專利名稱：：Msp－3樣基因家族的制作方法
技術領域：
：本發明涉及抗瘧疾。更具體地，本發明涉及包括已知的MSP-3基因的新的基因家族(現稱為MSP3-1，如圖1所示)，且該基因家族具有異常過剩的暴露表位，由此提示該基因家族在該寄生蟲的免疫原性方面具有重要作用。對該基因家族以及相應的基因產物家族的表征能夠確定抗惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)的新的免疫原性和疫苗組合物。引起人類瘧疾的寄生蟲，特別是惡性瘧原蟲，在人類宿主中具有不同的形態，并表達不同的抗原以起到定位于被感染的宿主生物體中的功能。根據這些寄生蟲在人體內的生命周期中不同的形態和抗原性，可將其至少明確分為4個不同的發育階段。該寄生蟲在人體內最初的發育階段相當于通過該寄生蟲的昆蟲載體的叮咬而進入血液的子孢子形式。第二個階段相當于寄生蟲進入肝臟并感染肝細胞的過程，寄生蟲在肝細胞中發育成為肝裂殖體，后者成熟后(例如，對于惡性瘧原蟲為子孢子進入人體后的第6天)通過裂解(bursting)釋放肝裂殖子。第三個階段為通過該寄生蟲的無性形式(裂殖子)感染血液中的紅細胞；這種紅內期發育相當于疾病的致病階段。第四個階段相當于有性(或配子母細胞)形式，可成為細胞外有性形式或蚊體內的配子。已經再三證實，抗體在產生針對惡性瘧原蟲瘧原蟲的臨床免疫方面具有重要的作用。眾多免疫學研究提示，人的嗜細胞抗體亞型(IgG1和IgG3)對于帶蟲免疫狀態特別至關重要。這種抗寄生蟲免疫是一種在長期(15-20年)暴露于寄生蟲之后獲得的、株依賴性的非消除性(non-sterilizingtype)免疫。其通常見于非洲和巴布亞-新幾內亞，東南亞僅僅最近才有文獻報道(Soe，KhinSawetal.2001)。盡管抗體可直接作用于裂殖子對紅細胞的入侵，但在流行地區，體內最有效的抗體介導的寄生蟲控制機制則需要單核細胞的參與(KhusmithandDruilhe1983)；(LunelandDruilhe1989)。抗體依賴性細胞抑制(antibody-dependentcellularinhibition，ADCI)分析模擬單核細胞和嗜細胞寄生蟲特異性抗體之間的這種協作，且在現在看來是抗惡性瘧原蟲血液期的獲得性免疫的最佳體外替代性標記物。目前已經有兩種分子被鑒定為可有效引起ADCI的人類抗體的靶位，即48-kDa的裂殖子表面蛋白3，下文中稱為MSP-3(Oeuvray，Bouharoun-Tayounetal.1994)；和220-kDa的富含谷氨酸蛋白質，下文中稱為GLURP(Theisen，Soeetal.1998)。已經發現，通過被動轉運至惡性瘧原蟲人源化SCID小鼠中，GLURP和MSP-3可在體內抑制寄生蟲的生長(Badell，Oeuvrayetal.2000)。許多免疫流行病學研究也提示針對MSP-3的人類抗體與產生臨床保護相關，這些研究證實，MSP-3特異性嗜細胞抗體(IgG1和IgG3)的水平與瘧疾發作的風險降低明顯相關(Roussillon1999)。這些研究進一步發現，嗜細胞IgG3抗體在抗瘧疾保護中具有主要作用，因此從流行病學的證據達到以下認識，即針對MSP-3的抗體可通過與攜帶FcγII受體的細胞協作而在體內有效地抑制寄生蟲的繁殖(Bouharoun-Tayoun，Oeuvrayetal.1995)。這些受體對IgG3subclass的親和力高于對IgG1subclass的親和力(PleassandWoof2001)。這些人類IgG抗體所識別的主要B細胞表位已經被定位于MSP-3212-257區域的保守序列中(Oeuvray，Bouharoun-Tayounetal.1994；Theisen，Soeetal.2000；Theisen，Dodooetal.2001)。核苷酸測序已經證實，這些重要表位在許多惡性瘧原蟲實驗株和來自非洲和亞洲的野外分離株中高度保守(Huber，Felgeretal.1997)；(McCollandAnders1997)。本發明人現已表征了一系列的9種惡性瘧原蟲基因，均成簇位于10號染色體的3’端，這些基因編碼蛋白質，其中的表位均是暴露于瘧疾的個體體內天然產生的抗體的靶位，通過與血液單核細胞協作而介導在紅內期殺死惡性瘧原蟲，且在不同的惡性瘧原蟲分離株之間，這些表位的序列保守性程度不同尋常。本發明因此涉及分離的基因家族，稱為MSP-3樣家族，該基因家族的產物具有共同的結構特征和免疫學特征，并涉及一些這樣的基因以及各個相應的蛋白質。包含來自所述新蛋白質的表位的抗原性多肽以及包含所述表位和/或來自任何MSP3樣蛋白質的表位中的至少兩種的抗原性多肽組合物，也屬于本發明的內容。本發明的其他重要的方面是抗瘧疾免疫原性組合物和疫苗，其包含作為免疫原的上述重組蛋白質、多肽或多肽組合物。與MSP-3樣基因家族的多種產物交叉反應的重組抗體及其部分也是本發明的一個目的，其可以指重組抗體及其部分本身，也可以指用于被動免疫治療的藥物或用于體外診斷瘧疾的試劑盒。本發明還涉及用于對個體的瘧疾進行體外診斷的方法，其通過使用上述抗原性多肽或使用上述抗體，也涉及用于進行這些方法的包含至少部分必需試劑(多肽、抗體...)的試劑盒。當然，編碼至少一種本發明的新的惡性瘧原蟲抗原的核苷酸序列及其在抗惡性瘧原蟲的藥物或核酸疫苗中的用途也屬于本發明的內容。在本文中，對于一些使用的術語可按照以下定義來理解下文中，術語“基因”是與包括編碼序列的“天然存在的序列”或包括編碼序列的重組或合成序列是同義詞。本文中，“基因”并不一定含有調節元件，這與該詞在科技文獻中的常用含義不同。因此，本發明的基因是任何包含瘧原蟲的天然存在的可讀框的核苷酸序列或包含瘧原蟲的天然存在的可讀框且進一步含有用于表達所述天然存在的序列的全部或部分調節序列的核苷酸序列。根據這個定義，基因是分離的核酸分子，即不處于天然環境中的核苷酸序列。這樣的核苷酸序列也被稱為是純化的。本文中，“基因家族”與其在科技文獻中的含義相同，即指一組多個基因，所述基因具有許多共同的(結構或功能)特征或特點。根據本發明，“MSP-3-c/d樣基序”是20個氨基酸的氨基酸序列，其與序列SEQIDNo25至30中的任一序列相同，或者其通過對這些序列中的至少兩個序列進行重新組合而獲得。例如，一個氨基酸序列，其具有SEQIDNo25的1至5位氨基酸，隨后是SEQIDNo29的6至12位氨基酸，以及SEQIDNo27的13至20位氨基酸，該氨基酸序列是MSP-3-c/d樣基序。也就是說，“MSP-3-c/d樣基序”是20個氨基酸的氨基酸序列，其中所述的氨基酸選自下表表1這些氨基酸中的一些具有相似的電荷，且可能不會改變分子的整體結構或抗體對其的識別，例如纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸。任何20個氨基酸的氨基酸序列，如果其包含如下所示的最保守的氨基酸(即第1、2、8、10、12、14和17至20位)，且其中位于其他位置的氨基酸殘基不同于上述氨基酸，且其被針對SEQIDNo25至30中的任一MSP-3-c/d基序的抗體所識別，其同樣被視為本發明的“MSP-3-c/d樣基序”。對于后一種功能性特征，可通過任何免疫分析方法如那些本領域人員已知的方法和/或下文中所述的方法而進行測試。本文中，“MSP-3-b樣基序”指的是11至14個氨基酸的氨基酸序列，其與序列SEQIDNo17至24中的任一序列相同，或者其通過對這些序列中的至少兩個序列進行重新組合而獲得。例如，一個氨基酸序列，其具有SEQIDNo17的1至5位氨基酸，隨后是SEQIDNo22的6至12位氨基酸，該氨基酸序列是MSP-3-b樣基序。也就是說，“MSP-3-b樣基序”是11至14個氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸選自下表，其中“-”代表“無氨基酸”表2這些氨基酸中的一些具有相似的電荷，且可能不會改變分子的整體結構或抗體對其的識別，例如纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸。MSP-3-b樣基序的一個亞組相應于SEQIDNo17、18和22的序列及其組合，即選自下表的11個氨基酸表3任何11至14個氨基酸的氨基酸序列，如果其包含如下所示的最保守的氨基酸(即表3中所示的氨基酸，其相應于表2所示的1、2和5至13位的具體的氨基酸)，且其中位于其他位置的氨基酸殘基不同于上述氨基酸，且其被針對SEQIDNo17至24中的任一MSP-3-b基序的抗體所識別，其同樣被視為本發明的“MSP-3-c/d樣基序”。對于后一種功能性特征，可通過任何免疫分析方法如那些本領域人員已知的方法和/或下文中所述的方法而進行測試。下文中，基因或蛋白質有時指的是在此揭示的具體的基因或蛋白質序列的“同源物”。該術語在此指的是不同瘧原蟲株(特別是惡性瘧原蟲株)中的近似的序列，即與所參照的序列具有至少70％的序列相同性、且優選地具有至少90％序列相同性的序列。“保守性取代”指的是，在氨基酸序列中，一個氨基酸殘基被另一個在疏水性和/或空間障礙方面具有相似特性的殘基所取代，這樣，多肽的三級結構不會發生顯著的改變。例如，以丙氨酸取代鳥嘌呤(guanine)是一種保守性取代，反之亦然。纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸也是相互之間可進行保守性取代的氨基酸。非限制性的其他保守性取代組是(D，E)、(K，R)、(N，Q)、和(F，W，Y)。通過對多肽的至少一個氨基酸進行保守性取代所獲得多肽變體在此被稱為所述多肽的“保守性變體”。用語“衍生自”，當用于核苷酸或氨基酸殘基的序列時，指的是有關序列是從被鑒定為本發明的序列家族的所了解的結構和/或特征出發而設計的。不過，可通過任何合適的技術方法、包括重組技術或合成方法來制備有關序列。因此，所述序列并不限于那些自天然存在的基因或蛋白質而獲得的序列，其甚至可以是嵌合序列。需要的時候，下文中會給出其他的定義。本發明人在此公開了一組9個基因，其中的6個是從未被公開過的，且這些基因成簇位于10號染色體的相同區域。該染色體實際上含有一系列9個可讀框，由非編碼區域所分開，并包含一排(5’-3’)編碼最初被命名為GLURP的蛋白質的基因，在1300堿基對處后接MSP-3(現命名為MSP-3-1)，隨后是7個其他基因，命名為MSP-3-2(有時也稱為MSP6)、MSP-3-3、MSP-3-4、MSP-3-5、MSP-3-6、MSP-3-7、MSP-3-8。圖1示出了這一組織結構。除了成簇位于同一染色體區域以外，這9個基因還具有突出的特征，預示它們是用于開發抗惡性瘧原蟲血液期感染的疫苗的優先產物。已經發現所有9個基因均同時表達于所有已經研究的寄生蟲中，即在惡性瘧原蟲的紅內期能夠檢測到相應的蛋白質，且這些蛋白質均位于裂殖子表面。此前發現GLURP、MSP-3-1和MSP-3-2(被稱為“MSP6”(Trucco，Fernandez-Reyesetal.2001))屬于這種情況，對于其余的基因，通過構建其N端的獨特序列證明也是如此，這些N端序列在這些基因之間是各自獨特的，其不具有交叉反應性表位，且其相應的抗體均與裂殖子的表面發生反應。此外，通過以各自獨特的特異性引物進行RT-PCR證實了其轉錄。不僅如此，8個MSP-3樣基因均具有同樣的一般性基因組織結構，如圖1所示，其每一個均具有相同的最N端的4個氨基酸“特征標記”(在圖1中以“s”表示)，并與間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax)和諾氏瘧原蟲(PlasmodiumKnowlesi)中所發現的相似的MSP-3同源蛋白質相同。因此，本發明的第一個目的是一個家族(或一組)分離的或純化的基因，這些基因具有以下特征-它們位于惡性瘧原蟲的10號染色體；-它們在惡性瘧原蟲株中高度保守；-它們表達于惡性瘧原蟲的紅內期；-它們編碼的蛋白質在N-末端具有NLRN或NLRK的特征標記并定位于裂殖子表面，其中所述家族至少包含3個基因。本發明還涉及所述基因家族的片段的家族。一個具體的家族具有所述基因的至少3種多核苷酸片段。本發明還涉及該家族的基因的C-末端序列中所含的多核苷酸片段。本發明的基因家族的特定多核苷酸片段或此類多核苷酸片段的特定家族來自所述基因，并編碼所述基因的C-末端部分。所述C-末端部分隨后在實施例和圖10中進行描述。本發明還涉及所述片段的組合，包括具有多個編碼所述基因的C-末端部分的多核苷酸的組合，特別是重組序列。所述基因的或所述基因家族的其他多核苷酸片段，包括重組的片段，是編碼所述基因的C-末端部分的序列的片段。本發明的多核苷酸具有30至1500個、特別是30至500個核苷酸，特別是30至250、或至240、或至210、或至180、或至150、或至120或至90個核苷酸。在本發明的MSP-3家族的蛋白質中，NLRN或NLRK特征標記的后面最常見地是A或G。該家族的基因優選地還具有相同的總體組織結構，如圖1所示。該家族的一個實例是整個MSP-3樣家族，包含序列SEQIDNo1、3、5、7、9、11、13、和15的基因或其如上所定義的片段。選自這些基因中的任何一組至少3個基因或其如上所定義的片段，也被認為是本發明的一個基因家族。除了上述N-末端特征標記以外，N-末端部分的其余部分在不同基因產物之間是高度可變的，然而，與此不同的是，C-末端的組織結構在除MSP-3-5和MSP-3-6兩種基因以外的所有的基因中的相同的，包括“b”表位樣序列段(stretch)(“b”)、“c/d”表位樣(“c/d”)的、富含谷氨酸區域(Glutamic-richregion)、以及最C端的亮氨酸拉鏈。基于所述基因的在基因產物的C-末端部分的組織結構，本發明人提供了一個具體的基因家族，其范圍在如上所述的9個基因的基因簇中，且其范圍在如上所述的8個MSP3樣基因中。該具體的家族包括瘧原蟲株的8個MSP3樣基因中的MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8基因，特別是惡性瘧原蟲株中的那些基因。該具體的基因家族編碼相應的具體的蛋白質(也稱為多肽)家族，包括MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8多肽。所述具體的基因家族和相應的蛋白質的具體的家族的特征還在于，所述基因進一步具有保守的C-末端序列，其編碼在該家族的基因中具有保守性的表位、特別是T表位，且其中所述末端序列在表位(包括MSP-3-b樣基序和MSP-3-c/d樣基序)以外的區域進一步包含密碼子趨異性(divergencesincodons)，所述趨異性在該家族基因中是保守的。因此，本發明的具體的基因家族是如上所述的家族，其中所述基因還具有如下特性它們編碼具有MSP-3-b樣基序和/或MSP-3-c/d樣基序的蛋白質。這種家族的一個實例是包括序列SEQIDNo1、3、5、7、13、和15的基因的家族或任何一組至少3個選自這些序列中的基因的家族。所有7種蛋白質(GLURP+6種同源性MSP-3樣分子)均在暴露于瘧疾的個體中引發產生抗體。對于那些已經進行研究的基因產物，特別是GLURP、MSP-3-1和MSP-3-2，其所引發的免疫應答與抵抗野外條件下的瘧疾侵襲的臨床保護是相關聯的。這種關聯具有高度的統計學顯著性，特別是與由IgG3同種型組成的抗體有關，且這已經在非洲的Dielmo和Ndiop以及緬甸的Oo-doI等三組研究中被證實。鑒于下面所提及的同源性原因，對于其余5個基因也極有可能會有相同的發現。對于GLURP、MSP-3-1和MSP-3-2，與保護性相關的抗體所針對的區域是GLURP的非重復區域R0和MSP-3-1和MSP-3-2的C-末端非重復區域。圖2顯示了來自MSP-3-1的不同的肽。保護作用與針對肽MSP-3-b、c和d的抗體相關。針對這7種基因產物的抗體均有效地在體外條件下通過單核細胞依賴性的抗體介導的ADCI機制介導在血液期殺死惡性瘧原蟲。實施例1給出的這些結果說明，針對這些區域的每一個的抗體可同樣有效地在體外條件下實現對惡性瘧原蟲紅內期的生長抑制。因此，本發明的優選的基因家族還具有如下特性針對所述基因的產物的抗體在體外條件下通過單核細胞依賴性的抗體介導的ADCI機制介導在血液期殺死惡性瘧原蟲。根據本發明的另一個優選的實施方式，本發明的基因家族因此還具有如下特性針對所述基因的產物的抗體在感染了惡性瘧原蟲的小鼠中介導惡性瘧原蟲的生長抑制(見例如實施例1和8所公開的測試結果)。本發明人還證實，這7種基因中的每一種在各種惡性瘧原蟲分離株中均具有異乎尋常的高度的序列保守性。在此之前已經發現GLURP即是如此，并導致選擇了在各種分離株中最具保守性的R0非重復區域，不過其具有一些氨基酸取代。MSP-3-1也是如此，已經發現在111株分離株中，該序列在覆蓋肽MSP-3-a，b，c和d的區域(即用于免疫志愿者的區域)具有顯著的保守性，其中沒有發現單個氨基酸取代，且因此沒有發現任何氨基酸的改變。最近進一步證實，MSP-3-1的C-末端的其余部分以及MSP-3-2、MSP-3-3、MSP-3-4、MSP-3-7和MSP-3-8的整個C-末端保守區域也是如此(圖9和10)。該基因家族的這種不同尋常的序列保守程度明顯不同于在當前所研究的絕大多數其他疫苗候選物中所觀察到的較大的多態性，且這顯然是加強該基因家族在疫苗開發中的應用前景的一個重要標志。本發明特別指出，MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8這6個基因的特定家族(以及相應的6種蛋白質的特定家族)的特征在于以下兩方面，(i)在于包含或限定表位(例如如上所述的b樣基序或c/d樣基序中所含的表位)的區域中的核苷酸或氨基酸的保守性，以及(ii)在于C-末端部分中含有的、特別是特定基序(包括b-，c/d-基序)中所含的所述表位以外的區域中的趨異核苷酸(以及所編碼的氨基酸)的保守性。要注意到，這兩種相反的保守性，即(i)這6種MSP3樣基因(或基因產物)的C-末端序列的確定區域所共同具有的核苷酸(氨基酸)的保守性和(ii)這6種MSP3樣基因(或基因產物)的所述C-末端序列的其他區域中的趨異核苷酸和編碼的氨基酸的保守性，對于確定能夠引發或增強免疫應答且特別是抗瘧原蟲(特別是惡性瘧原蟲株)感染的保護性免疫應答的方式具有重要性。因此，包含至少3種選自具有序列SEQIDNo1、3、5、7、9、11、13、和15的基因的基因的上述基因家族，且特別是選自具有序列SEQIDNo1、3、5、7、13和15的基因或它們在瘧原蟲(特別是惡性瘧原蟲株)中的同源物的上述基因家族，也是本發明的優選的基因家族。一個具體的家族特別是由6種MSP3樣基因即MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8組成或另一個家族包含包括MSP3-1和MSP3-2基因的至少3種基因。本發明的另一個方面是一種具有序列SEQIDNo5、7、13或15的分離的或純化的惡性瘧原蟲基因，或瘧原蟲株的相應于具有序列SEQIDNo5、7、9、11、13或15的惡性瘧原蟲基因的同源物的分離的基因，特別是SEQIDNo5、7、13或15。根據前面以及隨后所體積的理由，對于本領域人員來說，這些未被公開過的MSP-3樣基因在研究、診斷以及免疫接種領域具有多種用途。具體而言，它們可用于制備重組MSP-3樣蛋白質。因此，蛋白質SEQIDNo6、8、10、12、14和16，特別是蛋白質SEQIDNo6、8、14和16，也是本發明的一部分，此外，具有如下蛋白質的序列的任何重組蛋白質也是本發明的一部分，所述蛋白質是除3D7以外的瘧原蟲株中的蛋白質SEQIDNo6、8、10、12、14或16的同源物、特別是蛋白質SEQIDNo6、8、14或16的同源物。本發明還涉及一些基因或其多核苷酸片段，它們是如上所定義的基因或其片段的變體，且它們在嚴格性條件下與所述基因或基因片段雜交。這些變體的長度尤其是等于或者是短于其在嚴格性條件下與之雜交的基因或基因片段。在此，“嚴格性雜交條件”的定義是該條件允許兩種核酸、特別是兩個DNA分子，在大約65℃，在例如6XSSC、0.5％SDS、5XDenhardt溶液和100μg/ml的變性的非特異性DNA的溶液中或任何具有同等的離子強度的溶液中，并經過在65℃、在例如至多0.2XSSC和0.1％SDS的溶液中或任何具有同等的離子強度的溶液中進行的洗滌步驟之后，發生特異性雜交。不過，本領域人員可以將所述條件的嚴格性作為待雜交的序列的長度、其GC核苷酸含量以及其他參數的函數而進行適當調整，例如可根據Sambrook等2001(MolecularCloningALaboratoryManual，3rdEdition，LaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)的方案進行調整。比較MSP-3家族的基因之間的序列發現，其表位具有十分罕見的保守性，并且位于表位之間的趨異氨基酸殘基也具有保守性，所述保守性存在于家族成員之間，特別是產生保護作用至關重要的、具有生物學活性的抗體所針對的那些成員之間，且特別是由SEQIDNo1、3、5、7、13和15所代表的那些基因成員之間。圖11概括說明了序列比較的結果。因此，分離并表征MSP3樣家族的各種基因對于理解抗瘧原蟲、特別是抗惡性瘧原蟲的免疫應答以及設計更加有助于制備抗瘧原蟲、特別是抗惡性瘧原蟲的免疫原性組合物的手段，具有重要的意義。本發明人已經在家族成員之間鑒定到了2個區域，這2個區域即使不完全相同，至少也是極為相似，且其涉及MSP-3-b肽中的一個關鍵區域以及涉及MSP-3-c和d肽中的一個關鍵區域(該區域在MSP-3-c肽和MSP-3-d肽兩者之間是保守的)。圖12和13概括說明了不同基因中這些非常保守的表位之間的細微差異。值得注意并且十分重要的是，不同基因之間的最為保守的區域是兩個區域，體外的ADCI分析和被動轉移至SCID小鼠的研究發現它們是具有生物學活性的抗體的靶位(見上)。本發明人還證實，作為這一基因家族成員之間具有的結構同源性的結果，在MSP-3家族的不同蛋白質之間存在免疫學交叉反應性(實施例5至8)。免疫學和疫苗開發層面的實際的結果在于，以該基因家族的任何一個成員進行免疫接種均可誘導對同一個基因產物以及所有其余基因產物具有反應性的抗體。因此，本發明構成了一個十分獨特的多基因家族類型，不同于現今所公開的以表位多態性為特征的多基因家族，本發明的多基因家族的主要特征在于表位的保守性，且其中如果一個特定基因出現缺失、突變，另一個或所有其他的家族成員可接管其抗原性功能。此外，所有基因均同時表達于一種給定的寄生蟲中。因此，本發明還涉及一種蛋白質，其由上述基因中的一種基因所編碼。在一個具體的實施方式中，所述蛋白質是重組蛋白質。因此，包含來自本發明的蛋白質的至少5個、或至少10個、優選地至少15個連續氨基酸的片段的抗原性多肽是本發明的一部分。在本發明的一個具體實施方式中，這樣的抗原性多肽具有80個或更少的氨基酸殘基、特別是至多70個、或至多60個、或至多50個、或至多40個、且可以是至多30個氨基酸殘基。限于Oeuvray，Bouharoun-Tayoun等1994所公開的MSP3-1的片段(HERAKNAYQKANQAVLKAKEASSY，AKEASSYDYILGWEFGGGVPEHKKEEN，PEHKKEENMLSHLYVSSKDKENISKENE)或Trucco，Fernandez-Reyes等在2001所公開的MSP-3-2的片段(ILGWEFGGG-[AV]-P)的多肽不屬于本發明的范圍。而來自MSP3-1或MSP3-2的任何符合上述定義的片段，當其被包括在本發明的抗原性組合物中時，則屬于本發明的范圍。如上針對MSP3樣基因、特別是MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8的家族及其相應的多肽家族所述，本發明還涉及抗原性多肽的組合物，其包含至少兩種來自MSP3樣蛋白質家族的抗原性多肽，所述多肽所引發或增強的免疫應答能夠代表人類宿主針對天然多肽而獲得的應答，特別是能夠代表抗瘧原蟲株、特別是抗惡性瘧原蟲的保護性應答。因此，所述組合物是抗原性多肽組合物且優選地為免疫原性組合物。本發明的優選的抗原性多肽是那些包含至少一個如上所述的MSP3-b樣基序和/或至少一個如上所述的MSP3-c/d樣基序的多肽。例如，任何符合上述定義的包含選自序列SEQIDNo19至24(b樣基序)和27至30(c/d樣基序)中的至少一個基序的抗原性多肽或由任何此類基序所組成的抗原性多肽，均屬于本發明的一部分，任何包含選自通過在序列SEQIDNo19至24和27至30中進行至少一個氨基酸的取代而獲得的變體中的至少一個基序的抗原性多肽同樣屬于本發明的一部分，條件是所述抗原性多肽不是上述現有技術中所公開的MSP-3-1或MSP-3-2的片段。或者，相應的b-或c/d樣基序或包含所述基序的抗原性多肽，如果其符合上述有關所述抗原性多肽的定義并可來自其他瘧原蟲株，特別是來自惡性瘧原蟲，也屬于本發明。此類片段可來自圖10所示序列。如SEQIDNo17、18、25或26所示的來自MSP3-1或MSP3-2的抗原性多肽、或所述抗原性多肽的具有保守性取代的變體或具有來自其他瘧原蟲(特別是其他惡性瘧原蟲株)的序列的變體，當其與本發明的抗原性多肽(特別是從SEQIDNo19至24或27至30出發而設計的抗原性多肽或其變體)組合成組合物時，也屬于本發明的范疇。本發明的另一個方面是一種抗原性多肽組合物，其包含至少兩個不同的MSP-3-b樣基序和/或至少兩個不同的MSP-3-c/d樣基序。“多肽組合物”指的是包含多肽組分的組合物，多肽組分即多肽或包含多肽部分的分子，例如脂多肽、由結合于支持物的多肽組成的綴合物等等。本發明的多肽組合物可以是溶液、囊片等等。根據本發明的抗原性多肽組合物的一個具體的實施方式，所述至少兩個不同的MSP-3-b樣基序選自序列SEQIDNo17至24及其保守性變體，和/或所述至少兩個不同的MSP-3-c/d樣基序選自序列SEQIDNo25至30及其保守性變體。上述本發明的抗原性多肽本發明的或抗原性多肽組合物優選地包含多肽組分或由多肽組分組成，其中每一多肽組分具有10至80個氨基酸，特別是每一多肽組分具有10(或12、或15、或20)至70、或10(或12、或15、20)至60、或10(或12、或15、或20)至50、或10(或12、或15、或20)至40、或10(或12、或15、或20)至30個氨基酸。本發明的抗原性多肽組合物優選地是免疫原性組合物，其能夠在宿主、特別是人類宿主中引發或增強抗體的產生。因此，根據對所述基因和多肽家族所作的上述表征，每一種多肽或多肽組分的特征在于，除了涉及存在所述的基序b-、c/d-及可能的a-、e-和f-樣基序中的一或多個基序的上述特征，它們還衍生于MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8蛋白質的C-末端多肽。后面的實施例和附圖(圖10)描述了不同惡性瘧原蟲株的MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8蛋白質的這些MSP3樣蛋白質的具體的C-末端多肽序列。圖10描述的所有序列，無論是獨立的還是作為與這些序列中的至少一種、優選地至少兩種的組合，特別是來自各種MSP3樣蛋白質的序列的組合，均屬于本發明的范疇。本發明還涉及這些具體多肽的、來自其他瘧原蟲株、特別是來自惡性瘧原蟲的同源性序列。這些同源性序列(包括嵌合序列)可用于產生本發明的多肽組分。在本發明的抗原性多肽組合物中，所述至少兩個不同的MSP-3-b樣基序和/或至少兩個不同的MSP-3-c/d樣基序可由不同的分子所攜帶(即所述組合物可包含各種分子，所述分子各自僅含有一個基序)；或者，這些組合物中的每一多肽組分可攜帶至少兩個基序。因此，含有包含至少兩個不同的MSP-3-b樣基序和/或至少兩個不同的MSP-3-c/d樣基序的分子的上述抗原性組合物，也是本發明的一個目的。這些分子可以是復合分子，其中所述至少兩個基序是共價連接于一個共同載體的不同肽的部分；優選地，它們的多肽部分由包含所述基序的獨特多肽所構成。包含來自不同MSP-3蛋白質的多個部分的融合蛋白質，可納入這些組合物中。本發明的具體的多肽組合物包含融合多肽或由融合多肽組成，所述融合多肽例如為·包含選自MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8中的所有或至少三種MSP3樣蛋白質的C-末端序列的、或由選自MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8中的所有或至少三種MSP3樣蛋白質的C-末端序列組成的融合多肽；優選的融合多肽至少包含MSP3-1和/或MSP3-2蛋白質的所述C-末端序列；·短于所述C-末端序列的多肽組分的融合多肽(即短于80個氨基酸)，其中所述多肽組分包含或其組成為包含表位的至少一個基序，其選自本申請所述的名為b和c/d基序，所述基序來自MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8中的一種MSP3樣蛋白質，其與這些MSP3樣蛋白質中的另一種蛋白質的特征性的相同基序或不同基序相結合，或與MSP3樣蛋白質的多個(2，3，4，5，)相同基序相結合，或與MSP3樣蛋白質的多個(2，3，4，5，)不同基序相結合。本發明的組合物的多肽組分能夠通過任何合適的制備方法而制備，包括通過涉及重組表達或通過化學合成的方法。對于來自所述多肽組分的結合物的分子也是如此，包括制備融合多肽。鑒于表位的保守性，本發明人研究了針對GLURP和MSP-3的嗜細胞抗體是否如其在非洲被報道的那樣，也在緬甸的亞洲人群中(即在不同遺傳背景的人和寄生蟲中)參與了對瘧疾的臨床免疫的產生。結果記載于實施例7，其說明，針對MSP-3-1和GLURP的保守區域的嗜細胞IgG3抗體與抗惡性瘧原蟲瘧疾的臨床保護顯著相關。與此不同的是，針對GLURP的非嗜細胞IgG4抗體隨著瘧疾發作的次數而升高。最重要的是，MSP-3-1特異性IgG3和GLURP特異性IgG3抗體在抗瘧疾保護作用中具有互補作用。在那些對抗原之一沒有產生應答的個體中，總是檢測到針對另一種抗原的強應答，并且其與保護作用相關，這提示誘導產生針對MSP3和GLURP兩者的抗體對產生保護性免疫可能具有重要意義。因此，根據本發明的另一個具體的實施方式，抗原性多肽組合物還包含抗原性多肽分子，所述分子包含來自GLURP的區域R0的至少10個連續的氨基酸殘基(SEQIDNo34)。如上所述，本發明的抗原性多肽組合物可包含有限數量的分子，所述分子各自包含多個表位，或組合物可包含多個分子，所述分子各自包含有限數量的表位。根據一個具體實施方式，抗原性多肽的組合物包含2至小于9個、優選地3至小于9個、特別是2至6個由本發明的基因編碼的多肽。如上所述，表位可以是來自MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8中的不同MSP3樣蛋白質的相應的表位，或是這些蛋白質中的相同或不同蛋白質的不同表位，如b和c/d樣基序。基于以上定義的特征來闡述本發明的各種實施方式。本發明涉及抗原性多肽組合物，其中MSP3-b樣基序被包括在具有10至80個氨基酸殘基的多肽組分中。或者或此外，本發明涉及抗原性多肽組合物，其中MSP3-c/d樣基序被包括在具有20至80個氨基酸殘基的多肽組分中。根據另一個實施方式，本發明涉及抗原性多肽組合物，其中MSP3-b樣基序和MSP3-c/d樣基序被包括在一個獨特的多肽組分中。本發明的抗原性多肽組合物的特征可以是，MSP3-b樣基序和/或MSP3-c/d樣基序在多肽組分中被氨基酸序列隔開，所述氨基酸序列在所述基序所源自的MSP3樣蛋白質中天然存在于所述基序之間。在本發明的另一個具體實施方式中，抗原性多肽組合物的特征在于，所述多肽組分或每一所述多肽組分包含源自一種或數種MSP3樣蛋白質的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，所述氨基酸序列由選自瘧原蟲(特別是惡性瘧原蟲)的MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8中的一種或數種MSP3樣蛋白質的C-末端序列的全部或部分組成。本發明的抗原性多肽組合物的特征也可在于，所述多肽組分(們)由至少包括MSP3-1和MSP3-2在內的MSP3樣蛋白質的C-末端序列或所述C-末端序列的片段組成，所述片段包含MSP3-1-b、MSP3-1c/d、MSP3-2-b和MSP3-2c/d基序或由這些基序組成。在這樣的一種抗原性多肽組合物中，所述多肽組分(們)進一步包含由選自MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8的MSP3樣蛋白質的C-末端序列或所述C-末端序列的片段組成的氨基酸序列，所述片段包含MSP3-b樣基序和MSP3-c/d樣基序或由所述基序組成。在另一個實施方式中，抗原性多肽組合物的特征在于，所述多肽組分是數種融合多肽，其中每一融合多肽包含具有如下序列的多肽或由所述多肽組成(i)選自MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8的至少兩種MSP3樣蛋白質的C-末端序列，或(ii)選自MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8的至少兩種MSP3樣蛋白質的C-末端序列中的數種、特別是至少2種肽片段，其中每一肽片段包含至少一個MSP3-b樣基序或至少一個MSP3-c/d樣基序或由至少一個MSP3-b樣基序或至少一個MSP3-c/d樣基序組成。本發明的另一種抗原性多肽組合物包含一種融合多肽或由所述融合多肽組成，所述融合多肽包含或其組成為(i)選自MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8的每一種MSP3樣蛋白質的C-末端序列，或(ii)選自MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8的每一種MSP3樣蛋白質的C-末端序列中的一或數種、特別是至少2種肽片段，其中每一肽片段包含至少一個MSP3-b樣基序或至少一個MSP3-c/d樣基序或由至少一個MSP3-b樣基序或至少一個MSP3-c/d樣基序組成，其中不同MSP3樣蛋白質的C-末端序列的片段形成一個獨特的氨基酸序列。在另一種抗原性多肽組合物中，所述至少2種MSP3樣蛋白質的C-末端序列的肽片段選自MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8并含有至少一個MSP3-b樣基序和選自MSP3-a、-c/d、-e和-f樣基序的一種或數種其他基序，且所述基序在所述肽片段中是連續的或不連續的。在上述本發明的另一個具體點實施方式中，抗原性多肽組合物，其中MSP3樣蛋白質的C-末端序列是如下序列(i)對于MSP3-1，為圖10A的任何序列，且特別是3D7株的序列；(ii)對于MSP3-2，為圖10B-D的任何序列且特別是3D7株的序列；或任一所述序列的開始于氨基酸殘基161(或對于序列MSP3.2FLD4為165)并終止于氨基酸氨基酸殘基371(或對于序列MSP3.2FLD4為376)的片段；(iii)對于MSP3-3，為圖10D-E的任何序列，且特別是3D7株的序列；(iv)對于MSP3-4，為圖10E-F的任何序列，且特別是3D7株的序列；(v)對于MSP3-7，為圖10F-H的任何序列，且特別是3D7株的序列；(vi)對于MSP3-8，為圖10I的任何序列，且特別是3D7株的序列。上述各種可能性中的抗原性多肽組合物的另一個實例是一種組合、特別是一種混合表位(mixotope)，其包含多種、特別是至少2種合成肽，所述合成肽包含以下序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-G-X9-X10-X11-X12(SEQIDNo31)，其中X1＝I，Y或無；X2＝L，F或無；X3＝E，D，P或無；X4＝R，D或無；X5＝G，A，L或無；X6＝W，G，S，I或E；X7＝E，L或A；X8＝F，I，G，L或S；X9＝G，S或A；X10＝V，A，L，I或S；X11＝P，Y或L；X12＝E，F或無。“混合表位”是一種肽組合文庫，其可通過文獻所述單獨合成而獲得(Gras-Masse，Georgesetal.1999)。源自MSP-3-b的、且可納入本發明的抗原性多肽組合物中的另一種混合物或特別是混合表位是一種組合、特別是混合表位，其包含多種、特別是至少2種合成肽，所述合成肽包含以下序列X1-X2-X3-W-E-X4-G-G-G-X5-P(SEQIDNo32)，其中X1＝I或YX2＝L或F；X3＝G或A；X4＝F或I；且X5＝V或A。類似地，本發明的另一種抗原性多肽組合物是一種組合、特別是一種混合表位，其包含多種、特別是至少2種合成肽，所述合成肽包含以下序列L-X1-X2-X3-X4-X3-X5-X6-X7-D-X8-X9-X10-I-X11-X12-X13-X14-X15-X16(SEQIDNo33)，其中X1＝E，或S；X2＝L，H，S或Q；X3＝I，V或L；X4＝K，N，Y或P；X5＝T，S或P；X6＝S或L；X7＝K，W或S；X8＝E，K，R或I；X9＝E或N；X10＝D，N或Q；X11＝I，V，S，P或A；X12＝K，D或N；X13＝H或E；X14＝N或S；X15＝E或D；X16＝D或Q。以上三組中每一組中的數種多肽的組合或以上三組中數組中的多肽的組合可形成源自MSP3樣蛋白質的C-末端區域的包含所述肽的肽或多肽的混合物，或可形成融合多肽，或可形成不同融合多肽的混合物。以上抗原性混合表位組合物具體可以是至少50種、至少100種、或至少500種不同序列的肽的混合物。還可包含相應于每一種觀察到的和可能的取代物的合成肽的組合文庫。包含兩種上述組合或混合表位的抗原性組合物也包括在本發明范圍內。在任一上述抗原性多肽或抗原性多肽組合物中，可將脂質分子與多肽分子的至少部分相連接。可用于這方面的脂質分子的一個實例是C-末端palmitoylysylamide殘基。上面已經提到，本發明的抗原性多肽的至少部分多肽或多肽分子可結合于支持物，由此構成綴合物。在本發明的這一實施方式中，優選的支持物是病毒顆粒、硝化纖維素或聚苯乙烯珠、以及生物可降解聚合物如lipophosphoglycanes或聚-L乳酸。本發明的另一個方面涉及包含蛋白質或多肽或多肽組合物作為免疫原的免疫原性組合物，所述蛋白質或多肽或多肽組合物特別可通過上述任何重組方法而制備。如實施例5中所討論的，在此所述的基因家族表現出一個顯著的特征，即該家族的不同成員之間存在的表位的保守性，這造成該基因家族的不同產物之間存在的免疫原性交叉反應性。實施例2和3中所闡述的MSP-3-1及其片段在疫苗接種中的潛力，連同上面提及的表位保守性和交叉反應性，是使得該基因家族及由其產生的多肽組合物成為針對瘧疾進行疫苗接種的特別引人關注的候選物的顯著特征。因此，本發明的另一方面涉及上述重組蛋白質或多肽或多肽組合物在制備抗瘧疾疫苗中的用途以及這樣的疫苗，所述疫苗包含作為免疫原的所述重組蛋白質或多肽或多肽組合物以及合適的藥用載體。本發明的免疫原性組合物和疫苗可進一步包含選自LSA-1(Guerin-Marchand，Druilheetal.1987)、LSA-3(Daubersies，Thomasetal.2000)、LSA-5、SALSA(Bottius，BenMohamedetal.1996)、STARP(Fidock，Bottiusetal.1994)、TRAP(Robson，Halletal.1988)、PfEXP1(Simmons，Woollettetal.1987)、CS(Dame，Williamsetal.1984)、MSP1(Miller，Robertsetal.1993)、MSP2(Thomas，Carretal.1990)、MSP4(Marshall，Tieqiaoetal.1998)、MSP5(Marshall，Tieqiaoetal.1998)、AMA-1(Peterson，Marshalletal.1989；Escalante，Grebertetal.2001)、SERP(Knapp，Hundtetal.1989)和GLURP(見上)中的至少一種抗原。將GLURP和/或LSA-3和/或SERP蛋白質用于本發明的免疫原性組合物中值得特別關注。上述中的一種具體的免疫原性組合物包含選自LSA-3、SERP和GLURP或其組合或其免疫原性功能性片段中的特定抗原。根據本發明的一個具體實施方式，免疫原性組合物或疫苗被配制為用于皮內或肌肉內注射。為此，所述免疫原性組合物或疫苗優選地在每個注射劑量中包含1至100μg的免疫原，更優選地為2至50μg。或者，免疫原性組合物或疫苗可如文獻所述被配制為用于口服施用(BenMohamed，Belkaidetal.2002)。本發明的免疫原性組合物或疫苗還可進一步包含SBAS2和/或明礬和/或Montanide作為佐劑。本發明的其他方面涉及針對在此所述的抗原的抗體、特別是純化的抗體、以及抗體片段。如以上及實施例5所述，MSP-3家族的表位保守性造成所獲得的針對一種抗原的抗體具有交叉反應性。例如，本發明的一種特別引起關注的抗體是這樣一種合成或重組的抗體，其與MSP-3家族、特別是與MSP-3-3和/或MSP-3-4和/或MSP-3-7和/或MSP-3-8的數種蛋白質發生交叉反應，并介導在體外條件下通過單核細胞依賴性的抗體介導的ADCI機制介導在血液期抑制惡性瘧原蟲的生長或殺死惡性瘧原蟲。針對選自MSP-3家族中的、特別是具有SEQIDNo6、8、14和16的蛋白質中的數種蛋白質、和/或本發明的數種多肽的抗體庫和/或抗體片段庫，也是本發明的一部分。本發明的另一種抗體庫和/或抗體片段庫針對的是如上所述的多肽組合物。本發明的優選的抗體(或片段)是人抗體或人源化抗體。這些抗體或抗體片段可例如在浮萍屬(Lemna)以及玉米、煙草、CHO細胞等等中制備。如果在CHO細胞中制備，則可例如通過采用WO03/016354中所述的方法而獲得。本發明還涉及包含上述抗體或抗體庫或其抗體片段庫的組合物在制備抗瘧疾藥物中的用途。當然，包含這一抗體或抗體庫的、用于瘧疾的被動免疫治療的藥物，也視同為本發明的一部分。該藥物可進一步包含針對選自LSA-1、LSA-3、LSA-5、SALSA、STARP、TRAP、PfEXP1、CS、MSP1、MSP2、MSP4、MSP5、AMA-1、SERP和GLURP中的至少一種抗原的抗體。本發明還包括通過給有需求的患者施用上述免疫原性組合物、疫苗或包含抗體的藥物而預防、減輕或治療瘧疾的方法。本發明還涉及對可能感染惡性瘧原蟲的個體進行體外瘧疾診斷的方法，其包含將來自所述個體的生物學樣品與本發明的蛋白質或抗原性多肽相接觸，所述接觸在能夠使得所述抗原性肽或多肽與可能存在于所述生物學樣品中的抗體形成抗原/抗體復合物的條件下進行，并在體外檢測可能形成的抗原/抗體復合物。在該方法中，可通過ELISA分析進行體外針對。作為該方法的附加步驟，還可將所述生物學樣品與源自其他抗原的一或數種抗原性肽相接觸，所述其他抗原選自LSA-1、LSA-3、LSA-5、SALSA、STARP、TRAP、PfEXP1、CS、MSP-3-1、MSP-3-2、MSP-3-5、MSP-3-6、MSP1、MSP2、MSP4、MSP5、AMA-1、SERP和GLURP，特別是選自LSA-3、SERP和GLURP。用于對可能感染惡性瘧原蟲的個體進行體外瘧疾診斷的一個替代方法包含，將來自所述個體的生物學樣品與本發明的抗體相接觸，所述接觸在能夠使得所述抗體與可能存在于所述樣品中的惡性瘧原蟲特異性抗原形成抗原/抗體復合物的條件下進行，并在體外檢測可能形成的抗原/抗體復合物。本發明還預期基于MSP-3家族的特殊特征的、用于體外診斷瘧疾的試劑盒。例如，它們可包含本發明的至少一種肽或多肽，所述肽或多肽可結合于一種支持物。該試劑盒可進一步包含能夠使得所述抗原性肽或多肽與可能存在于生物學樣品中的抗體形成抗原/抗體復合物的試劑，以及能夠在體外檢測可能形成的抗原/抗體復合物的試劑。根據本發明，另一種用于體外診斷瘧疾的試劑盒包含如上所述的抗體，且需要時，包含能夠使得所述抗體與來自可能存在于生物學樣品中的MSP-3家族的蛋白質的抗原形成抗原/抗體復合物的試劑，以及能夠在體外檢測可能形成的抗原/抗體復合物的試劑。本發明還包括一種重組核苷酸序列，其包含編碼本發明的蛋白質或抗原性多肽的序列。本發明的具體的序列是包含編碼至少兩種MSP-3-b樣基序和/或MSP-3-c/d樣基序的核苷酸序列，其中所述基序中的至少一個選自基序SEQIDNo19至24和27至30或其保守性變體的序列。這種重組核苷酸序列的第一個實例包含編碼包含數個MSP-3-b樣基序的融合蛋白的序列，其中所述基序中的至少兩個選自基序SEQIDNo17至24及其保守性變體。第二個實例是包含編碼包含數個MSP-3-b樣基序的融合蛋白的序列的重組核苷酸序列，其中所述基序中的至少兩個選自基序SEQIDNo25至30及其保守性變體。另一個實例是編碼至少兩種MSP-3-b-like和/或MSP-3-c/d樣基序的序列，其中所述基序中的至少一個選自基序SEQIDNo19至24和27至30或其保守性變體，并包含一種包含編碼包含數個MSP-3-b樣基序的融合蛋白的序列的重組核苷酸序列，其中所述基序中的至少兩個選自基序SEQIDNo25至30。本發明還涉及重組的克隆和/或表達載體，其包含如上所述的核苷酸序列，所述序列能夠，例如置于相對于宿主細胞是同源的或異源的啟動子和調節元件的控制下，以便在宿主細胞中表達。上段中提及的表達載體可有利地用于制備用于抗惡性瘧原蟲的基因免疫接種的藥物。本發明還涉及核酸疫苗(例如多核苷酸疫苗)，其包含本發明的核苷酸序列。本發明還包括經上述表達載體轉化的重組宿主細胞，例如細菌、酵母、昆蟲細胞、或哺乳動物細胞。下文中的附圖和實驗數據舉例闡述了本發明的一些方面和優越之處。圖1成簇位于10號染色體的同一區域的9個基因的組織結構。9個可讀框被非編碼區域分隔開，并編碼一列(5’-3’)基因，所述基因編碼的蛋白質的第一個被命名為GLURP，其后在1300堿基對處是MSP-3(現命名為MSP-3-1)，隨后是其他7個基因，命名為MSP-3-2、MSP-3-3、MSP-3-4、MSP-3-5、MSP-3-6、MSP-3-7、MSP-3-8。圖2來MSP-3-1的各種肽。保護作用與針對肽MSP-3b、c和d的抗體相關。圖3、4和5體內研究。將特異性抗體被動轉移入移植了惡性瘧原蟲感染的人類RBC的免疫缺陷小鼠的實驗。在體內被動轉移的條件下證實，針對MSP3-b肽、MSP-3-d肽和GLURP-R0區域的抗體都能夠清除在免疫缺陷的SCID小鼠中建立的惡性瘧原蟲寄生蟲血癥。圖6體內研究。確證結果。以針對MSP-3-b表位并與MSP-3-2重組蛋白質交叉反應的人類重組抗體進行被動轉移可清除惡性瘧原蟲SCID小鼠的寄生蟲血癥。圖7采用覆蓋區域MSP-3-b、c、d肽的長合成肽對人志愿者進行人工免疫接種，用由此激發的抗體獲得的結果。在惡性瘧原蟲SCID小鼠模型中，在體外和體內條件下均觀察到同樣的效果。圖8比較總非洲IgG與調整到與總非洲IgG相同濃度的純化抗MSP-3-b抗體之間的生物學效應。僅觀察到抗MSP-3-b抗體具有更強的且更完全的效應，這突出說明其作為疫苗的潛力。圖9MSP-3家族的核苷酸序列的ClustalW比對。圖10MSP-3家族的肽序列的ClustalW比對。圖11MSP3基因家族之間的序列比較。這一比較說明，具有生物學活性的抗體所針對的該家族成員之間的表位具有非常罕見的保守性，這對于產生保護作用是至關重要的。圖12MSP-3-b樣基序。圖13MSP-3-c-d樣基序。圖14A.針對30個得到保護的OoDo個體中的每一個的抗原的IgG3抗體應答譜(IgG3特異性應答比例的平均值和標準誤)。B.具有低IgG3抗MSP3應答的7個得到保護的OoDo居民的IgG3應答譜(低IgG3截斷值被定義為那些低于平均值95％置信區間界限以下的截斷值，即抗MSP3bIgG3比例＜2.30)。C.具有低IgG3抗R0應答的15個得到保護的OoDo居民的IgG3應答譜(低IgG3截斷值被定義為那些低于IgG3比例平均值95％置信區間界限以下的截斷值，即抗GLURPR0IgG3比例＜1.38)。D.1998年具有高IgG3MSP3應答的7個得到保護的個體在5年間的改變。E.1998年具有高IgG3抗GLURPR0應答的6個得到保護的個體在5年間的改變。圖15親和純化的抗體對來自MSP-3基因家族的各種構建體的ADCI活性。結果表示為相對于陽性對照的平均SGI(特異性生長抑制指數)，陽性對照為免疫非洲人免疫球蛋白庫(PIAG)，其被用來被動轉移至泰國兒童。用于親和純化的序列相應于C-末端區域，其是基因間最具有同源性的部分且是唯一非常具有保守性的部分，在圖18中，以線條在C-末端區域下方標示出所述序列。結果說明，所有特異于6種基因中的各種的各區域的抗體均在ADCI機制中具有很強的活性，與非洲免疫球蛋白庫差不多，而通過被動轉移至感染個體發現，所述非洲免疫球蛋白庫可有效清除惡性瘧原蟲。圖16針對MSP-3家族的各個成員的C-末端區域進行親和純化的抗體與MSP-3家族的其他成員的交叉反應性模式。GLURP、571和BSA作為陰性對照。結果說明，針對該家族的一個成員的給定C-末端區域進行親和純化的抗體與MSP-3家族的所有其他成員發生不同程度的交叉反應。最強的交叉反應模式由MSP-3-4產生，其對所有其他成員顯示出強陽性信號，隨后是MSP-3-8。不過，這一斑點印跡僅顯示了MSP-3家族的各個成員中的交叉反應表位。圖17針對MSP-3家族的各個成員的C-末端區域進行親和純化的抗體與來自于MSP-3家族的MSP-3-1和MSP-3-2成員的肽的交叉反應性模式。肽是來自MSP-3-1和MSP-3-2的肽a、b、c、d和f。重組MSP-3C末端和BSA分別作為陽性和陰性對照。結果說明，針對該家族不同成員的C-末端區域的抗體與MSP-3-1(特別是MSP-3b和c)的C-末端的不同區域發生不同程度的反應，且MSP-3-f發生最強的反應。與MSP3-2的不同的肽的交叉反應性不如與MSP-3-1的肽那樣強。最后，與MSP-3-1CT(C末端重組體)發生非常強的交叉反應，這同樣提示交叉反應針對的不是任何個別的肽所限定的表位，而最可能是針對由較長的C末端重組體所產生的構象表位。就此而言，任何給定的親和純化的抗體與該家族的任何給定成員的交叉反應性的程度證明該家族的不同成員之間具有結構的同源性，且存在交叉反應性表位，包括那些因3維構象而產生的表位。對于MSP-3-2而言也是如此。圖18MSP-3家族的不同成員的示意圖。下劃線標示的是C-末端區域，其用于構建那些用于免疫分析的重組抗原。圖19惡性瘧原蟲MSP3蛋白質的示意圖以及設計MSP3重組蛋白質(MSP3-NTHis和MSP3-CTHis)和肽(MSP3a、MSP3b、MSP3c、MSP3d、MSP3e和MSP3f)。MSP3的N-端部分在此被壓縮表示(由點劃線表示)。DG210代表最初被鑒定為保護性抗體的靶位的λgt11表達克隆[Bouharoun-TayounH，DruilheP.1992]。數字所示為基于源自3D7株的序列的各個區域的氨基酸位置。圖20來自象牙海岸的高免疫血清(hyperimmunesera)(n＝30)中的針對MSP3的不同區域的總IgG應答，所述高免疫血清被用來制備保護性IgG，以用于進行人體被動轉移實驗[SabchareonA，BurnoufT，OuattaraD，etal.1991]。如果測試血清的平均O.D.與對照血清的平均O.D.+3X對照血清的標準差的比例≥1，則認為抗體反應為陽性。數字代表針對各個區域的陽性血清的平均抗體滴度(以比例表示)。表格顯示的是與MSP3的不同區域具有反應性的陽性血清(根據總IgG)的百分比發生率(Prevalence)。圖21來自Dielmo村的血清(n＝48)中的針對MSP3的不同區域的抗體的發生率和平均滴度。如果測試血清的平均O.D.與對照血清的平均O.D.+3X對照血清的標準差的比例≥1，則認為抗體反應為陽性。數字代表針對各個區域的陽性血清的平均抗體滴度(以比例表示)。表格顯示的是與MSP3的不同區域具有反應性的陽性血清(根據IgG同種型)的百分比發生率(Prevalence)。圖22在ADCI分析中，親和純化的人抗MSP3抗體對寄生蟲生長的作用。組方圖代表來自2個獨立實驗中的％SGI的平均值(如文字部分所述)±標準誤；＞30％的數值具有顯著性。PIAG，來自用于人類被動轉移的象牙海岸成人血清庫的陽性對照IgG[SabchareonA，BurnoufT，OuattaraD，etal.1991]。圖23體內，將親和純化的人抗MSP3抗體與人外周血單核細胞轉移入P.f.-HuRBC-BXN小鼠。曲線顯示的是注射抗MSP3b抗體(灰色方塊)和抗MSP3d抗體(白色圓環)的小鼠的寄生蟲血癥的過程，通過顯微鏡觀察薄層血涂片而確定。箭頭指示的是注射日，首先注射人單核細胞(HuMn)，然后注射單核細胞和抗MSP3抗體(200μl，IFA1∶200)。圖24MSP3a、MSP3b、MSP3c。25MSP3d、MSP3e、MSP3f。圖26圖片(A)位于惡性瘧原蟲10號染色體的32kb的重疊群(contig)(3D7株的1404403至1436403bp)的示意圖，示出了MSP3樣ORF的相對位置。MSP3.1和MSP3.2分別是已知的編碼裂殖子表面蛋白質MSP3(Oeuvray，etal.，1994)和MSP6(Trucco，etal.，2001)的基因。圖片(B)具有相關的C-末端序列組織結構的MSP3蛋白質家族的氨基酸序列的ClustalW比對和Boxshade表示法。MSP3.5和MSP3.6與其他成員不具有C-末端序列相似性。黑色背景上的白色字母代表相同的殘基，而灰色背景上的黑色字母代表相似的殘基。破折線代表使比對最優化的缺口。MSP3家族成員共同具有的模式為N-末端信號肽(點線框)；MSP3蛋白質家族的特征標記序列[1]；富含谷氨酸的區域[2]；以及亮氨酸拉鏈結構域[3]。以黑色突出顯示的序列涉及的區域被鑒定為在MSP3.1中鑒定的保護性抗體的靶位。圖片(C)是顯示通過比較被編碼的蛋白質序列而產生的不同MSP3樣ORF之間的序列相似性的進化樹。圖27由MSP3樣ORF編碼的蛋白質序列的示意圖。各個分子的N-末端區域具有()-信號肽和()-4-6個氨基酸的特征標記基序。除MSP3.5和MSP3.6以外的所有MSP3家族成員的C-末端部分具有與MSP3.1相似的序列組織結構。()-和()代表在MSP3.1中鑒定的與保護性抗體的靶位共享序列相關性的區域。()-和()分別代表富含谷氨酸的區域和推定的亮氨酸拉鏈結構域。()-代表與MSP3.1具有相似性的區域。在不同成員中觀察到的其他特征為()-MSP3.1中的七重復序列(heptadrepeats)；其他ORF中的與MSP3.1具有序列不一致性的區域()、()和()-分別位于MSP3.2、MSP3.7和MSP3.3中。()-代表MSP3.4和MSP3.8中的與var和ebl-蛋白質家族中的DBL結構域具有相似性的區域及半胱氨酸殘基的位置。()和()-分別是MSP3.4和MSP3.8中的與MSP3.1無關的區域，它們彼此具有相似性。()和()-分別代表MSP3.5和MSP3.6中的區域及其他被遮蔽的區域，它們與其他MSP3樣ORF不具有相似性。粗線代表()-覆蓋在各個成員中鑒定到的獨特區域的重組蛋白質，它們與其他惡性瘧原蟲蛋白質不具有序列相似性，和()-覆蓋除MSP3.5和MSP3.6以外的所有成員中的相關C-末端區域的重組蛋白質。圖28針對那些覆蓋了在MSP3樣ORF的各個成員中鑒定到的獨特區域的重組蛋白質的親和純化的抗體的特異性。將2μg的純化的His-tag重組蛋白質(MSP3.1u，....MSP3.8u)在硝化纖維素條上進行斑點印跡。如上圖所示，針對一組所有獨特區域重組蛋白質對來自高免疫血清的針對各獨特區域重組蛋白質的親和純化的抗體(抗MSP3.1u、抗MSP3.8u)進行測試。抗體反應性模式顯示，親和純化的抗體對重組蛋白質(這些抗體是針對這些重組蛋白質進行親和純化的)具有高特異性。圖29MSP3樣ORF的表達分析。圖片ART-PCR分析轉錄產物。箭頭指示了使用特異于各個ORF的引物組獲得的cDNA擴增產物的大小。注意到MSP3.5的轉錄產物相對于其他家族成員的豐度較低。圖片B檢測惡性瘧原蟲3D7血液期提取物中的由不同MSP3樣ORF編碼的蛋白質，通過Western印跡進行分析，使用了針對在各個ORF中鑒定到的獨特的非交叉反應區域的親和純化的抗體。箭頭指示了通過變性SDS-PAGE檢測到的惡性瘧原蟲蛋白質的大小。數字代表分子量標志的位置。針對MSP3.5和MSP3.6的獨特區域的親和純化的抗體在寄生蟲提取物中沒有檢測到特異性蛋白質產物。圖片CIFA分析丙酮固定的血液期寄生蟲的薄層涂片顯示了裂殖子表面染色，使用的是與用于Western印跡分析的抗體相同的抗體。各個顯微鏡視野右下角的比例尺代表5μm。針對MSP3.5的獨特區域的親和純化的抗體在IFA中沒有與寄生蟲蛋白質發生反應。圖30在來自塞內加爾瘧疾疫區Dielmo村的高免疫血清庫中觀察到的針對MSP3蛋白質家族的不同成員的抗體亞型反應性模式。組方圖代表減去針對BSA的反應性之后得到的O.D.450平均值。[NH4SCN]。圖31顯示的是在NH4SCN的濃度漸增條件下，針對MSP3蛋白質家族成員的抗體結合親和力。這里顯示的是親和純化的抗體的兩個實例，圖片A抗MSP3.4抗體對MSP3.1的反應性，和圖片B抗MSP3.7抗體對其自身的反應性。無NH4SCN時的抗原抗體反應性的測定值被認為是100％，存在漸增濃度的NH4SCN的條件下獲得反應性被表示為該100％的分數。由于抗體結合并非與漸增濃度的離液鹽呈線性關系，因此通過計算由圖中陰影面積所代表的“各個曲線下的面積％”確定抗體結合親和力。圖32通過人工免疫接種小鼠產生的抗體所顯示的交叉反應性。以來自MSP3.1和MSP3.2的相關C末端重組蛋白質免疫接種各組5只Balb/C小鼠，以Montanide作為佐劑。組方圖顯示的O.D.450值代表針對MSP3蛋白質家族的不同成員的抗MSP3.1和抗MSP3.2小鼠血清的反應性。誤差條代表標準差值。圖33在ADCI分析中，針對MSP3蛋白質家族的相關C-末端區域的人的親和純化的抗體對寄生蟲生長的影響。組方圖代表來自2個獨立實驗的％SGI(如文字部分所示)平均值±標準誤；＞30％的值具有顯著性。PIAG，來自用于在人類進行被動轉移的象牙海岸成人血清庫的陽性對照IgG(Sabchareon，etal.，1991)。圖34(A)惡性瘧原蟲MSP6蛋白質和設計MSP6C末端重組蛋白質和肽(MSP6a，MSP6b，MSP6c，MSP6d，MSP6e和MSP6f)的示意圖。分子的N-端部分在此被壓縮表示(由點劃線表示)。數字顯示的是各個區域的氨基酸位置，其基于來自3D7株的序列。(B)不同的MSP6肽區域與它們的來自MSP3的相應區域的同源性比對。實心圓代表這兩種相關的分子之間具有的氨基酸殘基的相同性，而垂直線顯示的是其相似性(采用Wilbur-Lipman算法進行成對比對，PAM250)。圖35來自象牙海岸的高免疫血清(n＝30)中的針對MSP6的不同區域的抗體流行程度和滴度。如果測試血清的O.D平均值與對照血清的O.D平均值+3x對照血清標準差之比＞或＝1，則認為抗體反應性為陽性。數字代表抗體滴度，以各血清的比例表示，點劃線代表等于1的基線比例。表格顯示對MSP6的不同區域具有陽性IgG反應性的血清的百分比流行程度。圖36ADCI分析測定的人類親和純化的抗MSP6抗體對寄生蟲生長的作用。組方圖代表來自3個獨立實驗的平均值％SGI(如蚊子部分所示)±標準誤；數值＞30％被認為具有顯著性。PIAG，來自用于在人類進行被動轉移的象牙海岸成人血清庫的陽性對照IgG。以通過PIAG觀察到的作用作為100％，并與之相比調整親和純化的抗體產生的寄生蟲抑制水平。NigG，來自從未暴露于瘧疾的法國供者庫的陰性對照IgG。抗RESA抗體親和純化自針對合成肽(序列H-[EENVEHDA]2-[EENV]2-OH)的高免疫血清(象牙海岸)庫。實施例實施例1通過ADCI機制在體外以針對基因產物的抗體在血液期殺死惡性瘧原蟲2.A.材料和方法ADCI分析2.A.1.介紹抗體依賴性細胞抑制(ADCI)分析被設計用于分析在存在單核細胞的情況下，抗體抑制惡性瘧原蟲的體外生長的能力。研究顯示，那些通過在人類進行被動轉移而證實具有抗惡性瘧原蟲血液期保護作用的抗體，如果不能與血液單核細胞進行協作，就不能在體外抑制寄生蟲。還發現，那些在體內不具有保護作用的抗體在ADCI分析中對惡性瘧原蟲的生長沒有作用。因此，ADCI作為一種體外分析，其結果反映的是在人類的體內條件下觀察到的抗瘧疾抗體的保護性作用。能夠與單核細胞協作的抗體顯然應該是嗜細胞性的IgG1和IgG3同種型在ADCI中是有效的，而IgG2、IgG4和IgM是無效的。與此一致的是，發現在來自被保護的個體的血清中，嗜細胞抗惡性瘧原蟲抗體是主要的，而在未被保護的患者中，所產生的針對寄生蟲的抗體主要是非嗜細胞性的。這些結果提示，ADCI很可能參與以下連續的事件在裂殖體破裂時，一些裂殖子表面成分與通過Fc片段結合于單核細胞的嗜細胞抗體之間的接觸觸發了可溶性介質的釋放，這些介質彌散于培養基中并阻斷周圍紅細胞內的寄生蟲的分裂。ADCI方案包括的主要步驟為(i).以離子交換層析制備血清IgG(ii).自健康的血液供者分離單核細胞(iii).制備惡性瘧原蟲寄生蟲，包括同步化和富集裂殖體(iv).在存在抗體和單核細胞的條件下培養寄生蟲96小時(v).通過顯微鏡觀察和寄生蟲計數分析抑制作用2.A.2.材料制備IgG1.Tris緩沖液0.025MTris-HCl，0.035MNaCl，pH8.8。2.磷酸緩沖鹽(PBS)，pH7.4。3.GF-05-三丙烯酰基過濾柱(IBF，Biothecnics，VilleneuveLaGarenne，France)。4.DEAE-三丙烯酰基離子交換層析柱(IBF)。5.G25過濾柱。6.用于蛋白質濃縮的Amicon濾膜和管(分子量截斷值50,000Da)。7.SterileMillex濾膜，0.22μm孔徑(MilliporeContinentalWaterSystems，BedfordMA)。8.配備紫外燈的分光光度計。制備單核細胞1.自健康供者收集肝素化的血液，體積20-40mL。2.Ficoll-Hypaque密度梯度(PharmaciaLKBUppsala，Sweden)。3.Hank溶液，補充了NaHCO3，pH7.0。4.RPMI1640培養基，補充了35mMHepes和23mMNaHCO3；以礦泉水制備，4℃存放。5.用于非特異性酯酶(NSE)染色所試劑固定溶液、亞硝酸鹽、染料、緩沖液和底物。6.96-孔無菌塑料板(TPP，Switzerland)。7.冷卻離心機。8.CO2孵箱。9.倒置顯微鏡。制備寄生蟲1.RPMI1640培養基(見上)。2.10％Albumax儲存液；4℃存放至1個月。3.5％山梨醇，用于寄生蟲的同步化。4.原生質凝膠，用于富集裂殖體。5.用于薄層涂片的固定和染色的試劑甲醇、伊紅、亞甲基藍。2.A.3.方法制備IgGIgG提取自人血清(見注釋1)，如下所示1.將血清按照1至3的比例稀釋于Tris緩沖液。2.將稀釋的血清以預先用Tris緩沖液平衡過的GF-05三丙烯酰基凝膠過濾柱進行過濾。確保血清與過濾凝膠的比例為1體積的未稀釋血清比4體積的GF-05凝膠。3.合并含蛋白質的組分。4.加載于預先用Tris緩沖液平衡過的DEAE-三丙烯酰基離子交換層析柱。確保血清與過濾凝膠的比例為1體積的未稀釋血清比4體積的DEAE凝膠。5.收集1mL體積的各組分。6.使用280nm濾鏡測量各個組分的光密度(OD)。7.如下計算IgG濃度8.合并含IgG的組分。9.使用Amicon濾膜濃縮IgG。Amicon濾膜先在蒸餾水中浸泡1小時然后使之適合特殊的管，所述管中加入IgG溶液。10.將管以876g離心2小時，4℃。這通常可產生25倍的濃縮物。11.以預先用RPMI培養基平衡過的G25柱進行最后一步凝膠過濾。12.收集RPMI中的IgG組分。13.使用280nm濾鏡測量各個組分的光密度(OD)。14.計算IgG濃度。15.合并含IgG的組分。16.將IgG組分以0.22μm孔徑濾膜進行過濾除菌。17.將無菌IgG溶液在4℃存放至1個約(或加入Albumax以存放更長的時間一但并不推薦)。制備單核細胞制備單核細胞的方法基于Boyum所述(Scand.J.Clin.Lab.Invest.1968，21，77-89)，步驟包括1.以Hank溶液將肝素抗凝血稀釋3倍。2.小心地將2體積的稀釋血液加至1體積Ficoll-Hypaque上層(每管最多20mL的稀釋血液)。3.以560g離心20min，20℃。4.將Ficoll/血漿交界處的單個核細胞層取出。5.在單個核細胞懸液中加入45mL的Hank溶液。6.1000g離心15min，20℃。7.小心地將沉淀的細胞重懸于45mL的Hank溶液中。8.1000g再次離心15min，20℃。重復洗滌步驟2次。9.最后，180g離心6min，20℃，以殘留于上清液中的血小板。10.將單個核細胞重懸于2mL的RPMI中。11.計算細胞懸液中的單個核細胞(即淋巴細胞加上單核細胞)的濃度將20μL的細胞懸液樣品在RPMI中稀釋3倍，使用血球計數器(例如Malassez型號)計數細胞數。12.使用非特異性酯酶(NSE)染色技術測定單核細胞數(i).在微量離心管A中，將40μL單個核細胞懸液加至40μL的固定液中。(ii).在微量離心管B中，按照以下次序混合NSE染色試劑60μL亞硝酸鹽、60μL染料、180μL緩沖液、和30μL底物。(iii).將微量離心管B中的混合物加至微量離心管A中的細胞中。(iv).取20μL染色細胞樣品并測定單核細胞淋巴細胞的比例單核細胞為棕色，而淋巴細胞是未著色的。單核細胞的比例通常占全部單個核細胞的10-20％。13.以RPMI將細胞懸液的濃度調整至每100μL中2×105單核細胞。14.將細胞懸液的樣品加入96-孔板中，100μL/孔。15.在37℃、5％CO2溫育90min。溫育期間，單核細胞會粘附于塑料板上。16.去除未粘附的細胞，通過在每孔中加入200μL的RPMI然后將其完全去除而洗滌單核細胞。17.重復洗滌步驟3次，以便去除所有未粘附細胞。18.至少95％的回收細胞為單核細胞。通過倒置顯微鏡觀察以調節細胞的狀態以及各孔中細胞分布的相對均質性(見注釋2、3和4)。制備寄生蟲惡性瘧原蟲株培養于RPMI1640，添加了0.5％Albumax。使用山梨醇處理將寄生蟲同步化，方法如下1.以礦泉水將山梨醇儲存液稀釋至5％。2.1200rpm離心未同步化的寄生蟲培養懸液10min，20℃。3.將沉淀重懸于5％山梨醇溶液中。這將導致裂殖體感染的RBC發生選擇性裂解，而不會影響環形和幼滋養體。如果需要，通過懸浮于原生質凝膠而富集裂殖體，方法如下1.將含有未同步的寄生蟲的培養物在250g離心10min，20℃。2.將沉淀重懸，終濃度為20％紅細胞(RBC)、30％RPMI、50％原生質凝膠。3.37℃溫育30min。感染了裂殖體的RBC會留在上清液中，而感染了幼滋養體和未感染的RBC會發生沉淀。4.通過在20℃以250g離心10min小心地收集上清液。5.制備來自沉淀細胞的薄層涂片，染色，并通過顯微鏡檢查確定寄生蟲血癥。6.通常，采用這種方法可回收～70％寄生蟲血癥的同步化裂殖體感染的RBC。為了進行ADCI分析，使用了同步化的早期裂殖體寄生蟲。通常，寄生蟲血癥為0.5-1.0％，而紅細胞壓積為4％。ADCI分析1.末次洗滌后，在每個含有單核細胞的孔中加入(i).40μL的RPMI，添加了0.5％Albumax(培養基)。(ii).10μL的待測試抗體溶液。通常使用的IgG的濃度為其血清原濃度(來自高發病疫區的成人為～20mg/mL，對于疫區的兒童以及首次發病的患者為～12mg/mL)的10％。(見注釋5)。(iii).50μL的寄生蟲培養物，以0.5％寄生蟲血癥和4％紅細胞壓積。2.對照孔的組成為(i).單核細胞(MN)和寄生蟲與自無瘧疾病史的供者的血清制備的正常IgG(NIgG)。(ii).寄生蟲與待測試IgG，無MN。3.在燭罐(candle-jar)(或低O2，5％CO2孵箱)中將培養物在37℃維持96小時。4.48和72小時后，在各孔中加入50μL培養基。5.96小時后去除上清液。制備來自各孔的薄層涂片，染色，通過顯微鏡檢查確定寄生蟲血癥。為了保證相對精確的寄生蟲計數，應該計數至少50,000個紅細胞(RBC)并計算感染的RBC的百分數(見注釋6和7)。6.計算特異性生長抑制指數(SGI)，這要考慮到可能由單核細胞或抗體單獨引起的抑制SGI＝100×(1-[具有MN和Ab的寄生蟲血癥百分數/具有Ab的寄生蟲血癥百分數]/[具有MN+NIgG的寄生蟲血癥百分數/具有NIgG的寄生蟲血癥百分數])2.A.4.注釋1.自待測試血清制備IgG是一個必要的步驟，這是因為當使用未成分化的血清時，經常觀察到非抗體依賴性的寄生蟲生長抑制作用，這可能是因為氧化的脂質的緣故。2.ADCI中的單核細胞(MN)功能依賴于多種因素，例如用于制備RPMI1640的水。高純度的水，如Millipore水，盡管足以進行寄生蟲培養，但造成粘附于塑料孔后的MN的回收數量產率低下。另一方面，含有微量礦物質的水，如商品化的Volvic水或玻璃蒸餾水(glass-distilledwater)，可穩定提供良好的單核細胞功能。3.通過在進行單個核細胞溫育之前，以纖連蛋白包被培養孔，即以來自MN供者的自體血漿包被，繼以RPMI1640洗滌，可獲得改善的單核細胞粘附性。4.來自病毒(如流感)感染個體的經常能夠誘導非IgG依賴性的寄生蟲生長抑制作用。這種非特異性抑制作用可造成在ADCI中無法觀察所IgG依賴性的抑制作用。因此，應該避免使用懷疑具有病毒感染或在過去的8天中出現發熱的MN供者。如果MN單獨的直接抑制作用大于50％，則ADCI的結果是不可靠的。在含有異源性血清例如FCS的培養基中制備MN，導致MN發生分化，進行性轉化為巨噬細胞，后者已經喪失了對ADCI的促進作用。5.如果需要，可以在ADCI中用人MN測試鼠IgG。IgG2a同種型能夠結合存在于單核細胞上的人的Fcγ受體II，其被發現參與了ADCI機制。6.ADCI分析的一種可能的變化是評價針對裂殖子表面抗原的保護性嗜細胞抗體(高發病疫區的成人)與識別相同抗原但由于不結合Fcγ受體而不能觸發單核細胞激活的非保護性抗體(疫區的兒童以及首次發病的患者)之間的競爭性作用。因此，針對“關鍵”抗原的非嗜細胞性Ig可阻斷保護性抗體的ADCI作用。使用的各個IgG組分的濃度應該是其血清中的原濃度的10％。7.可以對ADCI分析方案進行改動并作為兩步ADCI而進行，其中具有單核細胞的短期活化，方法如下(i).將MN與測試Ig和感染了同步化的成熟裂殖體的RBC(5-10％寄生蟲血癥)溫育12-18小時。在這種第一步培養過程中，感染的RBC發生破裂并釋放裂殖子。(ii).自各個孔收集上清液并將其在700g進行離心。(iii).將上清液分配至96-孔中，100μL/孔。(iv).在各個孔中加入100μL的惡性瘧原蟲同步化培養物，所述培養物含有新鮮培養基，0.5-1％寄生蟲血癥，5％紅細胞壓積(特別小心地將用于這種第二步培養的RBC制備物中的白細胞污染物降至最低)。(v).在培養的第36小時，在各個孔中加入1mCi的3H次黃嘌呤。(vi).在培養的第48小時，收集細胞并通過在液體閃爍計數器中計數而估計3H攝取。2.B.結果表1圖18指出了用于產生抗體的C-末端區域，相應于各個蛋白質下方的水平線。已經使用PTCR-His載體將它們克隆入大腸桿菌中。實施例2通過在小鼠中進行抗體被動轉移的體內分析通過將特異性抗體被動轉移入感染了惡性瘧原蟲的移植了人RBC的免疫缺陷小鼠的實驗，在體內條件下證實了實施例1的體外結果。用于進行本實施例的實驗的材料和方法描述于(Brahimi，Perignonetal.1993；Badell，Oeuvrayetal.2000)。具體而言，獲得抗體的方法見Brahimietal所述。鑒于處理這種動物模型的復雜性，除發現針對MSP-3-b肽、MSP-3-d肽和GLURP-R0區域的抗體在體內的被動轉移條件下能夠清除在免疫缺陷SCID小鼠中所建立的惡性瘧原蟲血癥以外，其他所有抗體目前均不能進行測試(圖3、4和5)。可以看出，抗MSP-3-b和抗MSP-3-d抗體的清除作用特別強，反之，由抗GLURP抗體誘導的清除作用，經調整至相同抗體濃度后，則作用較小以抗GLURP抗體進行轉移后寄生蟲清除的時間大約是抗MSP-3抗體的2倍。同樣，基于在此所述的原因，在此詳細描述的6種基因間的交叉反應網絡提示，針對其他基因的抗體如果被轉移入感染了惡性瘧原蟲的小鼠中，非常可能具有相同的生物學作用。最后，通過使用一種人的重組抗體進一步證實了這種體內作用，該重組抗體針對的是MSP-3-b表位(圖6)、與MSP-3-2重組蛋白質具有交叉反應性、且其經被動轉移后能夠清除惡性瘧原蟲SCID小鼠中的寄生蟲血癥。使用覆蓋區域MSP-3-b、c、d的長合成肽對人類志愿者進行人工免疫接種所激發的抗體也得到了基本相似的結果，其在體外條件下以及在惡性瘧原蟲SCID小鼠模型中的體內條件下，顯示出相同的效果(圖7)。實施例3在猴子中進行免疫接種實驗在體外和體內條件下收集到的保護性數據得到了在夜猴(aotusmonkey)上獨立進行的實驗的證實，實驗顯示，以重組形式的MSP-3-1并以Freund完全佐劑作為佐劑免疫接種夜猴，產生了在ADCI機制中有效的抗體，且當以烈性惡性瘧原蟲血液期接種對所述猴子進行攻擊時，所述猴子能夠控制并清除其惡性瘧原蟲寄生蟲血癥，而對照猴子則不能。實施例4比較總非洲人IgG與純化的抗MSP-3-b抗體所產生的生物學作用比較了總非洲人IgG與純化的抗MSP-3-b抗體所產生的生物學作用，其中抗MSP-3-b抗體的濃度被調整至與總非洲人IgG相同的濃度，結果顯示抗MSP-3-b抗體單獨具有更強和更完全的作用，這進一步說明其作為疫苗的前景。在先前研究以及本研究中，本發明人觀察到針對MSP-3-b肽的親和純化的抗體較總非洲人IgG(前者是自后者提取的)明顯具有更快和更強的作用。觀察到的這一結果是非常有趣的，這是由于惡性瘧原蟲由將近6000種不同的蛋白質組成，而肽MSP-3-b僅僅是其中一種蛋白質的一個小區域，可以計算出抗MSP-3-b抗體可能還不到因暴露于該寄生蟲所產生的總抗體的1/10,000。以總IgG或以抗MSP-3-b抗體進行了進一步的研究，圖8對此進行了概括。值得注意的是，在這些實驗中，抗MSP-3-b抗體的量在總IgG或在純化制備物中是完全相同的。這些實驗所對應的是以抗MSP-3-b抗體處理的6只小鼠的平均值±SD和以總非洲人的純化的IgG處理的6只小鼠的平均值±SD，其清楚地證實存在-抗MSP-3-b抗體具有更快的作用，-抗MSP-3-b抗體具有更完全的作用，這是因為其使得小鼠中的寄生蟲血癥被完全清除，而免疫IgG使其降低但沒有產生消除作用，以相同的制備物注射于人類志愿者也是如此(且在具有慢性低度寄生蟲血癥的非洲成人供者中的情況也是如此)。這一觀察結果提示在免疫的非洲人IgG中存在其他抗體，這些抗體能夠競爭或阻斷抗MSP-3抗體的抑制作用。不同抗體之間的這種負相互作用使人聯想到例如由Blackman及同事所報道的有關抗MSP-1抗體的情況。這也可能與針對其他裂殖子表面抗原的非嗜細胞性抗體的干擾有關，所述非嗜細胞性抗體可能例如通過空間位阻而間接地降低抗MSP-3抗體與MSP-3抗原的接近。總之，這一結果對于疫苗的研發具有非常重要的啟示可以這樣認為，其說明以選定的瘧疾抗原進行免疫接種引發的保護性應答可能較暴露于所有瘧疾蛋白質或這些蛋白質的至少一部分所產生的保護性應答更加強烈。換言之，以被鑒定為保護機制的靶位的分子進行免疫接種所產生的保護作用可較自然感染所產生的保護作用更強，而自然感染已知是針對寄生蟲在人類中的無性血液期的最強的保護作用。因此，這對于開發未來的、高效的瘧疾疫苗是非常有前途的。實施例5MSP-3家族的表位保守性用于進行本實施例的實驗的材料和方法描述于(Brahimi，Perignonetal.1993；Badell，Oeuvrayetal.2000)。具體而言，獲得抗體的方法見Brahimietal所述。由于該基因家族的成員之間具有結構相似性，因而在相應的的蛋白質之間存在免疫學交叉反應性，這已經得到證實針對各個基因的產物的親和純化的人類抗體能夠與所有其他基因產物發生反應。這些結果說明，針對MSP-3家族的一種單一蛋白質誘導的抗體也與其他抗原反應，如免疫印跡(圖16和17)和ELISA(以下表2)所示。表2針對7種基因產物的抗體均能夠有效地在體外條件下通過單核細胞依賴性的抗體介導的ADCI機制介導在血液期殺死惡性瘧原蟲。結果說明，針對這些區域中的每一個區域的抗體均同樣有效地在體外條件下實現對惡性瘧原蟲紅內期的生長抑制。這一研究仍在進行中，其說明針對一種基因產物的親和純化的抗體可與其他基因產物相互發生交叉反應，反之亦然，ADCI的結果(實施例1)也間接說明了這一點。其在免疫學和疫苗研發層面的實際意義在于，以該基因家族的任一成員進行免疫接種將誘導產生對同一基因產物和針對所有其他基因產物具有反應性的抗體。因此，這是一類非常特殊的多基因家族，其中，不同于迄今發現的多基因家族通常具有的表位多態性這一特征，其主要特征在于表位保守性，這樣，萬一一種特定的基因發生缺失、突變，該家族的另一種或所有其他成員均可頂替其抗原性功能。此外，所有基因均同時表達于一種給定的寄生蟲。本發明人認為這不僅是一個優選的的疫苗家族，也是寄生蟲為保證其存活而產生的一種機制。這種寄生蟲只能在不殺死宿主的條件下才能存活通過誘導以ADCI機制降低寄生蟲血癥的抗體，寄生蟲保證免疫宿主產生足夠程度的保護性，且由此保證其自身的存活。該基因家族所具有的表位重復性保證了存在一種以上的基因產物能夠實現這一重要的任務。實施例6以MSP-3-2肽在ADCI中獲得的結果以MSP-3-2肽a，b，c，d，e和F在ADCI中獲得的結果與以來自MSP-3-1的相同的肽獲得的結果相同，即針對肽MSP-3-2b，c，d和e抗體具有ADCI活性，而針對肽MSP-3-2a和f的抗體則不具有。實施例7縱向臨床研究和寄生蟲學隨診研究說明針對MSP3和GLURP的應答之間具有互補性7.A.材料和方法7.A.1.研究地區、人群和臨床觀察OoDo村是緬甸的再定居的叢林地區，具有以干熱、季風和干爽季節為特征的熱帶氣候。在這一地區，瘧疾具有穩定性和隨季節而變化的高發病性，感染主要為惡性瘧原蟲(98％)，而間日瘧原蟲可能是其余2％的原因。瘧疾發病的診斷要滿足同時存在4個標準i)-校正后的腋窩溫度≥38.0℃，ii)-不存在其他臨床疾病，iii)-厚層血膜中存在無性惡性瘧原蟲形式，和iv)-氯奎治療后出現臨床改善和寄生蟲學檢查的改善。如果兩次發熱的間隔≥72小時，則認為這是兩次不同的瘧疾發作。前33個月的隨診結果最近已經發表(Soe，KhinSawetal.2001)。對同一研究人群繼續隨診一年，直至1998年12月31日，采用的是相同的方案。在1998年9月抽取靜脈血樣品，自1998年1月1日至12月31日所記錄的瘧疾發作率被用于分析與臨床保護的關系。7.A.2.血液采樣和寄生蟲學研究通過對指血的厚層和薄層涂片進行每月一次的全面檢查而監視瘧疾感染的情況。如果在Giemsa染色的厚層涂片中的200個油鏡視野內沒有觀察到寄生蟲，該涂片即被認為是陰性。對于發熱病例，要檢查氯奎治療前后的兩張指血涂片。以真空采血器收集靜脈血樣品，無菌分裝血清，儲存于-20℃直至測試。樣品取自從一大組292個居民中選出的116個村民的代表性亞組，用于寄生蟲分析的數據的超過60％的每月一次的血片均來自這些村民。7.A.3.抗原三種重組GLURP抗原來自惡性瘧原蟲F32的N-末端非重復區域R0(GLURP27-500)、中央重復區域R1(GLURP489-705)、和C-末端重復區域R2(GLURP705-1178)(Oeuvray，Theisenetal.2000)。MSP1的C-末端19-kDa片段，即MSP119，來自Wellcome株(MSP1-W-19)，其作為重組GST融合蛋白質在大腸桿菌中制備，由Dr.A.Holder(UK)惠贈。使用前通過酶性裂解和隨后的親和層析去除GST-tag。MSP3b合成肽(184-AKEASSYDYILGWEFGGGVPEHKKEEN-210，SEQIDNo5)含有MSP3bB細胞表位，其與在ADCI中有效的人抗體反應(Oeuvray，Bouharoun-Tayounetal.1994)。7.A.4.抗體分析通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定針對三種源自惡性瘧原蟲的抗原的抗體的水平，方法見(Oeuvray，Theisenetal.2000)。簡言之，以重組蛋白質或合成肽于4℃過夜包被微滴定板(Maxisorb，Nunc，Denmark)，條件如下0.5μg/ml(R0和R2)，1μg/ml(R1和MSP1)和5μg/ml(MSP3b)。對于GLURP抗原，使用0.05MNa2CO3，pH9.6作為包被緩沖液，對于MSP1和MSP3，使用磷酸緩沖鹽(PBS)pH7.4作為包被緩沖液。次日以PBS加0.05％Tween20(PBST)洗滌板，并以溶于PBS的2.5％脫脂奶封閉2小時。稀釋于含1.25％(w/v)脫脂奶的PBST中的血清被加至兩個復孔中，室溫溫育1小時。各抗原使用不同稀釋度的血清GLURP為1∶200，MSP1為1∶100，而MSP3為1∶20。這些稀釋度是基于預試驗而選定的，這些預試驗揭示了對照樣品和測試樣品之間的10倍以上的差異。以1∶3000稀釋的過氧化物酶綴合的山羊抗人免疫球蛋白(CaltagLaboratories)檢測結合的抗體。通過在檸檬酸緩沖液pH5中的O-苯二胺(Sigma，St.Louis，Mo.)和H2O2溫育30min進行顯色。通過平板讀取器(TitertekMultiskanMCC1340)測定492nm處的光密度(OD)。各溫育步驟之間以PBST成分洗滌平板。所有ELISA測試均包括6個對照血清，隨機選自從未暴露于瘧疾的100個法國人血液供者。為了確定IgG1-4亞型，使用了單克隆小鼠抗人亞型(克隆NL16＝IgG1(Boehringer)、HP6002＝IgG2(Sigma)、Zg4＝IgG3、而RJ4＝IgG4(均來自Immunotech))。這些抗體分別按照1∶2,000、1∶10,000、1∶10,000、和1∶1,000稀釋于含1.25％(w/v)脫脂奶的PBST中，并在室溫溫育1小時。綴合了過氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(CaltagLaboratories)以1∶3000稀釋于含1.25％(w/v)脫脂奶的PBST中，加入該抗體并溫育1小時。如上所述對結合的標記抗體進行觀察。各個同種型特異性單克隆抗體(MAb)的稀釋度是預先確定的，這些稀釋度可鑒別人的不同Ig亞型，即各亞型之間不產生交叉反應(Oeuvray，Theisenetal.2000)。總IgG以及亞型抗體水平的結果被表示為抗體應答的比例，這是通過將測試OD平均值除以同時進行實驗的6個正常對照的平均值+3SD而計算的。比例≥1的樣品被認為是陽性的。7.A.5.統計學分析采用Mann-Whitney的U-檢驗和Spearman等級相關系數來計算P值。以JMP軟件測試1998年間瘧疾發病與抗體水平(以比例表示)之間的關聯，使用了Poisson回歸模型(其中對混雜因素例如年齡、性別、在村中度過的時間以及傳播等進行了控制)或邏輯回歸分析(有或沒有發生瘧疾發作)。7.B.結果7.B.1.研究人群中的惡性瘧原蟲感染本研究的所有116個對象均來自東南亞緬甸的OoDo村，該村是瘧疾的高發病疫區(Soe，KhinSawetal.2001)。惡性瘧原蟲血癥的流行程度在1998年1月至7月間在40％附近波動，在8月至12月間降至20％附近。臨床瘧疾的發病率按照該研究人群中每月發作的平均數而計算并以百分數表示，其在全年的變化相當顯著，在6月達到高峰。尚未確定OoDo的感染性接種率，不過，Tun-Lin，Wetal(Tun-Lin，Thuetal.1995)發現一個村子中每人每年有13.7次感染性叮咬，該村子位于OoDo村以東15km。這一發現與根據文獻(Beier，Killeenetal.1999)的方法計算出的每人每年11次感染性叮咬的數字十分符合。絕大多數感染(98％)是惡性瘧原蟲感染(Soe，KhinSawetal.2001)。在為期12個月的臨床觀察期間，116個村民中的86例(74％)具有至少一次如材料和方法部分所定義的瘧疾發作，且這些個體被認為對瘧疾易感。在相同的12個月期間，村民中有30人(26％)沒有出現臨床瘧疾發作，這些個體被認為是在臨床上被保護的。7.B.2.抗體對源自惡性瘧原蟲的MSP3、GLURP、和MSP1抗原的識別測定了1998年9月期間收集的116份血清中的針對MSP3b184-210肽(MSP3b)和代表GLURP27-500(R0)、GLURP489-705(R1)、GLURP705-1179(R2)、和MSP1-19-kDaC-末端區域的4種重組蛋白質的IgG和IgG亞型的水平。R2是被IgG抗體識別頻率最高的抗原(67.2％)，隨后是R1、MSP3b和MSP1(均為62％)，以及R0(58.6％)。最高的OD值是針對R0和R2產生的，而MSP3b產生較低的OD值。針對所有三種GLURP區域和MSP1的IgG水平均與年齡顯著相關(R0，R1，R2和MSP1的Spearman等級相關系數分別為R＝0.51，0.26，0.41和0.43，P＜0.05)，而針對MSP3的IgG應答與年齡無關(R＝0.16，P＝0.17)。至于亞型應答，針對MSP1的IgG1和IgG4、針對MSP3的IgG2、針對R0的IgG1和IgG3、針對R1的IgG2和IgG3、以及針對R2的IgG4均與年齡顯著相關(表3)。對于任何一種測試抗原，陽性抗體應答的水平或流行程度在性別間均沒有不同。表3.年齡與針對各種測試抗原的亞型抗體應答水平之間的關系。P和R值是通過Sperman等級相關系數而計算的。7.B.3.抗體應答和臨床保護觀察到針對三種不同抗原的IgG亞型應答和保護性存在顯著的不同(表4)。例如，針對MSP1的C-末端19-kDa片段的IgG應答幾乎完全是IgG1亞型，其在被保護組中的中位數是易感組的8.6倍，而被保護個體中針對MSP3b表位的主導性IgG3抗體的中位數是易感個體中的6.5倍。盡管不是那么顯著，但是觀察到針對GLURP的不同區域的嗜細胞IgG亞型應答、針對非重復R0區域的主導性IgG1抗體、以及針對R2重復區域的主導性IgG3抗體，也具有相似的差異性。表4.在OoDo村民中觀察到的針對MSP1、MSP3和GLURP抗原的IgG亞型抗體的中位水平(以及四分位距)，這些村民經過1年的積極和連續的隨診被認為對于惡性瘧原蟲瘧疾發作是得到保護的或者是易感的。鑒于進行的統計學檢驗的數量，施加了Bonferroni校正因子以確定顯著性水平，只有P值＜.0025才被視為具有限制性(*)。自非參數Mann-WhitneyU檢驗確定P值。差異倍數代表代表來自兩組的中位數的比例。#代表具有邊緣差異的數值。由于針對GLURP和MSP1的抗體滴度作為年齡的函數而增加，對村民的臨床狀態與不同抗體的相關性進行了重復檢測，采用的是邏輯回歸模型，并將年齡和所有抗體應答(log轉換)視為解釋性變量。當在該模型中檢驗這些參數，且特別是當對年齡進行控制時，所有抗體應答中被認為是最強的瘧疾保護性預測因素是針對MSP3b(F比例＝67.5；P＜0.0001)和針對GLURP-R0(F比例＝23.1；P＜0.0001)的IgG3水平的升高。其他抗體與保護作用的相關性不顯著。與此不同，該分析提示針對R0(F比例＝4.4；P＝0.038)和R1(F比例＝3.9；P＝0.051)的IgG4水平隨瘧疾發作的次數而升高，即所述抗體在某種意義上代表了對瘧疾的易感性。7.B.4.被保護的村民中的IgG3應答的抗原特異性圖14A所示為針對OoDo的不同血液期抗原的IgG3抗體應答的一般模式。大多數抗原特異性抗體應答的數值范圍很大，這說明可能存在不同亞組的“應答者”。那些得到保護而免于臨床瘧疾的村民的血清并不都具有針對MSP3b和GLURP-R0的高IgG3值。一些個體針對這兩種抗原之一的IgG3反應性出乎預料得低。為試圖了解這些村民是如何得到保護而免于瘧疾攻擊的，鑒定了兩個亞組，其特征在于a)-針對MSP3的低IgG3應答(30例中有7例)或b)-針對R0的低IgG3應答(30例中有15例)。評估了針對其他三種抗原的IgG3抗體水平(圖14B)。這7個對MSP3b具有低IgG3應答(IgG3比例＝1.26±.22)的被保護的個體(平均年齡±1標準差＝33.9±7.0歲)被發現對R0(IgG3比例＝9.09±3.41)和對R2(IgG3比例＝8.36±5.86)具有強IgG3應答。在第二亞組的15個其他個體(24.7±4.3歲)中，盡管對GLURP-R0具有低IgG3應答(IgG3比例＝0.55±.08)，但同樣得到了保護，在這些個體中發現了相反的情況(圖14C)觀察到了對MSP3b的高IgG3應答(IgG3比例＝10.45±2.07)和較其稍低一些的對GLURP-R2的應答(IgG3比例＝4.43±.80)。僅應答于一種抗原的抗體的滴度傾向于高于應答于兩種抗原的滴度(表4)。在OoDo村中度過的年數在兩組對MSP3(居住20.43±4.70年)和R0(居住18.7±10.6年)的低應答者之間沒有明顯的不同。在30個被認為在1998年得到保護的個體中有13個在1993年也取得過血清樣品，因此可用于比較間隔5年前后的抗MSP3和抗R0IgG1和IgG3抗體的相對水平。如圖14D和14E所示，針對這兩種抗原的特異性IgG1抗體的水平沒有可檢測到的明顯變化。相反，針對MSP3和GLURP的IgG3抗體水平從1993年至1998年是升高的。在一個亞組的7個個體中，針對MSP3的IgG3在1998年是升高的(Fig14D)，其差異相當于1.67倍的升高(P＝.11)。在一個亞組的6個個體中，針對R0的IgG3在1998年是升高的(Fig14E)，其差異相當于更為顯著的、3.93倍的升高(P＝.05)。在1998年具有針對MSP3的高IgG3應答的這6個個體在5年前同樣具有高滴度，這提示他們在1993年便已經通過持久的抗MSP3的IgG3應答而得到保護，當時他們的年齡為18.2±9.8歲。相反，在1998年可檢測到對GLURP具有強抗R0IgG3應答的7個個體，在5年前具有明顯較低的抗R0IgG3應答(P＝0.0157)，當時他們的年齡為23.7±6.9歲。因此，在1998年通過針對R0的IgG3而得到保護的這7個個體發生了巨大的變化，而他們5年前的保護作用可能與針對MSP3的IgG3有關。7.C.討論本研究首次說明在抗原特異性抗體應答與保護免于遭受東南亞臨床瘧疾之間存在關聯。針對GLURP和MSP3的陽性抗體應答的流行程度在OoDo很高，在58.6％(R0)至67.2％(R2)的范圍內。與這一觀察相一致的是，發現了GLURP和MSP3中的B細胞表位在惡性瘧原蟲實驗室株和來自非洲和亞洲的野生分離株中是高度保守的(Huber，Felgeretal.1997)，(McCollandAnders1997；deStricker，Vuustetal.2000)。針對MSP1-W-19的抗體的流行程度也是高的，幾乎是岡比亞和塞拉利昂(Egan，Morrisetal.1996)和加納(Dodoo，Theanderetal.1999)的兩倍，提示在OoDo流行的可能是與Wellcome株有關的株。最高的ELISA滴度針對的是重組GLURPR0區域和R2區域以及MSP1。GLURP-R0、-R1、-R2和MSP1ELISA滴度之間的差異很可能反映了血清抗體反應性的差異。相反，MSP3-ELISA給出相對低的信號，不過這種不同之處可能至少部分是由于使用了短合成肽，其僅限定一個或有限的表位，而對于重組蛋白質如GLURP和MSP1，已知其限定了多個表位(Theisen，Soeetal.2000)。針對所有GLURP區域和MSP1的IgG的水平與年齡顯著相關(P＜0.05)，而與此相反的是，針對MSP3的IgG應答被發現與年齡無關。關于IgG亞型應答，也發現其中一些明顯與年齡有關，這些變化可能反映了暴露于瘧疾寄生蟲的過程以及免疫系統隨時間逐漸成熟的過程。與生活在OoDo的未得到保護的個體相比，得到保護的個體中的針對R0和MSP3的IgG3的水平的升高具有統計學的顯著性。這些結果與Dodooetal.(Dodoo，Theisenetal.2000)的結果一致，Dodoo發現針對R0和R2的嗜細胞抗體應答是加納兒童中獲得保護作用的強預示因素，這些結果還與Oeuvrayetal.的結果一致，Oeuvray發現在西非的Dielmo地區，針對GLURP-R0和R2的IgG3升高與保護作用之間存在穩定的關聯(Oeuvray，Theisenetal.2000)。相似地，此前已經發現MSP3特異性IgG3應答與Dielmo的抗臨床瘧疾的保護作用相關。總之，這些結果提示，針對相同的關鍵表位的相同亞型的IgG應答參與了在生活在瘧疾疫區的非洲和亞洲人群中逐漸產生抗惡性瘧原蟲瘧疾的保護作用。此外，本研究發現，在針對R0和R1的非嗜細胞抗體水平與臨床保護之間存在顯著的負相關。因此，在一方面，嗜細胞IgG亞型應答與保護作用之間存在正相關，而另一方面，具有相同的表位特異性的非嗜細胞亞型應答與保護作用之間存在負相關。與這種流行病學結果相一致的是，在體外發現，非嗜細胞抗體能夠抑制針對相同抗原性靶位的嗜細胞抗體在裂殖子與人類單核細胞之間的橋梁作用，并由此降低后者通過ADCI機制控制寄生蟲增殖的能力(Bouharoun-TayounandDruilhe1992)。盡管大多數得到保護的OoDo居民具有針對MSP3和GLURP的高IgG3應答，但一些針對這些抗原之一僅具有低IgG3應答或甚至不具有IgG3應答的個體似乎同樣獲得了保護。本發明人發現，所有具有低GLURP-R0特異性IgG3應答而獲得保護的個體具有顯著升高的特異性抗MSP3的IgG3抗體水平，且反之亦然。這一發現提示，針對GLURP和MSP3的抗體可以互補的方式來控制免疫個體體內的寄生蟲的增殖。考慮到這些抗體在ADCI機制中的作用，這一認識是合理的。實際上，只有同時評價多種抗原才能揭示這種互補作用。這一發現有利于同時測試多種抗原的互補作用以及可能的拮抗作用，以便設計組合疫苗。總之，本研究發現，(1)-MSP3和GLURP抗原中最為保守的關鍵表位是全世界地理位置上相距遙遠的疫區的保護性抗體的靶位。(2)-針對MSP3和GLURP-R0的IgG3抗體是免于遭受非洲同時也是亞洲的臨床瘧疾的保護作用的最強預示因素。(3)-在非洲以及亞洲，達到帶蟲免疫需要產生針對關鍵抗原(即MSP3b和GLURP，其均誘導在ADCI中具有活性的抗體)的嗜細胞抗體亞型。(4)-這兩種抗原之間似乎存在互補作用。對于抗瘧疾發作的風險而言，IgG3應答可能具有相似的作用，條件是當針對其他抗原的應答是低的或幾乎缺乏時，仍存在針對一種抗原的應答。(5)-對給定抗原的不同B細胞靶位的應答似乎獨立地產生，且識別的水平可隨時間而改變。針對迄今為止鑒定到的ADCI的兩種主要靶位的應答的互補性為將這兩種抗原在混合疫苗配制品中進行組合提供了第一個理論基礎。此外，以混合疫苗在臨床前動物模型上進行的免疫原性研究，通過顯示具有針對各個分子的、均衡相稱的應答的改善的免疫原性，進一步支持這一抗原組合。實施例8鑒別由生物學活性抗體所針對的惡性瘧原蟲MSP3的保守區域以改善疫苗設計本實施例中，MSP3指的是MSP3-1。裂殖子表面蛋白-3(MSP3)是抗體依賴性細胞抑制(ADCI)的靶位，ADCI是在對惡性瘧原蟲瘧疾具有免疫力的人中觀察到的一種保護機制。從該分子具有高度保守性的C-末端一側選擇了6種重疊的肽來表征免疫應答。這6種肽的每一種均具有至少一種非交叉反應性B細胞表位。不過，在疫區的居民中觀察到在水平和IgG亞型分布這兩方面模式均不同的抗體應答。針對每一種肽的親和純化的抗體就其在ADCI分析中介導殺死寄生蟲的功能方面是不同的這6種重疊肽中的3種具有明顯的寄生蟲生長抑止作用。通過將抗MSP3抗體體內被動轉移至感染了惡性瘧原蟲的免疫缺陷BXN小鼠模型進一步證實了這一結果。在這3種被研究的肽的每一種中均鑒定到了T輔助細胞表位。因此，抗原性和功能性分析共同將MSP3的一個70個氨基酸的保守結構域鑒定為生物學活性抗體的表位，準備及其納入將來的基于MSP3的疫苗構建體中。瘧疾寄生蟲的血液期增殖是導致人出現瘧疾急性癥狀的原因。流行病學觀察已經發現，居住于疫區的成年人雖然不斷被感染并經常攜帶寄生蟲，但能夠控制其寄生蟲血癥，且相對于兒童而言具有明顯的臨床抵抗力(BairdJK，JonesTR，DanudirgoEW，etal，1991)。要獲得這種水平的抗病免疫力，需要反復的感染和持續暴露于寄生蟲(McGregorIA，Wilson，RJM.，1989)。天然獲得的抗病免疫狀態是一種被稱為帶蟲免疫的現象(SergentE，ParrotL.，1935)而并非消除性免疫，其特征在于慢性低度寄生蟲血癥而無臨床癥狀。被動轉移來自臨床免疫個體的血清免疫球蛋白(IgG)被證明能夠控制那些因暴露于地理上不同的寄生蟲株而不被保護的個體的疾病和寄生蟲血癥的水平(CohenS，McGregorIA，CarringtonS.，1961；EdozienJC，GillesHM，UdeozoIO.，1962；SabchareonA，BurnoufT，OuattaraD，etal.，1991)。我們此前發現，保護性IgG對于寄生蟲的侵襲和紅細胞內生長沒有重要的直接作用，但可與血液中的單核細胞聯合起作用，通過抗體依賴性細胞抑制(ADCI)機制而抑制寄生蟲的發展(Bouharoun-TayounH，AttanathP，ChongsuphajaisiddhiT，DruilheP.，1990)。保護性IgG的嗜細胞特性已經得到確認(Bouharoun-TayounH，DruilheP.，1992；Bouharoun-TayounH，DruilheP，1992)，其他的獨立研究也已經證實這些抗體在抗瘧疾保護作用中的重要性(OeuvrayC，TheisenM，RogierC，TrapeJF，JepsenS，DruilheP.，2000；GrouxH，GysinJ.，1990)。我們采用ADCI作為功能性分析來搜索這些保護性抗體的靶位，由此，我們將MSP3鑒定為一種這樣的靶位(OeuvrayC，Bouharoun-TayounH，Gras-MasseH，etal，1994)。MSP3與裂殖子表面分子可能是通過卷曲螺旋結構相結合，預測此類結構是由七重復序列和C-末端亮氨酸拉鏈結構域形成的(MillsKE，PearceJA，CrabbBS，CowmanAF.，2002)。組成該分子的N-端部分的區域在不同株之間具有多態性。相反，該分子的C-末端部分在所測試的各種寄生蟲分離株之間是高度保守的(McCollDJ，AndersRF.，1997；HuberW，FelgerI，MatileH，LippsHJ，SteigerS，BeckH.，1997)，且此前通過采用功能性ADCI分析篩選惡性瘧原蟲表達文庫所鑒定到的區域正是這個區域(OeuvrayC，Bouharoun-TayounH，Gras-MasseH，etal，1994)。以往對MSP3的研究僅僅集中在C-末端部分的27個氨基酸的區域(相應于3D7株的184-210位氨基酸，MSP3b)，以前已經將其鑒定為高免疫血清中保護性抗體應答的靶位(OeuvrayC，Bouharoun-TayounH，Gras-MasseH，etal，1994)。我們決定進一步表征該分子的C-末端部分中其他區域的抗原性。我們設計了6種重疊肽(MSP3a、MSP3b、MSP3c、MSP3d、MSP3e和MSP3f)(圖24和25)，其各自代表該分子的保守性C-末端部分的不同區域。使用它們來分析來自塞內加爾疫區村莊Dielmo的個體中的天然產生的免疫應答，以及它們與抗瘧疾攻擊的保護作用的潛在關系。在體外條件下的ADCI分析中評價了特異于各個區域的人抗體的功能性作用，且通過在植入了感染惡性瘧原蟲的人RBC的免疫缺陷小鼠模型中進行體內被動轉移而進一步證實了這種作用[BadellE，OeuvrayC，MorenoA，etal，Med2000；andMorenoA，BadellE，vanRooijenN，DruilheP.Chemother2001]。采用這一方法，我們將MSP3的一個70個氨基酸的區域鑒定為天然產生的保護性抗體應答的靶位。8A-材料與方法抗原MSP3重組蛋白質構建體和肽是基于惡性瘧原蟲3D7株序列而設計的(NCBIprotein_id＝″NP_700818.1″)。按照先前所述[TheisenM，VuustJ，GottschauA，JespenS，HoghB.1995]純化了兩種重組的標記了六組氨酸的蛋白質，MSP3-NTHis21-184和MSP3-CTHis191-354。6種肽MSP3a167-191、MSP3b184-210、MSP3c203-230、MSP3d211-252、MSP3e275-307和MSP3f302-354相應于MSP3C-末端區域的保守區域。一個小區域(氨基酸253-274；72％谷氨酸)被排除在該分析以外，這是由于富含谷氨酸的抗原決定簇在多種不同的惡性瘧原蟲抗原中具有交叉反應性[MatteiD，BerzinsK，WahlgrenM，etal，1989]。根據標準的肽合成方法合成這些肽[RoggeroMA，ServisC，CorradinG.1997]。人血清和淋巴細胞樣品我們依賴于來自象牙海岸的30個高免疫個體的血清對特異于各個MSP3區域的抗體進行親和純化，這些血清以前曾經在泰國瘧疾患者中被用于進行被動轉移實驗，并發現其能夠有效地控制所述患者的疾病和寄生蟲血癥[SabchareonA，BurnoufT，OuattaraD，etal.1991]。我們依賴于來自西非塞內加爾Diehmo村的48名常住居民的血漿樣品進行免疫流行病學研究，這些居民曾不同程度地暴露于瘧疾(年齡在3.5至53.4歲之間；平均年齡＝13.1±1.8歲；在730天的隨診期間平均有707天居住在村內)。該地區的瘧疾傳播情況嚴重且為全年性(≈200次感染性蚊子叮咬/人/年)，2年期間，瘧疾發作的平均數量為每人2.4±5.4次。在隨后的2年中，19名個體沒有瘧疾發作(平均年齡15.7±3.1歲)，而29名個體具有至少一次瘧疾發作(平均年齡11.4±2.2歲)。醫生每天對全部Dielmo居民的發熱情況進行積極隨診，并根據文獻所述對那些因瘧疾引起的發熱做出準確診斷[TrapeJF，RogierC，KonateL，etal，1994]。這使得在本研究為期2年的隨診過程中，個體被清楚地區分為“被保護的”(無瘧疾發作)或“未被保護的”(≥1次瘧疾發作)，由此我們能夠調查這些個體中針對MSP3的不同區域的IgG同種型應答的模式。這一組在有瘧疾發作或無瘧疾發作的年齡分布方面是全村的代表。來自Dielmo居民的單個核細胞被在4小時內帶回達喀爾的實驗室，并用于針對MSP3a、MSP3b和MSP3c的T細胞增殖和IFN-γ，方法如文獻所述[BehrC，SarthouJL，RogierC，etal，1992；andBottiusE，BenMohamedL，BrahimiK，etal，1996]。簡言之，對細胞的增殖應答的評價在96孔圓底培養板(Nunclon)設置4個復孔，將細胞在37℃、5％CO2、存在各種肽(使用的濃度為10μg/ml)的條件下培養6天，隨后加入1μCi的[3H]TdR過夜，使用液體閃爍計數器計算摻入的放射性。未刺激的培養物作為陰性對照，PPD和PHA作為陽性對照。以捕獲ELISA分析測定來自4個復孔的合并上清液中的IFN-γ濃度，實驗以雙份進行，分別使用抗人IFN-γmAb350B10G6和生物素標記的mAb67F12A8(Biosource)進行包被和顯色，按照生產商的說明進行。顯色反應使用鏈霉抗生物素-HRP和TMB發色團，在450nm測定光密度。考慮到實際的因素，主要是自每個供者所能得到的細胞數，對用于抗體分析的其他3種肽沒有進行T細胞分析。以來自61個居民(29個女性，32個男性，平均年齡27.31歲)的樣品進行淋巴增殖研究，研究了其中31個居民的IFN-γ分泌(19個女性，12個男性，平均年齡33.94歲)。發現這3種肽在16個未暴露于瘧疾的對照供者的PBMC中不誘導明顯的應答(數據未顯示)，這說明它們不具有促有絲分裂或超抗原作用。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)按照先前所述進行本試驗以檢測總IgG個亞型[Bouharoun-TayounH，DruilheP.1992；andBouharoun-TayounH，DruilheP.1992]。根據對非洲人同種抗免疫球蛋白(allotypes)的親和力和反應性選擇單克隆小鼠抗人亞型IgG1至IgG4{克隆NL16(Boehringer)、HP6002(Sigma)、Zg4(Immunotech)、和RJ4(Immunotech)}，并用作第二抗體，分別按照1/2000，1/5000，1/5000，和1/1000進行稀釋。通過用針對測試抗原的OD值減去針對對照蛋白質(BSA；0.25μg/孔)的OD值得到各血清的特異性反應性。為計算抗體應答的顯著性域值，自從未暴露于瘧疾的個體中隨機選擇一組8份血清，針對各抗原進行測試，用作對照。結果以來自測試血清的平均OD與對照血清的平均OD+3X對照血清的標準差之間的比例表示。比例＞1的血清被認為是陽性。抗體的親和純化由于ADCI分析需要抗體與Fc-γRII受體的協作[Bouharoun-TayounH，AttanathP，ChongsuphajaisiddhiT，DruilheP.1990]，因此首先針對不同的MSP3肽和重組體對來自象牙海岸的一組30份高免疫血清進行IgG分布的篩選。選擇血清用于對針對任何給定的MSP3構建體的抗體進行親和純化，依據的是針對該區域具有高反應性而對鄰近的肽具有最小的反應性且具有高含量的嗜細胞IgG抗體(IgG1+IgG3)。使用獨立的血清庫(每一個由5至7份個體血清樣品構成)來親和純化針對MSP3的不同區域的抗體。所使用的血清庫的嗜細胞與非嗜細胞IgG亞型的比例(IgG1+IgG3/IgG2+IgG4)為9.56(MSP3NT)、4.25(MSP3CT)、1.29(MSP3a)、3.86(MSP3b)、1.29(MSP3c)、4.58(MSP3d)、1.59(MSP3e)和3.68(MSP3f)。先前的研究發現，在親和純化的抗體中觀察到的嗜細胞抗體的模式與用于親和純化的血清庫的模式相似。按照先前文獻所述進行親和純化[BrahimiK，PerignonJL，BossusM，GrasH，TartarA，DruilheP.1993]，使用2.5％聚苯乙烯珠(平均直徑10μm，Polysciences，Ltd.)的水性懸液包被肽或重組蛋白質。使用0.2M甘氨酸pH2.5洗脫特異性抗體，并立即用2M的Tris水溶液中和至pH7.0。以PBS繼以RPMI對親和純化的抗體進行充分透析，并以Centricon濃縮器(Millipore)進行濃縮，濾膜濾過除菌，加入1％albumax(Gibco，BRL)后存放于4℃。使用濃度為10μg/ml的親和純化的抗體進行ELISA以確定其特異性和同種型分布。免疫熒光分析(IFA)由于抗體識別天然寄生蟲蛋白質的能力是生物學分析的關鍵因素，因此采用IFA來調整親和純化的抗體的濃度。按照先前文獻所述[DruilheP，KhusmithS.1987]，在風干的丙酮固定的惡性瘧原蟲成熟裂殖體薄層涂片上進行IFA，以評價親和純化的抗體與寄生蟲蛋白質的結合活性。各個抗體的有效濃度被調整至1/200IFA終點滴度用于功能性分析。抗體的體外功能性分析采用實驗室維持株3D7和UPA(UgandaPalo-Alto)，如先前文獻所述[Bouharoun-TayounH，AttanathP，ChongsuphajaisiddhiT，DruilheP.1990]，按雙份進行抗體依賴性單核細胞介導的ADCI分析。如先前文獻所述[Bouharoun-TayounH，AttanathP，ChongsuphajaisiddhiT，DruilheP.1990]制備來自健康的、未暴露于瘧疾的供者的單核細胞。調整親和純化的抗體的濃度以產生1/200IFA終點滴度，在90μl完全培養基中加入10μl上述抗體，即使用的最終滴度是ADCI分析中的1/20。培養96小時后，通過在來自各孔的以Giemsa染色的薄層涂片中鏡檢≥50,000個紅細胞而確定寄生蟲血癥。單核細胞依賴性寄生蟲抑制被表示為特異性生長抑制指數(SGI)SGI＝1-{(加入單核細胞和測試IgG的寄生蟲血癥百分數/加入測試IgG的寄生蟲血癥百分數)/(加入單核細胞和正常IgG的寄生蟲血癥百分數/加入正常IgG的寄生蟲血癥百分數)}×100。盡管計算SGI考慮到了可能存在單核細胞直接抗寄生蟲的作用，但由于僅僅在10-15％的單核細胞制劑中觀察到這種情況，因此我們沒有將具有直接抗寄生蟲作用的單核細胞制劑作為一種額外的安全措施。對感染了惡性瘧原蟲的免疫缺陷小鼠進行被動免疫接種使用P.f.-HuRBC-BXN小鼠模型來評價針對惡性瘧原蟲的不同的血液期抗原的抗體的作用在先前的文獻中已有詳述[BadellE，OeuvrayC，MorenoA，etal，2000]。以含有二氯亞甲基二磷酸酯(Cl2MDP)(RocheDiagnosticsMannheim，Germany)和抗分葉核中性粒細胞(PMN)單克隆抗體NIMP-R14(NIMR，London，UK)的脂質體處理無病原體條件下飼養的6-8周齡雄性Beige-Xid-Nude(BXN)小鼠(CharlesRiverLaboratories)以降低其天然免疫應答。在第0天經IP注射感染了惡性瘧原蟲的人紅細胞并以4天的時間間隔注射未感染的紅細胞。以顯微鏡檢查監測血液的寄生蟲血癥。給出現穩定的寄生蟲血癥(范圍在0.1-1％)的小鼠IP植入3×106個經CD14+磁珠主動選擇的人外周血單核細胞(MACS，MiltenyiBiotech)，24小時后植入3×106單核細胞以及200μl的上述1/200IFA終點滴度的針對MSP3的親和純化抗體。非特異性酯酶染色[Bouharoun-TayounH，AttanathP，ChongsuphajaisiddhiT，DruilheP.1990]顯示＞98％的CD14+細胞由單核細胞構成。統計學分析采用Mann-WhitneyU檢驗進行單變量分析。Fisher精確檢驗用于列聯表分析。瘧疾發作的風險與抗體水平之間的關聯通過JMP軟件進行測試，使用逐步回歸模型，其中對年齡的混雜作用進行了控制。在回歸模型中使用方差分析。對無效假設的檢驗基于以F表示的方差比，而來自無效假設的偏差用于給超過一致性(unity)的F賦值。8B-結果由6種MSP3C-末端肽的每一種所定義的非交叉反應性B細胞表位在來自象牙海岸的一組30份高免疫血清中測定針對不同MSP3C-末端區域的IgG應答。如圖20所示，針對各個區域的IgG水平和流行程度是不同的，但針對各個C-末端肽均檢測到抗體應答。自特異于各個肽的選定的高免疫血清中親和純化抗體，并研究這些抗體對其他肽的反應性。這樣可以親和純化出對各個肽具有特異性而與其他區域不具有交叉反應性的抗體(表5)。這些發現說明，覆蓋MSP3C-末端的肽中的每一種均定義了至少一個與其他區域不具有共同抗原決定簇的B細胞表位。還發現每一種親和純化的抗體在對惡性瘧原蟲的無性血液期的免疫熒光分析中均是陽性的，說明抗肽抗體對天然的寄生蟲蛋白質具有反應性(數據未顯示)。針對不同MSP3肽的IgG應答的不同同種型模式我們分析了來自塞內加爾的疫區Dielmo村的48名3至53歲的個體的血漿，以研究針對由這些肽所定義的MSP3的C-末端部分的不同區域的IgG同種型應答的分布和模式。如圖21所示，針對各個肽的抗體應答的水平和IgG同種型的模式均是不同的。針對MSP3的各個區域的應答者的流行程度是不同的(IgG1為6.25％至60.41％，IgG3為4.16％至47.91％，IgG2為0％至10.41％，而IgG4為0％至12.5％)。我們發現針對MSP3a和MSP3e的抗體的流行程度較低，且如果存在也僅能檢測到低水平。針對MSP3b、MSP3c、MSP3d和MSP3f的抗體最為流行，且主要是嗜細胞亞型。在嗜細胞同種型中，IgG3反應性被發現在針對MSP3b、MSP3c和MSP3d方面具有主導性。相反，針對MSP3f，則是IgG1反應性較IgG3更加強且流行程度更高。這提示針對MSP3的任何區域所引發的抗體應答不依賴于針對其他區域的應答。先前已經發現嗜細胞IgG應答在抗瘧疾的保護作用中具有重要作用[Bouharoun-TayounH，DruilheP.1992；Bouharoun-TayounH，DruilheP.1992；OeuvrayC，TheisenM，RogierC，TrapeJF，JepsenS，DruilheP.2000；GrouxH，GysinJ.1990]。我們進一步研究了每天所監測的臨床保護作用與所觀察到的針對各個肽的同種型應答模式之間的關聯。在本研究中，“保護作用”被定義為在進行血漿取樣后的2年中不出現任何臨床瘧疾發作。相對于未得到保護的對象，在得到保護的對象中觀察到存在更高的針對MSP3b、MSP3c和MSP3d的IgG3滴度。發現在針對MSP3b以及MSP3d的IgG3抗體水平與抗瘧疾發作的保護作用之間存在關聯(‘p’分別為0.037和0.057)。對于MSP3c，這種關聯沒有達到統計學上的顯著性，不過，無瘧疾發作的個體中的抗MSP3cIgG3抗體是有發作者的兩倍。IgG1水平與抗瘧疾發作的保護作用之間的關聯在MSP3d(p＝0.025)具有顯著性，在MSP3b也觀察到了相似的趨勢(p＝0.328)，但在MSP3c沒有。針對MSP3f的IgG1和IgG3應答均未發現與保護作用相關。僅檢測到低水平的針對MSP3不同區域的IgG2和IgG4抗體應答，且未發現其與保護作用相關。下一步，進行多變量逐步回歸分析以控制年齡，抗體應答(分為“應答者”或“非應答者”)和出現瘧疾發作(分為“被保護的”或“未被保護的”)均采用二分變量。針對6種肽中的3種觀察到保護作用與IgG3抗肽應答之間具有顯著的關聯MSP3b(F比例＝4.98，p＝0.025)、MSP3c(F比例＝3.02，p＝0.082)和MSP3d(F比例＝6.57，p＝0.01)，而針對其他3種肽則沒有。天然產生的針對MSP3b、MSP3c和MSP3d的抗體在功能性體外ADCI分析中的寄生蟲生長抑止作用為了評價天然產生的針對MSP3的不同區域的人抗體在ADCI分析中的功能，將各種親和純化的抗體的濃度調整至針對天然寄生蟲蛋白質可產生相同的反應性的濃度。結果(圖22)顯示，由針對重組蛋白質MSP3NT和MSP3CT的抗體所引發的寄生蟲抑制水平與在非洲人IgG庫(PIAG)所觀察到的水平相當，PIAG先前已經用于在人類進行被動轉移實驗[SabchareonA，BurnoufT，OuattaraD，etal.1991]。針對MSP3b、MSP3c和MSP3d的親和純化的抗體被發現在ADCI中產生強烈的單核細胞介導的抗寄生蟲活性，該活性與針對MSP3CT的抗體和PIAG相當，不過，未發現抗MSP3a和抗MSP3f抗體具有寄生蟲抑制活性(圖22)。抗MSP3e抗體僅顯示出臨界的抗寄生蟲活性，即略微高于顯著性的域值水平。在4個獨立的ADCI分析中，結果具有可重復性。在24至96小時，上述任何抗體在所使用的濃度均未記錄到抑制裂殖子侵襲的作用。抗MSP3b和抗MSP3d抗體在人源化小鼠模型中強烈降低惡性瘧原蟲寄生蟲血癥在體外ADCI分析中觀察到，抗MSP3b、MSP3c和MSP3d抗體對抑制寄生蟲生長很有效，使用P.f.-HuRBC-BXN小鼠模型在體內對其進一步評價。最近已經證實了這種新的小鼠模型在對人類抗體和抗瘧疾藥物對惡性瘧原蟲血液期生長的作用進行體內研究中的價值[BadellE，OeuvrayC，MorenoA，etal，2000；andMorenoA，BadellE，vanRooijenN，DruilheP.2001]。不過，由于處理這種新的模型有難度，因此只有那些在體外條件下被發現具有明顯的抗寄生蟲作用的抗體才被用于被動轉移實驗進行體內評價。將針對MSP3d的抗體與針對MSP3b的抗體相比較，后者在此用作陽性對照，其抗寄生蟲作用先前已經得到證實[BadellE，OeuvrayC，MorenoA，etal，2000]。如圖23所示，寄生蟲血癥升高并在接下去的3周中達到平臺。在第22天單獨注射外周血單核細胞不影響寄生蟲生長，這與先前的發現一致[BadellE，OeuvrayC，MorenoA，etal，2000]。在第23天注射親和純化的抗MSP3人抗體導致寄生蟲血癥顯著降低。被動轉移抗MSP3b抗體導致寄生蟲被清除。被動轉移抗MSP3d導致降低超過95％(圖23)。因此，在這種小鼠模型中進行的體內被動轉移的結果證實了體外研究的結果，并進一步確認了針對被MSP3b和MSP3d肽所覆蓋的70個氨基酸區域的天然產生的抗體的功能性抗寄生蟲活性。暴露于瘧疾的個體中的針對MSP3肽的T細胞應答由于受到場地的實際限制，僅能夠研究針對來自塞內加爾Dielmo村居民的6種C-末端肽中的3種(MSP3a、MSP3bandMSP3c)的T淋巴細胞應答。使用來自61個居民(年齡1至84歲，平均年齡27.34歲)的外周血淋巴細胞確定的增殖應答顯示，針對MSP3a的T輔助細胞應答者的流行程度為16.4％，針對MSP3b為28％，針對MSP3c為21.3％。在這些個體中的31個個體中監測到的IFN-γ分泌顯示，針對MSP3a的IFN-γ應答者的流行程度為42％，針對MSP3b為55％，針對MSP3c為61.3％。這些結果提示，所測試的3種MSP3肽的每一種均定義了至少一種T細胞表位。此外，IFN-γ分泌提示至少有一些應答細胞屬于Th1-樣類型。8C-討論為尋找瘧疾疫苗候選物，我們集中研究了由最有效的免疫力所針對的抗原，所謂最有效的免疫力指的是生活于高發病地區的個體經過多年而獲得的免疫力。我們已經說明了這種非消除性免疫(″帶蟲免疫″)是由通過單核細胞參與其中的間接機制(ADCI)而具有活性的IgG介導的。在第二步，采用ADCI將MSP3鑒定為保護性IgG的靶位[OeuvrayC，Bouharoun-TayounH，Gras-MasseH，etal，1994]。本研究的目的在于表征位于MSP3的保守C-末端內的抗原，并評價相應的抗體的功能和生物學活性。實際上，該分子的C-末端一側(開始于第三個七重復序列)在迄今所測試的不同分離株中是高度保守的[McCollDJ，AndersRF.1997；andHuberW，FelgerI，MatileH，LippsHJ，SteigerS，BeckH.1997]，而MSP3的N-末端一側顯示出總體上的二態性(dimorphism)(3D7-樣和K1-樣)[McCollDJ，AndersRF.1997；andHuberW，FelgerI，MatileH，LippsHJ，SteigerS，BeckH.1997]。因此，我們決定集中研究C-末端區域，因為其中的一部分(DG210，圖19)在我們的初步篩選中被鑒定為保護性人類抗體的靶位[OeuvrayC，Bouharoun-TayounH，Gras-MasseH，etal，1994]，且其次，也因為抗原保守性是成功研發瘧疾疫苗的關鍵標準。使用覆蓋MSP3的保守性C-末端一側的6種重疊的合成肽，我們發現針對各個區域的抗體模式在流行程度、滴度、同種型分布、與臨床保護作用的關聯、以及體外和體內的抗寄生蟲活性等方面差別顯著。針對MSP3a和MSP3e的抗體滴度與其余4種肽相比是低的。針對MSP3b、MSP3c、MSP3d和MSP3f的應答主要由嗜細胞IgG亞型構成，不過，針對MSP3f主要是IgG1同種型，而針對其他的則主要是IgG3。已經有報道，對于惡性瘧原蟲的另一種裂殖子表面蛋白質MSP-1，針對一種蛋白質的不同區域的亞型應答也存在相似的差別[CavanaghDR，DobanoC，ElhassanIM，etal，2001]。這些發現提示，在針對MSP3C-末端的不同區域的抗體應答的成熟過程中發生的IgG類別轉換受到獨立地調節。調節抗體成熟的因子還不十分清楚，但可能受到抗原的性質連同來自T細胞的接觸依賴性信號特別是T細胞所分泌的細胞因子的影響[StavnezerJ.1996]。不過，最近的發現提示瘧疾抗原的性質可能是決定抗體亞型的主要因素[GarraudO，PerrautR，DioufA，etal，2002]，本研究的結果似乎也是如此。由于能夠得到非常詳細的臨床資料，而這些資料是塞內加爾Dielmo村的主要特征性構成，因此我們得以研究亞型分布與抗瘧疾發作的保護作用之間的關聯。考慮到年齡的混雜影響，我們發現針對MSP3b、MSP3c和MSP3d的IgG3應答與抗瘧疾發作的保護作用明顯相關。這些結果與更大樣本的獨立研究相一致[SoeS，TheisenM，RoussilhonC，AyeKS，DruilheP.2003；andOeuray，C.，etal，inpreparation]，這些研究已經發現針對MSP3b的IgG3應答與抗瘧疾發作的保護作用之間存在關聯。對于其他裂殖子表面疫苗候選物，已經有報道認為在各種人種和不同的瘧疾傳播條件下，MSP2傾向于(skewingtowards)IgG3抗體應答[TaylorRR，SmithDB，RobinsonVJ，McBrideJS，RileyEM.1995；andRzepczykCM，HaleK，WoodroffeN，etal，1997]，且可能與抗瘧疾臨床免疫相互關聯[TaylorRR，AllenSJ，GreenwoodBM，RileyEM.1998]。相似地，針對MSP1的具有多態性的“2區(block2)”區域的抗體應答也傾向于IgG3亞型，該“2區”區域已經被鑒定為抗臨床瘧疾免疫的靶位[PolleySD，TettehKK，CavanaghDR，etal，2003]。不過，至少在后一種情況中，這些抗體的作用機制還不清楚，這是因為，通常認為具有生物學活性的抗MSP1抗體針對的是該抗原的C-末端部分[EganAF，BurghausP，DruilheP，HolderAA，RileyEM.1999]。相反，在我們的研究中所使用的功能性體外ADCI分析提供了關于針對各個區域的抗體的抗寄生蟲性生物學活性的信息。由于是在允許進行比較的條件下進行的，因此它們證實了針對MSP3的不同區域的抗體之間的重要差別。有趣的是，非常不同的方法得到了相似的結論，即體外的ADCI分析指出，與免疫流行病學研究所發現的完全相同的肽(MSP3b、MSP3candMSP3d)具有重要性。針對MSP3a和MSP3f的抗體缺乏作用的原因仍有待于闡明。對于MSP3f，可能是抗體無法接近位于裂殖子表面的表位，這是由于該亮氨酸拉鏈結構域與其他分子形成卷曲螺旋相互作用[MillsKE，PearceJA，CrabbBS，CowmanAF.2002；andMcCollDJ，AndersRF.1997]。體外研究結果的可靠程度也可在體內條件下進行證實[BadellE，OeuvrayC，MorenoA，etal，2000]。經被動轉移入感染了惡性瘧原蟲的植入了人單核細胞并具有持續穩定寄生蟲血癥的小鼠后，發現抗MSP3b和抗MSP3d抗體可有效地降低惡性瘧原蟲的寄生蟲負荷。最近發現以Freund佐劑中的全長MSP3進行免疫的夜猴(Aotusnancymai)中產生了抗惡性瘧原蟲攻擊的保護作用[HisaedaH，SaulA，ReeceJJ，etal，Merozoite2002]，這證實了MSP3作為疫苗的潛力。這一發現與我們的流行病學和生物學結果相一致。不過，本研究還為設計未來的疫苗構建體提供了來自人類免疫應答分析的額外的信息。實際上，MSP3的N-末端盡管能夠誘導在ADCI中具有功能活性的抗體，但由于其具有的多態性，因此其價值是有爭議的。此外，其含有的充分可能使得免疫應答偏離重要的保守性區域。在C-末端部分內，也發現區域MSP3e-f的價值較低，原因在于針對MSP3e的抗體應答的流行程度和水平均低，而抗MSP3f抗體缺乏生物學活性。所研究的a、b、c這3種肽中的每一種被證實在疫區人群中定義的是非交叉反應性T細胞表位。采用本研究中定義的構建體最近進行的疫苗試驗證實了這一發現，并指出肽“d”是一種額外的T細胞表位區域(Audranetal，submitted)。總之，免疫流行病學研究結合功能性分析使得我們定義了該分子的一個70個氨基酸的區域。我們發現，在天然暴露于瘧疾的人中產生了針對覆蓋MSP3b至MSP3d的這一區域的具有抗寄生蟲作用的抗體。這對于合理地設計出將來用于臨床試驗的源自MSP3的亞單位疫苗構建體而言具有重要的價值。表5由ELISA確定的親和純化的人抗MSP3抗體的特異性所示為來自雙份孔的O.D.450平均值。所有的肽均在相同的包被條件下使用。陰影代表陽性反應性。實施例9惡性瘧原蟲的裂殖子表面抗原家族確保寄生蟲的存活在表達于惡性瘧原蟲裂殖子表面的分子中，裂殖子表面蛋白質3(MSP3)是通過使用體外ADCI分析對全基因組表達產物進行篩選而鑒定的一種新的疫苗候選物，ADCI分析所基于的是被認為是對人類抗瘧疾保護作用至關重要的防御機制(Oeuvray，etal.，1994)。抗MSP3抗體通過觸發釋放寄生蟲抑制性單核因子(parasitostaticmonokines)而抑制寄生蟲的生長(Bouharoun-Tayoun，etal.，1995)。在一些野生情況中，IgG3抗MSP3抗體與獲得性瘧疾免疫狀態之間具有很強的關聯(Soe，etal.，2004；Singh，etal.，2004)。在36個志愿者中進行疫苗試驗導致在人類誘導產生了在體外和體內條件下均能夠觸發殺死惡性瘧原蟲的抗體(Druilhe，etal.，manuscriptunderpreparation)。對惡性瘧原蟲基因組數據的分析最近鑒定了一種新的MSP3多基因家族，其成員與MSP3具有結構同源性(Cowman&Crabb，2002)。已經報道了在間日瘧原蟲和諾氏瘧原蟲中鑒定到的MSP3的同源物由若干相關的分子組成(Galinski，etal.，2001；David，etal.，1985)。在惡性瘧原蟲中，MSP3樣分子的同源性涉及存在于所有相關分子中的N末端特征標記肽、這些分子的C-末端區域的總體組織結構以及具有高度同源性的亞結構域，已經發現它們在MSP3中構成了嗜細胞抗體的靶位，嗜細胞抗體與野外所保護作用相關并介導在體外和體內殺死寄生蟲(Singh，etal.，2004)。鑒于MSP3作為疫苗的潛力，特別是在臨床疫苗試驗中獲得的令人振奮的結果，我們決定詳細研究該家族的其他成員的基因表達、這些基因所編碼的蛋白質的定位、抗原性相關性程度、它們的序列的保守性、以及抗寄生蟲生長的抗體的功能性作用。結果顯示這個多基因家族在許多方面不同于迄今已知的其他惡性瘧原蟲的多基因家族，并提示它們在引發參與控制寄生蟲密度以及一般而言參與人類宿主防御機制的免疫應答方面具有重要作用。9A-材料與方法序列分析查詢惡性瘧原蟲3D7數據庫使用了GenBankblasts，NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Malaria/plasmodiumbl.html)。所有BLAST查詢均未使用低復雜性過濾(low-complexityfilter)但所有其他設置保持默認。使用Wilbur-Lipman算法在不同蛋白質序列之間進行成對同源性，PAM250采用GeneJockeyII序列分析軟件。ClustalW用于產生多重比對(http//www.ebi.ac.uk/cgi-bin/newclustalwpl)，其被復制到BoxshadeHofimann、Barron(在http//bioweb.pasteur.fr/seqanal.interfaces/boxshade.html#letters)用于產生比對。信號肽預測使用的是iPsort和SignalP(分別在http//hypothesiscreator.net/iPSORT/predict.cgi和http//www.cbs.dtu.dk/services/signalp/#submission)。自氨基酸序列預測并分析卷曲螺旋區域采用的是COILS2.1程序(Lupas，etal.，1991)。預測雙鏈和三鏈卷曲螺旋區域使用了基于PAIRCOIL的MULTICOIL程序(Wolf，etal.，1997)。亮氨酸拉鏈預測基于Lzpred程序(Bornberg-Bauer，etal.，1998)，該程序結合了卷曲螺旋預測算法和對特征性亮氨酸重復的近似搜尋。“獨特區域(Uniqueregions)”代表MSP3蛋白質家族不同成員之間的最小相關性。它們由大約50-80個氨基酸殘基組成(見表6A)，這些氨基酸是通過在不同成員的氨基酸序列之間進行同源性比對分析而鑒定的。在BLASTP搜索中用作查詢的“獨特區域”的序列證實了它們與數據庫中的任何其他惡性瘧原蟲蛋白質的初級氨基酸序列沒有任何顯著的相關性(它們在BLAST中的“分位(scorebit)”值總是大于100，“E值”的范圍是9e-23至1e-40；針對MSP3.3、MSP3.4和MSP3.5獲得的少數其他hits具有低于40的低“分位”值，“E值”不低于1e-04)。涉及了另一組重組蛋白質以覆蓋MSP3.1、MSP3.2、MSP3.3、MSP3.4、MSP3.7和MSP3.8的相關的C-末端區域(如圖27和表6B所示)。重組蛋白質的克隆和表達“獨特區域”和“相關羧基末端”重組蛋白質克隆自3D7株基因組DNA并作為N-末端his標記的重組蛋白質進行表達和純化，如文獻所述(Theisen，etal.，1995)。RNA分析RNA提取自未同步化的血液期寄生蟲培養物(3D7，在10-15％寄生蟲血癥時收集)，使用的是TRIZOL(LifeTechnologies)，按照生產商的說明進行。RNA沉淀存放于-20℃。為了確保RNA中完全沒有DNA污染，使用DNA-free試劑盒(Ambion)以DnaseI對其進行處理。自大約1μg的無DNA的RNA合成了cDNA的第一鏈，使用的是一組隨機引物和M-MLV逆轉錄酶(Invitrogen)，按照生產商的說明進行。對MSP3基因家族的獨特區域進行擴增使用了表6A所列的引物組。對照由基因組DNA作為模板和無核酸(以水作為模板)組成，并將其用于各個引物對。Western印跡和斑點印跡(Dot-blot)分析以12％SDS-PAGE在變性條件下分離寄生蟲蛋白質，對其進行Western印跡分析，采用了文獻所述的標準方案(Bouharoun-Tayoun&Druilhe，etal.，1992)。使用純化的重組蛋白質在硝化纖維素試紙(Amersham)上進行斑點印跡分析。為了在每個斑點樣品中獲得相當的蛋白質分布，對蛋白質的濃度和體積均進行調整。通常使用真空歧管(BioRad)將2μg/10μl的純化重組蛋白質施加至硝化纖維素膜。然后以類似于Western印跡條的方式處理斑點印跡斑以檢測抗體信號。間接免疫熒光分析(IFA)在風干的丙酮固定的惡性瘧原蟲成熟裂殖體薄層涂片上進行IFA，按照文獻所述方法進行(Druilhe&Khusmith，1987)。IFA用于檢測蛋白質的亞細胞定位并調整親和純化的抗體的功能性濃度以用于ADCI分析，按照文獻所述方法進行(Singh，etal.，2004)。ELISAELISA用于檢測針對MSP3蛋白質家族的不同成員的高免疫庫中的總IgG和亞型，按照文獻所述方法進行(Druilhe&Bouharoun-Tayoun，2002)。還測試了來自以MSP3.1和MSP3.2重組蛋白質進行免疫的小鼠的血清與MSP3家族其他成員的發生交叉反應的能力。通過以測試抗原的光密度值減去對照蛋白質(0.25μg牛血清白蛋白/孔)的光密度值得到各個血清樣品(人/小鼠)的特異性反應性。抗體的親和純化自西非塞內加爾Dielmo村居民的高免疫血清庫中親和純化出針對MSP3蛋白質家族的不同成員的抗體。按照文獻所述進行親和純化(Singh，etal.，2004)，使用了吸附于聚苯乙烯珠(平均直徑10μm，Polysciences)表面的純化重組蛋白質。使用0.2M甘氨酸(pH2.5)洗脫特異性抗體，并立即用2M的Tris水溶液中和至pH7.0。以PBS繼以RPMI對親和純化的抗體進行充分透析，并以Centricon濃縮器(Millipore)進行濃縮，濾膜濾過除菌，加入1％albumax(Gibco，BRL)后存放于4℃。交叉反應性研究通過測試針對來自MSP蛋白質家族成員的不同羧基末端重組蛋白質產生的抗體的交叉反應性來評價這蛋白質之間的抗原性相關性程度。為了測試MSP3蛋白質家族不同成員中是否存在抗原性相關性，使用來自高免疫血清的親和純化的抗體進行ELISA分析，ELISA中的濃度為10μg/ml。通過ELISA測試了針對MSP3.1和MSP3.2C-末端重組蛋白質所產生的小鼠血清對MSP3蛋白質家族的其他成員的交叉反應性，使用了1∶50稀釋的小鼠血清。親和力研究采用斑點印跡分析來確定針對MSP3蛋白質家族的不同成員的天然產生的人類抗體的抗體結合親和力。測試了以漸增濃度的離液鹽(NH4SCN0M，0.1M，0.25M，0.62M，1.56M和3.9M)室溫處理20分鐘后的排列有等量重組蛋白質的相同的硝化纖維素膜條的殘余抗體結合。將0MNH4SCN溶液條件下所得到的針對任一抗原的抗原反應性值作為100％，以更高濃度的NH4SCN處理后的殘余抗體反應性被表示為該100％的分數。使用EPSON掃描儀(型號EU34；EPSONTWAIN軟件)掃描斑點印跡斑，然后通過基于AdobePhotoshop的圖像分析來定量評價抗體反應性。使用MacintoshPowerPCG4系統，以AdobePhotoshop軟件(version6，AdobeSystems)分析圖像。簡言之，自同時含有因抗體反應性產生的“斑點染色”和“背景”部分(周圍未染色的硝化纖維素膜)的硝化纖維素膜選擇固定象素區。使用“選擇保存”選項(選擇菜單)保存該象素區并用于產生組方圖(圖像菜單)。設置組方圖以便在“發光度”頻道中顯示選定象素區的統計學細節。組方圖中的“StdDev”值代表明亮區域(硝化纖維素背景)和深色區域(因抗體反應而染色)之間的差異水平，將其用于比較殘余抗體反應性水平。功能性體外抗體分析進行雙份的抗體依賴性單核細胞介導的ADCI分析，使用的是實驗室中維持的3D7株和烏干達Palo-Alto，方法如文獻所述(Bouharoun，etal.，1990)。單核細胞來健康的未暴露于瘧疾的供者，按照文獻所述方法制備(Bouharoun，etal.，1990)。調整親和純化的抗體的濃度以產生1/200IFA終點滴度，以90μL完全培養基中10μL的比例添加，在ADCI分析中產生的最終滴度為1/20。培養96小時后，通過在來自各孔的以Giemsa染色的薄層涂片中鏡檢50,000個紅細胞而確定寄生蟲血癥的水平。單核細胞依賴性寄生蟲抑制被表示為特異性生長抑制指數(SGI)寄生蟲血癥SGI＝1-{(加入單核細胞和測試IgG的寄生蟲血癥百分數/加入測試IgG的寄生蟲血癥百分數)/(加入單核細胞和正常IgG的寄生蟲血癥百分數/加入正常IgG的寄生蟲血癥百分數)}。本分析中使用的陽性對照IgG為用于在人類進行被動轉移實驗的來自象牙海岸的血清樣品庫(Sabchareon，etal.，1991)，陰性對照IgG來自從未暴露于瘧疾感染的法國供者。9B-結果與MSP3串聯定位于10號染色體的8個ORF中的6個具有相似的序列組織結構已經在不同的瘧疾類型中鑒定了惡性瘧原蟲MSP3的同源物(Galinski，etal.，2001；David，etal.，1985)，在一些類型中，這些同源物以多等位基因家族的形式存在。最近發現了與MSP3有關的另一種惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白質MSP6。MSP3和MSP6在它們的C-末端區域共享一種有序的序列組織結構，由保護性抗體所針對的抗原性結構域繼以富含谷氨酸的區域和卷曲螺旋區域組成(Trucco，etal.，2001)。不同寄生蟲中的所有已知的MSP3樣基因在N-末端區域均具有一種4-6個氨基酸的特征標記基序(NLRNA/NLRNG)，其緊隨在推定的22-24個氨基酸的信號肽序列之后。通過分析惡性瘧原蟲基因組(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Malaria/plasmodiumbl.html)中具有該特征標記基序的基因鑒定到位于10號染色體上的一個32kb的重疊群，其含有串聯定位于同一編碼鏈的8個ORF，但在不同的讀碼框中。我們建議基于其與MSP3的序列相關性，根據它們在編碼鏈中的位置(自5’至3’端)，來重新命名這些基因，如圖26A所示。已知其中有2個編碼已知的裂殖子表面蛋白質MSP3和MSP6(現分別命名為MSP3.1和MSP3.2)，而其他的被歸于編碼數據庫中的尚未表征的假象蛋白質。它們在數據庫中的蛋白質id為MSP3.1-AAN35542.1；MSP3.2-AAN35543.1；MSP3.3-AAN35544.1；MSP3.4-AAN35545.1；MSP3.5-AAN35547.1；MSP3.6-AAN35548.1；MSP3.7-AAN35549.1和MSP3.8-AAN35552.1。所有這些ORF均含有相關的由ip-SORT和SignalP程序所推定的氨基末端信號肽區域。最可能的推定裂解位點的氨基酸位置為MSP3.125-26；MSP3.521-22；MSP3.621-22；以及MSP3.724-25。不過，對于MSP3.2、MSP3.3、MSP3.4和MSP3.8的推定裂解位點并非是最佳的。這8個ORF中的6個(MSP3.1、MSP3.2、MSP3.3、MSP3.4、MSP3.7和MSP3.8)具有相同的C-末端區域的有序的序列組織結構，但其他2個(MSP3.5和MSP3.6)具有無關序列(圖27)。這些MSP3樣ORF中的每一個在所測試的不同惡性瘧原蟲分離株中均具有高度保守的C-末端區域(見補充數據，附件5)。相關序列I的Clustal-W比對顯示于圖26B。BLASTP分析(見表6)發現這些相關的ORF之間的氨基酸殘基具有總體上大約28％的相同性以及大約45％的相似性，而在相關的C-末端區域內，這些值分別為大約32％和大約54％。進化樹(圖26C)顯示的是這些ORF中序列相關性的程度。這些ORF中的2個(MSP3.4和MSP3.8)由DBL樣結構域連同13至14個半胱氨酸殘基所組成，這一排列類似于在var或ebl基因家族成員中觀察到的情況(圖27)。MSP3.1的最C-末端區域先前被報道為亮氨酸拉鏈結構域(McColl&Anders，1997)，采用不同的算法例如Lzpred并未證實，這與MSP3.2中觀察到的情況一致(Trucco，etal.，2001)。不過，采用COILS2.1和PAIRCOILS，推定MSP3.1和MSP3.2兩者中的該最C-末端區域形成卷曲螺旋結構域。MSP3.3、MSP3.4、MSP3.7和MSP3.8也推定具有存在相似的卷曲螺旋最C-末端區域。所有6個MSP3樣ORF均表達為裂殖子表面蛋白質我們分析了所有這些ORF在惡性瘧原蟲血液期培養物中的RNA和蛋白質表達情況。在每一個ORF中都鑒定到了獨特區域(具有最少的相關氨基酸序列段)(ca70-80氨基酸)，如圖27所示。使用這些獨特區域作為查詢對惡性瘧原蟲基因組的BLASTP分析與其相應的ORF特別相配，具有高比對分值(100-200)和低‘E’值＜e-32。使用MSP3.3和MSP3.4獨特區域在很少的其他蛋白質觀察到低比對分值(＜40)。使用具體的引物自非同步化的無性血液期惡性瘧原蟲的基因組DNA和cDNA制備物擴增來自各個ORF的獨特區域。cDNA的分析結果顯示所有的具有相關C-末端區域的ORF在寄生蟲發育的血液期均被轉錄(圖29，圖片A)。在不具有C末端相關性的ORF中，檢測到MSP3.5和MSP3.6的RNA表達。不過，觀察到MSP3.5的獨特區域有低水平的cDNA擴增(圖29，圖片A，右上)，提示該ORF的轉錄產物較不穩定。使用非洲人高免疫血清庫，針對為各個ORF中的獨特區域設計的重組蛋白質對抗體進行親和純化，方法如文獻所述(Singh，etal.，2004)。圖28顯示了通過斑點印跡分析確定的針對各個獨特區域的親和純化的抗體的特異性。觀察到的對角反應性(diagonalreactivity)模式證實了親和純化的抗體對它們的相應蛋白質具有特異性。使用這些特異性親和純化的抗體進行Western印跡分析，以檢測相應ORF在寄生蟲無效血液期的表達(圖29B)。證實了具有相關C-末端區域的ORF表達天然的寄生蟲蛋白質。盡管觀察到的寄生蟲蛋白質的分子量大部分與其計算的分子量相一致，但對于少數情況，例如在MSP3.1中，觀察到的分子量(大約48kDa)遠大于計算的分子量(大約40kDa)，這與先前的研究相一致(McColl，etal.，1994)。一些親和純化的抗體所識別的低分子量蛋白質可能是由于天然蛋白質的蛋白裂解作用，如已知MSP3.2存在這種情況(Trucco，etal.，2001)。不過，不能排除蛋白質制備物的不穩定性導致的蛋白質降解。針對MSP3.5和MSP3.6的親和純化的抗體不識別特定的寄生蟲蛋白質。而抗MSP3.5抗體不與任何寄生蟲蛋白質反應，抗MSP3.6抗體與多種不符合其65kDa的計算分子量的多肽反應(圖29，圖片B)。采用間接IFA，以針對相應的蛋白質的親和純化的抗體評價這些蛋白質在3D7株寄生蟲的血液期的定位(圖29，圖片C)。針對具有相關C-末端區域的ORF的抗體使得游離裂殖子的表面被染色，這種模式無法與MSP3或MSP6中所觀察到的模式區別開來。在兩種其他的實驗室株寄生蟲培養物Palo-Alto(烏干達)和T23(數據未顯示)中也觀察到了這種模式的IFA反應性。針對MSP3.5的抗體未能與寄生蟲蛋白質發生反應(圖29，圖片C，右上)。可能是由于轉錄產物較不穩定，如在MSP3.5所觀察到的，其不表達于紅內期。針對MSP3.6的抗體與成熟裂殖體和游離裂殖子反應(圖29，圖片C)。不過，由于抗MSP3.4抗體在Western印跡分析中對多種寄生蟲蛋白質顯示出明顯的交叉反應性，因此需要采用更加精確的抗體來證實其表達。因此，表達分析說明，具有與MSP3相關的C-末端區域的ORF表達于寄生蟲發育的紅內期，作為裂殖子表面蛋白質，且這些構成了惡性瘧原蟲中的MSP3蛋白質家族。觀察到針對MSP3家族成員中的相關C-末端區域的抗原性交叉反應性為了確定MSP3家族不同成員之間的抗原性相關性程度，相關的C-末端區域被表達為His-標簽蛋白質，如圖27所示。針對這些重組蛋白質自非洲人高免疫血清庫親和純化抗體。圖30顯示了該庫對不同重組蛋白質的反應性。觀察到針對各重組蛋白質存在不同水平和模式的抗體亞型反應性，說明序列的不同導致這些蛋白質在抗原性特征方面存在差異。通過ELISA確定了針對各重組蛋白質的親和純化的抗體對于該家族其他成員的反應性。親和純化的抗體對該家族的不同成員表現出不同程度的交叉反應性，見表7。盡管抗MSP3.1抗體對家族其他成員顯示出最小的交叉反應性，但MSP3.1卻廣泛地被針對家族其他成員的親和純化的抗體識別。相反，盡管抗MSP3.4抗體對家族其他成員顯示出最高的交叉反應性水平，但MSP3.4本身卻較少被針對家族其他成員的親和純化的抗體所識別。針對其他家族成員的抗體顯示出中等水平的交叉反應性。為了確定交叉反應性抗體的結合親和力，我們使用針對不同重組蛋白質的親和純化的抗體，在漸增濃度的硫氰酸銨(NH4SCN)溶液條件下，對該家族所有成員進行了斑點-ELISA分析。將無NH4SCN時所觀察到的任何給定的抗原抗體組合的反應性視為100％，將存在漸增濃度的NH4SCN時觀察到的反應性視為該100％的分數。觀察到各個親和純化的抗體制備物針對家族的不同成員具有異質性的結合親和力模式。此外，對于一些抗原抗體組合出現了超過一個的斜坡(slope)，說明其是具有不同結合親和力的抗體混合物，如圖31所示。我們于是評價了“曲線下面積％”作為對抗體結合親和力的估計。如表8所示，通過分別對由不同抗體制備物(沿表8的列)所識別的各個抗原的能力和對針對家族所有成員(沿表8的行)的各個抗體的反應性進行“曲線下面積％”求和，得到不同抗原的“抗原性”的估計值和親和純化的抗體針對它們的“交叉反應性程度”。根據觀察，MSP3.1C-末端被發現最具有抗原性，表現出與針對家族不同成員的親和純化的抗體具有高結合力(表9)。相反，MSP3.4C-末端被發現具有最小的抗原性，表現出與不同抗體發生相對弱的結合。各種親和純化的抗體表現出的交叉反應性程度也不同。抗MSP3.1抗體被發現具有最小的交叉反應性，而抗MSP3.2和抗MSP3.4抗體表現出最高程度的交叉反應性。這些結果強烈提示針對MSP3蛋白質家族的不同成員的天然產生的抗體中具有抗原性交叉反應性網絡。我們以來自來自這些成員中的兩個成員MSP3.1和MSP3.2的C-末端重組蛋白質的免疫小鼠，以便確定通過人工免疫接種誘導的抗體所具有的交叉反應性。針對MSP3.1和MSP3.2兩種產生的抗體與家族的所有成員均具有交叉反應性，見圖32，這進一步證明MSP3蛋白質家族的不同成員之間共享抗原性特征。MSP3蛋白質家族的所有成員均引發通過ADCI有效殺死寄生蟲的天然產生的抗體。我們先前發現，抗MSP3.1和抗MSP3.2的抗體介導單核細胞依賴性的寄生蟲生長抑止作用(Singh，etal.，2004；Singh，etal.，manuscriptcommunicated)。為了評價針對家族其他成員天然產生的抗體的抗寄生蟲作用，在ADCI體外分析中測試了來自高免疫血清的針對所述分子的相關C-末端部分的親和純化的抗體。將各種親和純化的抗體調整至等效濃度，以便對天然寄生蟲抗原產生相同的反應性，這可通過各種抗體制備物在IFA中的終點滴度而確定(數據未顯示)。結果(圖33)顯示針對MSP3蛋白質家族各個成員的抗體引發了很強的寄生蟲抑止作用。抑制的水平與先前在人體進行被動轉移實驗所用的非洲人IgG庫(PIAG)中觀察到的水平(Sabchareon，etal.，1991)相當。結果證實MSP3-蛋白質家族的各個成員可作為天然產生的具有抗寄生蟲作用的抗體的靶位，這與抗原相似性以及由針對它們的抗體所表現出的交叉反應性的網絡相一致。9C-結論基于它們的序列相關性，惡性瘧原蟲蛋白質可劃分為不同家族。一些基因家族表達于寄生蟲的無性血液期。具有高度可變性的基因家族(例如PfEMP1(var)、rifin和stevor)的成員散布于不同染色體的誘重組性亞端粒區(recombinogenicsubtelomericregions)。它們表達于被感染的RBC的表面并參與抗原性變異和細胞粘附(Su，etal.，1995；Fernandez，etal.，1999)。RBL、EBL和RAP的成員表達于裂殖子分泌細胞器中并具有可觀的基因冗余性(Reed，etal.，2000；Kaneko，etal.，2000；Duraisingh，etal.，2003)。它們在裂殖子侵入RBC時被分泌，且已知它們在惡性瘧原蟲的替代侵襲途徑中具有作用(Barnwell，1999)。裂殖子表面蛋白質可分類為膜錨定蛋白質和膜結合蛋白質。盡管具有單EGF樣結構域的GPI錨定蛋白質MSP2、MSP5和MSP4定位于同一染色體基因座，但具有雙EGF樣結構域的GPI錨定蛋白質例如MSP1、MSP8、MSP8樣和MSP10定位于不同染色體上(Burns，etal.，2000；Black，etal.，2001；Black，etal.，2003)。相反，屬于膜結合蛋白質家族的大多數成員如MSP3、MSP7和SERA(除SERA9以外)則以串聯形式成簇位于同一染色體上(Mello，etal.，2002；Aoki，etal.，2002；Miller，etal.，2002)。MSP3蛋白質家族與其他多基因家族相比具有多種不同的特征。所有MSP3基因均具有單一的外顯子結構，這不同于在其他基因家族如PfEMP1、rifin、stevor、PfRBL、EBL和SERA基因家族成員中所見的兩個或多個外顯子結構。MSP3蛋白質家族的所有成員同時表達于裂殖子表面。這在其他基因家族中是不常見的，例如var基因，其在一個時期只表達一種抗原(Scherf，etal.，1998)，或例如SERA，其中基因簇的外周基因是不表達的(Aoki，etal.，2002；Miller，etal.，2002)。盡管其他基因家族的成員共享一般的序列組織結構，但它們是顯著不同的，且不具有共享的交叉反應性表位。例如，天然產生的針對不同MSP的EGF樣結構域的抗體不具有交叉反應性(Black，etal.，1999；Black，etal.，2003)。不過，最近報道在var基因家族的不同成員之間存在一定程度的交叉反應性(Chattopadhyay，etal.，2003)。MSP3蛋白質家族的C-末端區域是高度相關的，并共享交叉反應性表位，這些表位在不同寄生蟲分離株中是高度保守的，并且是介導ADCI的天然產生的抗體的靶位。MSP3家族的所有基因均被轉錄且相應的蛋白質同時表達于惡性瘧原蟲裂殖子的表面。這大大增加了同時表達于裂殖子表面的MSP3樣表位的數量，且由此大大增加了由MSP3誘導的抗體所針對的表位的數量，也就是說，以MSP3-LSP疫苗構建體對志愿者進行免疫接種誘導了不僅與MSP3.1，還與該家族其他成員相互作用的抗體，這些抗體因此能夠與該家族所有成員反應且因此在能夠反映保護作用的生物學分析方法中發揮作用。基因的復制以及相關同源性表位的表達也可解釋為何以MSP3.1(Mills，etal.，2002)和MSP3.2(Mills&Cowman，personalcommunication)進行的基因敲除實驗對寄生蟲的存活幾乎沒有影響。由MSP3家族的其余的成員所表達的同源性結構能夠補償MSP3.1或MSP3.2的缺失。換言之，所有成員同時表達使得寄生蟲具有了功能性“備胎”。已經發現來自該家族各個成員的相關C-末端區域可與單核細胞協作以抑制寄生蟲的生長，并可達到與針對原有MSP3.1蛋白質的抗體所介導的相似的程度。這拓寬了參與天然獲得的保護作用的抗原的范圍并能夠基于它們來制備疫苗構建體。除了在鑒定為對保護作用具有關鍵作用的區域具有高度同源性的相關C-末端區域具有共享的序列組織結構以外，各種MSP3基因還顯示出顯著的序列多樣性。對MSP3.1的詳細分析導致有3個表位區域，基于流行病學和臨床依據以及反映抗體介導的保護作用的研究，被鑒定為保護性抗體的靶位(Singh，etal.，2004)。對MSP3家族成員進行詳細的抗原性分析顯示，它們的初級氨基酸序列之間的差異，抗原性特性，具有足夠的保守性，可產生交叉反應性抗體。交叉反應性的程度能夠使得當檢測人體對該家族的一個成員的抗體應答時，該多基因家族的任何其他成員均能夠誘導這些抗體。不過，針對一種給定基因產物的親和純化的抗體在其與其他基因產物的結合親和力方面時不同的。結果提示在針對一種基因產物產生的抗體與該家族的其余成員之間存在分子相互作用的復雜模式。瘧疾基因的多態性可通過隨機突變產生，由于其經常累及那些參與保護作用的表位區域，因此通常被認為是疫苗研發的主要瓶頸。不過，對于MSP3多基因家族，不同成員之間的差異似乎與隨機突變無關。實際上，多個不同分離株之間的各個MSP3基因具有全序列保守性這一點是非常驚人的且最為與眾不同。這說明，不同成員之間現存的差異不是隨機產生的，且反過來提示，這些差異可能是為了某些重要功能而保守的。總之，惡性瘧原蟲的MSP3蛋白質家族成員之間具有高度保守的趨異性，而又仍然保留抗原性相關性。這些發現所產生的主要問題是保持這種多樣性的強保守性的原因何在？對此可有兩個主要的假設。1.這種多樣性產生了與單一抗原相比更廣泛的與相關抗原性網絡發生反應的抗體，即在親和性、親和力和精細特異性方面具有更廣泛的多樣性，與確保針對原始的以及相關的表位具有反應性并介導單核細胞依賴性寄生蟲殺死所必需的抗體庫。2.序列的差異還提供了表位多樣性以確保在廣泛的人類遺傳背景中誘導必需的抗體應答，即各種基因序列可能會更好地適合于一種給定的MHCII類亞型。既然如此，這種多樣性的保守性的目的在于在每一個單獨的個體中產生相同類型的必需抗體。MSP3.1疫苗試驗的結果支持這一假設(由于所有志愿者均沒有產生于天然寄生蟲蛋白質反應的Ab)。在后一種情況中，基因的序列保守性的驅動力在于，如果一種寄生蟲發生突變，其將無法在一些宿主中誘導這一類型的抗體，因此導致在這一特定宿主內出現高寄生蟲血癥，宿主可能死亡，且由此這種特定的突變寄生蟲也隨之死亡，即這種突變體的頻率在人群中自發降低。在這兩種情況中，結果均指向能夠控制寄生蟲增殖的抗MSP3交叉反應性抗體的重要意義，即確保每一給定的人類宿主中存在低至中度的寄生蟲密度，以這種方式保證宿主和寄生蟲均能夠存活。這一發現給裂殖子表面抗原的功能帶來了新的認識。它們在維持惡性瘧原蟲和人類之間的動態平衡的天然的宿主-寄生蟲相互作用中具有重要意義。它們對疫苗研發也具有實際的意義，并強烈提示，改進的MSP3疫苗應該結合各種C-末端區域，以產生作用于多基因家族的各種蛋白質產物中的每一種的更廣泛的抗體，并應該同時改進其在各種人類遺傳學背景中的免疫原性。表6(A)(B)表6(A)用于克隆獨特區域序列的引物對，和(B)來自MSP3蛋白質家族各個成員的相關的羧基端區域。右列顯示的是獨特區域的氨基酸序列。根據3D7序列對氨基酸進行編號。沒有設計來自MSP3.4和MSP3.5的相關羧基末端重組體，這是因為這些序列與該家族的其他成員沒有共享序列相關性。表7惡性瘧原蟲MSP3蛋白質家族的BLASTP比較粗體所示序列在MalariaGenetics/GenomicdatabaseatNCBI中被用作定制blast的查詢項。表8針對MSP3蛋白質家族的相關C末端區域的天然產生的抗體顯示出交叉反應性ELISA測定針對MSP3蛋白質家族各個成員的C末端重組蛋白質的親和純化的抗體對其他成員的交叉反應性。顯示了代表親和純化的抗體針對各個重組蛋白質的反應性的O.D.450值。陰影代表親和純化的抗體對它們相應的重組蛋白質的反應性，被認為是100％。針對其他家族成員的交叉反應性的程度表示為的分數100％，以粗體顯示。表9從抗體結合親和力推導得到的抗原性與交叉反應性之間的關系各個抗原抗體反應的抗體結合親和力以“曲線下面積％”表示(如說明書文字部分和圖6所述)。通過對由不同抗體制備物對任一給定抗原所顯示的結合親和力進行求和得到“抗原性”的估計值，沿本表的列。類似地，通過對由任一抗體制備物對不同抗原所顯示的結合親和力進行求和得到該抗體的“交叉反應性程度”的估計值，沿本表的行。通過將分子按其漸增的“抗原性”以及親和純化的抗體的“交叉反應性程度”進行排列，發現MSP3-1是家族中抗原性最高的分子，而MSP3-4是家族中抗原性最低的分子。反過來，抗MSP3-1抗體具有最低的交叉反應性，而抗MSP3-2和抗MSP3-4抗體具有較高程度的交叉反應性。實施例10惡性瘧原蟲裂殖子表面抗原6為介導單核細胞依賴性寄生蟲殺滅作用的天然產生的抗體提供多重靶位本實施例中，MSP6指MSP3-2，MSP3指MSP3-1。惡性瘧原蟲MSP6是裂殖子表面抗原，具有與MSP3相似的組織結構和序列同源性。其在C-末端保守區域具有與MSP3具有交叉反應性的表位和與之不具有交叉反應性的其他表位，兩者均為與單核細胞協作而阻斷惡性瘧原蟲紅細胞周期的天然產生的抗體。惡性瘧原蟲MSP6是一種最近發現的裂殖子表面分子，在其總體序列組織結構上與先前文獻所述的MSP3在結構上相關(Pearce，J.A.，T.Triglia，A.N.Hodder，D.C.Jackson，A.F.Cowman，andR.F.Anders，2004.；Trucco，C.，D.Fernandez-Reyes，S.Howell，W.H.Stafford，T.J.Scott-Finnigan，M.Grainger，S.A.Ogun，W.R.Taylor，andA.A.Holder，2001)。該蛋白質的C-末端部分與MSP3具有同源性(ca.與氨基酸殘基具有50％的相同性和85％的相似性)，且與先前鑒定為由那些具有強抗寄生蟲活性的抗體(Oeuvray，C.，H.Bouharoun-Tayoun，H.Gras-Masse，E.Bottius，T.Kaidoh，M.Aikawa，M.C.Filgueira，A.TatarandP.Druilhe.，1994；Singh，S.，S.Soe，J.P.Mejia，C.Roussilhon，M.Theisen，G.CorradinandP.Druilhe，2004)所針對的靶位的11個氨基酸的序列段(ILGWEFGGG[A/V]P)具有相同性。此外，該分子的C-末端部分在MSP6中是高度保守的，MSP3也是如此，而N-端部分可通過蛋白裂解作用裂解，其相對于C-末端部分具有更高的多態性并具有較低的抗原性(Pearce，J.A.，T.Triglia，A.N.Hodder，D.C.Jackson，A.F.Cowman，andR.F.Anders，2004；Wang，L.，L.Crouch，T.L.Richie，D.H.Nhan，andR.L.Coppel，2003)。ADCI(抗體依賴性細胞抑制)分析已經將MSP3鑒定為保護性抗體的靶位，已經發現ADCI機制可最好地反映能夠通過抗體而被動轉移至感染了惡性瘧原蟲的患者中的保護作用(Oeuvray，C.，H.Bouharoun-Tayoun，H.Gras-Masse，E.Bottius，T.Kaidoh，M.Aikawa，M.C.Filgueira，A.TartarandP.Druilhe，1994)。其已經被用于人類疫苗試驗中進行追蹤，這是基于以下一系列發現，其提示抗MSP3抗體促進形成抗瘧疾免疫保護i)免疫流行病學研究發現，IgG3抗體與通過天然暴露于寄生蟲而獲得的保護作用具有顯著的相關性(Singh，S.，S.Soe，J.P.Mejia，C.Roussilhon，M.Theisen，G.CorradinandP.Druilhe，2004，Soe，S.，M.Theisen，C.Roussilhon，K.S.Aye，andP.Druilhe，2004)；ii)天然產生的或人工合成的抗體具有強單核細胞依賴性抗體ADCI作用(Oeuvray，C.，H.Bouharoun-Tayoun，H.Gras-Masse，E.Bottius，T.Kaidoh，M.Aikawa，M.C.Filgueira，A.TartarandP.Druilhe，1994；Singh，S.，S.Soe，J.P.Mejia，C.Roussilhon，M.Theisen，G.CorradinandP.Druilhe，2004)；iii)可在靈長類動物中主動引發針對惡性瘧原蟲攻擊的免疫力并使之與攻擊前的抗體滴度相關聯(Hisaeda，H.，A.Saul，J.J.Reece，M.C.Kennedy，C.A.Long，L.H.Miller，andA.W.Stowers，2002)；iv)可通過抗體將免疫力被動轉移給感染了惡性瘧原蟲的SCID小鼠(Badell，E.，C.Oeuvray，A.Moreno，S.Soe，N.vanRooijen，A.Bouzidi，andP.Druilhe，2000；Singh，S.，S.Soe，J.P.Mejia，C.Roussilhon，M.Theisen，G.CorradinandP.Druilhe，2004)andP.reichnowi-infectedchimpanzees(DruilheP.，etal，submittedforpublication)。鑒于MSP6與MSP3的同源性，我們于是對MSP6的抗原性進行詳細的研究，并評價了天然產生的抗MSP6抗體的抗寄生蟲作用。10A-疫區人群中的抗原性克隆MSP6的C-末端部分(3D7克隆的161-371位氨基酸)并將其表達為重組組氨酸標記的蛋白質(MSP6-CT)，方法如先前文獻所述(Theisen，M.，J.Vuust，A.Gottschau，S.Jespen，andB.Hogh，1995)。設計了6種重疊的肽(MSP6a161-182，MSP6b179-204，MSP6c192-224，MSP6d205-257，MSP6e282-326和MSP6f320-371)，方法與MSP3中所用方法相似(Singh，S.，S.Soe，J.P.Mejia，C.Roussilhon，M.Theisen，G.CorradinandP.Druilhe，2004)，所述肽各自代表C-末端部分的不同區域，如圖34所示。排除了一個小的富含谷氨酸的區域(氨基酸258至氨基酸281；富含54％谷氨酸)以避免一些惡性瘧原蟲抗原中存在的富含谷氨酸的表位產生交叉反應性(Mattei，D.，K.Berzins，M.Wahlgren，R.Udomsangpetch，P.Perlmann，H.W.Griesser，A.Scherf，B.Muller-Hill，S.Bonnefoy，M.Guillotte，G.Langsley，L.H.PereiradaSilvaandO.Mercereau-Puijalon，1989)。進行ELISA分析，方法如先前文獻所述(Singh，S.，S.Soe，J.P.Mejia，C.Roussilhon，M.Theisen，G.CorradinandP.Druilhe，2004)，以確定來自象牙海岸的30個得到抗瘧疾保護的非洲成人的血清中的針對各個肽的總IgG水平和亞型分布。先前已經發現以純化自這些血清的IgG進行被動轉移可顯著降低瘧疾患者的寄生蟲血癥水平(Sabchareon，A.，T.Burnouf，D.Ouattara，P.Attanath，H.Bouharoun-Tayoun，P.Chantavanich，C.Foucault，T.Chongsuphajaisiddhi，andP.Druilhe，1991)。圖35概括了針對覆蓋MSP6-C末端不同區域的這6種肽所記錄到的抗體亞型反應性。盡管針對不同區域的IgG的流行程度是不同的，但針對各個肽的抗體亞型反應性模式是相當一致的，總體上以嗜細胞抗體IgG1和IgG3為主。還測定了針對一部分這些肽如MSP6e的IgG2抗體的實際水平。這種抗體亞型模式不同于針對一些血液期抗原所觀察到的模式。例如，MSP3的相應區域顯示，針對MSP3b、MSP3c和MSP3d肽以IgG3為主，而針對MSP3f則以IgG1為主(Singh，S.，S.Soe，J.P.Mejia，C.Roussilhon，M.Theisen，G.CorradinandP.Druilhe，2004)。還觀察到針對一種蛋白質內的不同區域存在不同模式的抗體亞型，例如針對MSP-1“2區”以IgG3為主，不同于針對MSP-119的IgG1(Cavanagh，D.R.，C.Dobano，I.M.Elhassan，K.Marsh，A.Elhassan，L.Hviid，E.A.Khalil，T.G.Theander，D.E.Arnot，andJ.S.McBride，2001)，在不同蛋白質之間也是不同的，例如針對MSP-2以IgG3為主(Rzepczyk，C.M.，K.Hale，N.Woodroffe，A.Bobogare，P.Csurhes，A.Ishii，andA.Ferrante，1997；Taylor，R.R.，S.J.Allen，B.M.Greenwood，andE.M.Riley，1995)，而針對RAP-1(Fonjungo，P.N.，I.M.Elhassan，D.R.Cavanagh，T.G.Theander，L.Hviid，C.Roper，D.E.Arnot，andJ.S.McBride，1999)和AMA-1(SinghS.，etal，unpublishedresults)主要為IgG1。在另一個裂殖子表面抗原家族中，針對MSP-4主要是IgG3，而針對MSP-5主要為IgG1(Wang，L.，L.Crouch，T.L.Richie，D.H.Nhan，andR.L.Coppel，2003；Weisman，S.，L.Wang，H.Billman-Jacobe，D.H.Nhan，T.L.RichieandR.L.Coppel.2001)。導致針對不同抗原產生不同的人類亞型應答的因素還不十分清楚。不過，抗原本身的性質(Gerraud，O.，R.Perraut，A.Diouf，W.S.Nambei，A.Tall，A.Spiegel，S.Longacre，D.C.Kaslow，H.Jouin，D.Mattei，G.M.Engler，T.B.Nutman，E.M.Riley，andO.Mercereau-Puijalon，2002)以及應答B細胞所處的細胞因子環境(Gerraud，O.，andT.B.Nutman，1996)均可影響結果。10B-抗MSP6抗體的抗瘧疾活性為了評價針對MSP6的不同區域的人抗體的功能活性，我們針對這6種肽的每一種對抗體進行親和純化，使用的是獨立的血清庫(每一個由5至7名個體的血清樣品構成)，如先前所述進行選擇(Singh，S.，S.Soe，J.P.Mejia，C.Roussilhon，M.Theisen，G.CorradinandP.Druilhe，2004)，基于高含量的嗜細胞抗體(IgG1+IgG3)以及針對鄰近區域的反應性。親和純化的抗體被證明對相應的肽具有特異性，這是因為沒有觀察到其對該分子的其他區域具有交叉反應性(圖10A)。因此，發現每一種MSP6肽定義了至少一種B細胞表位，所述表位不與該分子的其他區域共享抗原性決定簇。對丙酮固定的惡性瘧原蟲無性血液期寄生蟲薄層涂片進行間接免疫熒光分析(IFA)，其提示各個抗肽抗體與天然的寄生蟲蛋白質具有反應性(數據未顯示)。然后采用單核細胞依賴性ADCI分析在體外評價抗寄生蟲活性。為此，通過測試對寄生蟲蛋白質的反應性，調整各個肽特異性抗體至等效濃度(1/200IFA終點滴度)，如先前所述(Singh，S.，S.Soe，J.P.Mejia，C.Roussilhon，M.Theisen，G.CorradinandP.Druilhe，2004)，用于在ADCI中進行測試。檢測以雙份進行，歷時96小時，使用了3D7株寄生蟲和來自健康供者的單核細胞，方法如先前所述(Bouharoun-Tayoun，H.，P.Attanath，A.Sabchareon，T.Chongsuphajaisiddhi，andP.Druilhe，1990)。以RPMI培養基對親和純化的抗體進行透析，將其以完全培養基的10％(v/v)的比例添加，因此，在ADCI分析中，它們的每一種所使用的最終IFA滴度為1/20。在96小時時通過鏡檢Giemsa染色的薄層涂片上的i10,000個紅細胞確定寄生蟲血癥，如下計算特異性生長抑制指數％SGI＝1-{(加入單核細胞和測試IgG的寄生蟲血癥百分數/加入測試IgG的寄生蟲血癥百分數)/(加入單核細胞和正常IgG的寄生蟲血癥百分數/加入正常IgG的寄生蟲血癥百分數)}X100。ADCI分析的結果(圖36)顯示，針對這6種肽中的每一種的親和純化的抗體均能夠產生很強的單核細胞依賴性寄生蟲生長抑制作用。這一結果明顯不同于以MSP3得到的結果，后者的6種肽特異性抗體中僅有3種是有效的(Singh，S.，S.Soe，J.P.Mejia，C.Roussilhon，M.Theisen，G.CorradinandP.Druilhe，2004)。在所使用的抗體濃度中沒有觀察到對寄生蟲生長產生明顯的直接作用(無單核細胞的條件下)(數據未顯示)。10C-MSP6和MSP3共享交叉反應性表位使用抗MSP6親和純化的抗體檢測其對來自MSP3的同源性肽的交叉反應性。如表I0B所示，發現4個區域存在交叉反應性。抗MSP6“b”和“f”抗體具有完全的交叉反應性，而抗MSP6“d”和抗MSP6“e”抗體顯示出部分的交叉反應性。相反，抗MSP6a和抗MSP6c對相應的MSP3區域沒有顯示出交叉反應性。這些結果總體上與序列同源性一致(圖34B)，且提示由一些抗MSP6抗體介導的抗寄生蟲作用也可能是與MSP3的交叉反應性區域結合引起的。不過，由非交叉反應性MSP6抗體如抗MSP6a和抗MSP6c介導的寄生蟲抑制證明MSP6本身也是ADCI的靶位。表10ELISA測定的親和純化的人抗MSP6抗體的特異性(A)(B)測試了針對MSP6的不同區域的親和純化的抗體的(A)特異性，和(B)對MSP3的相關區域的交叉反應性。所示為來自雙份孔的O.D.450平均值。所有的肽均在相同的包被條件下使用。陰影代表陽性反應性。參考文獻AokiS，LiJ，etal(2002)“Serinerepeatantigen(SERA5)ispredominantlyexpressedamongtheSERAmultigenefamilyofPlasmodiumfalciparum，andtheacquiredantibodytiterscorrelatewithseruminhibitionoftheparasitegrowth.”JBiolChem.277(49)47533-40.Badell，E.，C.Oeuvray，etal.(2000).″HumanmalariainimmunocompromisedmiceaninvivomodeltostudydefensemechanismsagainstPlasmodiumfalciparum.″JExpMed192(11)1653-60.BairdJK，JonesTR，etal，(1991).″Age-dependantacquiredprotectionagainstPlasmodiumFalciparuminpeoplehavingtwoyearsexposuretohyperendemicmalaria.″AmJTopMedHyg4565-76.BarnwellJW，(1999).″Anewescapeandevasiontactic″Nature398(6728)562-3.Beier，J.C.，G.F.Killeen，etal.(1999).″ShortreportentomologicinoculationratesandPlasmodiumfalciparummalariaprevalenceinAfrica.″AmJTropMedHyg61(1)109-13.BenMohamed，L.，Y.Belkaid，etal.(2002).″Systemicimmuneresponsesinducedbymucosaladministrationoflipopeptideswithoutadjuvant.″EurJImmunol32(8)2274-81.BehrC，SartouJL，etal，(1992).″AntibodiesandreactiveTcellsagainstthemalariaheat-shokproteinPf72/Hsp70-1andderivedpeptidesinindividualscontinuouslyexposedtoPlasmodiumFalciparum.″JImmunol1493321-30.BlackCG，WangL，HibbsAR，WernerE，CoppelRL.IdentificationofthePlasmodiumchabaudihomologueofmerozoitesurfaceproteins4and5ofPlasmodiumfalciparum.InfectImmun.1999；67(5)2075-81.BlackCG，WuT，WangL，HibbsAR，CoppelRL.Merozoitesurfaceprotein8ofPlasmodiumfalciparumcontainstwoepidermalgrowthfactor-likedomains.MolBiochemParasitol.2001；114(2)217-26.BlackCG，WangL，WuT，CoppelRL.ApicallocationofanovelEGF-likedomaincontainingproteinofPlasmodiumfalciparum.MolBiochemParasitol.2003；127(1)59-68.Bornberg-BauerE，RivalsE，VingronM.Computationalapproachestoidentifyleucinezippers.NucleicAcidsRes.1998；26(11)2740-6.Bottius，E.，L.BenMohamed，etal.(1996).″AnovelPlasmodiumfalciparumsporozoiteandliverstageantigen(SALSA)definesmajorB，Thelper，andCTLepitopes.″JImmunol156(8)2874-84.Bouharoun-Tayoun，H.，P.Attanath，A.Sabchareon，T.Chongsuphajaisiddhi，andP.Druilhe.1990.AntibodieswhichprotectmanagainstP.falciparumbloodstagesdonotontheirowninhibitparasitegrowthandinvasioninvitrobutactinco-operationwithmonocytes.J.Exp.Med.1721633-1641.Bouharoun-Tayoun，H.andP.Druilhe(1992).″Antibodiesinfalciparummalariawhatmattersmost，quantityorquality？″MemInstOswaldoCruz87Suppl3229-34.Bouharoun-Tayoun，H.andP.Druilhe(1992).″Evidenceforanisotypeimbalance，whichmayberesponsibleforthedelayedacquisitionofprotectiveimmunity.″Infectimmun601473-81.Bouharoun-Tayoun，H.，C.Oeuvray，etal.(1995).″Mechanismsunderlyingthemonocyte-mediatedantibody-dependentkillingofPlasmodiumfalciparumasexualbloodstages.″JExpMed182(2)409-18.Brahimi，K.，J.L.Perignon，etal.(1993).″FastimmunopurificationofsmallamountsofspecificantibodiesonpeptidesboundtoELISAplates.″JImmunolMethods162(1)69-75.BurnsJMJr，BelkCC，DunnPD.Aprotectiveglycosylphosphatidylinositol-anchoredmembraneproteinofPlasmodiumyoeliitrophozoitesandmerozoitescontainstwoepidermalgrowthfactor-likedomains.InfectImmun.2000；68(11)6189-95.Cavanagh，D.R.，C.Dobano，I.M.Elhassan，K.Marsh，A.Elhassan，L.Hviid，E.A.Khalil，T.G.Theander，D.E.Arnot，andJ.S.McBride.2001.DifferentialpatternsofhumanimmunoglobulinGsubclassresponsestodistinctregionsofasingleprotein，themerozoitesurfaceprotein1ofPlasmodiumfalciparum.Infect.Immun.691207-1211.ChattopadhyayR，SharmaA，SrivastavaVK，PatiSS，SharmaSK，DasBS，ChitnisCE.Plasmodiumfalciparuminfectionelicitsbothvariant-specificandcross-reactiveantibodiesagainstvariantsurfaceantigens.InfectImmun.2003；71(2)597-604.CohenS，McGregorIA，CarringtonS.Gammaglobulinandacquiredimmunitytohumanmalaria.Nature1961；192733-7.CowmanAF，CrabbB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RT<213>PlasmodiumFalciparum<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(11)<223>MSP3-7MSP3b-likemotif<400>22TyrPheAlaTrpGluIleGlyGlyGlyAlaPro1510<210>23<211>11<212>PRT<213>PlasmodiumFalciparum<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(11)<223>MSP3-8MSP3b-likemotif<400>23ArgLeuGluLeuSerSerGlySerSerLeuGlu1510<210>24<211>11<212>PRT<213>PlasmodiumFalciparum<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(11)<223>MSP3-8MSP3b-likemotif<400>24ProAspGlySerGluLeuAlaGlyGlyIlePro1510<210>25<211>20<212>PRT<213>PlasmodiumFalciparum<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(20)<223>MSP3-1MSP3c/d-likemotif<400>25LeuSerHisLeuTyrValSerSerLysAspLysGluAsnIleSerLys151015GluAsnAspAsp20<210>26<211>20<212>PRT<213>PlasmodiumFalciparum<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(20)<223>MSP3-2MSP3c/d-likemotif<400>26LeuGluGlnIleLysIleProSerTrpAspArgAsnAsnIleProAsp151015GluAsnGluGln20<210>27<211>20<212>PRT<213>PlasmodiumFalciparum<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(20)<223>MSP3-3MSP3c/d-likemotif<400>27LeuGluSerValAsnLeuThrSerTrpAspLysGluAspIleValLys151015GluAsnGluAsp20<210>28<211>20<212>PRT<213>PlasmodiumFalciparum<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(20)<223>MSP3-4MSP3c/d-likemotif<400>28LeuGluLeuIleLysLeuThrSerLysAspGluGluAspIleIleLys151015HisAsnGluAsp20<210>29<211>20<212>PRT<213>PlasmodiumFalciparum<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(20)<223>MSP3-7MSP3c/d-likemotif<400>29LeuGluHisValLysIleThrSerTrpAspLysGluAspIleIleLys151015GluAsnGluAsp20<210>30<211>20<212>PRT<213>PlasmodiumFalciparum<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(20)<223>MSP3-8MSP3c/d-likemotif<400>30LeuGluLeuValProLeuSerLeuSerAspIleGluGlnIleAlaAsn151015GluSerGluAsp20權利要求1.抗原性多肽組合物，包含至少一個MSP-3-b樣基序和至少一個MSP-3-c/d樣基序。2.權利要求1的抗原性多肽組合物，包含至少兩個不同的MSP-3-b樣基序和/或至少兩個不同的MSP-3-c/d樣基序。3.權利要求1的抗原性多肽組合物，包含至少兩個不同的MSP3-b樣基序和至少一個MSP3-c/d樣基序。4.權利要求1至3中任一項的抗原性多肽組合物，其中MSP3-b樣基序被包括在具有10至80個氨基酸殘基的多肽組分中。5.權利要求1至3中任一項的抗原性多肽組合物，其中MSP3-c/d樣基序被包括在具有20至80個氨基酸殘基的多肽組分中。6.權利要求1至5中任一項的抗原性多肽組合物，其中MSP3-b樣基序和MSP3-c/d樣基序被包括在一個獨特的多肽組分中。7.權利要求1至6中任一項的抗原性多肽組合物，其中MSP3-b樣基序和/或MSP3-c/d樣基序在所述多肽組分中被氨基酸序列隔開，所述氨基酸序列在所述基序所源自的MSP3樣蛋白質中天然存在于所述基序之間。8.權利要求4至7中任一項的抗原性多肽組合物，其中所述多肽組分或其中每一個多肽組分包含源自一種或數種MSP3樣蛋白質的氨基酸序列或由源自一種或數種MSP3樣蛋白質的氨基酸序列組成，所述氨基酸序列由選自瘧原蟲的、特別是惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)的MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8蛋白質中的一種或數種MSP3樣蛋白質的C-末端序列的全部或部分組成。9.權利要求1至8中任一項的抗原性多肽組合物，其中所述多肽組分由MSP3樣蛋白質的C-末端序列或所述C-末端序列的片段組成，所述MSP3樣蛋白質至少包括MSP3-1和MSP3-2，所述片段包含MSP3-1-b、MSP3-1c/d、MSP3-2-b和MSP3-2c/d基序或由MSP3-1-b、MSP3-1c/d、MSP3-2-b和MSP3-2c/d基序組成。10.權利要求9的抗原性多肽組合物，其中所述多肽組分還包含由MSP3樣蛋白質的C-末端序列或所述C-末端序列的片段組成的氨基酸序列，所述MSP3樣蛋白質選自MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8，所述片段包含MSP3-b樣基序和MSP3-c/d樣基序或由MSP3-b樣基序和MSP3-c/d樣基序組成。11.權利要求1至10中任一項的抗原性多肽組合物，其中所述多肽組分是數種融合多肽，其中每一種融合多肽包含具有選自以下一組的序列的多肽或由該多肽組成(i)選自MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8中的至少兩種MSP3樣蛋白質的C-末端序列；或(ii)選自MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8中的至少兩種MSP3樣蛋白質的C-末端序列的數種肽片段，其中每一種肽片段包含至少一個MSP3-b樣基序或至少一個MSP3-c/d樣基序或由至少一個MSP3-b樣基序或至少一個MSP3-c/d樣基序組成。12.權利要求1至12中任一項的抗原性多肽組合物，其包含一種融合多肽或由所述融合多肽組成，所述融合多肽包含如下(i)或(ii)或由如下(i)或(ii)組成(i)選自MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8的每一種MSP3樣蛋白質的C-末端序列；或(ii)選自MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8的每一種MSP3樣蛋白質的C-末端序列的一或數種肽片段，其中每一種肽片段包含至少一個MSP3-b樣基序或至少一個MSP3-c/d樣基序或者由至少一個MSP3-b樣基序或至少一個MSP3-c/d樣基序組成，其中不同MSP3樣蛋白質的C-末端序列的片段形成一個獨特的氨基酸序列。13.權利要求11或12的抗原性多肽組合物，其中選自MSP3-1、MSP3-2、MSP3-3、MSP3-4、MSP3-7和MSP3-8的至少兩種MSP3樣蛋白質的C-末端序列的肽片段含有至少一個MSP3-b樣基序和選自MSP3-a、MSP3-c/d、MSP3-e和MSP3-f樣基序的一種或數種其他基序，且所述基序在所述肽片段中是連續的或不連續的。14.權利要求1至13中任一項的抗原性多肽組合物，其中所述MSP3樣蛋白質的C-末端序列是以下序列(i)對于MSP3-1，為圖10A的任何序列，且特別是3D7株的序列；(ii)對于MSP3-2，為圖10B-D的任何序列，且特別是3D7株的序列；或任一所述序列的開始于氨基酸殘基161(或對于序列MSP3.2FLD4為165)并終止于氨基酸氨基酸殘基371(或對于序列MSP3.2FLD4為376)的片段；(iii)對于MSP3-3，為圖10D-E的任何序列，且特別是3D7株的序列；(iv)對于MSP3-4，為圖10E-F的任何序列，且特別是3D7株的序列；(v)對于MSP3-7，為圖10F-H的任何序列，且特別是3D7株的序列；(vi)對于MSP3-8，為圖10I的任何序列，且特別是3D7株的序列。15.權利要求1至14中任一項的抗原性多肽組合物，其中所述至少兩個不同的MSP-3-b樣基序選自序列SEQIDNo17至24和/或所述至少兩個不同的MSP-3-c/d樣基序選自序列SEQIDNo25至30。16.權利要求1至15中任一項的抗原性多肽組合物，還包含一種包含來自GLURP的R0區域的至少10個連續的氨基酸殘基的抗原性多肽。17.權利要求1至15中任一項的抗原性多肽組合物，其包含至少兩種合成肽，所述合成肽包含或對應于序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-G-X9-X10-X11-X12(SEQIDNo31)，其中X1＝I，Y或無；X2＝L，F或無；X3＝E，D，P或無；X4＝R，D或無；X5＝G，A，L或無；X6＝W，G，S，I或E；X7＝E，L或A；X8＝F，I，G，L或S；X9＝G，S或A；X10＝V，A，L，I或S；X11＝P，Y或L；X12＝E，F或無。18.權利要求1至15中任一項的抗原性多肽組合物，其包含至少兩種合成肽，所述合成肽包含或對應于序列X1-X2-X3-W-E-X4-G-G-G-X5-P(SEQIDNo32)，其中X1＝I或Y；X2＝L或F；X3＝G或A；X4＝F或I；和X5＝V或A。19.權利要求1至15中任一項的抗原性多肽組合物，其包含至少兩種合成肽，所述合成肽包含或對應于序列L-X1-X2-X3-X4-X3-X5-X6-X7-D-X8-X9-X10-I-X11-X12-X13-X14-X15-X16(SEQIDNo33)，其中X1＝E，或S；X2＝L，H，S或Q；X3＝I，V或L；X4＝K，N，Y或P；X5＝T，S或P；X6＝S或L；X7＝K，W或S；X8＝E，K，R或I；X9＝E或N；X10＝D，N或Q；X11＝I，V，S，P或A；X12＝K，D或N；X13＝H或E；X14＝N或S；X15＝E或D；X16＝D或Q。20.權利要求17至19中任一項的抗原性多肽組合物，其是一種混合表位，特別是至少50、至少100、或至少500種不同序列的肽的混合物。21.權利要求1至19中任一項的抗原性多肽組合物，其中所述至少兩個不同的MSP-3-b樣基序是SEQIDNo17和19、或SEQIDNo17和20、或SEQIDNo17和22、或SEQIDNo20和23、或SEQIDNo20和24、或其組合。22.權利要求1至19中任一項的抗原性多肽組合物，其中所述至少兩個不同的MSP-3-c/d樣基序是SEQIDNo25和27、或SEQIDNo25和28、或SEQIDNo28和30、或SEQIDNo25和29、或其組合。23.權利要求1至19中任一項的抗原性多肽組合物，其中所述多肽組分包含MSP3樣蛋白質的序列，所述序列由MSP3-1的C-末端序列和MSP3-7的C-末端序列組成。24.權利要求23的抗原性多肽組合物，其還包含由MSP3-3的C-末端序列組成的多肽組分。25.權利要求23或24的抗原性多肽組合物，其還包含由MSP3-2的C-末端序列組成的多肽組分。26.權利要求23至25中任一項的抗原性多肽組合物，其還包含由MSP3-8或/和MSP3-4的C-末端序列組成的多肽組分。27.純化基因家族，所述基因具有以下特征-它們定位于惡性瘧原蟲的10號染色體；-它們在惡性瘧原蟲株中高度保守；-它們同時表達于紅內期的惡性瘧原蟲；-它們編碼的蛋白質在N-末端具有NLRN或NLRK的特征標記并定位于裂殖子表面，其中所述家族包含至少3個基因。28.權利要求27的基因家族的多核苷酸家族，其中所述多核苷酸來自所述基因，且特別是編碼所述基因的C-末端部分的多核苷酸家族，或所述C-末端部分的多核苷酸片段，特別是具有30至500個核苷酸、特別是30至250、或至240、或至210、或至180、或至150、或至120、或至90個核苷酸的多核苷酸。29.權利要求27或28的基因家族，其中所述基因還具有保守的C-末端序列，其編碼的T表位在所述家族的基因中是保守的，且其中所述末端序列還包含所述家族的基因中的保守趨異性。30.權利要求27至29中任一項的基因家族，其中所述基因還具有以下特征-在體外條件下，針對所述基因的產物的抗體通過單核細胞依賴性的抗體介導的ADCI機制介導在血液期殺死惡性瘧原蟲。31.權利要求27至29中任一項的基因家族，其中所述基因還具有以下特征針對所述基因的產物的抗體在感染惡性瘧原蟲的小鼠中介導惡性瘧原蟲的生長抑制。32.權利要求27至30中任一項的基因家族，其包含編碼如圖10所示的惡性瘧原蟲3D7株的MSP3樣蛋白質的C-末端序列或所述蛋白質的在如圖1O所示的其他瘧原蟲株中的同源物的C-末端序列的序列。33.權利要求27至31中任一項的基因家族，其包含SEQIDNo1、3、5、7、13和15的基因或它們的在瘧原蟲株中的同源物。34.分離自權利要求27至32中任一項的家族的惡性瘧原蟲基因，其具有SEQIDNo5的序列，或其在瘧原蟲株中的同源物。35.分離自權利要求27至32中任一項的家族的惡性瘧原蟲基因，其具有SEQIDNo7的序列，或其在瘧原蟲株中的同源物。36.分離自權利要求27至32中任一項的家族的惡性瘧原蟲基因，其具有SEQIDNo13的序列，或其在瘧原蟲株中的同源物。37.分離自權利要求27至32中任一項的家族的惡性瘧原蟲基因，其具有SEQIDNo15的序列，或其在瘧原蟲株中的同源物。38.一種多核苷酸序列，其在嚴格性條件下與權利要求34至37中任一項的惡性瘧原蟲基因雜交或與權利要求27至33中任一項的基因家族雜交。39.由權利要求34至38中任一項的基因編碼的蛋白質。40.一種抗原性多肽，其包含來自權利要求39的蛋白質的至少10個、優選地至少15個連續的氨基酸的片段或由所述片段組成。41.權利要求40的抗原性多肽，其包含至少一個MSP-3-b樣基序。42.權利要求39或40的抗原性多肽，其包含至少一個MSP-3-c/d樣基序。43.權利要求39至42至任一項的抗原性多肽或權利要求1至26中任一項的抗原性多肽組合物，其中至少部分所述多肽分子連接于一種脂質分子。44.權利要求43的抗原性多肽或多肽組合物，其中所述脂質分子是C-末端palmitoylysylamide殘基。45.權利要求39至44中任一項的抗原性多肽或權利要求16至25中任一項的抗原性多肽組合物，其中至少部分所述多肽分子結合于一種支持物。46.權利要求45的抗原性多肽或多肽組合物，其中所述支持物是病毒顆粒、或硝化纖維素或聚苯乙烯珠、或生物可降解聚合物例如lipophosphoglycanes或聚-L乳酸。47.一種免疫原性組合物，其包含權利要求37的重組蛋白質、或權利要求39至46中任一項的多肽、或權利要求1至26中任一項的多肽組合物作為免疫原。48.一種抗瘧疾疫苗，其包含權利要求39的重組蛋白質、或權利要求40至46中任一項的多肽、或權利要求1至26中任一項的多肽組合物作為免疫原以及合適的藥用載體。49.權利要求47的免疫原性組合物或權利要求48的疫苗，還包含選自LSA-1、LSA-3、LSA-5、SALSA、STARP、TRAP、PfEXP1、CS、MSP1、MSP2、MSP4、MSP5、AMA-1、SERP和GLURP中的至少一種抗原。50.權利要求47至49中任一項的免疫原性組合物或疫苗，其被配制為用于皮內或肌肉內注射。51.權利要求50的免疫原性組合物或疫苗，其每一注射劑量包含1至100μg的免疫原，優選地為2至50μg。52.權利要求47至50中任一項的免疫原性組合物或疫苗，還包含SBAS2和/或明礬和/或Montanide作為佐劑。53.權利要求39的重組蛋白質、或權利要求40至46中任一項的多肽、或權利要求1至26中任一項的多肽組合物在制備抗瘧疾疫苗組合物中的用途。54.一種合成的或重組的純化抗體或抗體片段，其與權利要求39的數種蛋白質交叉反應，并在體外條件下通過單核細胞依賴性的抗體介導的ADCI機制介導在血液期殺死惡性瘧原蟲。55.針對權利要求39的數種蛋白質和/或權利要求40至46中任一項的多肽的抗體庫或抗體片段庫。56.針對權利要求1至26中任一項的多肽組合物的抗體庫或抗體片段庫。57.權利要求54的抗體或權利要求55或56的抗體庫，其中所述抗體是人抗體或人源化抗體。58.包含權利要求55至57中任一項的抗體或抗體庫的組合物在制備抗瘧疾藥物中的用途。59.用于對瘧疾進行被動免疫治療的藥物，包含權利要求55至57中任一項的抗體或抗體庫。60.權利要求60的藥物，還包含針對選自LSA-1、LSA-3、LSA-5、SALSA、STARP、TRAP、PfEXP1、CS、MSP1、MSP2、MSP4、MSP5、AMA-1、SERP和GLURP中的至少一種抗原的抗體。61.對可能感染惡性瘧原蟲的個體進行體外瘧疾診斷的方法，該方法包含將來自所述個體的生物學樣品與權利要求39的蛋白質、或權利要求40至46中任一項的抗原性多肽、或權利要求1至26中任一項的抗原性組合物相接觸，所述接觸在能夠使得所述抗原性肽或多肽與可能存在于所述生物學樣品中的抗體形成抗原/抗體復合物的條件下進行，并在體外檢測可能形成的抗原/抗體復合物。62.權利要求61的方法，其中體外診斷通過ELISA分析進行。63.權利要求61或62的方法，其中還將所述生物學樣品與源自其他抗原的一或數種抗原性肽相接觸，所述其他抗原選自LSA-1、LSA-3、LSA-5、SALSA、STARP、TRAP、PfEXP1、CS、MSP-3-1、MSP-3-2、MSP-3-5、MSP-3-6、MSP1、MSP2、MSP4、MSP5、AMA-1、SERP和GLURP。64.用于體外診斷瘧疾的試劑盒，包含至少一種權利要求39至46中任一項的肽或多肽。65.權利要求64的試劑盒，其中所述抗原性肽或多肽結合于支持物。66.權利要求64或65的試劑盒，還包含能夠使得所述抗原性肽或多肽與可能存在于生物學樣品中的抗體形成抗原/抗體復合物的試劑，以及能夠在體外檢測可能形成的抗原/抗體復合物的試劑。67.對可能感染惡性瘧原蟲的個體進行體外瘧疾診斷的方法，該方法包含將來自所述個體的生物學樣品與權利要求54至57中任一項的抗體相接觸，所述接觸在能夠使得所述抗體與可能存在于所述樣品中的惡性瘧原蟲特異性抗原形成抗原/抗體復合物的條件下進行，并在體外檢測可能形成的抗原/抗體復合物。68.用于體外診斷瘧疾的試劑盒，包含權利要求54至57中任一項的抗體。69.權利要求68的試劑盒，還包含能夠使得所述抗體與來自可能存在于生物學樣品中的MSP-3家族的蛋白質的抗原形成抗原/抗體復合物的試劑，以及能夠在體外檢測可能形成的抗原/抗體復合物的試劑。70.一種重組核苷酸序列，包含編碼權利要求39的蛋白質或權利要求40至46中任一項的抗原性多肽的序列。71.權利要求70的重組核苷酸序列，包含編碼至少兩個MSP-3-b-樣和/或MSP-3-c/d樣基序的序列，其中所述基序中的至少一個選自基序SEQIDNo19至24和27至30。72.權利要求71的重組核苷酸序列，包含編碼包含數個MSP-3-b樣基序的融合蛋白的序列，其中所述基序中的至少兩個選自基序SEQIDNo17至24。73.權利要求71的重組核苷酸序列，包含編碼包含數個MSP-3-b樣基序的融合蛋白的序列，其中所述基序中的至少兩個選自基序SEQIDNo25至30。74.一種重組的克隆和/或表達載體，包含編碼權利要求33至38或70至73中任一項的核苷酸序列。75.權利要求74的重組的克隆和/或表達載體，其中所述核苷酸序列受控于相對于宿主細胞是同源的或異源的啟動子和調節元件，以便在所述宿主細胞中表達。76.權利要求74或75的表達載體在制備用于抗惡性瘧原蟲的基因免疫接種的藥物中的用途。77.一種多核苷酸疫苗，包含權利要求70至73中任一項的核苷酸序列或權利要求27至33中任一項的基因家族的基因或權利要求34至38中任一項的基因。78.一種重組宿主細胞，其以權利要求77的載體轉化。79.權利要求78的宿主細胞，其是細菌、酵母、昆蟲細胞、或哺乳動物細胞。全文摘要本發明涉及抗瘧疾。更具體地，本發明涉及包括已知的MSP－3基因的新的基因家族，且該基因家族具有異常過剩的暴露表位，由此提示該基因家族在該寄生蟲的免疫原性方面具有重要作用。對該基因家族的表征能夠確定抗惡性瘧原蟲的新的免疫原性和疫苗組合物。本發明還涉及抗原性多肽組合物，其包含至少一個MSP－3－b樣基序和至少一個MSP－3－c/d樣基序。文檔編號C12N15/63GK1898384SQ200480038655公開日2007年1月17日申請日期2004年10月22日優先權日2003年10月24日發明者皮埃爾·德呂耶,蘇巴哈什·辛格,杜·梭梭,佩德羅·麥吉亞申請人:巴斯德研究院