用植物培養生產高甘露糖蛋白的制作方法

專利名稱：用植物培養生產高甘露糖蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及生產高甘露糖蛋白的轉化宿主細胞以及特別是用植物培養生產這些蛋白的方法和系統。
背景技術：
戈謝病(Gaucher′s disease)是最普遍的溶酶體貯積病。該病由隱性遺傳性疾病(1號染色體q21-q31)所導致的葡糖腦苷脂酶(亦稱葡萄糖神經酰胺酶)缺乏所引起，葡糖腦苷脂酶是膜結合的溶酶體酶，催化糖鞘脂葡糖腦苷脂(葡萄糖神經酰胺，GlcCer)水解成葡萄糖和神經酰胺。戈謝病是因hGCD(人葡糖腦苷脂酶)基因(GBA)的點突變所引起，導致GlcCer在巨噬細胞的溶酶體內的累積。這種特征性貯藏細胞稱為戈謝細胞，存在于肝、脾和骨髓。相關的臨床癥狀包括嚴重肝脾腫大、貧血、血小板減少癥和骨骼退化。
編碼人GCD的基因于1985年首次測序(6)。該蛋白由源自536-聚體前肽的497個氫基酸所組成。成熟的hGCD包含五個N-糖基化氨基酸的共有序列(Asn-X-Ser/Thr)。這些位點中有四個位點正常是糖基化的。第一個位點的糖基化是產生活性蛋白所必需的。已經對高甘露糖寡糖鏈和復合寡糖鏈進行了鑒定(7)。胎盤的hGCD含有7％的糖，其中的20％為高甘露糖型(8)。生化和定點誘變的研究已經提供了對于折疊、激活物相互作用和活性位點位置有重要作用的區域和殘基的原始圖譜(9)。
用神經氨酸苷酶處理胎盤hGCD(生成脫唾液酸酶)，導致大鼠肝細胞清除和吸收速率隨著肝的酶活性的增加而增加(Furbish等，1981，Biochim.Biophys.Acta 673425-434)。這種經聚糖修飾的胎盤hGC目前用作治療戈謝病的治療藥，生化和定點誘變的研究已經提供了對于折疊、激活物相互作用和活性位點位置有重要作用的區域和殘基的原始圖譜[Grace等，J.Biol.Chem.2692283-2291(1994)]。
戈謝病有三種不同的類型，均由hGC活性的水平確定。主要受該病影響的細胞是巨噬細胞，由于GlcCer的累積而高度增大，并因此稱為“戈謝細胞(Gaucher cell)”。
對于GCD的缺陷是引起戈謝病的主要病因的證實，促使了開發酶替代療法作為這種疾病的醫治對策。
De Duve首先建議，用外源生物活性酶替代失去的溶酶體酶，可能是治療溶酶體貯積病的可行方法[Fed Proc.231045(1964)]。
從那時起，各項研究都表明酶替代療法可能有益于治療不同的溶酶體貯積病。用從胎盤制備的外源酶(β-葡糖腦苷脂酶)(阿糖腦苷酶(Ceredase)TM)，或者，最近用重組方法制備的外源酶(β-葡糖腦苷脂酶)(重組葡糖腦苷脂酶注射劑(Cerezyme)TM)，治療I型戈謝病的患者已顯示了最好的成功。
天然的未經修飾的葡糖腦苷脂酶是帶有四個糖鏈的糖蛋白。這種蛋白不以機體內的吞噬細胞為靶，因此治療價值是有限的。在戈謝病的現代治療的開發中，用三種不同的糖苷酶處理序貫去除葡糖腦苷脂酶糖鏈上的末端糖。這種糖苷酶處理導致生成糖蛋白，其末端糖由甘露糖殘基組成。由于吞噬細胞具有甘露糖受體，該受體識別帶末端為甘露糖殘基的寡糖鏈的糖蛋白和糖肽，葡糖腦苷脂酶的糖重建模(remodeling)改進了該酶對這些細胞的靶向性[Furbish等，Biochem.Biophys.Acta 673425，(1981)]。
如本文所指出的，糖基化對于hGCD的活性起著關鍵作用，因此無論使用衣霉素(Sf9細胞)還是使用點突變消除所有的糖基化位點(Sf9和COS-1細胞)使細胞系中所表達的hGCD去糖基化，都導致酶活性完全喪失。此外，發現在大腸桿菌(E.coli)中所表達的hGCD是無活性的。進一步的研究表明，不同糖基化位點對于蛋白質活性的意義。除了糖基化在有效蛋白質活性中的作用以外，商業生產的酶含有聚糖序列修飾以利于特異性遞藥。將糖基化蛋白提取后重建模使其包括只含甘露糖的聚糖序列。
人GCD酶含有4個糖基化位點和22個賴氨酸。重組生產的酶(重組葡糖腦苷脂酶注射劑TM)不同于胎盤酶(阿糖腦苷酶TM)，其495位上的精氨酸已被組氨酸所取代。此外，重組GCD和胎盤GCD之間的寡糖組成不同，前者具有更多的巖藻糖和N-乙酰-萄糖胺殘基，而后者僅保留一個高甘露糖鏈。如上所述，用三種不同的糖苷酶(神經氨酸酶、半乳糖苷酶和P-N乙酰-氨基葡糖苷酶)處理這兩種類型的GCD以暴露末端甘露糖，從而能夠靶向吞噬細胞。US 5,549,892中描述了一種包含重組生產的酶的藥物制劑。應當注意的是，所有提及的參考文獻都通過引用全部結合到本文中。
現有的溶酶體酶替代療法治療的一個缺點在于酶的體內生物活性是不合需要的低，例如由于低的吸收，降低了累積底物的特異性細胞溶酶體的靶向性，并且溶酶體中體內作用的半壽期短。
現有的GCD重組酶的另一個主要缺點是它們的費用，它們給保健制度帶來了沉重的經濟負擔。由于復雜的純化方案和目前治療所需的相當大的治療藥量導致了這些重組酶的高成本。因此，迫切需要降低GCD的成本，使得這種挽救生命的治療能向所有需要這種治療的患者提供。
藥用蛋白傳統上用哺乳動物或細菌表達系統來生產。最近十年，已用植物開發出了新的表達系統。這種方法是利用土壤桿菌屬(Agrobacterium)，這是一種能夠將單鏈DNA分子(T-DNA)插入到植物基因組中的細菌。由于導入基因大量生產蛋白質和肽相對簡單，因此這種方法日益流行成為可替代的蛋白表達系統(1)。
由于細菌表達系統里沒有翻譯后修飾，而植物的表達系統卻能容易進行這些對蛋白表達和活性極為關鍵的修飾。哺乳動物和植物蛋白表達系統之間的一個主要差異在于蛋白質糖側鏈的不同，這是由于生物合成途徑的差異所致。糖基化對于蛋白質的活性、折疊、穩定性、溶解度、對蛋白酶的敏感性、血清除率和抗原潛能都具有意義深遠的影響。因此，任何用植物生產的蛋白質都要考慮植物糖基化的潛在后果。
蛋白質糖基化分為兩類N-聯修飾和O-聯修飾(2)。這兩種類型的差異在于聚糖部分所連接的氨基酸——N-聯連接到天冬酰胺殘基上，而O-聯連接到絲氨酸或蘇氨酸殘基上。此外，每種類型的聚糖序列都具有獨特的區別特征。就這兩種類型而言，N-聯糖基化比較豐富，而且其對蛋白質功能的影響已進行了深入的研究。另一方面，O-聯聚糖相對稀少，而且關于它們對蛋白質的影響的可利用的信息并不多。
發明概述背景技術中沒有教授或建議用植物培養選擇性地生產糖基化蛋白的裝置、系統或方法。
背景技術：
中也沒有教授或建議用植物培養生產高甘露糖蛋白的裝置、系統或方法。
背景技術：
中也沒有教授或建議通過內質網(ER)用植物培養生產蛋白質的裝置、系統或方法。
背景技術：
中也沒有教授或建議在繞過高爾基體時通過內質網用植物培養生產蛋白質的裝置、系統或方法。
背景技術：
中也沒有教授或建議通過使用ER信號繞過高爾基體用植物培養生產蛋白質的裝置、系統或方法。
本發明克服了背景技術中的這些缺點，提供了用植物培養生產糖基化蛋白、特別是具有高甘露糖糖基化的蛋白、同時任選和優選地靶向(和/或別的操作處理)這種有ER信號的蛋白的裝置、系統和方法。雖然不希望受一種假說的束縛，但認為這種靶向性使得蛋白質繞過高爾基體并因此保留所需的糖基化，特別是高甘露糖糖基化。應當注意的是，本文所用的術語“植物培養物”包括培養生長的任何類型的轉基因植物細胞和/或其它基因工程植物細胞。所述基因工程可任選是永久性的或是瞬時的。優選所述培養物的特征為不會長成完整植株的細胞，因此至少有一種植物的生物學結構不存在。任選和優選地，所述培養物的特征可為許多不同類型的植物細胞，但優選所述培養物的特征為一種特殊類型的植物細胞。應當注意的是，任選特征為一種特殊類型的植物細胞的植物培養物來源于這些許多不同類型的植物細胞。
植物細胞可以根據任何類型合適的培養方法進行生長，所述培養方法包括但不限于固體表面培養(例如塑料培養容器或培養板)或懸浮培養。
本發明還涉及用轉基因植物根細胞、特別是胡蘿卜細胞表達和產生具酶活性的高甘露糖溶酶體酶的載體和方法。更具體地說，本發明涉及以高水平表達和大量生產生物活性高甘露糖葡糖腦苷脂酶(GCD)的宿主細胞、特別是轉基因懸浮胡蘿卜細胞、載體和方法。本發明還提供用于治療溶酶體貯積病的組合物和方法。
本發明也涉及能給缺陷型細胞提供足量的生物活性溶酶體酶、特別是人GCD的裝置、系統和方法。本發明也涉及包含能有效生產基因編碼溶酶體酶例如GCD的新的載體組合物的宿主細胞。
因此，本發明解決了一直想要解決的生產具有特殊糖基化要求的蛋白質的經濟上可行的技術難題，例如溶酶體酶如GCD的高甘露糖糖基化。本發明通過使用植物細胞培養物能夠解決這個一直想要要解決的難題。
為了進一步說明本發明，現簡要說明一下高甘露糖蛋白的生物合成途徑。高甘露糖和復合N-聯聚糖的基本生物合成途徑在所有真核生物中都是高度保守的。生物合成始于內質網(ER)，通過寡糖基轉移酶將聚糖前體從多萜醇脂質載體轉移到蛋白質上的特定天冬酰胺殘基上。然后，前體在ER中通過用糖苷酶I和II和假擬甘露糖苷酶進行修飾，產生高甘露糖結構，這類似于哺乳動物中的過程。
在高爾基體中進一步修飾聚糖序列形成復合結構和雜合結構。這樣的修飾包括用α-甘露糖苷酶I去除四個甘露糖殘基中的一個、添加N-乙酰萄糖胺殘基，用α-甘露糖苷酶II去除另外兩個甘露糖殘基、添加N-乙酰萄糖胺，而且任選在此階段，可添加木糖和巖藻糖殘基，獲得植物特有的N-聯聚糖。將木糖和巖藻糖轉移到核心后，可以通過添加末端巖藻糖和半乳糖進一步加工復合型N-聚糖。在糖蛋白轉運過程中可以進行進一步修飾。
當前在
背景技術：
中常常使用的控制和精修植物中的蛋白質糖基化有幾種方法，但所有這幾種方法均有很多不足之處，特別是與本發明比較后。總的改進，例如糖基化的完全抑制或從肽鏈中去除糖基化位點是一個策略。然而，該方法可能導致結構缺陷。另一方法包括特異性糖加工酶的敲除和引入。再者，該方法比較艱難而且也可能傷害植物細胞自身。
本發明通過使用ER信號和/或通過阻斷從ER至高爾基體的分泌克服了背景技術方法中的不足之處。雖然不希望受一種假說的束縛，但認為如果可以阻斷分泌并且使蛋白質仍能保留在ER中，那么不需要結構重塑就可以獲得天然存在的高甘露糖結構，因此優選溶酶體酶的高甘露糖結構。
如上所述，蛋白質通過內膜系統首先進入內質網進行轉運。這個步驟所需的轉運信號由位于分子N末端的信號序列所代表，即所謂的信號肽。只要這個信號肽完成了它的功能，就將它所連接的前體蛋白插入到內質網中，將信號肽從前體蛋白中通過蛋白酶解作用切割下來。在所有的活細胞的進化過程中，無論是細菌、酵母、真菌、動物還是植物，這種類型的信號肽序列憑借其特異性功能是高度保守的。
憑借信號肽將很多植物蛋白插入內質網，不在ER中滯留，而從內質網轉運至高爾體并且繼續從高爾體運輸至液泡。這種運輸滯留類信號中的一類分揀信號，是在前體蛋白的C端部分滯留的信號[Neuhaus和Rogers，(1998)Plant Mol.Biol.38127-144]。含有插入內質網的N端信號肽和C端液泡靶向信號的蛋白預期含有復合聚糖，其在高爾基體中與它們連接[Lerouge等，(1998)Plant Mol.Biol.3831-48]。這種C端分揀信號的性質變化多端。US 6,054,637描述了從煙草堿性殼多糖酶區中所獲得的肽片段，該殼多糖酶是作為液泡靶向肽的液泡蛋白。含有C端靶向信號和復合聚糖的液泡蛋白的一個實例是得自豆籽的菜豆蛋白貯藏蛋白[Frigerio等，(1998)Plant Cell 101031-1042；Frigerio等，(2001)Plant Cell 131109-1126]。
范例是，所有真核細胞中的液泡蛋白在它們的最終目的地液泡內匯集之前都要經過ER和高爾基體。令人驚奇的是，本發明的轉化植物根細胞能產生一種意想不到的高甘露糖GCD。有利的是，發現這種高甘露糖產物具有生物活性，因此無需進一步活化它。雖然不希望受一種假說的束縛，但認為使用以植物細胞培養物產生的重組蛋白的ER信號似乎能夠克服至高爾基體的轉運，并因此保留所需的高甘露糖糖基化。任選能夠產生高甘露糖糖基化的任何類型的機制，包括可繞過高爾基體的任何類型的機制，可以根據本發明進行使用。
第一方面，本發明涉及產生目標高甘露糖重組蛋白的宿主細胞。該細胞可以用編碼目標蛋白的重組核酸分子或者用包含所述核酸分子的表達載體轉化或轉染。這種核酸分子包含編碼目標蛋白的第一核酸序列，所述第一核酸序列與編碼液泡靶向信號肽的第二核酸序列操作性連接。第一核酸序列還可以任選與編碼ER(內質網)靶向信號肽的第三核酸序列操作性連接。本發明的宿主細胞的特征在于目標蛋白由細胞以高度甘露糖基化的形式產生。
本發明的宿主細胞可以是真核細胞或是原核細胞。
在一個實施方案中，本發明的宿主細胞是原核細胞，優選細菌細胞，最優選根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)細胞。如下所述，這些細胞用來感染優選的植物宿主細胞。
在另一個優選的實施方案中，本發明的宿主細胞可以是真核細胞，優選植物細胞，最優選植物根細胞，選自發根土壤桿菌(Agrobacterium rihzogenes)轉化的根細胞、芹菜細胞、姜細胞、辣根細胞和胡蘿卜細胞。
在一個優選的實施方案中，所述植物根細胞是胡蘿卜細胞。應當注意的是，本發明的轉化胡蘿卜細胞進行懸浮培養。如上所述及實施例中所述，這些細胞用根癌土壤桿菌細胞轉化。
在另一個實施方案中，包含在本發明的宿主細胞中的重組核酸分子，包含編碼溶酶體酶的第一核酸序列，所述第一核酸序列與編碼源自堿性煙草殼多糖酶A基因的液泡靶向信號肽編碼溶酶體酶的第二核酸序列操作性連接。這種液泡信號肽具有由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列。第一核酸序列還可以任選與第三核酸序列操作性連接，所述第三核酸序列編碼ER(內質網)靶向信號肽，如SEQ ID NO1所示。在一個實施方案中，包含在本發明的宿主細胞中的重組核酸分子還包含在植物細胞內起作用的啟動子。這種啟動子應該與本發明的重組分子操作性連接。
在另一個實施方案中，這種重組核酸分子還可以任選包含優選在植物細胞內起作用的操作性連接的終止子。本發明的重組核酸分子還可以任選包含另外的控制、啟動和調節元件和/或選擇標記。應當注意的是，這些調節元件與所述重組分子操作性連接。
在一個優選的實施方案中，由本發明宿主細胞產生的目標高甘露糖蛋白可以是具有暴露的甘露糖末端殘基的高甘露糖糖蛋白。
根據另一個優選的實施方案，這種高甘露糖蛋白可以是選自以下的溶酶體酶葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。在一個優選的實施方案中，所述溶酶體酶可以是人葡糖腦苷脂酶(GCD)。除非另有說明，否則在下文中的重組GCD、rGCD、rhGCD全都是指各種形式的重組人GCD。
如前所述，戈謝病，最常見的溶酶體貯積病，由hGCD(人葡糖腦苷脂酶)基因(GBA)中的點突變引起，導致了GlcCer在巨噬細胞溶酶體中的累積。對于GCD缺乏是引起戈謝病的主要病因的證實，促使開發酶替代療法作為這種疾病的醫療對策。然而，糖基化對于靶細胞的hGCD活性和吸收起著關鍵性作用。
因此，根據本發明的其它優選實施方案，優選通過控制植物細胞培養物中的hGCD的表達，任選和更優選地通過提供ER信號和/或任選和更優選地通過阻斷至高爾基體的轉運來提供合適的糖基化hGCD。
任選和優選地，hGCD至少具有一個包含暴露甘露糖殘基的寡糖鏈，因而可用于治療或預防戈謝病。
再者，在一個具體的實施方案中，這種優選的宿主細胞被重組核酸分子轉化或轉染，該重組核酸分子還包含來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子、根癌土壤桿菌的章魚堿合酶終止子和TMV(煙草花葉病毒)Ω翻譯增強子元件。根據一個優選的實施方案中，這種重組核酸分子包含基本上如SEQ ID NO13所示的核酸序列，并且編碼其氨基酸序列基本上如SEQ ID NO14所示的高甘露糖GCD。
應當了解的是，本發明還提供包含編碼生物活性溶酶體酶的核酸分子的表達載體。
在一個優選的實施方案中，本發明的表達載體包含編碼生物活性高甘露糖人葡糖腦苷脂酶(GCD)的核酸分子。優選這種優選的表達載體包含重組核酸分子，其核酸序列基本上如SEQ ID NO13所示。
第二方面，本發明涉及由本發明宿主細胞產生的重組高甘露糖蛋白。
在一個優選的實施方案中，這種高甘露糖蛋白可以是選自以下的生物活性高甘露糖溶酶體酶葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。最優選這種溶酶體酶可以是人葡糖腦苷脂酶(GCD)。
再者，本發明提供重組生物活性高甘露糖溶酶體酶，其具有至少一個包含暴露甘露糖殘基的寡糖鏈。
根據一個優選的實施方案，本發明的重組溶酶體酶可以與靶部位的靶細胞上的甘露糖受體結合。優選這個部位可以是在患了溶酶體貯積病的患者體內。
應當注意的是，所述重組溶酶體酶對于靶細胞的親和力比天然存在的溶酶體酶對于靶細胞的相應親和力大。在一個具體的實施方案中，靶部位的靶細胞可以是患者肝內的枯否細胞(Kupffer cell)。
在一個優選的實施方案中，所述重組溶酶體酶可選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。
最優選這種重組溶酶體酶是葡糖腦苷脂酶(GCD)。
第三方面，本發明涉及高甘露糖蛋白的制備方法。因此，本發明的方法包括下述步驟(a)制備重組宿主細胞的培養物，該細胞用編碼目標重組蛋白的重組核酸分子或者用包含所述重組核酸分子的表達載體轉化或轉染；(b)在允許蛋白表達的條件下，培養步驟(a)制備的這些宿主細胞培養物，其中所述宿主細胞產生高度甘露糖基化形式的蛋白；(c)從細胞中回收蛋白并從步驟(a)提供的培養物中收獲細胞；(d)用合適的蛋白質純化方法純化步驟(c)的蛋白。
根據一個優選的實施方案，這種方法所用的宿主細胞是本發明的宿主細胞。
在另一個優選的實施方案中，通過本發明的方法產生的高甘露糖蛋白可以是生物活性高甘露糖溶酶體酶，其具有至少一個包含暴露甘露糖殘基的寡糖鏈。
這種重組酶可以與靶部位的靶細胞上的甘露糖受體結合。更具體地說，通過本發明的方法產生的重組酶對于靶細胞的親和力比天然存在的溶酶體酶對于靶細胞的相應親和力大。因此，靶部位的靶細胞可以是患者肝內的枯否細胞。
在一個具體的實施方案中，這種溶酶體酶可選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。最優選這種溶酶體酶可以是葡糖腦苷脂酶(GCD)。
在另一個優選的實施方案中，本發明方法所使用的宿主細胞可以是選自以下的植物根細胞發根土壤桿菌轉化的根細胞、芹菜細胞、姜細胞、辣根細胞和胡蘿卜細胞。最優選植物根細胞是胡蘿卜細胞。應當特別注意的是，在本發明的方法中，所述轉化宿主胡蘿卜細胞進行懸浮培養。
再一方面，本發明涉及用外源重組溶酶體酶治療患有溶酶體貯積病的患者的方法，所述方法包括(a)提供重組生物活性形式的溶酶體酶，所述溶酶體酶從轉化植物根細胞中純化而來并且能夠有效靶向異常缺乏溶酶體酶的細胞，這種重組生物活性酶在附著的寡糖上有暴露的末端甘露糖殘基；(b)給予所述患者治療有效量的重組生物活性溶酶體酶。在一個優選的實施方案中，本發明方法所使用的重組高甘露糖溶酶體酶可以由本發明的宿主細胞產生。優選這種宿主細胞是胡蘿卜細胞。
在另一個優選的實施方案中，本發明方法所使用的溶酶體酶可以是包含至少一個具有暴露甘露糖殘基的寡糖鏈的高甘露糖酶。這種重組酶可以與患者體內的靶部位的靶細胞上的甘露糖受體結合。更優選這種重組溶酶體酶對于這些靶細胞的親和力比天然存在的溶酶體酶對于靶細胞的相應親和力大。
更準確地講，本發明方法所使用的溶酶體酶可選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。優選這種溶酶體酶是葡糖腦苷脂酶(GCD)。
根據一個優選的實施方案，本發明方法用于治療溶酶體貯積病，特別是戈謝病。
在這種情況下，靶部位的靶細胞可以是患者肝內的枯否細胞。
本發明還提供用于治療溶酶體貯積病的藥物組合物，所述組合物包含作為活性成分的如本發明所限定的重組生物活性高甘露糖溶酶體酶。本發明的組合物可任選還包括藥物可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。
在一個具體的實施方案中，本發明的組合物用于治療戈謝病。所述組合物可優選包含作為有效成分的如本發明所限定的生物活性高甘露糖人葡糖腦苷脂酶(GCD)。
本發明還涉及本發明重組生物活性高甘露糖溶酶體酶在制備用于治療或預防溶酶體貯積病的藥物中的用途。更準確地講，該病可以是戈謝病。
因此，這種生物活性溶酶體酶是如本發明所限定的生物活性高甘露糖人葡糖腦苷脂酶(GCD)。
根據本發明，提供產生高甘露糖重組蛋白的宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼重組蛋白和使產生的重組蛋白作為高甘露糖蛋白的信號的多核苷酸。優選所述多核苷酸包含編碼目標蛋白的第一核酸序列，所述第一核酸序列與編碼信號肽的第二核酸序列操作性連接。任選信號肽包含ER(內質網)靶向信號肽。優選所述多核苷酸還包含編碼液泡靶向信號肽的第三核酸序列。
優選所述信號使重組蛋白靶向ER。更優選所述信號包含使重組蛋白靶向ER的信號肽。最優選所述多核苷酸包含編碼信號肽的核酸區段。
任選和優選地，所述信號使重組蛋白繞過高爾基體。優選所述信號包含使重組蛋白不靶向高爾基體的信號肽。更優選所述多核苷酸包含編碼信號肽的核酸區段。
任選和優選地，所述宿主細胞是任一種真核細胞和原核細胞。任選原核細胞是細菌細胞，優選是根癌土壤桿菌細胞。優選真核細胞是植物細胞。更優選植物細胞是選自以下的植物根細胞發根土壤桿菌轉化的根細胞、芹菜細胞、姜細胞、辣根細胞和胡蘿卜細胞。最優選植物根細胞是胡蘿卜細胞。
優選所述重組多核苷酸包含編碼目標蛋白的第一核酸序列，所述第一核酸序列與編碼源自堿性煙草殼多糖酶A基因的液泡靶向信號肽的第二核酸序列操作性連接，該液泡信號肽具有由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列，其中第一核酸序列還任選與第三核酸序列操作性連接，所述第三核酸序列編碼ER(內質網)靶向信號肽，如SEQ IDNO1所示。
更優選重組多核苷酸還包含在植物細胞內起作用的啟動子，其中啟動子與重組分子操作性連接。
最優選重組多核苷酸還包含在植物細胞內起作用的終止子，其中終止子與重組分子操作性連接。
最最優選重組多核苷酸任選還包含另外的控制、啟動和調節元件和/或選擇標記，其中調節元件與重組分子操作性連接。
優選高甘露糖蛋白是糖基化的、有至少一個暴露甘露糖殘基的高甘露糖糖蛋白。更優選高甘露糖蛋白是選自以下的生物活性高甘露糖溶酶體酶葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
最優選溶酶體酶是人葡糖腦苷脂酶(GCD)。
優選GCD包含基本上如SEQ ID NO8所示的氨基酸序列，該氨基酸序列由如SEQ ID NO7所示的核酸序列編碼。
更優選所述細胞用重組多核苷酸或用包含所述分子的表達載體轉化或轉染，該重組多核苷酸還包含來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子、根癌土壤桿菌的章魚堿合酶終止子，調節元件是TMV(煙草花葉病毒)Ω翻譯增強子元件，具有基本上如SEQ ID NO13所示的核酸序列，并且編碼其氨基酸序列基本上如SEQ ID NO14所示的GCD。
根據優選的實施方案，提供由上述宿主細胞產生的重組高甘露糖蛋白。
優選高甘露糖蛋白是選自以下的生物活性高甘露糖溶酶體酶葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
更優選溶酶體酶是人葡糖腦苷脂酶(GCD)。
根據本發明的其它優選實施方案，提供重組生物活性高甘露糖溶酶體酶，其具有至少一個包含暴露甘露糖殘基的寡糖鏈。
根據再一些優選的實施方案，提供重組蛋白，其包含具有信號肽活性的第一部分和具有溶酶體酶活性的第二部分，第一部分使第二部分在植物細胞內被加工成具有至少一個包含暴露甘露糖殘基的寡糖鏈。
優選溶酶體酶包含用于治療或預防戈謝病的蛋白。
更優選所述蛋白包括hGCD。
優選第一部分包含植物細胞ER靶向信號肽。更優選重組酶可以與溶酶體貯積病患者體內的靶部位的靶細胞上的甘露糖受體結合。最優選重組溶酶體酶對于靶細胞的親和力比天然存在的溶酶體酶對于靶細胞的相應親和力大。
最最優選重組溶酶體酶選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。
優選重組溶酶體酶是葡糖腦苷脂酶(GCD)。
還優選靶部位的靶細胞是患者肝內的枯否細胞。
根據再一些優選的實施方案，提供植物細胞培養物中產生的重組高甘露糖蛋白。優選所述蛋白的特征為使蛋白靶向ER的植物信號肽。
更優選植物信號肽包含使蛋白靶向根植物細胞培養物中的ER的肽。最優選根植物細胞培養物包含胡蘿卜細胞。
根據又一些優選的實施方案，提供用植物細胞培養生產的重組高甘露糖hGCD蛋白。
根據再一些優選的實施方案，提供植物細胞培養在生產高甘露糖蛋白中的用途。
根據其它優選的實施方案，提供高甘露糖蛋白的制備方法，所述方法包括制備用編碼重組蛋白的重組多核苷酸轉化或轉染的重組宿主細胞的培養物；在允許蛋白表達的條件下，培養宿主細胞培養物，其中所述宿主細胞產生高度甘露糖基化形式的蛋白。
優選懸浮培養所述宿主細胞培養物。更優選所述方法還包括純化所述蛋白。
根據其它優選的實施方案，所述方法用如前所述的宿主細胞來實施。優選高甘露糖蛋白是生物活性高甘露糖溶酶體酶，其具有至少一個包含暴露甘露糖殘基的寡糖鏈。更優選重組酶與靶部位的靶細胞上的甘露糖受體結合。最優選重組酶對于靶細胞的親和力比天然存在的溶酶體酶對于靶細胞的相應親和力大。
優選溶酶體酶選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
更優選溶酶體酶是葡糖腦苷脂酶(GCD)。最優選靶部位的靶細胞是患者肝內的枯否細胞。
優選宿主細胞是選自以下的植物根細胞發根土壤桿菌轉化的根細胞、芹菜細胞、姜細胞、辣根細胞和胡蘿卜細胞。
更優選植物根細胞是胡蘿卜細胞。
最優選懸浮培養所述轉化宿主胡蘿卜細胞。
根據再一些優選的實施方案，提供使用外源重組溶酶體酶治療溶酶體貯積病患者的方法，所述方法包括提供重組生物活性形式的溶酶體酶，所述溶酶體酶從轉化植物根細胞中純化而來并且能夠有效靶向異常缺乏溶酶體酶的細胞，其中所述重組生物活性酶在附著的寡糖上具有暴露末端甘露糖殘基；給予所述患者治療有效量的重組生物活性溶酶體酶。該方法可以任選用如上所述的任何宿主細胞和/或蛋白來實施。
優選重組酶可以與患者體內的靶部位的靶細胞上的甘露糖受體結合。更優選重組溶酶體酶對于靶細胞的親和力比天然存在的溶酶體酶對于靶細胞的相應親和力大。最優選溶酶體酶選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。最最優選溶酶體酶是葡糖腦苷脂酶(GCD)。
最最優選溶酶體貯積病是戈謝病。最最優選靶部位的靶細胞是患者肝內的枯否細胞。
根據再一些優選的實施方案，提供用于治療溶酶體貯積病的藥物組合物，所述組合物包含作為活性成分的如上所述的重組生物活性高甘露溶酶體酶，所述組合物任選還包含藥物可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。優選溶酶體貯積病是戈謝病。更優選重組溶酶體酶是生物活性高甘露糖人葡糖腦苷脂酶(GCD)。
根據再一些優選的實施方案，提供如上所述的重組生物活性高甘露糖溶酶體酶在制備用于治療或預防溶酶體貯積病的藥物中的用途。優選該病是戈謝病。更優選生物活性溶酶體酶是生物活性高甘露糖人葡糖腦苷脂酶(GCD)。
本發明用以下附圖簡述作進一步說明，


僅是說明性的，而不是對本發明范圍的限制，本發明的范圍僅由所附權利要求書的限定。
附圖簡述本發明通過實施例并參考附圖進行說明，附圖中圖1A-1B圖1A顯示所得到的表達盒，其包含來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子、TMV(煙草花葉病毒)Ω翻譯增強子元件、ER靶向信號、人GCD序列(也用SEQ ID NO7表示)、液泡信號和來自根癌土壤桿菌的章魚堿合酶終止子序列。
圖1B顯示pGreenII質粒骨架的示意圖。
圖2顯示，用抗hGCD特異性抗體進行hGCD轉化細胞提取物的蛋白質印跡分析。用標準重組葡糖腦苷脂酶注射劑(泳道1)作為陽性對照，用未轉化的愈傷組織作為陰性對照(泳道2)，各種所選擇的愈傷組織提取物見泳道3-8。
圖3A-3C顯示用裝在XK柱(2.6×20cm)里的強陽離子交換樹脂(Macro-Prep high-S support，Bio-Rad)來純化rhGCD的第一個步驟。將柱子與AKTA主系統(Amershanm Pharmacia Biotech)連成一體，使能監測電導率、pH和280nm的吸光度。用含有600mM NaCl的平衡緩沖液洗脫rh-GCD。圖3A表示該純化步驟的標準洗脫圖。通過酶活性測定來監測洗脫過程中所收集的流分，如圖3B所示，合并顯示酶活性(在洗脫峰中)的試管。圖3C顯示已測活性的洗脫流分的考馬斯藍染色。
圖3D-3F顯示圖3A-3C的相應圖，但不包括第二個柱的。
圖4A-C顯示，用裝在XK柱(2.6×20cm)中的疏水作用樹脂(TSK凝膠，Toyopearl Phenyl-650C，Tosoh Corp.)對重組hGCD實施的最后一個純化步驟。將柱子與AKTA主系統(Amersham Pharmacia Biotech)連成一體，使能監測電導率、pH和280nm的吸光度。將前一個柱的GCD洗脫合并液以6ml/min上樣，隨后用平衡緩沖液洗滌直至UV吸光度達到基線。用含有50％乙醇的10mM檸檬酸緩沖液洗脫純GCD。
圖4A表示該純化步驟的標準洗脫圖。
圖4B顯示通過酶活性試驗監測洗脫過程中所收集的流分。
圖4C顯示已測活性的洗脫流分的考馬斯藍染色。
圖5顯示重組hGCD被腹膜巨噬細胞攝取后的活性(圖5A-5C)，而圖5D顯示本發明重組GCD的蛋白質印跡。
圖6顯示本發明rGCD和重組葡糖腦苷脂酶注射劑(Cerezyme)TM的比較糖基化結構。
圖7顯示本發明rGCD的糖基化結構。
圖8顯示本發明rGCD的另外的N-聚糖糖基化結構。
發明詳述傳統生產藥用蛋白質是用哺乳動物表達系統或細菌表達系統。在最近幾年，已經在植物中發現了一種有前途的新的表達系統。由于導入新基因相對簡單和大量生產蛋白質和肽的潛力，“分子制藥(molecular pharmings)”作為一種蛋白表達系統變得越來越受歡迎。
哺乳動物和植物蛋白表達系統間的一個主要差異是由生物合成途徑的不同所引起的蛋白質糖基化序列的不同。已經表明，糖基化對于蛋白質的活性、折疊、穩定性、溶解度、對蛋白酶的敏感性、血清除率和抗原潛能都具有意義深遠的影響。因此，任何用植物生產的蛋白質都要考慮到植物糖基化的潛在后果。
糖部分是蛋白質的一種最普通的翻譯后修飾。蛋白質糖基化分為兩類N-聯和O-聯。這兩種類型的差異在于蛋白質上聚糖部分所連接的氨基酸——N-聯連接到天冬酰胺殘基上，而O-聯連接到絲氨酸或蘇氨酸殘基上。此外，每種類型的聚糖序列都具有獨特的區別特征。就這兩種類型而言，N-聯糖基化比較豐富，而且其對蛋白質的影響已進行了深入的研究。另一方面，O-聯聚糖相對稀少，而且關于它們對蛋白質的影響的可利用的信息并不多。對于植物中蛋白質糖基化的多數可用的數據集中于N-聯聚糖，而不是O-聯聚糖。
本文描述了本發明的一種以轉基因植物細胞為基礎的植物表達系統，優選根細胞，任選和優選地在懸液中生長。這種表達系統特別設計用來高效地生產目標高甘露糖蛋白。術語“高甘露糖”包括具有至少一個暴露甘露糖殘基的糖基化。
因而，第一方面，本發明涉及生產目標高甘露糖重組蛋白的宿主細胞。優選重組蛋白的特征為ER(內質網)信號肽，更優選ER靶向信號肽。或者或此外，重組蛋白的特征為使蛋白質繞過高爾基體的信號。該信號的特征優選使重組蛋白能夠高甘露糖糖基化，更優選保留這種糖基化，最優選靶向ER和/或繞過高爾基體。如本文更詳細描述，優選將這種信號作為信號肽使用，其更優選形成蛋白質序列部分，任選和更優選地通過蛋白質工程改造使信號肽成為蛋白質的組成部分。應當注意的是，信號可任選是靶向信號、保留信號、回避(繞過)信號或這些信號的任意組合，或任何能夠提供所需的高甘露糖糖基化結構的其它類型的信號。
雖然不希望受一種假說的束縛，但認為應用ER靶向信號和用植物細胞培養物生產的重組蛋白似乎能克服至高爾基體的轉運，并因此保留所需的高甘露糖糖基化。任選能夠產生高甘露糖糖基化的任何類型的機制，包括繞過高爾基體的任何類型的機制，都可以根據本發明進行使用。ER靶向信號肽為本領域通曉；它們是N端信號肽。任選任何合適的ER靶向信號肽可以根據本發明進行使用。
本發明的宿主細胞可以任選用編碼目標蛋白的重組核酸分子或者用包含核酸分子的表達載體(永久地和/或瞬時地)轉化或轉染。這種核酸分子包含編碼目標蛋白的第一核酸序列，所述第一核酸序列任選和優選與編碼液泡靶向信號肽的第二核酸序列操作性連接。應當注意的是，本文所用的術語“操作性”連接不一定是指物理連接。第一核酸序列還可以任選和優選地與編碼ER(內質網)靶向信號肽的第三核酸序列操作性連接。本發明的宿主細胞的特征在于，目標蛋白由細胞產生，其形式包括至少一個暴露甘露糖殘基，但優選是高甘露糖基化形式。
“細胞”、“宿主細胞”或“重組宿主細胞”在本文中是可互換使用的術語。人們知道，這些術語不僅指具體的主題細胞而且指這種細胞的子代或可能的子代。由于突變或環境影響，某些修飾可能在后代中出現，因此這樣的子代事實上與親代細胞可能不完全相同，但仍然包括在如本文所用的術語范圍內。本文所用的“宿主細胞”是指可用裸DNA或重組DNA技術構建的表達載體重組轉化的細胞。本文所用的術語“轉染”是指將核酸，例如裸DNA或表達載體通過核酸-介導的基因轉移導入受體細胞中。本文所用的“轉化”是指細胞基因型改變是細胞攝取外源DNA或RNA的結果，例如，轉化細胞表達重組形式的所需蛋白。
應該了解的是，抗藥性或其它選擇標記將部分地使選擇轉化體變得容易。此外，選擇標記的存在，例如抗藥性標記的存在可用于避免污染微生物在培養基中繁殖。在誘導的表型存活所要求的條件下，通過培養細胞獲得這種轉化宿主細胞的純培養物。
如上所述，本發明的宿主細胞可以用核酸分子轉染或轉化。本文所用的術語“核酸”是指多核苷酸例如脫氧核糖核酸(DNA)，適當的時候是指核糖核酸(RNA)。該術語也應該理解為包括由核苷酸類似物構成的RNA或DNA的類似物，以及可適用于所描述的實施方案的單鏈(例如有義鏈或反義鏈)和雙鏈多核苷酸。
在又一個實施方案中，本發明的宿主細胞可以用包含所述重組核酸分子的表達載體轉染或轉化。本文所用的“表達載體”，包括載體例如質粒、病毒、噬菌體、整合型DNA片段和其它載體，它們能夠將DNA片段整合到宿主基因組中。表達載體是典型的自我復制的DNA或RNA構建體，該構建體含有所需的基因或其片段，并且操作性連接遺傳控制元件，該控制元件可被合適的宿主細胞識別且影響所需基因的表達。這些控制元件能夠在合適的宿主中影響表達。通常，遺傳控制元件可以包括原核啟動子系統或真核啟動子表達控制系統。這個系統典型地包括轉錄啟動子、任選控制轉錄開始的操縱基因、提高RNA表達水平的轉錄增強子、編碼合適的核糖體結合位點的序列、RNA剪接點、終止轉錄和翻譯的序列等等。表達載體通常含有復制起點使得載體在宿主細胞中獨立地復制。
質粒是最常用的載體類型，但有同等功能又為本領域所知或漸知的其它載體類型也適合本文引用。參見例如Pouwels等，CloningVectorsa Laboratory Manual(1985及附錄)，Elsevier，N.Y.；和Rodriquez等(編著)Vectorsa Survey of Molecular Cloning Vectors andtheir Uses，Buttersworth，Boston，Mass(1988)，所有這些文獻都通過引用結合到本文中。
此外，通常這種載體還含有特異性基因，該基因能夠提供轉化細胞的表型選擇。也考慮了用原核和真核病毒表達載體來表達編碼本發明多肽的基因。
任選載體可以是一般的植物載體(如以下實施例所述)。或者，載體可以任選是根細胞特異性的載體。
在一個優選的實施方案中，本發明的宿主細胞可以是真核細胞或原核細胞。
在一個具體的實施方案中，本發明的宿主細胞是原核細胞，優選細菌細胞，最優選根癌土壤桿菌細胞。這些細胞用來感染如下所述的優選的植物宿主細胞。
在另一個優選的實施方案中，本發明的宿主細胞可以是真核細胞，優選植物細胞，最優選植物根細胞，選自發根土壤桿菌轉化的植物根細胞、芹菜細胞、姜細胞、辣根細胞和胡蘿卜細胞。
在一個優選的實施方案中，植物根細胞是胡蘿卜細胞。應當注意的是，懸浮培養本發明的轉化胡蘿卜細胞。如上所述及實施例中所述，這些細胞用本發明的根癌土壤桿菌細胞轉化。
根據本領域技術人員已知的方法，可將用于轉染或轉化本發明的宿主細胞的表達載體或重組核酸分子做進一步修飾，以添加、去除或者修飾肽信號序列以改變信號肽切割或通過植物內膜系統增加或改變已表達溶酶體的靶向。例如但不限于可以將表達構建體進行特殊的工程改造以靶向溶酶體酶分泌或液泡定位或內質網(ER)保留。
在一個實施方案中，可以將表達載體或重組核酸分子進行工程改造，以把編碼靶向溶酶體酶的信號的核苷酸序列摻入植物液泡中。例如但不限于此，包含在本發明宿主細胞內的重組核酸分子，包含編碼溶酶體酶的第一核酸序列，所述第一核酸序列與編碼源自堿性煙草殼多糖酶A基因的液泡靶向信號肽的第二核酸序列操作性連接。這種液泡信號肽具有由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列。第一核酸序列還可以任選以操作性連接方式與編碼由SEQ ID NO1表示的ER(內質網)靶向信號肽的第三核酸序列連接。在一個實施方案中，包含在本發明的宿主細胞內的重組核酸分子還包含在植物細胞內起作用的啟動子。這種啟動子應該與本發明的重組分子操作性連接。
本文所用的術語“操作性連接”是指，當第一核酸序列與第二個核酸序處于功能關系時，則第一核酸序列與第二核酸序列操作性連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表達，則啟動子與編碼序列操作性連接。任選和優選地，操作性連接的DNA序列是毗連的(例如物理連接的)，必要時在同一讀框內連接兩個蛋白質-編碼區。因此，當合適的分子(例如轉錄激活蛋白質)與調節序列結合時，DNA序列和調節序列用基因能夠表達的方式相連接。
在另一個實施方案中，該重組核酸分子還可以任選包含操作性連接的終止子，優選在植物細胞內起作用的終止子。本發明的重組核酸分子還可以任選包含另外的控制、啟動和調節元件和/或選擇標記。應當注意的是，這些調節元件與所述重組分子操作性連接。
可用于表達構建體中的調節元件包括啟動子，其對于植物細胞而言可以是異源的或是同源的。啟動子可以是植物啟動子或非植物啟動子，其能夠驅動植物細胞和植物里的連接的序列高水平轉錄。可以有效地用來實踐本發明的植物啟動子的非限制性實例包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S、rbcS、葉綠素a/b結合蛋白的啟動子、AdhI、NOS和HMG2或其修飾物或衍生物。啟動子可以是組成型的或是誘導型的。例如但不限于在植物、植物組織或植物細胞的機械性基因激活(MGA)后，誘導型啟動子可以是啟動或增加溶酶體酶核苷酸序列表達的啟動子。
根據本領域技術人員已知的方法，將用于轉染或轉化本發明宿主細胞的表達載體另外修飾，以提高或優化異源基因在植物和植物細胞中的表達。這樣的修飾包括但不限于使DNA調節元件突變以增加啟動子強度或改變目標蛋白。
在一個優選的實施方案中，由本發明宿主細胞產生的目標高甘露糖蛋白可以是具有至少一個暴露甘露糖殘基(至少一個末端甘露糖殘基)的高甘露糖糖蛋白。
根據另一個優選的實施方案，這種高甘露糖蛋白可以是選自以下的溶酶體酶葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
本文所用的術語“溶酶體酶”，對于通過用本發明所述的植物表達系統產生的任何這種酶和產物，是指在轉基因植物細胞中，由編碼人或動物的溶酶體酶、經修飾的人或動物的溶酶體酶或該酶的片段、衍生物或修飾物的核苷酸序列，在轉基因植物細胞中所表達的重組肽。有用的經修飾的人或動物的溶酶體酶包括但不限于具有一個或幾個天然或人工導入的氨基酸添加、缺失和/或取代的人或動物的溶酶體酶。
可溶性溶酶體酶和分泌性蛋白共享起始的生物合成步驟，即在核糖體上的合成，N端信號肽與粗面內質網(ER)表面的結合，轉運到ER腔內，在此信號肽被切割，并將寡糖添加到特異性天冬酰胺殘基上(N-聯)，接下來新生蛋白質在高爾基體中進一步修飾[von Figura和Hasilik，Annu.Rev.Biochem.55167-193(1986)]。N-聯寡糖可以是復合的、多種多樣的和不均一的，并且可含有高甘露糖殘基。蛋白質在后ER、前高爾基體區室和順式高爾基體內進一步加工形成依賴N-聯甘露糖6-磷酸(M-6-P)寡糖的或不依賴N-聯M-6-P寡糖的溶酶體定位酶的識別信號[Kornfeld & Mellman，Ann.Rev.Cell Biol.，5483-525(1989)；Kaplan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 742026(1977)]。M-6-P識別信號的存在導致酶與M-6-P受體(MPR)的結合。這些結合的酶保留在細胞中，最后被包裝到溶酶體，因此與靶向分泌或質膜的蛋白分離。
在一個優選的實施方案中，溶酶體酶可以是人葡糖腦苷脂酶(GCD)。
再者，在一個具體的實施方案中，將這種優選的宿主細胞用重組核酸分子轉化或轉染，該重組核酸分子還包含來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子，優選具有由SEQ ID NO9表示的核酸序列；根癌土壤桿菌的章魚堿合酶終止子，優選具有由SEQ ID NO12表示的核酸序列；和TMV(煙草花葉病毒)Ω翻譯增強子元件。根據一個優選實施方案，這種重組核酸分子包含基本上如SEQ ID NO13所示的核酸序列并編碼有著基本上如SEQ ID NO14所示的氨基酸序列的高甘露糖GCD。
應該了解的是，本發明還提供包含編碼生物活性高甘露糖溶酶體酶的核酸分子的表達載體。
在這方面的一個優選的實施方案中，本發明的表達載體包含編碼生物活性高甘露糖人葡糖腦苷脂酶(GCD)的核酸分子。優選這種優選表達載體包含具有基本上如SEQ ID NO13所示的核酸序列的重組核酸分子。根據一個具體的實施方案，如以下實施例1所述，優選的表達載體利用pGREEN II質粒。
還應當注意的是，本發明提供包含在如上所述的表達載體內的表達盒。
第二方面，本發明涉及由本發明宿主細胞產生的重組高甘露糖蛋白。
在一個優選實施方案中，這種高甘露糖蛋白可以是選自以下的生物活性高甘露糖溶酶體酶葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。最優選這種溶酶體酶可以是人葡糖腦苷脂酶(GCD)。
本文所用的術語“生物活性”，對于用植物表達系統產生的任何重組溶酶體酶，是指重組溶酶體酶能夠以可檢測的水平水解相應的人或動物溶酶體酶的天然底物或類似物或合成底物。
再者，本發明提供重組生物活性高甘露糖溶酶體酶，其具有至少一個包含暴露甘露糖殘基的寡糖鏈。
根據一個優選實施方案，本發明的重組溶酶體酶可以與靶部位的靶細胞上的甘露糖受體結合。優選這個部位可以是在溶酶體貯積病患者的體內。
任選和更優選地，重組溶酶體酶對于靶細胞的親和力比天然存在的溶酶體酶對于靶細胞的相應親和力大。在一個具體的實施方案中，靶部位的靶細胞可以是患者肝內的枯否細胞。
在一個優選的實施方案中，重組溶酶體酶可選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。
最優選這種重組溶酶體酶是葡糖腦苷脂酶(GCD)。
第三方面，本發明涉及生產高甘露糖蛋白的方法。因此，本發明的方法包括下述步驟(a)制備重組宿主細胞的培養物，該宿主細胞已用編碼目標重組蛋白的重組核酸分子或用包含所述重組核酸分子的表達載體轉化或轉染；(b)在高甘露糖蛋白能夠表達的條件下，懸浮培養步驟(a)所制備的宿主細胞培養物，其中所述宿主細胞產生高度甘露糖基化形式的蛋白；(c)從(a)步驟提供的培養物中收獲細胞并且從細胞中回收蛋白；(d)通過合適的蛋白質純化方法純化步驟(c)的蛋白。
任選和優選地，根據本發明，可能通過在某一裝置中培養植物細胞產生重組蛋白，該裝置在2002年5月21日授權的美國專利第6,391,638號中有描述，該專利通過引用全部結合到本文中。用這種裝置懸浮培養植物細胞的條件，參見美國專利申請″CELL/TISSUECULTURING DEVICE，SYSTEM AND METHOD″，其中一位是本發明的發明人之一，并且共同擁有本申請，該專利申請通過引用全部結合到本文中且與本申請在同一天提交。
可能會在以下的實施例中發現一個具體的和非限制性的回收和純化用本發明方法生產的目標高甘露糖蛋白的實例。這個實例顯示通過本發明生產的重組h-GCD，意想不到地與本發明的轉化胡蘿卜細胞的內膜結合而沒有分泌到培養基中。根據本領域已知的方法例如過濾或沉淀，將可溶性rh-GCD與細胞碎片和其它不溶性組分分離。例如，凍-融循環后，細胞經過破碎而釋放胞內可溶性蛋白，而h-GCD保持與不溶性膜碎片結合。將這種可溶性和不溶性膜碎片混合物再離心，去除可溶性級分從而簡化純化。然后在有溫和的去污劑、蛋白酶抑制劑和中和氧化劑時，通過機械破碎使膜結合的h-GCD溶解。可以用層析技術進一步純化可溶性酶，例如陽離子交換和疏水作用層析柱。在rh-GCD在生物反應器的生產和純化過程中，通過一個或多個生化檢測可以確定h-GCD的身份、產率、純度和酶活性。包括但限于測試酶底物或底物類似物的水解作用、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析和免疫學分析，例如ELISA和蛋白質印跡。
根據一個優選實施方案，這種方法所使用的宿主細胞包含本發明的宿主細胞。
在另一個優選實施方案中，用本發明方法所生產的高甘露糖蛋白可以是生物活性高甘露糖溶酶體酶，其具有至少一個包含暴露甘露糖殘基的寡糖鏈。
這種重組酶可以與靶部位的靶細胞上的甘露糖受體結合。更具體地說，用本發明方法生產的重組酶對于靶細胞的親和力比天然存在的溶酶體酶對于靶細胞的相應親和力大。因此，靶部位的靶細胞可以是患者肝內的枯否細胞。
在一個具體的實施方案中，這種溶酶體酶可選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。最優選這種溶酶體酶可以是葡糖腦苷脂酶(GCD)。
在另一個優選實施方案中，本發明方法所用的宿主細胞可以是選自以下的植物根細胞發根土壤桿菌轉化的根細胞、芹菜細胞、姜細胞、辣根細胞和胡蘿卜細胞。最優選植物根細胞是胡蘿卜細胞。應當特別注意的是，懸浮培養所述轉化宿主胡蘿卜細胞。
再一方面，本發明涉及用外源重組溶酶體酶治療患有溶酶體貯積病的患者、優選哺乳動物患者的方法。
根據所公開的和描述的，可以理解為，本發明不受本文公開的具體實施例、方法步驟和原料的限制，因此方法步驟和原料可能會有稍許不同。也可以理解為，由于本發明的范圍只受所附權利要求書及其等同實施方案的范圍的限制，因此本文所用的術語僅用于描述具體的實施方案，而無意限制。
在本發明說明書和所附權利要求書的全文中，除非上下文另有要求，否則用語“包括”和類似的說法如“包含”和“含有”可以理解為意味著包括指出的整數、步驟或整數群，但并不排除任何其它整數、步驟或整數群或步驟群。
下面的實施例是發明人實施本發明各方面所用技術的代表。應該理解為，如果這些技術是實踐本發明的示例性的優選實施方案，那么根據本文記載的內容，本領域技術人員將會認識到，在不偏離本發明的精神和范圍的情況下，可以對本發明進行各種修改。
實施例實驗程序質粒載體*CE-T——是由得自Galili教授[美國專利第5,367,110號，1994年11月22日]的質粒CE構建的。質粒CE用SalI消化。
用DNA聚合酶I的大片段將SalI黏端做成平端。然后質粒用PstI消化，連接到DNA片段上，該片段編碼堿性內切殼多糖酶基因[擬南芥(Arabidopsis thaliana)]ATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTTCTCATCTTTTCACTTCTCCTATCATTATCCTCGGCCGAATTC的ER靶向信號，來自煙草殼多糖酶AGATCTTTTAGTCGATACTATG的液泡靶向信號用SmaI和PstI消化。
*pGREENII——得自P.Mullineaux博士[Roger P.Hellens等，(2000)Plant Mol.Bio.42819-832]。pGREENII載體的表達處于花椰菜花葉病毒的35S啟動子、TMV(煙草花葉病毒)Ω翻譯增強子元件和根癌土壤桿菌的章魚堿合酶終止子序列的控制之下。cDNAhGCD——得自ATCC(保藏號65696)，GC-2.2[GCS-2kb；λ-EZZ-γ3，智人(Homo sapiens)]，含有葡糖苷酶β酸性[葡糖腦苷脂酶]。插入片段長度(kb)2.20；組織成纖維細胞WI-38細胞。
表達質粒的構建用正向引物5′CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3′和反向引物5′CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3′擴增編碼hGCD(ATTC克隆號65696)的cDNA。純化的PCR DNA產物用內切核酸酶EcoRI和BglII(參見引物中加下劃線的識別序列)消化，連接到用相同酶消化的表達盒E-T的中間載體。表達盒用限制酶SmaI和XbaI切割并與中間載體經冼脫分開，再連接到雙元載體pGREENII，形成最終的表達載體。與pGREEN載體(圖1B)一起獲得的nos啟動子驅動的NPTII基因賦予卡那霉素抗性。所獲得的表達盒見圖1A。
用下列測序引物5′35S啟動子5′CTCAGAAGACCAGAGGGC3′和3′終止子5′CAAAGCGGCCATCGTGC 3′，將所獲得的質粒測序以保證信號正確的符合讀框的融合。
胡蘿卜愈傷組織及細胞懸浮培養物的建立如上所述，按Torres K.C.(《園藝作物的組織培養技術(Tissueculture techniques for horticular crops)》，第111、169頁)建立胡蘿卜愈傷組織和細胞懸浮培養物。
胡蘿卜細胞的轉化及轉化細胞的分離用經修改的前述方法[Wurtele，E.S.和Bulka，K.Plant Sci.61253-262(1989)]，用土壤桿菌轉化胡蘿卜細胞。在整個過程中，用液體培養基培養的細胞代替愈傷組織。培養和生長時間都要適應細胞在液體培養物中的轉化。概括地說，按照電穿孔法[den Dulk-Ra，A.和Hooykaas，P.J.(1995)Methods Mol.Biol.5563-72]，土壤桿菌用pGREENII載體轉化，然后用30mg/ml巴龍霉素抗生素進行選擇。胡蘿卜細胞用土壤桿菌轉化，然后在液體培養基中用60mg/ml巴龍霉素抗生素進行選擇。
篩選轉化的胡蘿卜細胞以分離出高水平表達GCD的愈傷組織轉化后14天，將培養物中的細胞以稀釋度為3％收集細胞體積接種到固體培養基上，以從單個細胞簇形成愈傷組織。當各個愈傷組織直徑達到1-2cm時，用SDS樣品緩沖液將細胞制成勻漿，將所得的蛋白提取物在SDS-PAGE上進行分離[Laemmli U.，(1970)Nature227680-685]，轉移到硝酸纖維素膜(hybond C硝酸纖維素，0.45微米，產品目錄號RPN203C，Amersham Life Science)上。用多克隆抗hGCD抗體(本文下面描述)進行蛋白質印跡法以檢測GCD。將表達顯著水平GCD的愈傷組織擴展和轉移到液體培養基中生長，以便進行擴大培養、蛋白質純化和分析。
多克隆抗體的制備將75微克重組GCD(重組葡糖腦苷脂酶注射劑TM)懸浮在3ml弗氏完全佐劑中，給兩只兔子注射。兩周后給每只兔子加強注射。加強注射后約10天，從兩只兔子抽血，以后每隔一周抽血直至抗體滴度開始下降。去除血塊后，將血清分成等份并貯藏于-20℃。
用生物反應器擴大培養將含有rh-GCD基因經遺傳修飾的胡蘿卜細胞的約1cm(直徑)的愈傷組織接種到Murashige和Skoog(MS)9cm直徑瓊脂培養板上，該板中裝有4.4g/L MSD培養基(Duchefa)、9.9mg/L鹽酸硫胺素(Duchefa)、0.5mg葉酸(Sigma)、0.5mg/L生物素(Duchefa)、0.8g/L酪蛋白水解產物(Ducifa)、糖30g/L和激素2-4D(Sigma)。愈傷組織于25℃培養14天。
通過在MSD液體培養基(含有0.2mg/L 2，4-二氯乙酸，Murashige& Skoog(1962))中傳代培養轉化的愈傷組織來制備懸浮細胞培養物，這是本領域眾所周知的。將懸浮細胞在250ml錐形瓶(工作體積開始為25ml，7天后增加到50ml)中以60rpm的搖動速度于25℃進行培養。接著，在相同條件下，由于將工作體積增加到300ml，因此細胞培養物的量有所增加因而轉入1L的錐形瓶中。用兩個1L錐形瓶中培養了7天的400ml懸浮細胞，作為有4L MSD培養基的小生物反應器(10L)[參見WO98/13469]的接種物。以1Lpm的氣流于25℃培養1周后，將MDS培養基增加至10L，并且在相同條件下繼續培養。再培養5天后，用80μ的網過濾細胞培養基收獲和收集絕大部分細胞。擠出多余的培養基，將壓緊細胞決貯藏于-70℃。
于2002年5月21日授權的美國專利第6,391,638號中，可以發現有關生物反應器裝置的詳細內容，該專利通過引用結合到本文。
蛋白質純化為了將培養基與不溶性GCD分開，將含有約100g濕重細胞的冷凍細胞塊解凍，接下來，將解凍的細胞在4℃以17000xg離心20分鐘。將不溶性材料和完整的細胞通過重懸浮在100ml洗滌緩沖液(20mM磷酸鈉pH 7.2、20mM EDTA)中進行洗滌，然后在4℃以17000xg離心20分鐘使其沉淀。用200ml提取緩沖液(20mM磷酸鈉pH 7.2、20mM EDTA、1mM PMSF、20mM抗壞血酸、3.8g聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、1mM DTT和1％Triton-X-100)，將沉淀制成勻漿以提取和溶解rh-GCD(重組人GCD)。然后于室溫將勻漿振蕩30分鐘，在4℃以17000xg離心20分鐘使其澄清。棄沉淀，并通過加入濃檸檬酸，將上清液的pH調至pH5.5。在上述相同條件下，通過離心使pH調整后生成的渾濁物澄清。
通過層析柱方法如下進一步純化將200ml澄清的培養基加到20ml強陽離子交換樹脂(Macro-Prep high-S support，Bio-Rad)上，該樹脂已用25mM檸檬酸鈉緩沖液平衡并裝在XK柱(2.6×20cm)里。將柱子與AKTA主系統(Amersham Pharmacia Biotech)連成一體，以便監測電導率、pH和280nm的吸光度。樣品以20ml/min的速度上樣，然后用平衡緩沖液(25mM檸檬酸鈉緩沖液pH 5.5)以12ml/min流速洗滌柱子直到UV吸光度達到基線。用含有200mM NaCl的平衡緩沖液初步洗脫rh-GCD，并用含有600mM NaCl的平衡緩沖液獲得洗脫液。通過酶活性測定來監測在洗脫過程中所收集的流分，將顯示酶活性(在冼脫峰中)的試管合并。合并的樣品用含5％乙醇的水稀釋(1∶5)，并用NaOH將pH調至6.0。將含有rh-GCD的樣品加到第二個XK柱(1.6×20cm)上，第二個柱子中裝有10ml和前一個柱中相同的樹脂。將該柱中的樹脂用含有5％乙醇的20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)平衡。將樣品加到柱子上后，柱子用平衡緩沖液洗滌，然后用洗脫緩沖液(20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)、5％乙醇和1M NaCl)從柱子中洗脫出GCD。將洗脫步驟中的各吸收峰流分合并，加到第三個柱子上。
在裝有8ml疏水作用樹脂(TSK凝膠，Toyopearl Phenyl-650C，Tosoh Corp.)的XK柱(1.6×20cm)上，進行最后的純化步驟。樹脂用含有5％乙醇的10mM檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)平衡。從前面柱子洗脫的GCD以6ml/min的速度上樣，隨后用平衡緩沖液洗滌直到UV吸光度達到基線。純GCD用含有50％乙醇的10mM檸檬酸緩沖液洗脫，合并并貯藏于-20℃。
蛋白質濃度的測定使用牛血清白蛋白標準品(流分V Sigma)，通過Lowry/Bradford方法(Bio Rad蛋白質分析)[Bradford，M.，Anal.Biochem.(1976)72248]，測定細胞提取物和流分中的蛋白質濃度。或者，用280nm的吸光度、lmg/ml＝1.4 O.D280來測定均勻的蛋白質樣品濃度。用280/260nm比值求出純度。
GCD酶活性測定用對硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷(Sigma)作為底物，測定GCD的酶活性。測定緩沖液中含有60mM磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液pH＝6、4mMβ-巰基乙醇、1.3mM EDTA、0.15％Trion X-100、0.125％牛磺膽酸鈉。在96孔ELISA板中進行測定，將0-50微升樣品與250微升測定緩沖液一起孵育，加入底物至最終濃度為4mM。反應物于37℃孵育60分鐘。通過405nm的吸光度可檢測產物(對硝基苯基；pNP)形成。在t＝0和終點監測405nm的吸光度。60分鐘后，向各孔中加入6微升5NNaOH，并再次監測405nm的吸光度。用平行測定的參照標準曲線，對試驗樣品中的GCD濃度進行定量[Friedman等，(1999)Blood，93(9)2807-16]。
生化分析凝膠蛋白水解分析和質譜法分析用干凈的薄刀片將染色的蛋白條帶切下，凝膠中的蛋白用10mMDTT還原并用含100mM碘乙酰胺的10mM碳酸氫銨進行修飾。用含50％乙腈的10mM碳酸氫銨處理凝膠條以除去蛋白質中的染料，隨后干燥凝膠條。用含10％乙腈的10mM碳酸氫銨將干燥的凝膠條再水化，每份樣品中含有約0.1μg胰蛋白酶。將凝膠條于37℃保溫過夜，用60％乙腈、0.1％三氟乙酸鹽回收所得肽。
用本身填裝了多孔R2(Persepective)的0.1×300mm熔凝硅石毛細管(J&W，100微米ID)，通過反相色譜解析胰蛋白酶消化肽。以約1μ/min的流速，使用含5-95％乙腈/0.1％乙酸水溶液的80min線性梯度洗脫肽。將柱中的液體電噴霧到離子阱質譜儀(LCQ，Finnegan，SanJose，CA)中。以正離子方式用重復全長MS掃描進行質譜分析，接著用選自第一次MS掃描的大多數顯性離子通過碰撞誘導解離(CID)進行分析。用Sequest軟件[J.Eng和J.Yates，University of Washington andFinnegan，San Jose]，將質譜數據與NR-NCBI數據庫中蛋白質的模擬蛋白酶解和CID進行比較。
根據生產商的說明書，用肽測序儀494A(Perkin Elmer)測定蛋白質氨基端的序列。
腹膜巨噬細胞的GCD攝取已經知道巨噬細胞的GCD的靶向和攝取是由甘露糖/N-乙酰葡糖胺受體介導的，并可用得自小鼠的硫代乙醇酸鹽誘發的腹膜巨噬細胞來確定，如Stahl P.和Gordon S.[J.Cell Biol.(1982)93(1)49-56]中所述。簡要地說，給小鼠(雌性，品系C57-B6)腹膜內注射2.5ml的2.4％Bacto-硫代乙醇酸鹽培養基w/o葡萄糖(Difco，產品目錄號0363-17-2)。4-5天后，用頸脫位處死經處理的小鼠，用磷酸鹽緩沖鹽溶液沖冼腹膜腔。細胞經離心(1000xg，10min)沉淀，懸浮于含10％胎牛血清的DMEM(Beit Haemek，以色列)中。將細胞以1-2×105細胞/孔接種到96孔組織培養板中，于37℃孵育。90分鐘后，未貼壁細胞用PBS洗滌三次，將貼壁巨噬細胞在含有規定量的rh-GCD的培養基中于37℃孵育90分鐘，在200微升最終體積中含量介于0-40微克之間，有和沒有酵母甘露聚糖(2-10，5mg/ml)皆可。孵育后，除去含有過量rGCD的培養基，細胞用PBS洗滌三次，然后用裂解緩沖液裂解(10mM TrispH＝7.3，1mM MgCl2，0.5％NP-40和蛋白酶抑制劑)。將細胞裂解物按上述方法進行體外糖苷酶活性測定以確定細胞攝取的rGCD活性。
實施例1表達質粒的構建本實施例描述示例性表達質粒的構建，并與下面相關的實施例一起使用，詳述如下。
用正向引物5′CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3′(也用SEQ IDNO1表示)和反向引物5′CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3′(也用SEQ ID NO2表示)擴增編碼hGCD(ATTC克隆號65696)的cDNA。
純化的PCR DNA產物用內切核酸酶EcoRI和BglII(參見引物中加下劃線的識別序列)消化并連接到具有用相同酶消化的表達盒CE-T的中間載體。CE-T包括來自堿性內切殼多糖酶基因[擬南芥]的靶向信號MKTNLFLFLIFSLLLSLSSAEA(也用SEQ ID NO3表示)，和來自煙草殼多糖酶A的液泡靶向信號DLLVDTM*(也用SEQ ID NO4表示)。
用限制酶SmaI和XbaI將表達盒從中間載體切下和洗脫并連接到雙元載體pGREENII，形成最終的表達載體。與pGREEN載體(圖1B)一起獲得的nos啟動子驅動的NPTII基因賦予卡那霉素抗性。所得表達盒見圖1A。
用以下的測序引物將所得質粒測序以保證信號正確的符合讀框的融合來自5′35S啟動子的引物5′CTCAGAAGACCAGAGGGC 3′(也用SEQ ID NO5表示)和3′終止子的引物5′CAAAGCGGCCATCGTGC 3′(也用SEQ ID NO6表示)。經確證的克隆hGCD編碼序列用SEQ ID NO7表示。
實施例2胡蘿卜細胞的轉化及篩選表達rhGCD的轉化細胞本實施例描述本發明轉化胡蘿卜細胞的示例性方法，如以下實施例中所用。
用前面[Wurtele和Bulka(1989)，出處同上]描述的土壤桿菌轉化方法來轉化胡蘿卜細胞。將經遺傳修飾的胡蘿卜細胞接種到含有抗生素的Murashige和Skoog(MS)瓊脂培養基上供選出轉化體用。如圖2所示，使用抗hGCD抗體，通過蛋白質印跡分析，測試從愈傷組織制備的提取物的GCD的表達，并與重組葡糖腦苷脂酶注射劑標準(陽性對照)和未轉化的細胞提取物(陰性對照)進行比較。從各種所測試的愈傷組織中選出一種愈傷組織(22號)進行擴大培養和蛋白質純化。
如下進行蛋白質印跡。
關于這種試驗，將所得樣品的蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中進行分離，然后轉移到硝酸纖維素上。為此，如下制備SDS聚丙烯酰胺凝膠。該SDS凝膠由濃縮膠和分離膠組成(根據Laemmli，UK1970，Cleavage of structural proteins during assembly of the head ofbacteriphage T4，Nature 227，680-685)。分離膠的組成如下12％丙烯酰胺(Bio-Rad)、每10ml凝膠溶液4微升TEMED(N，N，N′，N′-四甲基乙二胺；Sigma目錄號T9281)、1％SDS、375mM Tris-HCl pH 8.8和0.1％過硫酸銨(APS)，在本文中TEMED和過硫酸銨用作聚合反應的自由基起子。從聚合反應開始后大約20分鐘，將濃縮膠(3％丙烯酰胺、0.1％SDS、126mM Tris-HCl pH 6.8、0.1％APS和5微升TEMED，每5ml濃縮膠溶液)倒在分離膠上，插入12或18個空格梳制成加樣孔。
將陽級槽和陰級槽裝入相同的緩沖液含有SDS的Tris甘氨酸緩沖液pH 8.3(Biorad目錄號161-0772)。含抗原物質用0.5倍體積的樣品加樣緩沖液(30ml甘油(Sigma目錄號G9012)、9％SDS、15ml巰基乙醇(Sigma目錄號M6250)、187.5mM Tris-HCl pH 6.8、500微升溴酚藍，樣品緩沖液每份100ml)進行處理，然后將混合物在100℃加熱5分鐘并加到濃縮膠上。
電泳在室溫下進行適當時間，例如以13×9cm大小的凝膠為例，直流電流強度為50-70伏，45-60分鐘，接著用180-200伏，45-60分鐘。然后將抗原轉移到硝酸纖維素(Schleicher和Schuell，Dassel)上。
基本上按本文描述的方法進行蛋白質轉移。將與硝基纖維素相接的凝膠置于Whatmann 3mm濾紙、導電、0.5cm厚的多孔材料和導電用的電極(鉑電極)之間。用轉移緩沖液(TG緩沖液，Biorad，目錄號161-0771，用甲醇和水緩沖液(20％甲醇)稀釋10倍)徹底浸泡濾紙、多孔材料和硝基纖維素。在4℃以100伏轉移90分鐘。
轉移后，用含有1％奶粉(Dairy America)和0.1％吐溫20(Sigma目錄號P1379)的磷酸緩沖液(Riedel deHaen，目錄號30435)稀釋的封閉緩沖液在4℃過夜，使硝基纖維素上分離的結合部位飽和。印跡條與抗體(用上述含有1％奶粉和0.1％吐溫20的磷酸緩沖液pH 7.5進行稀釋1∶6500)于37℃孵育1小時。
與抗體孵育后，用PBS(磷酸鹽緩沖的磷酸鈉緩沖液(RiedeldeHaen，目錄號30435))洗滌印跡條3次，每次10分鐘。然后將印跡條與適當的第二抗體(山羊抗兔(完整分子)HRP(Sigma目錄號A-4914))于室溫孵育1小時，上述抗體含有1％奶粉(Dairy America)和0.1％吐溫20(Sigma目錄號P1379)的磷酸緩沖液(Riedel deHaen，目錄號30435))按1∶3000稀釋。用PBS洗滌數次后，印跡條用ECL顯色劑(Amersham RPN 2209)染色。
在印跡浸入ECL試劑后，印跡對X-射線膠片(FUJI Super RX18×24)曝光，用FUJI-ANATOMIX顯影劑和定影劑(FUJI-X fix目錄號FIXRTU，2選1)顯影。這樣處理后，可以看到抗體所結合的蛋白特有的條帶。
用生物反應器擴大培養以液體培養基傳代培養轉化的愈傷組織獲得愈傷組織22的懸浮培養物。用錐形瓶振蕩培養細胞直至數量足夠接種生物反應器(如實驗程序所述)。遺傳修飾的轉基因胡蘿卜細胞可培養數月，每5-7天為一個周期收獲細胞(數據未顯示)。在培養的第七天，當胡蘿卜細胞中的rh-GCD產量達到峰值，用100目篩孔的網過濾收獲細胞。值得注意的是，可用本領域已知的過濾或離心方法收獲細胞。收集的細胞塊是制備勻漿純化h-GCD的原料，可冷凍保存。
實施例3從轉化胡蘿卜細胞純化重組活性HGCD蛋白轉化胡蘿卜細胞表達的重組hGCD與細胞內膜結合而未分泌到培養基中。機械破碎細胞留下與不溶性膜碎片結合的rGCD(數據未顯示)。然后，用溫和的洗滌劑溶解rGCD，使其與細胞碎片和其它的不溶性組分分開。再用層析技術，包括在實驗程序中描述的陽離子交換層析和疏水作用層析柱進一步純化可溶性酶。
為了使培養基與不溶性GCD分開，將含約100g濕重細胞的冰凍細胞塊解凍，然后在4℃以17000xg離心20分鐘。將不溶性物質和完整細胞重懸于100ml洗滌緩沖液(20mM磷酸鈉pH 7.2、20mMEDTA)而進行洗滌，并在4℃以17000xg離心20分鐘使其沉淀。用200ml提取緩沖液(20mM磷酸鈉pH 7.2、20mM EDTA、1mM PMSF、20mM抗壞血酸、3.8g聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、1mM DTT、1％Triton-X-100(Sigma))將沉淀制成勻漿，以提取和溶解rGCD。將勻漿于室溫振蕩30分鐘，然后在4℃以17000xg離心20分鐘澄清。棄沉淀，上清液的pH用濃檸檬酸調節至pH 5.5。調節pH后產生的渾濁液，在上述相同條件下通過離心澄清。
如下用層析柱進一步純化第一階段，將200ml澄清的提取物加到20ml強陽離子交換樹脂(Macro-Prep high-S support，Bio-Rad)上，該樹脂已用25mM檸檬酸鈉緩沖液pH 5.5平衡并裝入XK柱(2.6×20cm)內。將柱子與AKTA主系統(Amersham Pharmacia Biotech)連成一體，使能監測電導率、pH和280nm的吸光度。以20ml/min上樣，然后用平衡緩沖液(25mM檸檬酸鈉緩沖液pH 5.5)以12ml/min的速率洗滌柱子直至UV吸光度達到基線。用含有200mM NaCl的平衡緩沖液預洗脫rh-GCD，然后用含有600mM NaCl的平衡緩沖液獲得洗脫液。通過酶活性測定來監測洗脫過程中所收集的流分，合并顯示酶活性(在洗脫峰內)的試管。合并的樣品用含有5％乙醇的水稀釋(1∶5)，并用NaOH調節pH至6.0。
圖3A代表該純化階段的標準洗脫圖。該洗脫過程中所收集的流分通過酶活性測定來監測，如圖3B所示，而圖3C顯示經活性測定的洗脫流分的考馬斯藍染色。
第二純化階段，將含有rGCD的洗脫流分加到第二個XK柱(1.6×20cm)上，柱子內裝有10ml與前述柱子相同的樹脂。用含有5％乙醇的20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)平衡這個柱子里的樹脂。將樣品加到柱子上之后，用平衡緩沖液洗滌，然后用洗脫緩沖液(20mM檸檬酸鹽緩沖液pH 6.0、5％乙醇和1M NaCl)從柱子中洗脫出rGCD。圖3D代表該純化階段的標準洗脫圖。該洗脫過程中所收集的流分通過酶活性測定來監測，如圖3E所示，而圖3F顯示經活性測定的洗脫流分的考馬斯藍染色。
第三純化階段，將洗脫步驟中有吸收峰的各流分合并并加到第三個柱子上。在裝有8ml疏水作用樹脂(TSK凝膠，Toyopearl Phenyl-650C，Tosoh Corp.)的XK柱子(1.6×20cm)上進行第三純化階段。用含有5％乙醇的10mM檸檬酸鹽緩沖液(PH6.0)平衡樹脂。前面柱子的GCD洗脫液以6ml/min速率上樣，隨之用平衡緩沖液洗滌直至UV吸光度達到基線。純的GCD用含有5％乙醇的10mM檸檬酸緩沖液洗脫，合并并貯藏于-20℃。
圖4A代表該純化階段的標準洗脫圖。該洗脫過程中所收集的流分通過酶活性測定來監測(圖4B)，而圖4C顯示經活性測定的洗脫流分的考馬斯藍染色。
經處理的細胞的分批純化，可使rGCD蛋白純化至純度大于95％；如果只進行第一階段和第三階段，可使純度達到約80％(結果未顯示)。
生物化學分析為了鑒定純化的rhGCD，采用質譜質譜(MSMS)分析。所得結果表明蛋白質序列的復蓋范圍為49％，這與根據表達盒的DNA(包括先導肽和靶向序列)所預期的氨基酸序列一致。
重組hGCD在腹膜巨噬細胞內的攝取和活性為了確定胡蘿卜中產生的rhGCD是否已經正確地糖基化并可以被靶細胞攝取，從而可用于治療戈謝病，也就檢測了rhGCD與巨噬細胞結合并被它攝取的能力。靶向巨噬細胞的rhGCD受甘露糖/N-乙酰萄糖胺(Man/GlcNAc)受體的介導，因而可用硫代乙醇酸鹽誘發的腹膜巨噬細胞進行測定。如圖5所示，細胞高水平攝取rGCD。圖5A顯示，細胞所攝取的本發明的rGCD與甘露聚糖濃度有關。
圖5A顯示的攝取水平與重組葡糖腦苷脂酶注射劑TM相近(此制劑只用上述純化工藝的第一和第三階段，80％的純度)。
圖5B和圖5C顯示rGCD的攝取高于重組葡糖腦苷脂酶注射劑TM，用上述純化工藝的所有三個階段純化制劑純度都大于95％。
對于圖5C，本發明的GCD(rGCD或重組人GCD)受4mg/ml甘露聚糖抑制的比活與總活性的百分比明顯高于市場上現有的下述產物GCD(CB-mixl，是本發明的rGCD)-75％重組葡糖腦苷脂酶注射劑-65％。
此外，如附圖所示，添加甘露聚糖明顯抑制細胞結合rGCD。甘露聚糖濃度為2mg/ml時，rGCD的結合被抑制50％。
這些結果表明，即使聚糖結構沒有重塑，轉化胡蘿卜細胞所表達并經純化的rhGCD通過Man/GlcNAc受體特異性地攝取到靶巨噬細胞。此外，這種重組rhGCD有酶催化活性。
圖5D顯示，用蛋白質印跡法，rhGCD為抗GCD抗體所識別；rGCD是指本發明的蛋白，而GCD標準品(每泳道約5ng、10ng和25ng)是市售的GCD(重組葡糖腦苷脂酶注射劑)。
實施例4毒理學試驗按照標準毒理學試驗方案(Guidance for Industry on Single DoseAcute Toxicity Testing for Pharmaceuticals，Center for Drug Evaluationand Research(CDER)PT 1(61FR 43934，1996年8月26日)并通過ICHM3(M)Non-clinical Safety Studies for the Conduct of Human ClinicalTrials for Pharmaceuticals CPMP/ICH/286/95modification，Nov 16 2000)檢驗用上述純化方法獲得的物質。
對小鼠作如下注射。初始劑量1.8mg/kg(臨床劑量)，隨后劑量為9mg/kg和18mg/kg。試驗組的6只小鼠(ICR CD-1；雌雄各3只)接受本發明的rGCD(液體載體中含有25mM檸檬酸鹽緩沖液、150mMNaCl、0.01％吐溫80、5％乙醇)，而另外6只小鼠單用載體處理作為對照組。然后觀察小鼠14天并實施安樂死。在實施安樂死前并沒有小鼠死亡。沒有小鼠顯示處理的明顯影響。沒有找到任何小鼠有顯著的病理學發現和/或體重改變。
實施例5糖基化分析對按前述實施例所描述的方法所得rGCD上的聚糖結構進行了分析。就如下面更詳盡的描述，結果表明大多數聚糖含有末端甘露糖殘基以及高甘露糖結構。有利的是，這種高甘露糖產物具有生物活性，因而無需進一步的活化步驟。
采用下述方法測定按上述已知實施例所得的重組hGCD的糖基化結構。簡要地說，用水解和GC-MS方法測定N-聚糖和O-聚糖兩者的單糖鍵。這種方法測定糖與肽的鍵合類型以及糖蛋白一般的單糖組成。根據先前的知識和不同單糖間的比例，這種方法可以提示糖蛋白上聚糖的類型。這些信息對于測定蛋白質上可能的聚糖結構是重要的。
另一方法是N-聚糖群體的寡糖分析為特色。要進行FAB-MS和MALDI-TOF MS，隨后用胰蛋白酶和肽N-糖苷酶F(PNGaseF)消化等份的樣品以及聚糖的全甲基化。這個方法用來從酶消化糖蛋白分開和分離N-聯糖。測定分離的聚糖混合液內的聚糖群體的質量，并將它們的質量和那些數據庫和按單糖組成分析中已知結構的質量進行比較。所建議的結構還要以來源生物的糖基化模型作基礎。
另一方法包括分析O-聚糖群體，繼之還原消除胰蛋白酶和PNGase F處理的糖肽，脫鹽和全甲基化。PNGase F不會釋放O-聚糖，因此依然與肽連接的聚糖更像O-聯聚糖。然后通過還原消除反應釋放這些聚糖并分析它們的質量。
單糖組成分析(概述如下)顯示植物糖基化的己糖、己糖胺和戊糖的特征性分布。GlcNac和甘露糖的比例顯示特征性的N-聯結構是主要的聚糖群體。
如上所述制備的hGCD的N-聚糖的質譜分析表明主要的N-聚糖群體的單糖組成為Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc2。
材料與方法用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)、快速原子轟擊-質譜法(FAB-MS)和延遲萃取-襯質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜法(DE-MALDI-TOF MS)，進行分析。
對于寡糖分析，用FAB-MS和MALDI-TOF MS分析N-聚糖群體，繼之用胰蛋白酶和肽N-葡糖苷酶F(PNGaseF)消化等份的樣品以及聚糖的全甲基化。經分析的O-聚糖群體繼之還原消除胰蛋白酶和PNGase F處理的糖肽，脫鹽和全甲基化。
N-聚糖和O-聚糖兩者的單糖鍵都用水解、衍生化GC-MS策略進行測定。
實驗描述樣品給樣品瓶如下編排獨特的樣品號(表1)表1

將樣品置于-10℃和-30℃保存，備用。
蛋白質化學透析完整樣品將一小瓶(裝有1ml蛋白，其濃度為0.8mg/ml)注入Slide-A-Lyzer透析夾(截留分子量10kDa)內，在4℃對水透析24小時，換水3次。透析后從透析夾取出樣品并凍干。
胰蛋白酶消化完整樣品供寡糖篩選用將已透析的凍干樣品重懸于50mM碳酸氫銨緩沖液中，用10％氨水調至pH 8.4，并按SOPs B001和B003用TPCK處理的胰蛋白酶在37℃消化4小時。置于加熱器內95℃下加熱2分鐘后終止反應隨后凍干。
糖化學肽N-糖苷酶A的消化將胰蛋白酶分解的糖蛋白樣品中的肽/糖肽混合物用含于醋酸銨緩沖液pH 5.5中肽N-糖苷酶A(PNGaseA)在37℃處理15小時。凍干終止反應。用C18Sep-Pak柱純化所得產物。
還原消除反應將含有潛在的O-聯糖肽的Sep-Pak流分溶于含10mg/ml硼氫化物的0.05M氫氧化鈉溶液中，在45℃保溫16小時。加冰醋酸終止反應。
還原消除反應物質的脫鹽用Dowex珠按SOP B022進行脫鹽。將樣品上樣并用4ml 5％的醋酸水溶液冼脫。將所收集的流分凍干。
釋放的糖的全甲基化對洗脫在5％醋酸水溶液Sep-Pak流分中的N-聯糖和還原消除反應所釋放的潛在的O-聯聚糖，用氫氧化鈉(NaOH)/甲基碘(MeI)方法(SOP B018)進行全甲基化。全甲基化N-聯聚糖混合物的一部分用FAB-MS和MALDI-TOF MS分析，其余部分作鍵合分析。
N-聯糖的鍵合分析衍生化將胰蛋白酶和PNGase A消化或還原消除反應所得的全甲基化聚糖樣品混合物進行水解(2M TFA，120℃ 2小時)和還原(硼氘化鈉(NaBD4)/2M NH4OH，室溫2小時，SOP B025)。加入3次甲醇冰醋酸(90∶10)混合物以除去硼氘化物分解產生的硼酸鹽，隨后凍干。再用乙酸酐使樣品乙酰化(100℃1小時)。用氯仿萃取純化乙酰化樣品。然后用氣相色譜/質譜聯用(GC/MS)檢查部分甲基化糖醇乙酸酯。部分甲基化糖醇乙酸酯的標準混合物以及空白也在同樣條件下測試。
氣液色譜/質譜聯用(GC/MS)對溶于己烷的等份的(1μl)衍生糖樣品，采用配有Autosystem XL的氣相色譜儀和Dell數據系統的Perkin Elmer Turbomass Gold質譜儀在下述條件進行GC/MS分析氣相色譜法柱子DB5注射柱上注射器溫度40℃程序40℃1分鐘，然后70℃/分鐘至100℃，100℃保持1分鐘，然后8℃/分鐘至290℃，最后290℃保持5分鐘。
載氣氦氣質譜法電離電壓70eV取數方式掃描質量范圍35-450道爾頓MS分辨率單位完整葡糖腦苷脂酶的糖分析衍生化凍干等分為500μg的葡糖腦苷脂酶，以10μg阿糖醇作為內標。然后在80℃過夜甲醇分解，在氮氣氛下干燥。用甲醇、吡啶和乙酸酐溶液使釋放出單糖再N-乙酰化，在氮氣氛下再次干燥，按照SOPB023使其轉化為三甲基甲硅烷基(TMS)衍生物。將TMS衍生物在氮氣下大量還原，溶于2ml己烷并超聲處理3分鐘。置樣品在4℃平衡過夜。平行制備含10μg阿糖醇的空白和標準單糖混合物，其中含巖藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰氨基半乳糖、N-乙酰萄糖胺、N-乙酰神經氨酸和阿糖醇各10μg。然后用氣相色譜/質譜聯用(GC/MS)檢查TMS衍生物。
氣液色譜/質譜聯用(GC/MS)對溶于己烷的等份(1μl)衍生糖樣品采用配有Autosystem XL的氣相色譜儀和Dell數據系統的Perkin Elmer Turbomass Gold質譜儀在下述條件進行GC/MS分析氣相色譜法柱子DB5注射柱上注射器溫度40℃程序90℃1分鐘，然后25℃/分鐘至140℃，5℃/分鐘至220℃，最后10℃/分鐘至300℃，300℃保持5分鐘。
載氣氦氣質譜法電離電壓70eV取數方式掃描質量范圍50-620道爾頓MS分辨率單位延遲萃取襯質輔助激光解吸電離質譜(DE-MALDI-MS)和快速原子轟擊-質譜(FAB-MS)MALDI-TOF質譜法是用Voyager STR生物光譜測定研究站激光-解吸質譜儀，與延遲萃取(DE)相偶聯。
將無水全甲基化聚糖再溶于甲醇∶水(80∶20)中，用2，5-二羥基苯甲酸基質進行分析。緩激肽、血管緊張肽和ACTH用作外部校正。
用M-Scan′s VG AutoSpecE質譜儀，在Vacc＝8kV，質量范圍4500，分辨率約2500，以最大敏感度進行正離子快速原子轟出質譜分析。用銫離子槍在30kV下操作產生質譜。用Opus軟件將質譜記錄在VAX數據系統3100M76上。
將無水全甲基化聚糖溶于甲醇中，加到靶上，在插入源之前已預先用2-4μl硫甘油作為基質將靶涂抹。
結果與討論葡糖腦苷脂酶的TMS糖分析N-聯寡糖的篩選完整糖蛋白透析后用胰蛋白酶消化，而凍干產物用PNGase A消化，再用C18Sep-Pak純化。對5％乙酸水溶液(含N-聯寡糖)流分全甲基化，用低質量范圍碎片離子的衍生寡糖部分獲得FAB質譜，而用高質量范圍的分子離子的衍生寡糖部分獲得DE-MALDI-TOF質譜。
葡糖腦苷脂酶的N-聚糖分析表1列出了FAB譜中的主要碎片離子和MALDI譜中的分子離子。分子離子區(見附錄III)有主信號m/z 1505.8(與組成結構Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc2的[M+Na]+的準分子離子一致)。也檢測了低強準分子離子的范圍與復合結構和高甘露糖結構一致。所測高甘露糖結構的大小范圍從Hex5.HexNAc2m/z 1579.8至Hex8.HexNAc2m/z 2193.0。復雜信號例如得自低強處理的N-聚糖m/z 1331.7(與組成結構為Pent.Hex3.HexNAc2)的[M+Na]+準分子離子一致，或者得自較大N-聚糖例如m/z 1751.0(與具有組成結構Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc3的[M+Na]+準分子離子一致)，m/z 2375.4(與具有組成結構Pent.DeoxyHex2.Hex4.HexNAc4的[M+Na]+準分子離子一致)，m/z 2753.6(與具有組成結構Pent.DeoxyHex3.Hex5.HexNAc4的[M+Na]+準分子離子一致)。
FAB質譜提供憑借低質量質譜區的碎片離子的天然結構的信息，所測得的信號證實己糖(m/z 219)和HexNAc(m/z 260)為N-聚糖中非還原末端單糖。
表2胰蛋白酶和肽N-糖苷酶A消化的葡糖腦苷脂酶(參考號62996)全甲基化后在質譜中所觀測的質量


除非另有說明，否則柱1中的所有質量全是單種同位素的。質量數不一定與原始數據直接相關，因為軟件常將質量數歸于13C同位素峰，特別是對高于1700Da的質量而言。
葡糖腦苷脂酶的N-聚糖的鍵合分析對PNGase A消化、Sep-Pak純化和全甲基化后釋放的N-聯糖進行了鍵合分析。
獲得的復合物色譜圖帶有源自衍生化試劑的某些雜質峰。將保留時間和質譜與標準混合物進行比較得出含糖峰的假定排布，列于表3。
表3胰蛋白酶和肽N-糖苷酶A消化后，在對葡糖腦苷脂酶(參考號62996)進行的GC-MS分析中，所測得的作為它們的部分甲基化糖醇乙酸酯的各種連接的單糖的保留時間

4.3O-聯寡糖的篩選用胰蛋白酶和PNGase A消化后，從Sep-Pak純化的葡糖腦苷脂酶的60％2-丙醇流分(可能的O-聯糖肽流分)進行還原消除反應。終止反應后對樣品脫鹽，除去硼酸鹽后全甲基化。用部分低質量范圍內的碎片離子衍生的寡糖部分獲得FAB質譜，而用高質量范圍內的分子離子衍生的寡糖部分獲得DE-MALDI-TOF質譜。未觀測到O-聯聚糖存在的信號(數據未顯示)。
葡糖腦苷脂酶的O-聚糖的鍵合分析對全甲基化后還原消除反應的產物進行鍵合分析。未觀測到典型的O-聯聚糖存在的信號(數據未顯示)。
圖6顯示一些示例性聚糖結構，將得自哺乳動物細胞的CHO(中國倉鼠卵巢)細胞的GCD(重組葡糖腦苷脂酶注射劑TM)，與本發明的得自胡蘿卜細胞的GCD作比較。如其所示，這些結構的重塑需要為重組葡糖腦苷脂酶注射劑TM獲得暴露的甘露糖殘基。相反，按照本發明，這種暴露甘露糖殘基可直接從得自植物細胞的GCD獲得，無需進一步操作，例如使用糖基化酶。
圖7代表rGCD發現中的主要聚糖結構。圖7顯示所提出的結構屬于a)在胡蘿卜細胞懸液中表達的hGC上占主要的寡糖群體(1505.7m/z)；b)典型的N-聯核心；c)巖藻糖基化植物N-聯核心。N-聯聚糖經由天冬酰胺并通過示意圖右側的GlcNac(GN)殘基的還原末端與蛋白質偶聯。N植物糖基化模式，巖藻糖殘基可能是核心結構的組成部分，用α(1-3)糖苷鍵與第一個GlcNac結合，而哺乳動物的結構通常用α(1-6)糖苷鍵。
圖8A-8D顯示按本發明所測得的rGCD蛋白的N-聚糖的所有可能的結構。
經確認的主要聚糖結構是核心聚糖結構，從豌豆、水稻、玉米和其它食用植物的絕大多數植物糖蛋白中都可發現這種結構。這種結構含一個核心木糖殘基以及一個核心α-(1，3)-巖藻糖。Bardor等(33)所完成的工作指出，在他們的血清中50％非變應性血供體有核心木糖的特異性抗體，25％有核心α-(1，3)-巖藻糖的特異性抗體。然而，仍然有待研究的是這樣的抗體是否可能導致限制植物源性生物藥物糖蛋白的應用。
上述生成的hGCD的次要聚糖群體主要是高甘露糖結構Hex4HexNAc2至Hex8HexNAc2。在復雜結構中顯示有結構如Pent.deoxyHex2.Hex4.HexNAc3和Pent.deoxyHex3.Hex5.HexNAc3。已檢測極少數群體有結構如Pent.Hex3.HexNAc2。
主要末端單糖是己糖(甘露糖或半乳糖)以及N-乙酰己糖胺，這與有高甘露糖結構和部分加工的復雜結構一致。
對于O-聯寡糖篩選，未觀測到與典型O-聯聚糖一致的信號。本領域周知GCD沒有O-聯寡糖，所以這些結果與源自其它細胞系統的GCD的已知的糖基化一致，包括天然GCD和哺乳動物培養系統所生產的重組GCD。然而，在單糖組成內，檢測有與阿拉伯糖一致的信號。
關于本發明重要的一點在于hGCD蛋白N-聚糖的組成分析表明多數N-聚糖末端為甘露糖殘基。這點符合需要甘露糖為末端N-聚糖以促進巨噬細胞甘露糖受體攝取治療用hGCD。然而，無論是天然的GCD還是哺乳動物細胞產生的重組GCD都不是高甘露糖。因此本發明克服了商業生產的hGCD蛋白的重大缺點，這些蛋白質經修飾末端是甘露糖，不同于上述產生的蛋白。
實施例6本發明的治療用途按本發明生產的重組蛋白優選包含用植物細胞培養生產的適當糖基化蛋白，例如優選溶酶體酶和/或高甘露糖糖基化蛋白。
按照本文的優選的實施方案，根據本發明所生產的蛋白適于治療溶酶體相關疾病，例如溶酶體貯積病。
治療方法任選和優選包括(a)提供重組生物活性形式的溶酶體酶，該溶酶體酶是從轉化植物根細胞中純化的并能夠有效靶向異常缺乏溶酶體酶的細胞，在附著的寡糖上，重組生物活性酶有暴露的末端甘露糖；(b)給予患者治療有效量的重組生物活性溶酶體酶或包含它們的組合物。在一個優選的實施方案中，本發明的方法所用的重組高甘露糖溶酶體酶也可以用本發明的宿主細胞生產。優選這種宿主細胞是胡蘿卜細胞。
“哺乳動物受治療者”或“哺乳動物患者”是指需要基因治療的任何哺乳動物，包括人、牛、馬、狗和貓患者，最優選人患者。
應當注意的是，術語“治療”也包括病理疾病和/或其中的一個或多個癥狀的改善或減輕，這種疾病的治愈或預防。
在另一個優選的實施方案中，本發明的方法所用的溶酶體酶也可以是高甘露糖酶，其包含至少一個具有暴露甘露糖殘基的寡糖鏈。這種重組酶可與患者體內的靶部位的靶細胞上的甘露糖受體結合。更優選這種重組溶酶體酶對這些靶細胞的親和力比天然存在的溶酶體酶對靶細胞的相應親和力大。因此，每劑取決于異常缺乏GCD的細胞的有效靶向，并且每劑這種類型的GCD基本上小于天然存在的GCD的劑量，在其他方面都是以類似的方式達到治療效果。
根據本發明的優選的實施方案，所述蛋白適合治療溶酶體酶貯積病，因此本發明也包含治療這種病的方法。溶酶體貯積病包括40多種失調癥狀，是由于編碼能分解細胞溶酶體中的糖脂或多糖廢物的酶的基因有缺陷所致。酶產物例如糖和脂質然后再利用生成新的產物。每一種失調都是由于遺傳性常染色體或X-連鎖隱性性狀所引起的，它影響溶酶體內酶的水平。通常受影響的個體的細胞和組織內受影響的酶沒有生物學活性或功能活性。在這些疾病中，酶功能的缺乏造成體內細胞的溶酶體內的脂質或糖底物的進行性系統性沉積，最終引起器官功能的喪失和死亡。溶酶體貯積病的遺傳病因學、臨床表現、分子生物學或可能性詳見Scriver等[Scriver等(編著)，TheMetabolic and Molecular Basis of Inherited Disease，第7版，第II卷，McGraw Hill，(1995)]。
溶酶體貯積病(及其相關缺陷型酶)的實例包括但不限于法布萊病(Fabry disease)(α-半乳糖苷酶缺乏)、法伯病(Faber disease)(神經酰胺酶缺乏)、戈謝病(葡糖腦苷脂酶缺乏)、Gm1神經節苷脂沉積癥(β-半乳糖苷酶缺乏)、泰-薩病(Tay-Sachs disease)(β-氨基己糖苷酶缺乏)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)(神經鞘磷脂酶缺乏)、Schindler病(α-N-乙酰半乳糖苷酶缺乏)、亨特綜合征(Hunter syndrome)(艾杜糖醛酸酯-2-硫酸酯酶缺乏)、斯賴綜合征(Sly syndrome)(β-葡糖醛酸糖苷酶缺乏)、胡爾勒和胡爾勒/沙伊綜合征(Hurler and Hurler/Scheiesyndrome)(艾杜糖苷酸酶缺乏)和I-Cell/San Filipo綜合征(甘露糖6-磷酸酯轉運蛋白缺乏)。
戈謝病是人類最常見的溶酶體貯積病，在Ashkenazi猶太族人群中發病率最高。在美國大約有5,000-10,000人患有此病[Grabowski，Adv.Hum.Genet.21377-441(1993)]。戈謝病是因缺乏葡糖腦苷脂酶(hGCD，葡萄糖神經酰胺酶)所引起。這種缺乏導致骨髓、脾、肝的網狀內皮細胞內酶底物葡糖腦苷脂的累積，引起嚴重的骨骼并發癥如骨髓膨脹和骨質退化，以及脾機能亢進、肝腫大、血小板減少、貧血和肺并發癥[Grabowski，(1993)出處同上；Lee，Prog.Clin.Biol.Res.95177-217(1982)]。
更準確地講，本發明方法所用的溶酶體酶選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。在治療戈謝病時，本發明方法所用的溶酶體酶優選是葡糖腦苷脂酶(GCD)。
可用本發明的蛋白生產藥物組合物。因此，按照本發明的另一方面，提供一種藥物組合物，所述組合物包含作為活性成分的蛋白以及藥物可按受的載體。本文所用的“藥物組合物”是指在此描述的一種或多種活性成分如重組蛋白與其它化學組分如傳統藥物、生理上合適的載體和賦形劑所組成的制劑。藥物組合物的目的在于將蛋白或細胞方便地給予生物體。本發明的藥物組合物可用本領域眾所周知的方法制備，例如用常規的混合、溶解、制粒、制錠、研磨、乳化、包膠囊、包埋或凍干等方法。
在一個優選的實施方案中，術語“藥物可接受的”是指為聯邦或州政府法定機構所批準的或列入動物、尤其是人用的美國藥典或其他公認的藥典。在下文中，短語“生理上適合的載體”和“藥物可接受的載體”可互換使用，是指已批準的對生物體不造成明顯的刺激也不會消除所給綴合物的生物活性和性質的載體或稀釋劑。
術語“載體”是指給予治療藥時所用的稀釋劑、輔料、賦形劑或溶媒。這些藥用載體可以是無菌液體，例如水和油，包括源自石油、動物、植物或合成的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。當靜脈給予藥物組合物時，水是優選的載體。也可以使用鹽溶液和葡萄糖溶液以及甘油溶液作為液體載體，尤其是用作注射液時。合適的藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。如果需要，所述組合物也可含少量濕潤劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可以為溶液劑、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、緩釋制劑等形式。也可用傳統的粘合劑和載體例如甘油三酯將組合物制成栓劑。口服制劑可包括標準載體例如藥用級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。在E.W.Martin的″Remington′sPharmaceutical Sciences″中描述了合適藥用載體的一些實例。這些組合物將含有治療有效量的蛋白，優選純化形式的蛋白，以及適量的載體，以便給患者提供適當給藥的形式。這種制劑應當適合于給藥方式。
術語“賦形劑”是指加到藥物組合物中使活性成分加工與給藥更有利的惰性物質。賦形劑的實例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、不同規格的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。
活性成分配制和給藥的其它技術可參見″Remington′sPharmaceutical Sciences，″Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版本，該文獻通過引用全部結合到本文中。
本文描述的藥物組合物也包括合適的固體或凝膠相載體或賦形劑。這些載體或賦形劑的實例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物例如聚乙二醇。
合適的給藥途徑可包括例如口服、直腸、經粘膜、透皮、小腸或腸胃外給藥，包括肌內、皮下和髓內注射，以及鞘內、直接心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內或眼內注射。
因此，按照本發明所采用的藥物組合物可以使用一種或多種藥物可接受的載體(包括賦形劑和助劑)按常規方式制備，以便于將活性成分加工成藥用制劑。合適的制劑取決于選擇的給藥途徑。
對于注射，本發明的活性成分可以配制在水溶液，優選生理上相容的緩沖液例如Hank氏溶液、Ringer氏溶液或生理鹽水緩沖液中。對于經粘膜給藥，制劑中使用滲透劑。這些滲透劑是本領域眾所周知的。
對于口服給藥，可通過給予產生本發明蛋白例如GCD的全細胞，任選配制活性成分。也可將活性成分和/或細胞與本領域眾所周知的藥物可接受的載體混合，配制活性成分。這些載體使得本發明的活性成分能制成片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊劑、液體制劑、凝膠劑、糖漿劑、膏劑、混懸劑等，供患者口服用。可以使用固體賦形劑，任選研磨所得混合物，如果需要在添加適當的助劑后，將顆粒混合物加工成片劑或糖衣丸核心，制備口服用藥物制劑。具體地說，合適的賦形劑是填充劑，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制品，例如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃芪樹膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉；和/或生理上可接受的聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解劑例如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽例如藻酸鈉。
給糖衣丸核心包上合適的糖衣。為此，可以使用濃縮糖溶液，其中任選含有阿拉伯樹膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝膠、聚乙二醇、二氧化鈦、漆用溶液和合適的有機溶劑或溶劑混合物。為了鑒別或鑒定活性成分劑量的不同組合的特征，也可以將染料或色素加到片劑或糖衣丸的糖衣里。
可用于口服的藥物組合物包括由明膠制成的兩節式(push-fit)膠囊以及由明膠和增塑劑例如甘油或山梨醇制成的密封軟膠囊。兩節式膠囊的混合物中含有活性成分，另外的填充劑例如乳糖、粘合劑例如淀粉、潤滑劑例如滑石粉或硬脂酸鎂以及任選的穩定劑。至于軟膠囊，活性成分可溶于或懸浮于適當的液體例如脂肪油、液體石臘或液態聚乙二醇中。此外，可加入穩定劑。所有口服給藥用制劑的劑量應當適合所選擇的給藥途徑。
對于經頰給藥，所述組合物可以是按常規方式制成的片劑或錠劑。
對于吸入給藥，可以將本發明所用的活性成分常規地裝在加壓容器或噴霧器中，以氣溶膠噴霧劑形式方便地遞送，其中采用合適的拋射劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。如果是氣霧劑，通過裝一個遞送計量閥來確定劑量單位。制備用于吸入器或吹入器的例如明膠的膠囊和注射用藥筒，其中可含有活性成分和合適的粉末基質例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文描述的活性成分可制備成胃腸道外給藥，例如通過快速濃注或連續輸注。注射用制劑可以為任選加有防腐劑的單位劑型，例如安瓿或多劑量容器。所述組合物也可以是含有油或水性溶媒的混懸劑、溶液劑或乳劑，而且可含有配方劑例如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。
胃腸外給藥用藥物組合物包括水溶性活性制劑的水溶液。此外，活性成分的混懸液可制備成油性注射混懸液。合適的親脂溶劑或載體包括脂肪油例如芝麻油、合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三酯或脂質體。水性注射混懸液可含增加混懸液粘度的物質例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選混懸液也可含合適的穩定劑或增加活性成分溶解度的物質，使能夠制備高濃度溶液。
在一個優選的實施方案中，可按常規方法將組合物制成適合人體靜脈給藥的藥物組合物。通常，靜脈給藥用藥物組合物是無菌等滲緩沖水溶液。一般以單位劑型或分開或混合供給成分，例如以干的凍干粉或無水濃縮物密封于容器例如安瓿或小囊中，標明活性劑的含量。如用輸液給予組合物，可與含無菌的藥用級水或鹽水的輸液瓶一同配藥。如注射給予組合物，可提供注射用的無菌水或鹽水安瓿，給藥前與各成分混合。
本發明的藥物組合物可配制成中性或鹽型。藥物可接受的鹽包括與陰離子例如來自鹽酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等所形成的鹽，以及與陽離子例如來自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等所形成的鹽。
也可將本發明的活性成分制成直腸組合物例如栓劑或滯留型灌腸劑，例如采用常規栓劑基質例如可可脂或其它的甘油酯。
本文描述的藥物組合物亦可包含適當的凝膠相載體或賦形劑的固體。這些載體或賦形劑的實例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物例如聚乙二醇。
任選采用局部途徑，且可藉助于局部載體。局部載體一般適合活性成分的局部給藥，包括本領域已知的任何這類材料。對局部載體進行選擇便于以所需的劑型提供組合物，例如以液體或非液體載體、洗劑、乳膏劑、糊劑、凝膠劑、散劑、軟膏劑、溶劑、液體稀釋劑、滴劑等等，并且也可以含有天然存在的或合成得來的物質。顯然重要的是，所選擇的載體不能對活性成分或局部制劑中的其它組分有不良影響，而且對局部制劑的所有組分都是穩定的。本文所用的合適的局部載體的實例包括水、醇及其它的無毒有機溶劑，甘油、礦物油、硅油、石油膠凍劑、羊毛脂、脂肪酸、植物油、對羥基苯甲酸酯類、蠟等等。本文優選的制劑是無色無味的軟膏劑、液體制劑、洗劑、乳膏劑和凝膠劑。
軟膏劑是半固體制劑，一般是以石油或其它石油衍生物作基質。所用的具體軟膏劑基質，如本領域技術人員所知道的，是能優選遞送活性成分，并且優選也能賦于其它所需特征例如潤滑等。至于其它載體，軟膏劑基質應是惰性的、穩定的、無刺激的和不致敏的。如Remington所解釋的The Science and Practice of Pharmacy，第19版，(Easton，Pa.Mack Publishing Co.，1995)，第1399-1404頁，軟膏劑基質分成4類油質基質；乳化基質；乳劑基質和水溶性基質。油質軟膏基質包括例如植物油、得自動物的脂肪、得自石油的半固體烴。乳化軟膏基質，亦稱吸收軟膏基質，無水或幾乎無水而且包括例如羥基硬脂精硫酸酯、無水羊毛脂和親水石油。乳劑軟膏劑的基質是油包水(W/O)乳劑或水包油(O/W)乳劑，例如包括鯨蠟醇、甘油單硬脂酸酯、羊毛脂和硬脂酸。優選的水溶性軟膏劑基質是由不同分子量的聚乙二醇來制備；再者，更多的信息可參考RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy。
洗劑是無磨擦的施用于皮膚表面的制劑，一般是液體或半液體制劑，其中的固體顆粒包括活性成分，存于水或醇基質中。洗劑通常是固體的懸液，也可以含水包油型液體油乳劑。因為易于使用較多的流體組合物，所以在此優選洗劑作為治療生物體的大面積的制劑。一般需要將洗劑中的不溶物質完全分散。洗劑通常含有懸浮劑以獲得較好的分散性，以及有助于維持局部活性劑與皮膚接觸的活性成分例如甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉等等。
本領域已知的含選擇的活性成分的乳膏劑是粘液或半固體乳劑，即水包油乳劑或油包水乳劑。乳膏劑的基質可水洗，且含油相、乳化劑和水相。油相有時也稱為“內”相，通常由石油或脂肪醇例如鯨蠟醇和十八烷醇組成；水相，雖不必需，但其含量通常超過油相，且一般含有保濕劑。乳膏劑中的乳化劑，如Remington(出處同上)解釋，一般是非離子的、陰離子的、陽離子的或兩性的表面活性劑。
凝膠制劑優選用于頭皮。在局部活性成分制劑領域的工作人員都了解，凝膠是半固體、懸液型系統。單相凝膠含有基本上均勻分布于載體液中的有機大分子，它一般是水性的，但還優選含有醇和任選含有油。
本領域技術人員都知道的各種添加劑，也可以包括在本發明的局部制劑中。例如溶劑也可以用于溶解某些活性成分物質。另一些任選的添加劑包括皮膚滲透增強劑、遮光劑、抗氧化劑、凝膠劑、增稠劑和穩定劑等等。
本發明的局部組合物亦可用常規表皮型貼劑或藥品的皮膚遞送，其中活性成分的組合物含于薄片狀結構內，作為貼在皮膚上的遞藥裝置。在這種結構內，活性成分的組合物含在上面的襯里下的層內，或“貯庫(reservoir)”內。此層狀結構可含一個貯庫或含多個貯庫。在一個實施方案中，貯庫包含藥物可接受的接觸粘合劑物質的聚合物基質，在遞送活性成分時，使系統貼在皮膚上。適當的皮膚接觸粘合劑物質的實例包括但不限于聚乙烯、聚硅氧烷、聚異丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯等等。所選擇的具體聚合物粘合劑取決于具體活性成分、載體等等，而粘合劑必須與含活性成分的組合物的全部成分相容。或者含活性成分的貯庫和皮膚接觸粘合劑是分開的和不同的層，這樣在貯庫下的粘合劑或是上述的聚合物基質，或是液體或水凝膠貯庫，或是某些其它類型。
這些層壓材料的襯里層，作為裝置的表面，是層壓結構的主要結構要素，使裝置具有許多適應性。應選擇不透活性成分也不透含活性成分的組合物的任何其它成分的物質作襯里材料，因而能防止任何成分通過裝置的上表喪失。襯里層可以是包藏的或非包藏的，取決于遞送活性成分時皮膚是否為水合的。襯里優選柔軟高彈體物質的層或片制成。適合作襯里層的聚合物實例包括聚乙烯、聚丙烯和聚酯。
在貯藏和使用前，層壓結構含有釋放襯墊。臨用前，從裝置移去此層露出其基礎的表面，或是活性成分貯庫或是分開的接觸粘合劑層，使得系統貼在皮膚上。此釋放襯墊應由不透活性成分/載體的物質制成。
這種裝置可用本領域周知的常規技術制作，例如將粘合劑流體混合物、活性成分和載體澆注到襯里層，隨之鋪上釋放層。同樣，可將粘合劑、混合物澆注到釋放層，隨之鋪上襯里層。或者在沒有活性成分或賦形劑時制備活性成分貯庫，然后通過“浸泡”在活性成分/載體混合物中來裝填。
至于本發明的局部制劑，含在這些層壓系統的活性成分貯庫內的活性成分組合物也可以含有若干組分。某些情況下，所遞送的活性成分也可以是“純”的，即沒有其它液體。然而，在多數情況下，活性成分是溶于、分散于或懸浮于適當的藥物可接受的載體里，一般是溶劑或凝膠。另一些可能存在的成分包括防腐劑、穩定劑、表面活性劑等等。
應當注意的是，本發明的蛋白例如高甘露糖溶酶體酶，優選以有效量給予有需要的患者。本文所用的“有效量”是指達到所選結果所必需的量。例如，本發明組合物的有效量是選來用于治療溶酶體貯積病。
適宜用于本發明范圍的藥物組合物所包括的組合物，其中所含的活性成分是達到預期目標的有效量。更具體地說，治療有效量是指有效預防、減輕、改善疾病癥狀或延長受治患者的存活時間的活性成分的量。
確定治療有效量正好在本領域技術人員的能力范圍之內，尤其是可按照本文所提供的詳細內容。
關于本發明方法所用的任何活性成分，從動物的活性測定可以初步確定治療上的有效量或劑量。例如劑量的確定可通過動物模型獲得循環濃度范圍，它包括用活性測定所確定的IC50。
本文描述的活性成分的毒性和治療效果可以標準藥學方法用實驗動物確定，例如測定患者活性成分的IC50和LD50(50％試驗動物的致死劑量)。從這些活性測定中和動物研究中所得數據可用來制定人用的劑量范圍。例如，適于治療遺傳病的治療有效劑量可通過用這些疾病的動物模型的實驗確定。
劑量可因所用劑型和所采用的給藥途徑而不同。可由各主治醫師根據患者的病癥選擇準確的制劑、給藥途徑和劑量(參見例如Fingl等，1975，″The Pharmacological Basis of Therapeutics″，第1章，第1頁)。
劑量與時間間隔可逐一調節使活性部分的血漿水平足以保持調節效果，稱為最小有效濃度(MEC)。每個群體的MEC各不相同，但能任選從整體動物數據估計。
用MEC值也可確定劑量的間隔時間。可按給藥方案任選施用制劑，維持10-90％、優選30-90％、最優選50-90％時間的血漿水平高于MEC。
根據所治疾病的嚴重程度和反應性，也可一次施用上述的緩釋組合物，療程數日至數周或直至完全治愈或使疾病減輕。
如果需要，本發明的組合物也可以包裝或分藥裝置呈現，例如FDA所批準的藥盒，其中含有活性成分的一個或多個單位劑型。包裝，例如包括金屬箔或塑料箔，例如泡眼包裝。包裝或分藥裝置也可以附有用藥說明書。包裝和分藥器也附有與容器相關的須知，是由管理藥物生產、使用或銷售的政府機構以法令的形式授權的，這種須知也可以是美國食品及藥物管理局所批準的處方藥的標志或是所批準產品的插頁。用相容的藥用載體也可配制含有本發明活性成分的組合物，將其置于合適的容器內，注明所治療的適應癥。
本文所用的術語“調節”包括疾病進程基本受到抑制、減慢或逆轉，疾病或病癥的臨床癥狀基本緩解，或者基本防止疾病或病癥臨床癥狀的出現。因此，“調節劑”包括可調節疾病或病癥的物質。
序列表SEQ ID NO1信號肽ER的氨基酸序列MKTNLFLFLIFSLLLSLSSAEFSEQ ID NO2來自煙草殼多糖酶A的液泡靶向信號的氨基酸序列DLLVDTMSEQ ID NO3正向引物的核酸序列cagaattcgcccgcccctgcaSEQ ID NO4反向引物的核酸序列ctcagatcttggcgatgccacaSEQ ID NO5來自35S啟動子的正向引物的核酸序列ctcagaagaccagagggctSEQ ID NO6來自終止子的反向引物的核酸序列caaagcggccatcgtgc
SEQ ID NO7用于本發明構建體的人GCD cDNA的核酸序列gcccgccc ctgcatccct aaaagcttcg gctacagctc ggtggtgtgtgtctgcaatg ccacatactg tgactccttt gaccccccga cctttcctgc ccttggtacc ttcagccgctatgagagtac acgcagtggg cgacggatgg agctgagtat ggggcccatc caggctaatc acacgggcacaggcctgcta ctgaccctgc agccagaaca gaagttccag aaagtgaagg gatttggagg ggccatgacagatgctgctg ctctcaacat ccttgccctg tcaccccctg cccaaaattt gctacttaaa tcgtacttctctgaagaagg aatcggatat aacatcatcc gggtacccat ggccagctgt gacttctcca tccgcacctacacctatgca gacacccctg atgatttcca gttgcacaac ttcagcctcc cagaggaaga taccaagctcaagatacccc tgattcaccg agccctgcag ttggcccagc gtcccgtttc actccttgcc agcccctggacatcacccac ttggctcaag accaatggag cggtgaatgg gaaggggtca ctcaagggac agcccggagacatctaccac cagacctggg ccagatactt tgtgaagttc ctggatgcct atgctgagca caagttacagttctgggcag tgacagctga aaatgagcct tctgctgggc tgttgagtgg ataccccttc cagtgcctgggcttcacccc tgaacatcag cgagacttca ttgcccgtga cctaggtcct accctcgcca acagtactcaccacaatgtc cgcctactca tgctggatga ccaacgcttg ctgctgcccc actgggcaaa ggtggtactgacagacccag aagcagctaa atatgttcat ggcattgctg tacattggta cctggacttt ctggctccagccaaagccac cctaggggag acacaccgcc tgttccccaa caccatgctc tttgcctcag aggcctgtgtgggctccaag ttctgggagc agagtgtgcg gctaggctcc tgggatcgag ggatgcagta cagccacagcatcatcacga acctcctgta ccatgtggtc ggctggaccg actggaacct tgccctgaac cccgaaggaggacccaattg ggtgcgtaac tttgtcgaca gtcccatcat tgtagacatc accaaggaca cgttttacaaacagcccatg ttctaccacc ttggccactt cagcaagttc attcctgagg gctcccagag agtggggctggttgccagtc agaagaacga cctggacgca gtggcactga tgcatcccga tggctctgct gttgtggtcgtgctaaaccg ctcctctaag gatgtgcctc ttaccatcaa ggatcctgct gtgggcttcc tggagacaatctcacctggc tactccattc acacctacct gtggcatcgc cag
SEQ ID NO8葡糖腦苷脂酶氨基酸序列A R P C I P K S F G Y S S V VC V C N A T Y C D S F D P P T F P A L G T F SR Y E S T R S G R R M E L S M G P I Q A N H TG T G L L L T L Q P E Q K F Q K V K G F G G AM T D A A A L N I L A L S P P A Q N L L L K SY F S E E G V R L L M L N D Q R L L L P H W A K VV L T D P E A A K Y V H G I A V H W Y L D F L A P A K AT L G E T H R L F P N T M L F A S E A C V G S K F W EQ S V R L G S W D R G M Q Y S H S I I T N L L Y H V VG W T D W N L A L N P E G G P N W V R N F V D S P I IV D I T K D T F Y K Q P M F Y H L G H F S K F I P E G SQ R V G L V A S Q K N D L D A V A L M H P D G S A V VV V L N R S S K D V P L T I K D P A V G F L E T I S P GY S I H T Y L W H R QSEQ ID NO935S啟動子核酸序列TtttcacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctaccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggaacatcgtggaaaaagaagacgtccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacSEQ ID NO10編碼ER信號肽的核酸序列atgaagactaatctttttctctttctcatcttttcacttctc ctatcattatcctcggccgaattcSEQ ID NO11編碼液泡靶向序列的核酸序列gatcttttagtcgatactatg
SEQ ID NO12終止子的核酸序列taatttcatgatctgttttgttgtattcccttgcaatgcagggcctagggctatgaAtaaagttaatgtgtgaatgtgtgaatgtgtgattgtgacctgaagggatcacgactataatcgtttataataaacaaagactttgtcccaaaaaccccccccccngcagaSEQ ID NO13本發明的表達盒的核酸序列ttttcacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctaccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggaacatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacaggcttcttgagatccttcaacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattactatttacaattacagtcgagggatccaaggagatataacaatgaagactaatctttttctctttctcatcttttcacttctcctatcattatcctcggccgaattcgcccgcccctgcatccctaaaagcttcggctacagctcggtggtgtgtctgcaatgccacatactgtgactcctttgaccccccgacctttcctgcccttggtaccttcagccgctatgagagtacacgcagtgggcgacggatggagctgagtatggggcccatccaggctaatcacacgggcacaggcctgctactgaccctgcagccagaacagaagttccagaaagtgaagggatttggaggggccatgacagatgctgctgctctcaacatccttgccctgtcaccccctgcccaaaatttgctacttaaatcgTacttctctgaagaaggaatcggatataacatcatccgggtacccatggccagctgtgacttctccatccgcacctacacctatgcagacacccctgatgatttccagttgcacaacttcagcctcccagaggaagataccaagctcaagatacccctgattcaccgagccctgcagttggcccagcgtcccgtttcactccttgccagcccctggacatcacccacttggctcaagaccaatggagcggtgaatgggaaggggtcactcaagggacagcccggagacatctaccaccagacctgggccagatactttgtgaagttcctggatgcctatgctgagcacaagttacagttctgggcagtgacagctgaaaatgagccttctgctgggctgttgagtggataccccttccagtgcctgggcttcacccctgaacatcagcgagacttcattgcccgtgacctaggtcctaccctcgccaacagtactcaccacaatgtccgcctactcatgctggatgaccaacgcttgctgctgccccactgggcaaaggtggtactgacagacccagaagcagctaaatatgttcatggcattgctgtacattggtacctggactttctggctccagccaaagccaccctaggggagacacaccgcctgttccccaacaccatgctctttgcctcagaggcctgtgtgggctccaagttctgggagcagagtgtgcggctaggctcctgggatcgagggatgcagtacagccacagcatcatcacgaacctcctgtaccatggtcggctggaccgactggaaccttgccctgaaccccgaaggaggacccaattgggtgcgtaactttgtcgacagtcccatcattgtagacatcaccaaggacacgttttacaaacagcccatgttctaccaccttggccacttcagcaagttcattcctgagggctcccagagagtggggctggttgccagtcagaagaacgacctggacgcagtggcactgatgcatcccgatggctctgctgttgtggtcgtgctaaaccgctcctctaaggatgtgcctcttaccatcaaggatcctgctgggcttcctggagacaatctcacctggctactccattcacacctacctgtggcatcgccaagatcttttagtcgatactatgtaatttcatgatctgttttgttgtattcccttgcaatgcagggcctagggctatgaAtaaagttaatgtgtgaatgtgtgaatgtgtgattgtgacctgaagggatcacgactataatcgtttataataaacaaagactttgtcccaaaaaccccccccccngcagaSEQ ID NO14本發明的重組蛋白的氨基酸序列M K T N L F L F L I F S L L L S L S S A E F A R P CI P K S F G Y S S V V C V C N A T Y C D S F D P P T F PA L G T F S R Y E S T R S G R R M E L S M G P I Q A NH T G T G L L L T L Q P E Q K F Q K V K G F G G A M TD A A A L N I L A L S P P A Q N L L L K S Y F S E E G I GY N I I R V P M A S C D F S I R T Y T Y A D T P D D F QL H N F S L P E E D T K L K I P L I H R A L Q L A Q R PV S L L A S P W T S P T W L K T N G A V N G K G S L K GQ P G D I Y H Q T W A R Y F V K F L D A Y A E H K L QF W A V TA E N E P S A G L L S G Y P F Q C L G F T P EH Q R D F I A R D L G P T L A N S T H H N V R L L M LD D Q R L L L P H W A K V V L T D P E A A K Y V H G IA V H W Y L D F L A P A K A T L G E T H R L F P N T ML F A S E A C V G S K F W E Q S V R L G S W D R G M QY S H S I I T N L L Y H V V G W T D W N L A L N P E G GP N W V R N F V D S P I I V D I T K D T F Y K Q P M F YH L G H F S K F I P E G S Q R V G L V A S Q K N D L DA V A L M H P D G S A V V V V L N R S S K D V P L T I KD P A V G F L E T I S P G Y S I H T Y L W H R Q D L L VD T M其他實施方案人們知道，盡管結合發明詳述描述了本發明，但是前面的描述是說明性的，而不是對本發明范圍的限制，本發明的范圍僅由所附權利要求的范圍限定。其他方面、優點和修改都在所附權利要求的范圍之內。
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1.一種生產高甘露糖重組蛋白的宿主細胞，該細胞包含編碼所述重組蛋白和使所產生的重組蛋白作為高甘露糖蛋白的信號的多核苷酸。
2.權利要求1的細胞，其中所述多核苷酸包含編碼所述目標蛋白的第一核酸序列，所述第一核酸序列與編碼信號肽的第二核酸序列操作性連接。
3.權利要求2的細胞，其中所述信號肽包含內質網(ER)靶向信號肽。
4.權利要求3的細胞，其中所述多核苷酸還包含編碼液泡靶向信號肽的第三核酸序列。
5.權利要求1的細胞，其中所述信號使所述重組蛋白靶向ER。
6.權利要求5的細胞，其中所述信號包含使所述重組蛋白靶向ER的信號肽。
7.權利要求6的細胞，其中所述多核苷酸包含編碼所述信號肽的核酸區段。
8.權利要求1或權利要求3-7中任一項的細胞，其中所述信號使重組蛋白繞過高爾基體。
9.權利要求8的細胞，其中所述信號包含使重組蛋白不靶向高爾基體的信號肽。
10.權利要求9的細胞，其中所述多核苷酸包含編碼所述信號肽的核酸區段。
11.權利要求1的宿主細胞，其中所述宿主細胞是任一種真核細胞和原核細胞。
12.權利要求11的宿主細胞，其中所述原核細胞是細菌細胞，優選是根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)細胞。
13.權利要求12的宿主細胞，其中所述真核細胞是植物細胞。
14.權利要求13的宿主細胞，其中所述植物細胞是選自以下的植物根細胞發根土壤桿菌(Agrobacterium rihzogenes)轉化的根細胞、芹菜細胞、姜細胞、辣根細胞和胡蘿卜細胞。
15.權利要求14的宿主細胞，其中所述植物根細胞是胡蘿卜細胞。
16.權利要求15的宿主細胞，其中所述重組多核苷酸包含編碼所述目標蛋白的第一核酸序列，所述第一核酸序列與編碼源自堿性煙草殼多糖酶A基因的液泡靶向信號肽的第二核酸序列操作性連接，該液泡信號肽的氨基酸序列由SEQ ID NO2表示，其中所述第一核酸序列還任選與第三核酸序列操作性連接，所述第三核酸序列編碼由SEQ ID NO1表示的內質網(ER)靶向信號肽。
17.權利要求16的宿主細胞，其中所述重組多核苷酸還包含在植物細胞內起作用的啟動子，其中所述啟動子與所述重組分子操作性連接。
18.權利要求17的宿主細胞，其中所述重組多核苷酸還包含在植物細胞內起作用的終止子，其中所述終止子與所述重組分子操作性連接。
19.權利要求18的宿主細胞，其中所述重組多核苷酸還任選包含另外的控制、啟動和調節元件和/或選擇標記，其中所述調節元件與所述重組分子操作性連接。
20.權利要求19的宿主細胞，其中所述高甘露糖蛋白是具有至少一個暴露甘露糖殘基糖基化的高甘露糖糖蛋白。
21.權利要求20的宿主細胞，其中所述高甘露糖蛋白是選自以下的生物活性高甘露糖溶酶體酶葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
22.權利要求21的宿主細胞，其中所述溶酶體酶是人葡糖腦苷脂酶(GCD)。
23.權利要求22的宿主細胞，其中所述GCD包含基本上如SEQID NO8所示的氨基酸序列，該氨基酸序列由SEQ ID NO7所示的核酸序列編碼。
24.權利要求23的宿主細胞，其中所述細胞用重組多核苷酸或包含所述分子的表達載體轉化或轉染，該重組多核苷酸還包含花椰菜花葉病毒的35S啟動子、根癌土壤桿菌的章魚堿合酶終止子，調節元件是煙草花葉病毒(TMV)Ω翻譯增強子元件，具有基本上如SEQ IDNO13所示的核酸序列，其編碼的GCD具有基本上如SEQ ID NO14所示的氨基酸序列。
25.由權利要求1-24中任一項的宿主細胞產生的重組高甘露糖蛋白。
26.權利要求25的重組高甘露糖蛋白，其中所述高甘露糖蛋白是選自以下的生物活性高甘露糖溶酶體酶葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
27.權利要求26的重組蛋白，其中所述溶酶體酶是人葡糖腦苷脂酶(GCD)。
28.一種重組生物活性高甘露糖溶酶體酶，其具有至少一個包含暴露甘露糖殘基的寡糖鏈。
29.一種重組蛋白，該蛋白包含具有信號肽活性的第一部分和具有溶酶體酶活性的第二部分，所述第一部分使所述第二部分在植物細胞中被加工成具有至少一個包含暴露甘露糖殘基的寡糖鏈。
30.權利要求29的蛋白，其中所述溶酶體酶包含用于治療或預防戈謝病的蛋白。
31.權利要求29或30的蛋白，其中所述蛋白包含人葡糖腦苷脂酶(hGCD)。
32.權利要求29-31中任一項的蛋白，其中所述第一部分包含植物細胞ER靶向信號肽。
33.權利要求29的重組溶酶體酶，其中所述重組酶能與溶酶體貯積病患者體內的靶部位的靶細胞上的甘露糖受體結合。
34.權利要求33的重組溶酶體酶，其中所述重組溶酶體酶對于所述靶細胞的親和力比天然存在的溶酶體酶對于所述靶細胞的相應親和力大。
35.權利要求34的重組溶酶體酶，其中所述重組溶酶體酶選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。
36.權利要求35的重組溶酶體酶，其中所述重組溶酶體酶是葡糖腦苷脂酶(GCD)。
37.權利要求36的重組溶酶體酶，其中所述靶部位的靶細胞是所述患者肝內的枯否細胞。
38.一種用植物細胞培養生產的重組高甘露糖蛋白。
39.權利要求38的重組高甘露糖蛋白，該蛋白包含使蛋白靶向ER的植物信號肽。
40.權利要求39的蛋白，其中所述植物信號肽包含使所述蛋白靶向根植物細胞培養物中的ER的肽。
41.權利要求40的蛋白，其中所述根植物細胞培養物包含胡蘿卜細胞。
42.一種用植物細胞培養生產的重組高甘露糖人葡糖腦苷脂酶(hGCD)蛋白。
43.植物細胞培養物在生產高甘露糖蛋白中的用途。
44.一種生產高甘露糖蛋白的方法，所述方法包括制備用編碼重組蛋白的重組多核苷酸轉化或轉染的重組宿主細胞的培養物；在允許所述蛋白表達的條件下培養所述宿主細胞培養物，其中所述宿主細胞產生所述高甘露糖基化形式的蛋白。
45.權利要求44的方法，其中懸浮培養所述宿主細胞培養物。
46.權利要求45的方法，所述方法還包括純化所述蛋白。
47.權利要求45的方法，其中所述宿主細胞如權利要求1-15中任一項所限定。
48.權利要求46或47中任一項的方法，其中所述高甘露糖蛋白是生物活性高甘露糖溶酶體酶，其具有至少一個包含暴露甘露糖殘基的寡糖鏈。
49.權利要求48的方法，其中所述重組酶與靶部位的靶細胞上的甘露糖受體結合。
50.權利要求49的方法，其中所述重組酶對于所述靶細胞的親和力比天然存在的溶酶體酶對于所述靶細胞的相應親和力大。
51.權利要求50的方法，其中所述溶酶體酶選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
52.權利要求51的方法，其中所述溶酶體酶是葡糖腦苷脂酶(GCD)。
53.權利要求52的方法，其中所述靶部位的靶細胞是所述患者肝內的枯否細胞。
54.權利要求53的方法，其中所述宿主細胞是選自以下的植物根細胞發根土壤桿菌轉化的根細胞、芹菜細胞、姜細胞、辣根細胞和胡蘿卜細胞。
55.權利要求54的方法，其中所述植物根細胞是胡蘿卜細胞。
56.權利要求55的方法，其中讓所述轉化宿主胡蘿卜細胞在懸液中生長。
57.一種用外源重組溶酶體酶治療溶酶體酶貯積病患者的方法，所述方法包括(a)提供重組生物活性形式的溶酶體酶，所述溶酶體酶從轉化植物根細胞純化并且能夠有效靶向異常缺乏所述溶酶體酶的細胞，其中所述重組生物活性酶在附著的寡糖上有暴露的末端甘露糖殘基；(b)給予所述患者治療有效量的所述重組生物活性溶酶體酶。
58.權利要求57的方法，其中所述宿主細胞如權利要求1-24中任一項所限定。
59.權利要求58的方法，其中所述宿主細胞是胡蘿卜細胞。
60.權利要求59的方法，其中所述溶酶體酶是高甘露糖酶，其包含至少一個具有暴露甘露糖殘基的寡糖鏈。
61.權利要求60的方法，其中所述重組酶能與患者靶部位的靶細胞上的甘露糖受體結合。
62.權利要求61的方法，其中所述重組溶酶體酶對于所述靶細胞的親和力比天然存在的溶酶體酶對于所述靶細胞的相應親和力大。
63.權利要求62的方法，其中所述溶酶體酶選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。
64.權利要求63的方法，其中所述溶酶體酶是葡糖腦苷脂酶(GCD)。
65.權利要求64的方法，其中所述溶酶體酶貯積病是戈謝病。
66.權利要求65的方法，其中所述靶部位的靶細胞是所述患者肝內的枯否細胞。
67.一種治療溶酶體貯積病的藥物組合物，所述組合物包含作為活性成分的如權利要求25-42中任一項限定的重組生物活性高甘露糖溶酶體酶，所述組合物還任選包含藥物可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。
68.權利要求67的組合物，其中所述溶酶體貯積病是戈謝病。
69.權利要求68的組合物，其中所述重組溶酶體酶是生物活性高甘露糖人葡糖腦苷脂酶(GCD)。
70.權利要求25-42中任一項限定的重組生物活性高甘露糖溶酶體酶在制備用于治療或預防溶酶體貯積病的藥物中的用途。
71.權利要求70的用途，其中所述疾病是戈謝病。
72.權利要求71的用途，其中所述生物活性溶酶體酶是生物活性高甘露糖人葡糖腦苷脂酶(GCD)。
全文摘要
用植物培養生產糖基化蛋白、特別是具有高甘露糖糖基化、同時靶向具有ER信號和/或繞過高爾基體的蛋白的裝置、系統和方法。本發明還涉及應用轉基因植物根細胞、特別是胡蘿卜細胞表達和生產有酶活性的高甘露糖溶酶體酶的載體和方法。更具體地說，本發明涉及高水平表達和大量生產生物活性高甘露糖葡糖腦苷脂酶(GCD)的宿主細胞、特別是轉基因懸浮胡蘿卜細胞、載體和方法。本發明還提供了用于治療溶酶體貯積病的組合物和方法。
文檔編號C12N1/20GK1875111SQ200480017916
公開日2006年12月6日 申請日期2004年2月24日 優先權日2003年4月27日
發明者Y·沙亞迪伊, G·鮑姆, D·巴特費德, S·哈斯穆里, A·勒科維茨 申請人:普羅塔里克斯有限公司