中，也沒有檢測出γ-GTP(樣品3)，但從牙周疾病患者的牙齦溝滲出液中，檢測出γ-GTP(樣品4)。由此可知，通過檢測、測定γ-GTP可以明確區分牙齦炎和牙周炎。在牙齦炎患者的牙齦溝滲出液中不含有γ-GTP，但在牙周病患者的牙齦溝滲出液中含有γ-GTP。
樣品5和樣品6是對雖有牙周炎發病但正通過抗炎劑(類固醇等)抑制牙齦炎癥的患者的在其牙齦溝滲出液中所含的γ-GTP進行測定的樣品。因為使用抗炎劑，表面上牙齦的炎癥(發紅)被抑制，但牙周炎并未治愈，實際上在牙周組織的深部正發生炎癥。因此，本實驗是用于研究通過本發明方法是否可以判斷在牙周組織的深部有無炎癥。其結果，如表1所示，在樣品5和樣品6患者中，都已檢測出γ-GTP。因此可知，當應用抗炎劑表面上已治愈牙周炎而在牙周組織的深部仍然發生炎癥時，通過本發明方法可以判斷有無牙周炎的發病。
另外，當對樣品5和樣品6進行比較時，從深牙齦溝(牙周袋)采集的牙齦溝滲出液(樣品6)與從淺牙齦溝(牙周袋)采集的牙齦溝滲出液(樣品5)相比，前者中的γ-GTP酶活性更高。這提示距離炎癥部位越近γ-GTP越多，另外，還提示當以與牙齦溝相同的深度采集牙齦溝滲出液時，炎癥越大γ-GTP就越多。因此，本發明方法不僅可以區分牙齦炎和牙周炎，而且在判斷成牙周炎的情況下，還可以判斷牙周組織的炎癥的程度。
實施例2實施例2是使用基因檢測法，配制牙周病患者的牙齦溝滲出液，確認γ-GTP的mRNA發現表達的實驗。
首先，使用RNA提取用試劑盒/ISOGEN(日本基因株式會社制NIPPON GENE Co.，Ltd)，從牙周病患者的牙齦溝滲出液中提取RNA。然后利用RT-PCR high-Plus-kit(TOYOBO制)試劑盒，通過RT-PCR法合成、擴增目的DNA。進行RT-PCR時的引物使用5’-TCCCTTGACCTTCAGGAGAACGAG-3’、和5’-GTGTGGTGCTGTTGTAGATGGTGA-3’。其結果，通過使用了該引物的PCR法，使目的NDA擴增，因此可以確認人γ-GTP的mRNA在牙齦溝滲出液中表達。
根據以上結果，顯示即使通過基因檢測法，也可以檢測出牙齦溝滲出液中的γ-GTP。
實施例3實施例3是使用實驗性牙周病模型大鼠，顯示γ-GTP參與牙槽骨的破壞的實驗，步驟如下所示。
麻醉下固定7周齡的Wistar大鼠，使LPS接觸大鼠的已咬合的左右臼齒1個小時。此外，隨后、0、1、2、3、7天后，使其安樂死采集牙周組織，采用常規方法進行福爾馬林固定，制作病理切片。其中，所謂“LPS”是指脂多糖(1ipopolysaccharide)，是革蘭式陰性細菌的外膜的重要組成成分。LPS作為內毒素具有多種生物活性，在本實驗中，用于通過使LPS接觸大鼠的臼齒一定時間而致敏，實驗性地發生牙周炎。LPS使用源自大腸桿菌的LPS。
接下來，首先用γ-GTP染色該病理切片(圖1)。另外，使用同樣制作的病理切片作為對照，用非特異性抗體進行染色而制作(圖2)。其結果，根據對圖1的觀察，可知在實驗性發生牙周炎的大鼠的牙槽骨周邊，有γ-GTP大量表達。其中，圖1、圖2所示的相片是對LPS致敏后、3天后的病理切片進行染色的相片。
然后，對同樣制作的病理切片進行TRAP染色(圖3)。所謂TRAP染色，是指通過使用了酒石酸耐受性酸性磷酸酶(成熟破骨細胞的標記物)的染色法，可以特異性對破骨細胞進行染色。其結果，可知在發生實驗性牙周炎的大鼠的牙槽骨中，多數破骨細胞被誘導。其中，圖3所示的相片是對LPS致敏后、3天后的病理切片進行染色的相片。在通過光學顯微鏡的觀察中，在LPS致敏后第3天的病理切片中，可以看到破骨細胞的誘導，但牙槽骨的吸收、破壞僅僅觀察到極少部分。
通過上述實驗可知，當發生牙齦炎時γ-GTP在牙周組織中大量表達。另外，可以確認伴隨γ-GTP的表達破骨細胞在牙槽骨中被誘導。因此，提示γ-GTP在發生牙齦炎時表達，在牙槽骨中誘導破骨細胞，參與牙槽骨的吸收、破壞。另外，已知實際上在牙槽骨的吸收、破壞即將開始前，已有γ-GTP表達。
由本發明取得的效果如下所述。
可以通過簡單的方法明確區分牙齦炎和牙周炎。另外，可以明確牙齦炎和牙周炎的區分的判斷標準，不是通過牙科醫生各自的標準，而是通過客觀的標準可以判斷牙周炎的發病。由此，能夠有助于牙周炎的早期診斷、早期治療。特別是因為γ-GTP的表達在牙槽骨的吸收、破壞即將開始之前就出現，所以在早期判斷牙周炎發病的情況下也是有效的。
γ-GTP的檢測、測定，可以使用在肝臟疾病等的檢查診斷中采用的公知的簡單方法。因此，能夠迅速且容易地使本發明方法普及。
通過檢測、測定與牙周炎的發病關系密切的酶γ-GTP，可以直接區分牙齦炎和牙周病，可以判斷牙周炎的發病。特別是，本發明并不是以與牙周組織炎癥或損傷相關的酶、或成為牙周疾病的原因的細菌釋放的酶作為標記物來判斷牙周炎的發病，而是利用與牙周病的發病直接相關的酶作為標記物，所以可以明了且確實可靠地進行牙齦炎與牙周炎的區分或牙周病發病的判斷。
當是牙周炎患者時，通過使用抗炎劑等，表面看上去牙齦的炎癥(發紅)被治愈，但實際上在牙周組織的深部炎癥仍然沒有治愈，在該時點停止牙周炎的治療，反而會使牙周炎發生惡化。通過使用本發明方法，可以簡單且準確地判斷正在使用抗炎劑的患者的牙周組織的深部的炎癥實際上是否治愈。
本發明不僅可以區分牙齦炎和牙周炎，而且在判斷成牙周炎的情況下，通過測定γ-GTP的檢測量等，還可以判斷牙周炎的炎癥輕重。
本發明也有助于判斷種植體周圍炎的發病。
權利要求
1.一種牙周炎發病判斷方法，其特征在于，檢測或測定在牙齦溝滲出液中含有的γ-谷氨酰轉肽酶。
2.一種種植體周圍炎判斷方法，其特征在于，檢測或測定在從已埋入的種植體周圍所采集的血液中含有的γ-谷氨酰轉肽酶。
全文摘要
本發明提供一種簡單且明確地區分牙齦炎和牙周炎的方法。發明人發現在牙齦炎患者的牙齦溝滲出液中幾乎不含γ－GTP(γ－谷氨酰轉肽酶)，而在牙周病患者的牙齦溝滲出液中含有γ－GTP。因此，提供一種檢測或測定在牙齦溝滲出液中含有的γ－GTP的牙周炎發病判斷方法。另外，該方法也可以應用于判斷種植體牙周炎發病的方法。
文檔編號C12Q1/48GK1813189SQ200480018370
公開日2006年8月2日 申請日期2004年6月28日 優先權日2003年6月30日
發明者石塚保行, 新飯田俊平 申請人:株式會社應用細胞生物工程