乳酸產生細菌和肺功能的制作方法

專利名稱：乳酸產生細菌和肺功能的制作方法
技術領域：
本發明涉及食品和/或藥物組合物的領域。本發明提供了活的(益生菌)乳酸產生細菌，及其死的或不能存活的細菌的新用途，以及含有這些細菌的食品補充劑，營養組合物和/或藥物組合物。本發明進一步提供了制備這樣組合物的方法以及鑒定適合包含于這樣組合物中的細菌的方法。
背景技術：
肺功能衰退可能由氣道變窄或氧通過肺上皮細胞向血流擴散降低而引起。氣道變窄導致例如提高的氣道阻力(AR)和氣道或支氣管反應過度(AHR或BHR)。AHR指的是對各種刺激物過度的支氣管收縮響應，并由對(氣道變窄)刺激物提高的敏感性反映出來。此外，患者的頻繁AHR導致氣道改造并因此導致氣道變窄，增加的氣道阻力，并隨后導致朝向肺功能進一步衰退事件的粘性循環(Babu和Arshed，2003)。氣道變窄是與各種肺病相關的癥狀，如慢性阻塞性肺病(COPD)，哮喘，囊性纖維化和環境肺病。它還在上呼吸道感染之后和在特應性非哮喘患者和具有哮喘既往史的那些患者中發生。
COPD是涵蓋慢性支氣管炎和肺氣腫的總括術語。COPD的主要致病因素是主動和/或被動吸煙。其他致病因素是職業引起的暴露和α-1蛋白酶抑制劑(或α-1抗胰蛋白酶)的遺傳缺失。慢性支氣管炎患者具有多日慢性痰咳的歷史，每年至少3個月，連續2年。通常，觀察到緩慢地進展成咳嗽增加，呼吸困難，呼吸氣流削弱，運動耐量降低和日常生活的活動減少。增稠的粘液分泌和水腫的支氣管壁是引起氣道變窄的原因。在肺氣腫中，觀察到肺泡壁溶解或圍繞肺泡的肺毛細血管喪失，末端支氣管遠側氣室擴大，肺泡壁破壞，和由于肺泡表面積減小造成的氣體擴散削弱。除了肺泡的萎陷，在COPD中看到的形態學改變是平滑肌細胞的過度增殖。這些形態學改變導致降低的氧攝取功能和平滑肌收縮的失調。這隨后導致了肺(氣道)對非特異性藥物如乙酰甲膽堿，組胺，冷空氣等的反應過度，并導致氣道阻力的增加。
哮喘是另一種肺部病痛。它是與如呼吸困難，胸緊，喘鳴，產痰和咳嗽等癥狀相關的慢性病癥。認為哮喘的發展和持續主要是由于抗原誘導的炎癥的存在及其對氣道結構的影響(“過敏性哮喘”)。盡管COPD的一些癥狀與哮喘相似，但存在表明哮喘和COPD不是相同的且患有這些病癥的患者應當接受不同治療的大量證據。與COPD相反，哮喘患者的氣道阻塞是可逆的。
其中氣道反應過度和/或氣道阻力起重要作用的疾病是主要的健康問題。例如，COPD是目前世界第五大常見的疾病和第四大死亡原因，并預測到2020年，COPD可能位于全世界第三個最常見的死亡的原因。在過去這些年超過三分之一的患者報告了他們的病癥使他們不能工作，限制了他們的工作能力，或導致他們錯過工作時機。這些間接成本，與初級和醫療保健級健康支出的直接成本一起在90年代中期的美國，估計約為110億美元。
在發達國家中哮喘的發病率是高的。例如，在2001年的英國，通過國民健康活動中的哮喘檢查，13個成人中有1個和8個兒童中有1個目前正在接受哮喘治療。對于哮喘，生產力損失的成本，健康治療和社會安全成本也是巨大的(估計在2001年的英國為22億英鎊)。
目前對肺病如COPD或哮喘的治療方法包括藥物治療和幫助停止吸煙。停止吸煙通常是患者難以實現的而藥物則具有可能產生副作用的缺陷。這些副作用包括例如心悸，心動過速，震顫，顫抖/神經過敏，頭疼，失眠，口干，視力模糊，易怒，坐立不安，惡心，嘔吐，嘶啞，腎上腺皮質功能不全，免疫抑制和腹瀉，取決于所用的特定藥物。此外，患者可能變得對藥物不敏感。
因此，存在對組合物和方法的其他需要，該組合物和方法通過降低患者的AHR和AR具有對肺功能的有益效果，同時沒有副作用。
微生物的一些菌株，尤其屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)和/或雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的那些，已知在人和/或動物活的食用時具有有益效果，因此稱為“益生菌”菌株。已經報道了對腹瀉，胃腸道或尿道感染，陰道感染，炎癥疾病和過敏癥的治療和/或預防作用。益生菌在這些病痛中的作用機理是通過直接排除病原菌和/或通過調節免疫系統。例如，已經表明特定的益生菌菌株對促炎細胞因子IFN-γ具有體外或體內腸內的降低作用(Schulte等，2003；Varcoe等，2003；Madsen等，2001；Tejada-Simon 1999)。WO 03/010298公開了唾液乳桿菌(L.Salivarius)的益生菌菌株，其具有炎癥調節作用，因為當它們存在于腸內時明顯地降低了促炎細胞因子的水平。相似地，WO 03/010297公開了雙歧桿菌屬的益生菌菌株，其具有抗炎作用。WO 01/97822公開了乳桿菌GG(ATCC 53103)和乳酸雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)Bb-12菌株對于過敏性炎癥的用途。WO01/37865描述了給予益生菌后IgE抗體的下調。
盡管現有技術中已經描述了益生菌的用途，選擇迄今為止所述的細菌菌株的有益抗過敏癥和/或免疫系統抗炎作用或抗病原菌作用。當這些菌株已經表明具有有益作用時，這種作用在所有情況中通過這些作用方式來發揮(間接或直接地)。例如，過敏癥的治療中，已經描述益生菌菌株的食用具有抗炎作用，或對恢復Th1/Th2平衡的免疫系統的作用，且因此推定這樣的菌株可用于治療過敏性哮喘。
發明概述本發明者首次測試了分離的細菌菌株對肺功能(即，對PenH和因此對AHR和/或AR)的直接作用且令人驚訝地發現乳酸產生細菌的一些菌株(參見以下的第1和2組)對氣道變窄尤其是對AHR具有顯著的體內有益作用，且這種作用通過與抗炎響應無關、與Th1/Th2細胞因子響應再次平衡也無關的作用方式來發揮，Th1/Th2細胞因子響應是在過敏性患者中觀察到的(抗原特異性)免疫響應(參見Cross等，2002)。此外，與以前所述的用于治療呼吸道疾病的藥物相反，本發明的菌株不需要吸入，并可以攝食。因此本發明的菌株可用于治療或預防以前不知道用益生菌可治療的呼吸道疾病，如例如COPD和非過敏性哮喘。此外，在此包括共同給予本發明的一種或多種菌株，例如與已知的益生菌菌株(例如，具有不同作用方式的菌株)一起。此外，本發明的菌株可以作為死細胞，或包括這些死細胞的組合物來給予，以提供對肺功能的有益效果。
發明詳述定義“乳酸細菌”和“乳酸產生細菌”，在此可交替使用，并指的是產生作為發酵終產物的乳酸的細菌，諸如，但不限于，乳桿菌屬，鏈球菌屬(Streptococcus)，乳球菌屬(Lactococcus)，酒球菌屬(Oenococcus)，明串菌屬(Leuconostoc)，片球菌屬(Pediococcus)，肉桿菌屬(Carnobacterium)，丙酸桿菌屬(Propionibacterium)，腸球菌屬(Entercoccus)和雙歧桿菌屬的細菌。
“益生菌”或“益生菌菌株”指的是活微生物優選細菌的菌株，當患者攝入時(例如，腸內或經吸入)其對宿主具有有益效果。
“患者”在此指的是人或非人動物，尤其是脊椎動物。
術語“肺機能障礙”在此指的是由“非特異性氣道變窄”引起的氣道通路衰退。術語肺機能障礙不包括“特異性氣道變窄”，其在此指的是與肺組織的免疫響應相關的氣道變窄，如由過敏原引發時在過敏性哮喘中觀察到的。可以以氣道阻力(AR)或氣道反應過度(AHR)來測量肺機能障礙。
“氣道或支氣管響應性過度”或“氣道或支氣管反應過度”(AHR或BHR)指的是在對支氣管收縮刺激物的響應中氣道變窄的容易性和程度的增加。通過本文別處所述的支氣管刺激測試來測量AHR。在此所用的“非特異性誘導的氣道反應過度”(非特異性AHR)指的是與患者中過敏性反應(由過敏原引起的)無關的AHR。相反，“特異性誘導的AHR”指的是依賴于患者免疫系統的AHR，其對特異性過敏因子敏感。
“氣道阻力”(AR)指的是對空氣以一定速度通過肺的氣道阻力的量度。在尚未給予支氣管刺激時，AR具有和AHR基礎水平一樣的值。也可以在支氣管刺激測試中測量AR。
“FEV1”指的是用肺活量計測量的在第一秒鐘呼氣時的最大呼氣量。“FVC”指的是最大肺活量，也用肺活量計來測量。FEV1是對人肺機能和氣道變窄的量度。與測試動物中所用的PenH測試相反，對人患者進行的支氣管刺激測試通常測量FEV1。
具有“對氣道變窄的顯著有益效果”的菌株指的是與在此所述的PenH測試中的合適對照相比較，具有顯著降低的PenH值的菌株。當然代替評價PenH，可以測定等價的替代值，如人測試中的FEV1。
將術語“顯著的抗炎作用”定義為支氣管肺泡灌洗中測定的炎癥細胞數目至少10％的增加。
術語“包含”應理解為具體說明所述部分、步驟或組分的存在，但不排除一種或多種其他部分、步驟或組分的存在。包含乳酸細菌的組合物因此可以包含另外的細菌菌株等。
當使用PenH測試測量幾株乳酸細菌(口服給予)對卵清蛋白敏化的小鼠的效果時，令人驚訝地發現乳酸產生細菌的一些菌株能夠對PenH尤其是對氣道反應過度具有顯著的有益效果，而沒有對炎癥的伴隨作用，如通過炎性細胞(例如，嗜中性粒細胞，嗜曙紅細胞，淋巴細胞和巨噬細胞)流入肺組織中而測定的。
令人驚訝地，基于它們對氣道變窄的作用(如通過PenH測定的)和抗炎/免疫調節作用，可以將細菌菌株區分開來并分組。因此，除了對炎癥或氣道變窄沒有活性的細菌菌株組以外，基于它們不同的作用方式，可以將乳酸產生細菌分成3組。第1組的菌株(例如，菌株TD1，即，Morinaga的短雙歧桿菌(B.breve)菌株MV-16)具有顯著的抗炎作用和對氣道變窄的顯著有益效果。屬于第1組的其他菌株是乳桿菌GG和雙歧桿菌Bb-12，在我們的實驗中發現它們對PenH具有超過25％的降低作用。已知這些菌株具有顯著的抗炎作用(WO 01/97822，在此引入作為參考)。第2組的菌株(例如，菌株TD2，以保藏號No.LMGP-22110保藏于BCCMTM，Univ.Gent，比利時)不具有顯著的抗炎作用，但對氣道變窄具有顯著的有益效果。第3組的菌株(例如，菌株TD5，即，Rhodia Food的嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)Bi07)對氣道變窄不具有顯著的有益效果，但具有顯著的抗炎作用。這清楚地證明了對氣道變窄的有益效果和抗炎作用是不相關的，且乳酸產生細菌能夠對氣道變窄具有顯著的有益效果，與它們是否對炎癥還具有效果無關。
推斷第2組的菌株沒有通過免疫系統來發揮它們的作用，這通過測量肺組織炎癥的常用方法就可以測定，即，測量抗炎細胞，尤其是嗜中性粒細胞，嗜曙紅細胞，淋巴細胞和巨噬細胞流入支氣管。然而，不排除第2組的菌株還以一些使用這些方法不可以或不能測量的其他的新的或不同的方式影響免疫系統。無論如何，這些菌株抗炎作用的缺乏使它們與已知菌株(如雙歧桿菌Bb-12和乳桿菌GG)清楚地區分開來，這些已知菌株在過敏性患者中確實通過抗炎響應來發揮它們的作用。在不限制本發明范圍的情況下，可以設想對肺上皮細胞或肺中的平滑肌細胞的直接作用，盡管這種對肺的作用的精確機理仍然有待闡明。
在本發明的一個實施方案中，提供了乳酸產生細菌菌株在制備用于治療或預防肺機能障礙(如上所限定的)的組合物中的用途。適用于制備該組合物的乳酸產生細菌是第1組和/或第2組的細菌，即對氣道變窄具有顯著有益效果的細菌，如可以在PenH測試或在FEV1測試中測量的。優選，使用PenH測試(如Hamelmann等，1997中所述的)。
如上所述，第1組的菌株是對測試對象的氣道變窄(如所限定的)具有顯著有益效果且至少還具有顯著抗炎作用的菌株。第1組菌株還具有免疫調節作用，例如通過調節細胞因子水平。第1組菌株是例如Morinaga的短雙歧桿菌菌株MV-16(在此也稱為菌株TD1)。
第2組菌株是新的菌株，其對氣道變窄(如所限定的)具有顯著的有益效果但是至少缺乏伴隨的抗炎作用。第2組菌株的實例是LMGP-22110(在此也稱為TD2)。優選，第2組菌株不具有免疫調節活性。使用本文別處所公開的方法可以容易地鑒定出第2組的其他菌株。
第3組菌株是對氣道變窄(如所限定的)不具有顯著有益效果但至少具有抗炎作用的菌株。Rhodia Food的嬰兒雙歧桿菌Bi07(在此也稱為菌株TD5)是該組的實例。
通過測量測試菌株的顯著(有益)效果，與對照菌株對氣道變窄的效果相比較，來測定細菌菌株對氣道變窄的顯著有益效果。可以使用測試動物或人患者來進行，盡管各自的測試和所測量的參數是不同的(分別為PenH測試和FEV1測試)，如下所述。因此，顯著的PenH或FEV1值確定了是否存在對氣道變窄尤其是對AHR和/或AR的顯著有益效果。在這方面何種水平被認為是“顯著的”取決于所用的測試和參數，如下所討論的。當進行適于所用測試的統計學分析時，重要的因素是測試結果是統計學上顯著的。優選，使用至少95％的置信界限。使用這些測試中的任一個，或本領域已知的等價測試，本領域技術人員將能夠鑒定對氣道變窄具有顯著有益效果的菌株。這樣的菌株適用于根據本發明的組合物和方法中。
人患者-FEV1在支氣管收縮劑刺激之前和之后，通過肺活量測定法測定FEV1是最常用的用于定量人患者中AHR響應和/或AR的方法。陽性測試的特征在于特定劑量或水平的刺激物與限定的FEV1(1秒鐘內的最大呼氣量)的降低一致。通常根據特定的實驗方案來進行支氣管刺激測試，通過累積的劑量測量PD20(Yan等，1983)(PD20指的是FEV1下降20％的刺激劑量)或通過較長的方法測量PC(Cockcroft 1985)(PC指的是刺激濃度)。PC20＜0.25mg/ml(PD20＜0.1μmol)是嚴重響應，PC20 0.25-2.0mg/ml(PD20 0.1-0.8μmol)是中度響應而PC202.0-8.0mg/ml(PD20，0.8-8.0μmol)是溫和響應。所用的支氣管收縮刺激物是藥劑(組胺，乙酰甲膽堿)，物理刺激(非等滲氣霧劑，冷/干空氣，運動)和特異性敏化劑(過敏原)。在人中，這樣的支氣管刺激測試可以用于診斷或證實AHR的診斷來證明治療干預或癥狀惡化后AHR跟隨AHR改變的嚴重程度，來排除具有慢性咳嗽患者的哮喘，來確定誰在工作場所或在娛樂活動期間處于危險中，和/或來建立環境或職業性暴露之前的對照或基線。
與對照對象相比較，在支氣管刺激后在人測試對象中測定的，FEV1至少10％的下降，被認為是肺功能的衰退(Cockroft 1985，Yan等，1983)。當在補充特定菌株的過程中和/或之后FEV1的基礎水平顯著提高(＜10％)時，或當支氣管刺激后FEV1下降顯著降低(＜10％)時，認為菌株具有有益效果。
測試動物-PenH測試由于在動物中不能測量FEV1，建立了測量氣道變窄的其他方式(即，測量PenH并因此測量AHR和AR)。優選使用體積描記器在測試動物體內測量PenH，如通過Hamelman等(1997)中所述的，在此引入作為參考。簡而言之，將測試動物(通常是小鼠)放入體積描記器的動物室中。當動物平靜呼吸時，在該室內造成了壓力波動，表示呼吸過程中一次換氣量和胸廓運動之間的差異。壓差傳感器測量動物室和參照室之間的壓力改變。除了已知的肺功能參數如呼氣峰流量(PEF)，一次換氣量(TV)，呼氣時間(Te)和頻率(f)，還測量了提高的暫停(PenH)。沒有遭受任何肺功能衰退的正常動物中的基礎PenH大約為0.30。也認為動物中的基礎PenH是AR的參數。在(由乙酰甲膽堿引發的)支氣管收縮過程中，PEF和PIF(吸入峰流量)提高，而Tr(放松時間)和Te降低。這導致了提高的PenH。將有意識不受限制的小鼠中的氣道響應性的數據表示為PenH。PenH的提高與FEV1的降低相關。因此，推定抑制動物中PenH提高的化合物不會降低人的FEV1且因此減輕氣道變窄并提高肺機能。
概括地說，在支氣管刺激之后在對照對象和給予測試菌株的對象之間至少10％，優選至少20％等，或更大的PenH值差異表明測試菌株的顯著效果。
上述的動物測試方法(PenH)或人測試方法(FEV1)可以用于確定哪些菌株適用于制造本發明的組合物。以這種方式制得的組合物將對人和/或動物患者肺機能障礙的治療和/或預防具有有效效果。也可以通過支氣管刺激測試來測量這些菌株和/或含有這些菌株的組合物對人患者的效果，如上所述。
為了測定對氣道變窄具有顯著有益效果的菌株是否屬于第1組或第2組，使用已知的方法，例如實施例中所述的，來測定菌株的抗炎作用(和任選地免疫調節作用)。使用適于所使用測試的已知統計學分析方法來測定效果是否顯著。一般地說，對照和給予測試菌株對象之間至少10％，優選至少20，30，40或50％的PenH差異表明測試菌株的顯著效果。
組合物使用一種或多種根據本發明的菌株制成的組合物可以是適于患者攝取的任何類型的組合物，尤其是適于患有肺機能障礙，如COPD，或哮喘，或其中發生氣道反應過度和/或氣道限制的其他呼吸道疾病的人患者。組合物可以是食品，食品補充組合物，營養(食品)組合物或藥物組合物。根據組合物的類型及其優選的給予方法，組合物的成分和質地可以改變。食品或食品/營養組合物除了包含本發明的細菌菌株以外，還包含合適的食品基料。食品或食品組合物在此認為包含用于人或動物食用的固體(例如，粉末)，半固體和/或液體(例如，酒或飲料)。食品或食品/營養組合物可以是乳制品，如發酵的乳制品，包括但不限于酸奶，基于酸奶的飲料或酪乳。這樣的食品或食品組合物可以以本身已知的方式制得，例如，以合適的量(參見，例如，WO01/82711)將本發明的菌株加入合適的食品或食品基料中。在另外的實施方案中，將菌株用于食品或食品/營養組合物中或用于制備食品或食品/營養組合物，例如，通過發酵。這樣菌株的實例包括本發明的益生菌乳酸產生細菌。在這種情況下，可以以本身已知的方式將本發明的菌株用于制備這樣的發酵食品或食品/營養組合物，例如，以本身已知的使用乳酸產生細菌來制備發酵乳制品的方式。在這樣的方法中，除了通常所用的微生物以外還可以使用本發明的菌株，和/或可以用本發明的菌株替代一種或多種或部分通常所用的微生物。例如，在制備發酵乳制品如酸奶或基于酸奶的飲料中，本發明的活的食品級乳酸產生細菌可以被加入發酵劑培養物中或用作發酵劑培養物的一部分或可以在這樣發酵的過程中適時加入。
食品補充組合物除了有效量的第1組和/或第2組的一種或多種菌株以外，食品補充劑可以包含一種或多種載體，穩定劑，益生素等。優選，組合物是粉末形式，用于腸內(優選口服)給予，盡管鼻給予或吸入也是合適的。當使用菌株的活細胞時，這些細胞可以以被膜包裹的形式存在以防受到胃的作用。例如，組合物可以是包裝于小袋中的粉末形式，其可以溶解于水，果汁，牛奶或另一種飲料中。優選，組合物包含至少一種第2組的菌株，如，例如，LMG P-22110。每株的活細胞劑量優選為每株至少1×106cfu，優選每天約1×106-1×1012cfu(菌落形成單位)，更優選約1×107-1×1011cfu/天，更優選約1×108-5×1010cfu/天，最優選1×109-2×1010cfu/天。可以將有效劑量再分成幾個更小的劑量并例如以每天兩份，三份或更多份給予。替代使用活細胞，在一些組合物中可以使用死的或不能存活的細胞，如以下進一步所述的。
食品/營養組合物除了合適劑量的第1組和/或第2組的一種或多種菌株以外，營養組合物優選包含適于人和/或動物食用的碳水化合物和/或蛋白質和/或脂類。組合物可以含有或不含有其他生物活性組分，如其他的(益生菌)菌株，和支持益生菌菌株的益生素。當使用菌株的活細胞時，這些細胞可以以被膜包裹的形式存在以防受到胃的作用。每株的活細胞劑量優選為至少1×106cfu，優選約每天1×106-1×1012cfu(菌落形成單位)/天，更優選約1×107-1×1011cfu/天，更優選約1×108-5×1010cfu/天，最優選1×109-2×1010cfu/天。優選，組合物包含至少一種第2組的菌株，如，例如，LMG P-22110。營養品優選是液體或粉末的形式。在一個實施方案中，營養品是“Respifor”-樣液體產品，可購得(Nutricia，荷蘭)，即，基于牛奶的、能量密集的、高蛋白和碳水化合物的，富含抗氧化劑并包含調味料的營養品。營養品優選不替代患者的正常食品/飲料攝入，而是除此以外額外食用的。營養品優選腸內給予，如口服和通過管飼。
藥物組合物合適劑量的第1組和/或第2組的一種或多種菌株也可以用于制造用于治療或預防肺機能障礙的藥物組合物。藥物組合物通常用于腸內(例如口服)，鼻/吸入，陰道或直腸給藥。藥物組合物除了本發明的菌株以外通常包含藥物載體。優選的形式取決于預期的給藥方式和(治療)應用。藥物載體可以是適于將菌株遞送至所需的體腔例如患者的腸中的任何相容的，非毒性物質。例如，無菌水，或惰性固體可以用作載體，通常補充藥物上可接受的助劑，緩沖劑，分散劑等。藥物組合物可以進一步包含另外的生物或藥物活性組分。
在另外的實施方案中，替代活(或存活的)細菌或除了活(或存活的)細菌以外，可以將菌株的死的或不能存活的細菌細胞用于上述組合物中，例如WO 01/95741中所述的。所用的死的或不能存活的細胞的量例如可以等于所用的活細菌的量。本領域技術人員可以容易地確定合適的量。在這樣的組合物中，當以“菌落形成單位”量度不可行時，以本領域技術人員已知的不同方式來計數(例如，使用流式細胞計數器)或測量細胞的量。
應當理解當提及含有活細胞的組合物時，這包括存活的細胞，如例如凍干細胞，在用液體給藥或重構后將再次變成活的。
食品，食品補充劑，營養或藥物組合物是液體形式，例如，穩定的菌株懸浮液，或固體形式，例如粉末，或半固體形式，例如對于口服給藥，可以以固體劑型，如膠囊，片劑和粉末，或以液體劑型，如酏劑，糖漿和懸浮液給予菌株。可以將菌株與非活性組分和粉末載體一起包封于明膠膠囊中，這些載體如例如葡萄糖，乳糖，蔗糖，甘露醇，淀粉，纖維素或纖維素衍生物，硬脂酸鎂，硬脂酸，糖精鈉，滑石，碳酸鎂等。如上所述，組合物可以包含另外的組分，如蛋白質，碳水化合物，維生素，礦物質，微量元素，氨基酸，其他生物或藥物活性化合物，載體，穩定劑，調味劑，其他益生菌菌株，益生素等。
第2組的菌株尤其適于制備用于治療或預防肺機能障礙，如COPD，非過敏性哮喘，囊性纖維化，吸入，支氣管內腫瘤，氣管內腫瘤，由非特異性吸入的刺激物引起的肺機能障礙，肺水腫，氣管狹窄或聲帶機能障礙的組合物。當然，第2組的菌株可以與已知具有抗炎活性的菌株(如第1組和/或第3組的菌株)合用。這樣的組合物適于治療或預防與炎癥相關的肺病或呼吸道疾病/病癥，例如過敏性哮喘。
含有根據本發明的一種或多種菌株的組合物適于治療已經患有肺機能障礙的患者或可以預防性地給藥于處于產生這種肺機能障礙的高危險的對象，如例如暴露于煙/吸煙，寒冷等的對象。
所用的細菌菌株優選是乳酸產生細菌，優選乳桿菌屬或雙歧桿菌屬。細菌應當是食品級的，即，當人或動物患者攝入時，可以將它們視為是無害的。應當理解已經將其改良使得當患者攝入時不再有害的非食品級細菌，例如致病菌，包括于本發明的范圍內。乳桿菌菌株可以是以下的菌種鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)，干酪乳桿菌(L.casei)，類干酪乳桿菌(L.paracasei)，瑞士乳桿菌(L.helveticus)，德氏乳桿菌(L.delbrueckii)，羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)，短乳桿菌(L.brevis)，卷曲乳桿菌(L.cripatus)，清酒乳桿菌(L.sakei)，詹氏乳桿菌(L.jensenii)，舊金山乳桿菌(L.sanfransiscensis)，食果糖乳桿菌(L.fructivorans)，高加索酸奶乳桿菌(L.kefiri)，彎曲乳桿菌(L.curvatus)，類植物乳桿菌(L.paraplantarum)，高加索酸奶粒乳桿菌(L.kefirgranum)，類高加索酸奶乳桿菌(L.parakefir)，發酵乳桿菌(L.fermentum)，植物乳桿菌(L.plantarum)，嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)，約氏乳桿菌(L.johnsonii)，加氏乳桿菌(L.gasseri)，乳乳桿菌(L.xylosus)，唾液乳桿菌(L.salivarius)等。優選的菌種是鼠李糖乳桿菌，干酪乳桿菌，類干酪乳桿菌，羅伊氏乳桿菌，卷曲乳桿菌，發酵乳桿菌，植物乳桿菌，嗜酸乳桿菌，約氏乳桿菌，加氏乳桿菌，唾液乳桿菌，更優選是植物乳桿菌，干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌。最優選使用屬于干酪乳桿菌菌種的乳桿菌屬的菌株。
在本發明的一個實施方案中，排除鼠李糖乳桿菌菌株，尤其是L.GG菌株，因為它們可能導致安全問題且因為例如L.GG菌株具有對于特定的應用可能不理想的特征(參見實施例)。
雙歧桿菌菌株可以是以下的菌種長雙歧桿菌(B.longum)，短雙歧桿菌(B.breve)，動物雙歧桿菌(B.animalis)，嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)，雙歧雙歧桿菌(B.bifidum)，青春雙歧桿菌(B.adolescentis)，假長鏈雙歧桿菌(B.pseudolongum)，鏈狀雙歧桿菌(B.catenulatum)，假小鏈雙歧桿菌(B.pseudocatenulatum)，角雙歧桿菌(B.angulatum)等。優選的菌種是短雙歧桿菌和/或動物雙歧桿菌(尤其是動物雙歧桿菌乳酸亞種)。
微生物的種身份可以用生化方法或通過測序(例如，保守區域)或通過已知的方法如脈沖場凝膠電泳測定。通常，如果在16S rRNA區域中(例如，當通過例如程序GAP或BESTFIT使用系統設定的參數進行最佳比對時)細菌菌株顯示出至少97％核酸序列同一性，則它們屬于相同菌種。
干酪乳桿菌菌株TD2，根據布達佩斯條約保藏于比利時微生物協調保藏中心(Blegian Co-ordination Collections ofMicroorganisms)，BCCMTM，Gent，比利時，保藏號為LMG P-22110。LMG P-22110尤其適于制備上述的組合物，盡管本發明不只限于該菌株。
應當理解本發明包括保藏菌株或根據本發明的任何其他菌株的復制品和/或衍生物。術語“復制品”指的是表示材料基本上未改變拷貝的生物材料，如通過微生物生長例如培養基中的細菌生長產生的材料。術語“衍生物”指的是從該生物材料形成且被實質性改變以具有新特性的材料，例如，由遺傳物質的可遺傳改變引起的。這些改變可以同時發生或可以是所用化學和/或物理試劑(例如，誘變劑)的結果和/或通過本領域已知的重組DNA技術。當提及“源自”另一菌株的菌株時，應當理解為包括該菌株的“復制品”以及該菌株的“衍生物”兩者，只要衍生的菌株仍然保持其所源自的菌株對氣道變窄的有益效果，且因此可用于治療和/或預防肺機能障礙。
在本發明的另一實施方案中，至少兩種或多種菌株合用于一種組合物中或共同給予患者。優選，將至少一種具有抗炎作用的菌株(例如，本領域已知的菌株如TD5，或第1組的菌株，如TD1)和至少一種對氣道變窄具有有益效果但不具有抗炎作用的其他菌株(例如，第2組的菌株，例如，TD2)組合。在一些情況中，菌株的這種組合優于只給予具有抗炎活性的菌株，因為發揮不同作用方式的菌株的組合可能對肺功能具有增強的效果。菌株可以存在于不同的組合物中且在將不同組合物給予患者后只在體內組合。或者，菌株可以存在于單個組合物中。在這兩種情況中，兩種或多種菌株的給予稱為“共同給予”。
在另外的實施方案中，提供了包含至少一種根據本發明的菌株的組合物，如上所述的。
在本發明的再一個實施方案中，提供了菌株LMG P-22110(TD 2)或源自所述菌株的任何菌株。
本發明還提供了容器，包含根據本發明的組合物，如上所述。這樣的容器可以是存儲1-100個，和1至100之間的每個單個值，如1，5，10，20，30，40，50，100個或更多劑量的片劑、膠囊、粉末、安瓿，小袋等的包裝。同樣，包裝可以存儲1-200個，1-500個或更多的劑量。當欲共同給予不同菌株時，應當理解容器可以包含分開劑量的含有每個菌株的組合物。優選，容器包括在外表面上標明組合物的有益效果或健康效果的書面標簽。例如，容器可以標明該組合物是“用于COPD患者”或“改善健康狀況”的。容器可以是硬紙盒，塑料的，和金屬的等。如果組合物是液體或粉末形式，容器還可以包括適于給予該組合物的工具，如吸入器。此外，容器可以包括書面使用說明書。
本發明的目的還在于提供一種制備用于治療或預防肺機能障礙的組合物的方法，包括下列連續的步驟-使用PenH測試或通過測定人患者的FEV1值來測試細菌菌株，優選乳酸產生細菌對氣道變窄的效果，-基于對PenH和/或FEV1的效果，選擇對氣道變窄，尤其是對AHR具有顯著有益效果的菌株，-使選定的菌株生長于合適的液體或固體培養基中，-任選地從培養基中分離菌株，例如，通過離心和/或過濾并如本領域已知的進行下游加工，例如凍干，噴霧干燥和/或冷凍，-將菌株配制成適于給予患者的形式。
任選地，還測試了分離的菌株是否能夠對患者提供顯著的抗炎作用。
應當注意上述方法中測試的菌株優選從其天然環境中分離，并且其沒有污染物。分離的菌株可以生長于人造培養基或天然培養基上，如(低脂)牛奶，酸奶等。然后可以將其直接用于制造根據本發明的組合物，或可以通過離心和/或過濾從培養基中將細菌濃縮或分離，然后配制成合適的組合物。應當理解現有的食品組合物，如例如包含不明確的微生物混合物(例如，酵母，各種菌種的細菌)的酸乳酒，排除在本發明的組合物之外，因為這樣的產品在它們的細菌組成(菌種)以及細菌濃度(劑量)方面都是未確定的。然而，它們可以用作的食品基料，可以將根據本發明的一種或多種菌株加入其中。只有由此所產生的組合物(包含至少一種根據本發明的菌株)及其用途被看作是本發明的實施方案。
根據本發明的第1組和/或第2組的菌株在制備用于治療或預防肺機能障礙，尤其是用于治療或預防COPD，非過敏性哮喘，囊性纖維化，吸入，支氣管內腫瘤，氣管內腫瘤，由于非特異性吸入的刺激物引起的肺機能障礙，肺水腫，和/或聲帶機能障礙的藥物中的用途是本發明另外的實施方案。在尤其優選的實施方案中，將藥物用于治療和/或預防選自COPD，吸入，由于非特異性吸入的刺激物引起的肺機能障礙，肺水腫和/或氣管狹窄的肺機能障礙。
在另一實施方案中，提供了益生菌乳酸細菌在制備用于治療或預防患者慢性阻塞性肺病(COPD)的藥物中的用途。
以下的非限制性實施例描述了根據本發明的菌株的鑒定和使用。除非另外指出，本發明的實施將使用分子生物學、病毒學、微生物學或生物化學的標準常規方法。
實施例實施例1菌株TD2的描述和特征以及益生菌特性菌株分離從健康人志愿者的糞便中分離出菌株TD2。研究健康成人志愿者糞便中的益生菌菌株。“健康的”，意思是沒有疾病，沒有痛苦，未患有胃腸道疾病，至少6周沒有使用抗生素，至少一周沒有食用益生菌產品，沒有對乳蛋白的不耐受性，并具有規律的大便習慣的成人。記錄有關飲食習慣的日志。
在厭氧室中分析新鮮的人糞便。將糞便在90ml貯存培養基(每升20g/l緩沖的蛋白胨水，1.0ml/l吐溫80，0.5g/l L-半胱氨酸-HCl和1片刃天青片劑，pH6.3(用2M HCl調節))中稀釋十倍，然后使用Ultra-Turrax均化。在減少的蛋白胨(1.0g/l)生理鹽溶液中進行連續稀釋并將102-107稀釋液鋪在LAMVAB上(Harternik等，1997)。這個最終的培養基由52g/l De Man Rogosa和Sharpe(MRS，Oxoid)，0.25g/l L-半胱氨酸-HCl，0.025g/l溴甲酚綠，20g/l瓊脂，和20mg/l萬古霉素組成。將MRS(104g/l)，L-半胱氨酸-HCl(0.5g/l)和溴甲酚綠(0.05g/l)與瓊脂(40g/l)分開在121℃高壓滅菌15分鐘，并冷卻至50℃。將萬古霉素的儲液(2mg/ml)通過使用0.2μm的濾器過濾滅菌。將高壓滅菌的瓊脂和MRS+半胱氨酸+溴甲酚綠以1∶1的比例混合。隨后將萬古霉素加入至20mg/ml的終濃度，此后將其倒在平板上。然后將平板在厭氧罐中37℃溫育三天。為了純度將菌落在MRS瓊脂上劃線培養并在37℃溫育。
菌株分類16sRNA的測序給出了菌株的可靠鑒定。根據Boom等(1990)描述的方法進行菌株DNA的提取。用表1中所提及的8f和1510r引物來完成16sRNA區域的擴增和測序。擴增程序是94℃ 5分鐘；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 90s，30個循環；最后72℃ 4分鐘。
表1引物
使用Sanger等(1977)詳述的DNA測序的雙-脫氧方法進行測序。在循環測序反應(CSR)中使用ABI PRISM BigDye終止子循環測序迅速反應試劑盒(Applied Biosystems Inc.，Nieuwekerk aan de IJssel，荷蘭)結合表2中提及的所有引物。CSR的程序為96℃ 30s，接著96℃ 10s，50℃ 5s和60℃ 4分鐘，25個循環。隨后借助ABI PRISM 310基因分析儀(Applied Biosystems Inc.，Nieuwekerk aan de IJssel，荷蘭)來分析CSR-混合物。用Chromas V1.51(Technelysium Pty Ltd.，Tewantin，澳大利亞)來分析序列數據并借助Windows V2.5的DNASIS(Hitachi Software Engineering Co.，Ltd.，Wembley，英國)來比對。將完整的雙鏈16S rDNA測序區域輸入Basic Local AlignmentSearch Tool(BLAST)程序(Altschul等，1990)中并與GenBank，EMBL，DDBJ和PDB數據庫中的其他(菌株)的(16S rDNA)序列相比較來進行菌株鑒定。因此將菌株鑒定為屬于干酪乳桿菌種。
菌株存活評價從人糞便中分離的菌株干酪乳桿菌TD2，以及已知的益生菌菌株在胃和小腸中的存活。當該菌株用作人的益生菌時，在胃和小腸中的存活是重要的。
使細菌在MRS中生長24小時，隨后在MRS中再接種24小時。將1ml生長培養物加入9ml胃培養基中，胃培養基由8.3g/l細菌蛋白胨，3.1g/l NaCl，0.11g/l CaCl2，1.1g/l KCl，0.6g/l KH2PO4，1.0g/lD-葡萄糖，22.2mg/l胃蛋白酶和22.2mg/l脂酶組成，pH3.0。將細菌在胃培養基中37℃溫育3小時。此后，將1ml用細菌溫育的胃培養基與9ml小腸培養基混合并在37℃再溫育3小時。小腸培養基由5.7g/l細菌蛋白胨，1.25g/l NaCl，0.055g/l CaCl2，0.15g/l KCl，0.68g/lKH2PO4，1.0g/l NaHCO3，0.3g/l Na2HPO4，0.7g/l葡萄糖，20.3g/l胰酶和5.5g/l膽汁組成，pH6.5。在t＝0，3和6小時時取樣并涂布于MRS瓊脂上來測定菌落形成單位。
從人糞便分離的干酪乳桿菌，LMG P-22110，在胃和小腸培養基中呈現與其他益生菌菌株相似或甚至更好的存活，如以下表2中所示的。
表2
菌株粘附益生菌的特性之一是它們可以粘附于小腸細胞上并與病原菌競爭上皮細胞的結合位點。對上皮細胞的粘附也與定居的能力和對宿主的益生菌效果相關。
測試了干酪乳桿菌LMG P-22110的粘附性。
通過離心(10分鐘，4000rpm，Sorval RT17)收集菌株的過夜培養物并重懸浮于PBS中。在顯微鏡下使用Burker Turk計數室來計數細胞的數量。將細菌再次離心并將沉淀重懸浮于無Pen/Strep的Caco-2 1％FCS-培養基中。Caco-2細胞是2周后匯合并在24孔平板中生長(1-2×105個Caco-2細胞每孔)。每孔加入1×108CFU細菌并在含有5％CO2的溫育箱中37℃溫育1小時。溫育后，從Caco-2細胞中除去培養基，并用PBS(37℃)洗滌細胞3次。用無菌Mili Q水將細胞裂解，制備裂解細胞的連續稀釋液并涂布于MRS瓊脂上。
結果表明干酪乳桿菌LMG P-22110(TD2)的粘附至少和其他公知的益生菌菌株一樣好。粘附性好于陽性對照。粘附了約13％凈增的培養物。
沒有觀察到有害的特性，如溶血，或組胺和酪胺的產生。
實施例2其中用幾種乳酸細菌菌株預防性治療清蛋白敏化小鼠的動物實驗動物從Charles River(Maastricht，荷蘭)獲得無特異性病原菌的雄性BALB/c小鼠。隨意提供食物和水，當6-9周齡時使用小鼠。所有實驗均由荷蘭烏特勒支大學動物論理學委員會批準。
試劑清蛋白(V級)和乙酰-β-甲基膽堿氯化物(乙酰甲膽堿)從SigmaChemical Co.(St.Louis，MO，USA)購得。氫氧化鋁(AlumInject)從Pierce(Rockford，IL，USA)購得。
敏化，治療和激發通過在第0和第7天兩次i.p.注射吸附于100μl鹽水中2.25mg氫氧化鋁上的10μg清蛋白或單獨的鹽水來敏化小鼠。在第35，38和41天通過在有機玻璃暴露室中吸入清蛋白氣霧劑20分鐘來激發小鼠。通過使用Pari LC Star噴霧器(Pari呼吸設備，Richmond，VA，USA)將鹽水中的清蛋白溶液(10mg/ml)噴霧來產生氣霧劑。在第28天開始直至實驗結束(即，第42天)每日通過管飼法口服109(CFU)每株乳酸細菌來治療小鼠。
氣道響應性的測定在最終氣霧劑激發后24小時時使用整體體積描記器(BUXCO，EMKA，Paris，法國)測定對有意識的，不受限制的小鼠對吸入的噴霧乙酰甲膽堿的氣道響應性。將氣道響應表示為提高的暫停(PenH)。
支氣管肺泡灌洗測量膽堿能氣道響應后，將動物處死并進行支氣管肺泡灌洗，測定細胞的總數并將細胞區別開來。將第一毫升灌洗液的上清液分離并冷凍于-70℃直至進一步的分析。將全部細胞(嗜中性粒細胞，巨噬細胞，嗜曙紅細胞+淋巴細胞)的流入作為肺組織炎癥的量度。
統計學分析通過常規的線性模型或重復測量后組之間的post-hoc比較來統計學分析對乙酰甲膽堿的氣道響應曲線。使用Mann-Whitney U檢驗來統計學分析細胞計數。概率值p＜0.05被認為是統計學上顯著的。
結果結果顯示于表3中。菌株TD2顯示了對氣道反應過度的顯著效果，但是對炎癥沒有顯著效果，而菌株TD5顯示了對氣道反應過度沒有顯著效果，但顯示了對炎癥有效果。菌株TD1顯示對氣道反應過度和炎癥都具有效果。
這些結果表現出一些乳酸產生細菌菌株對肺功能的不同效果，且表明對肺炎癥的有益效果并非必然導致對肺功能的有益效果，反之亦然。因此，這些結果表明對肺功能具有有益效果的產乳酸菌株對涉及肺機能障礙的疾病具有治療和/或預防作用，不同于具有抗炎作用的那些菌株。這些結果表明屬于干酪乳桿菌種的菌株尤其有效。
表3在清蛋白敏化小鼠中各種乳酸細菌菌株對氣道反應過度和炎癥的效果。
a沒有用乳酸細菌治療的清蛋白敏化的小鼠b沒有用清蛋白敏化的對照大鼠c用支氣管肺泡肺灌洗中存在的細胞數量來估量炎癥d將氣道反應過度的降低表示為在最高測試劑量乙酰甲膽堿(50mg/ml)對PenH的效果*與沒有用乳酸細菌治療的清蛋白敏化的小鼠相比較，P＜0.05e未測定f在分開的實驗中測定的實施例3在內毒素誘導的肺氣腫期間顯示乳酸細菌在小鼠模型中的效果的動物實驗通過LPS處理可以誘導小鼠的肺氣腫。
動物從Charles River(Maastricht，荷蘭)獲得無特異性病原菌的雄性BALB/c JIco小鼠。隨意提供食物和水，并在7-8周齡時使用小鼠。所有實驗均由荷蘭烏特勒支大學動物論理學委員會批準。
試劑LPS大腸桿菌(E.coli)，血清型O55B5Sigma Chemical Co.
乙酰甲膽堿(乙酰-β-甲基膽堿，從Janssen Chimica(Beerse，比利時)獲得)。
敏化，治療和激發通過鼻內給予LPS(50μl磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中5μg)來誘導肺氣腫，或作為對照，給予PBS(50μl)，一周兩次，共四周(第0，3，7，10，14，17，21和24天)。在第14天開始直至實驗結束(即，第42天)每日通過管飼口服0.2ml含有109(CFU)每株乳酸細菌的鹽水(0.9％w/v NaCl)來治療小鼠。作為對照，加入0.2ml鹽水。
如實施例2中所述測定氣道反應過度和支氣管肺泡灌洗。
右心室肥大右心室肥大是肺氣腫的征兆。在第42天分離整個心臟(10只動物中4只的)并在解剖顯微鏡下完全分離無壁的右心室(RV)并取出。在吸干后將左心室和隔膜(LV+S)和RV分別稱重。將RV重與LV+S重之比用作右心室肥大的指數。
統計學分析將對乙酰甲膽堿的氣道響應曲線，支氣管肺泡灌洗(BAL)細胞計數，和右心室(RV)肥大的數據表示為算術平均±平均的標準誤差，并使用一種方式方差分析(ANOVA)(和非參數的)來進行組之間的比較，接著進行組之間的post-hoc比較(Bonferroni’s多重比較檢驗)。p＜0.05的概率值被認為是統計學上顯著的。對于氣道響應的測量，n＝10，對于BAL細胞計數，n＝6，對于RV肥大，n＝4。
結果結果顯示于表4中。菌株TD2再次顯示出對氣道反應過度的顯著效果，但是對炎癥沒有顯著效果。
結果表明乳酸產生細菌菌株TD2對患有LPS誘導的肺氣腫小鼠的氣道反應過度和右心室肥大具有有益效果，且該效果不是通過抗炎機理產生的。這些結果表明一些對PrnH具有效果的特定菌株在治療和/或預防肺機能障礙，如肺氣腫和/或COPD中是有益的。這些結果表明干酪乳桿菌菌株是合適的，尤其菌株TD2是合適的。
表4在肺氣腫LPS模型中乳酸細菌菌株對氣道反應過度、右心室肥大和炎癥的效果。
a沒有用乳酸細菌治療的LPS處理的小鼠b沒有用LPS處理的對照大鼠c用支氣管肺泡肺灌洗中存在的細胞數量來估量炎癥d將氣道反應過度的降低表示為在最高測試劑量乙酰甲膽堿
(50mg/ml)對PenH的效果*與LPS處理的對照小鼠相比較，P＜0.05實施例4含有乳酸細菌菌株的組合物食品補充組合物1.含有0.5g脫脂奶粉及0.5g半乳糖寡糖和果糖多糖的混合物且每克含有5×109cfu TD2的膠囊。劑量每天2×1g。
2.粉末，麥芽糖糊精，每克含有5×109cfu TD1和5×109cfu TD2；包裝于小袋中。劑量每天2×1g。在食用前將其溶解于水、果汁、牛奶或酸奶等中。
食品/營養組合物1.適用于患有COPD的患者的液體營養品，每125ml含有5×109熱滅活的TD1細胞。推薦劑量為每天3×125ml。
每100ml-7.5g蛋白質(乳清酪蛋白混合物，1/1)-22.5g碳水化合物(葡萄糖0.3g，乳糖2.0g，麥芽糖1.0g，蔗糖3.0g，多糖15.8g)。
-3.3g脂肪(0.5g飽和脂肪酸，1.9g單不飽和脂肪酸，0.9g多不飽和脂肪酸)-礦物質(55mg Na，110mg K，60mg Cl，155mg Ca，100mg P，15mg Mg)-微量元素(3.2mg Fe，2.4mg Zn，360μg Cu，0.66mg Mn，0.20mgF，20μg Mo，23μg Se，13μg Cr，27μg I)-維生素(維生素A 127μg RE；前β類胡蘿卜素73μg RE；0.8mg類胡蘿卜素，1.4μg維生素D，5.0μg α-TE維生素A，0.30mg硫胺素，0.32mg核黃素，3.6mg NE煙酸，1.1mg泛酸，0.35mg維生素B6，53μg葉酸，0.50μg維生素B12，8.0μg生物素，40mg維生素C)
-膽堿74mg。
2.基于牛奶的粉末；85g包裝于小袋中；待與240ml液體例如牛奶，酸奶或果汁混合；每100g粉末含有-1×1010cfu TD2-4.7g蛋白質-68.2g碳水化合物(糖25g)-24.7g脂肪-礦物質(140mg Na，570mg K，130mg Ca，400mg P，14mg Mg)。
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I.2.國際保藏機構給予的保藏號
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權利要求
1.乳酸產生細菌用于制備治療或預防患者肺機能障礙的組合物的用途，其中所述乳酸產生細菌是通過測量測試動物的提高的暫停值(PenH)來測定的對氣道變窄具有顯著有益效果的細菌。
2.根據權利要求1的用途，其中所述肺機能障礙選自慢性阻塞性肺病(COPD)，非過敏性哮喘，囊纖維化，吸入，支氣管內腫瘤，氣管內腫瘤，由于非特異性吸入的刺激物引起的肺機能障礙，肺水腫，氣管狹窄和聲帶機能障礙。
3.根據權利要求1的用途，其中所述肺機能障礙選自慢性阻塞性肺病(COPD)，吸入，由于非特異性吸入的刺激物引起的肺機能障礙，肺水腫和氣管狹窄。
4.根據之前任一項權利要求的用途，其中所述乳酸產生細菌是乳桿菌屬(Lactobacillus)或雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的。
5.根據之前任一項權利要求的用途，其中所述乳酸產生細菌是干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)種的。
6.根據之前任一項權利要求的用途，其中所述細菌是菌株LMGP-22110或源自其的任何菌株。
7.根據之前任一項權利要求的用途，其中所述組合物是藥物，食品或食品補充劑。
8.根據之前任一項權利要求的用途，其中所述組合物進一步包含至少一種具有抗炎特性的其他細菌。
9.根據之前任一項權利要求的用途，其中所述組合物進一步包含一種或多種載體和/或蛋白質，和/或碳水化合物，和/或脂類和/或抗氧化劑，且是液體，粉末，固體或膠囊形式。
10.根據之前任一項權利要求的用途，其中所述組合物適于腸內給藥。
11.根據之前任一項權利要求的用途，其中所述組合物適于鼻內給藥或吸入。
12.根據之前任一項權利要求的用途，其中以有效量給予所述組合物，所述有效量包括每天約1×106至約1×1012菌落形成單位，優選約1×107-1×1011菌落形成單位，更優選每天約1×108-5×1010菌落形成單位，最優選每天1×109-2×1010菌落形成單位或每天等量的所述細菌的不能存活的細胞。
13.用于治療或預防患者肺機能障礙的組合物，其中所述組合物包含至少一種對氣道變窄具有顯著有益效果的乳酸產生細菌，其中通過測量測試動物提高的暫停值(PenH)來測定所述的顯著有益效果。
14.根據權利要求13的組合物，其中所述肺機能障礙選自慢性阻塞性肺病(COPD)，非過敏性哮喘，囊性纖維化，吸入，支氣管內腫瘤，氣管內腫瘤，由于非特異性吸入的刺激物引起的肺機能障礙，肺水腫，氣管狹窄和聲帶機能障礙。
15.根據權利要求13的組合物，其中所述肺機能障礙選自慢性阻塞性肺病(COPD)，吸入，由于非特異性吸入的刺激物引起的肺機能障礙，肺水腫和氣管狹窄。
16.根據權利要求13-15任一項的組合物，其中所述乳酸產生細菌是乳桿菌屬或雙歧桿菌屬的。
17.根據權利要求13-16任一項的組合物，其中所述乳酸產生細菌是干酪乳桿菌種的。
18.根據權利要求13-17任一項的組合物，其中所述細菌是菌株LMGP-22110或源自其的任何菌株。
19.根據權利要求13-18任一項的組合物，進一步包含至少一種具有抗炎特性的其他細菌。
20.根據權利要求13-19任一項的組合物，進一步包含一種或多種載體和/或蛋白質和/或碳水化合物和/或脂類和/或抗氧化劑，且是液體，粉末，固體或膠囊形式。
21.細菌菌株LMG P-22110或源自其的任何菌株。
22.含有根據權利要求21的菌株的組合物。
23.根據權利要求22的組合物，選自食品，食品補充劑或藥物。
24.含有根據權利要求13-20，22或23任一項的組合物的容器。
25.制備用于治療或預防患者氣道反應過度和/或氣道阻力的組合物的方法，所述方法包括通過測量測試動物的PenH來測試乳酸產生細菌對氣道反應過度和/或提高的氣道阻力的效果，選擇對所述測試動物或人患者的氣道反應過度和/或提高的氣道阻力具有顯著有益效果的細菌菌株，使所述選定的菌株生長并將所述的生長菌株進行配制，使其變得適合給藥于患者。
26.益生菌乳酸細菌用于制備治療或預防患者慢性阻塞性肺病(COPD)的藥物的用途。
27.根據權利要求26的用途，其中所述乳酸細菌是死的或不能存活的。
全文摘要
本發明提供了活的(益生菌)乳酸產生細菌，其死的或不能存活的細菌的新用途，以及含有這些細菌的食品補充劑，營養組合物和/或藥物組合物，用于治療或預防患者的肺機能障礙。合適的乳酸產生細菌通過測量測試動物的提高的暫停值(PenH)測定的對氣道變窄具有顯著的有益效果。
文檔編號A23L1/30GK1913906SQ200480041425
公開日2007年2月14日 申請日期2004年12月16日 優先權日2003年12月17日
發明者L·穆拉比特, G·施佩爾曼斯, A·J·M·弗里塞瑪, J·加森, J·克諾爾 申請人:紐迪西亞公司