專利名稱：源自甘薯的多重脅迫誘導的過氧化物酶啟動子的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種多重脅迫誘導的啟動子，更具體地，涉及源自甘薯(Ipomoea batatas)的多重脅迫誘導的過氧化物酶啟動子，用于生產包含所述啟動子并具有增強的多重脅迫耐受性的轉基因植物的表達載體，由所述表達載體轉染的轉基因植物細胞系和植物，以及用于產生轉基因植物的方法。
背景當植物受到包括環境或來自病原菌、有害昆蟲、或病毒的生物脅迫時，作為生命的基本組分的內部的氧變成諸如超氧陰離子自由基(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基等的活性氧類別(ROS)，引起嚴重的紊亂。為了減少所述活性氧，生命體具有諸如超氧化物歧化酶(SODEC 1.15.1.1)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的大分子抗氧化劑酶，和諸如維生素C、維生素E、谷胱甘肽等的低分子量抗氧化劑物質。
過氧化物酶是一種在電子供體存在下還原過氧化氫的酶，并且大量地在植物細胞中發現。由于它對酶反應的高敏感性，過氧化物酶已被用作用于許多臨床測試的試劑。除了在工業上的重要性，由于它在植物抗外界脅迫的反應中起著重要作用，過氧化物酶還引起科學家們的關注。一般而言，植物過氧化物酶的活性由各種環境脅迫增加。具體地，由于在巨大的氧化壓力下培養細胞，植物培養細胞表現出高過氧化物酶活性。按照早先的報道，過氧化物酶在甘薯培養細胞中大量產生，其多于在任何其它植物培養細胞中產生(Phytochemistry，39，981-984，1995)。
到現在，編碼包含在一些具體的植物中的過氧化物酶的基因已在大約20種不同的植物物種中發現，諸如辣根屬(horseradish)、大麥屬、小麥屬、油菜屬、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、煙草、菠菜屬、稻屬植物、等等。近來，已經鑒定了擬南芥屬(Arabidopsis)的全堿基序列，其中73個過氧化物酶基因已被確定(Gene，288，129-138，2002)。然而，每一種單獨的過氧化物酶的功能還沒有得到解釋。本發明人首次報道了甘薯的過氧化物酶基因。具體地，本發明人已經從甘薯培養細胞中分離了3種酸性過氧化物酶基因(swpa1，swpa2，swpa3)和一種中性過氧化物酶基因(swpn1)，并且報道了那些基因在甘薯培養細胞中特異性地表達，而且發現其在基因組中的多樣性，并且還確定過氧化物酶可以由具有一些部分或完整的過氧化物酶基因的轉染的細胞或植物穩定地大量產生(Mol.Gen.Genet.，255，382-391，1997；Mol.Genet.Genet.，261，941-947，1999)。
在早先的研究中，本發明人分離了新的酸性過氧化物酶基因‘swpa4、‘swpa5、和‘swpa6’以及堿性過氧化物酶基因‘swpb1’、‘swpb2’和‘swpb3’，其堿基序列全部被公開(韓國專利申請#2003-28811；Mol.Genet.Genomics，261，941-947，2003)。Swpa4在甘薯培養細胞中強烈地表達，但是在正常植物組織中卻沒有表達。Swpa4不僅通過如病原菌(菊歐文氏菌(Pectobacterium chrysanhemi，KCTC 2569)的生物脅迫而且通過非生物脅迫進行高度表達，其中所述非生物脅迫諸如創傷、通過產生活性氧而具有除草活性的甲基木精和過氧化氫、NaCl、茉莉酮酸甲酯、脫落酸、15℃的低溫和37℃的高溫、等等。
因此，本發明人已經從甘薯分離了基因組DNA，其編碼不僅通過生物脅迫而且通過許多其它物理或化學脅迫而活躍地表達的過氧化物酶，并且通過確定所述過氧化物酶的啟動子在工業中相當有價值而完成了該發明。
發明概述本發明的一個目的是提供一種多重脅迫抗性的啟動子序列，其包括由SEQ.ID.No 2代表的堿基序列。
本發明還有一個目的是提供用于生產多重脅迫抗性的轉化子的表達載體，其包括上述啟動子序列、靶物質編碼序列和轉錄終止子序列。
本發明的另一個目的是提供多重脅迫抗性的轉基因細胞，其通過用上述表達載體轉染宿主植物細胞而制備。
本發明還有一個目的是提供多重脅迫抗性的轉基因植物，其通過使用農桿菌(Agrobacterium)用上述表達載體轉染宿主植物而制備。
本發明還有一個目的是提供用于上述多重脅迫抗性轉基因植物的制備方法。
優選實施方案詳述為了實現上述目的，本發明提供包含SEQ.ID.No 2代表的堿基序列的多重脅迫抗性啟動子序列。
本發明還提供用于產生多重脅迫抗性轉化子的表達載體，其包括上述啟動子序列、靶物質編碼序列和轉錄終止子序列。
本發明還提供多重脅迫抗性的轉基因細胞，其通過用上述表達載體轉染宿主植物細胞而制備。
本發明還提供多重脅迫抗性的轉基因植物，其通過使用農桿菌用上述表達載體轉染宿主植物而制備。
本發明還提供用于上述多重脅迫抗性轉基因植物的制備方法。
“SWPA4啟動子”是位于具有SEQ.ID.No 11代表的堿基序列的啟動子的-1～-2433區域的堿基序列，并且在需要的條件下誘導相關基因的轉錄。
“SWPA4啟動子的活性片段”是含有一些位于SEQ.ID.No 1代表的swpa4基因組基因序列的-1～-2433區的堿基序列的堿基序列，并且賦予基因與SWPA4啟動子正確連接的活性。
“轉化子”意指用DNA構建體轉染的植物培養細胞系或植物，其中DNA構建體由SWPA4啟動子和編碼相關物質的正確連接的DNA序列。
“多重脅迫”包含生物的或非生物的脅迫，例如，創傷、活性氧類別、熱、濕度、溫度、鹽、空氣污染、UV、重金屬、化學除草劑、病原菌、等等。
在下文中，對本發明進行詳細地描述。
本發明提供多重脅迫抗性的啟動子序列，其包括由SEQ.ID.No 2代表的堿基序列。
本發明的啟動子序列優選地選自由SEQ.ID.No 2～No 11代表的堿基序列組成的組。由SEQ.ID.No 11代表的啟動子序列是完整的啟動子序列，其位于轉錄起始區(ATG)前，包含在源于甘薯的由SEQ.ID.No 1代表的過氧化物酶SWPA4基因組基因中。SEQ.ID.No 2，SEQ.ID.No 3，SEQ.ID.No 4，SEQ.ID.No 5，SEQ.ID.No 6，SEQ.ID.No 7，SEQ.ID.No 8，SEQ.ID.No 9和SEQ.ID.No 10都是片段序列，分別位于-110th，-177th，-306th，-366th，-433rd，-818th，-1199th，-1467th和-1934th位點，每個自完整SWPA4啟動子序列的末端(恰好位于轉錄起始區前)。
具有SEQ.ID.No 11代表的堿基序列的全長SWPA4啟動子包含各種真核啟動子調節元件的特異區域，并且用于轉錄起始的TATA框(TATTTAA)位于-92nd～-86th位點。RSTGACTMANA，AP-1的共有序列，位于-431st和-421st之間，其中AP-1已知為轉錄調節蛋白的附著位點和與活性氧類別反應的主要元件(Lucibello，FC.等.，Oncogene，8，1667-1672，1993)。ELRE的共有序列，TTGACC(Rushton，PJ.等.，EMBO J，15，5690-5700，1996)，其表達通過由植物抗病原菌感染或創傷的防御機制產生的誘導子(elicitor)強烈地誘導，作為反向重復序列位于-2227和-2232之間以及-1329和-1334之間的區域。TAACGTA，GARE的共有序列，其表達由植物激素‘赤霉素’(GA)調節，位于-382和-376之間的區域(Sutoh，K.等.，Plant J，34，636-645，2003)。AWTTCAAA，ERE的共有序列，其表達由與果實成熟和老化相關的植物激素‘乙烯’調節，位于-192和-185之間的區域(Itzhaki，H.等.，Proc Natl Acad Sci USA，91，8925-8929，1994)。W-框，在其上附著了WRKY蛋白，該蛋白在通過水楊酸(SA)表達后在抵抗疾病中起著重要作用，以TTGAC重復位于-1993～-1989之間、和-1032～-1028之間的區域，并且還位于-2227～-2231之間和-1329～-1333之間的區域，這次作為反向重復(Yu，D.等.，Plant Cell，13，1527-1540，2001)。AGAAN，其為熱激元件(HSE)的共有序列，位于-182和-178之間的啟動子區域(Fernandes，M.等.，Nucleic Acids Res，22，167-173，1994)(見
圖1a)。
在本發明的優選實施方案中，本發明人從包含在甘薯中由SEQ.ID.No 1代表的過氧化物酶SWPA4基因組基因制備由SEQ.ID.No 2～No 11代表的啟動子序列，并制備了含有上述啟動子的表達載體。通過用上述制備的表達載體轉染煙草培養細胞還生產了含有各種大小的啟動子的轉基因煙草細胞。通過使用煙草細胞的原生質體研究啟動子的活性。結果，由SEQ.ID.No 2～No 11代表的具有不同大小的缺失啟動子片段，表現出與對照組的CaMV35S啟動子相似的或高出4.5倍(但低于8.5倍)的更高啟動子活性(見圖3a和3b)。通過使用農桿菌將含有各種大小的缺失啟動子片段的表達載體插入煙草葉片切口而生產轉基因煙草植物。然后，在切口處誘導脅迫。在誘導脅迫后研究啟動子活性。結果，GUS的活性(包含在表達載體中的靶基因)在經過病原菌、甲基紫精或引起創傷處理后增加了，至少為處理前的2倍(見表1)。因此，證明本發明由SEQ.ID.No2～No 11代表的啟動子序列具有高于任一常規啟動子的啟動子活性，并且其活性由脅迫強烈地增強。因此，本發明的啟動子序列可以有效地用于開發環境脅迫抗性植物和通過利用由此獲得的轉基因植物細胞生產有價值的物質。
本發明還提供用于生產多重脅迫抗性轉化子的表達載體，其包括上述啟動子序列、靶物質編碼序列和轉錄終止子序列。
包含在本發明的表達載體中的啟動子序列優選地選自由SEQ.ID.No2～No 11代表的堿基序列。
對于本發明的靶物質，還優選地包含具有藥用作用的各種蛋白或肽以及賦予轉化子脅迫抗性的任何其它物質。在本發明的優選實施方案中，通過將由SEQ.ID.No 2～No 11代表的啟動子的每一序列克隆到由Clontech，Co.提供的質粒載體pBI1221(CaMV35S啟動子，包括GUS編碼序列和NOS轉錄終止子序列)構建具有各種大小的缺失啟動子的表達載體。按照啟動子序列的長度，將上述制備的每一個表達載體命名為‘p2433’、‘p1934’、‘p1467’、‘p1199’、‘p818’、‘p433’、‘p366’、‘p306’、‘p177’和‘p110’。GUS用作用于本發明的表達載體的靶基因。然而，GUS可以被任何其它目標有價值物質編碼序列取代，以構建產生保持脅迫抗性的目標有價值物質的表達載體。
本發明還提供通過用上述表達載體轉染宿主植物細胞而制備的多重脅迫抗性轉基因細胞，以及通過使用農桿菌用上述表達載體轉染宿主植物而制備的多重脅迫抗性轉基因植物。
為了制備本發明的轉基因細胞和轉基因植物，所述表達載體優選地包含選自由SEQ.ID.No 2～No 11代表的序列組成的組的啟動子序列。為了生產本發明的轉基因細胞，宿主細胞優選地選自由煙草屬、諸如稻屬、甘薯等的主要農作物、和包括人參屬的藥用植物組成的組。為了生產本發明的轉基因植物，宿主植物優選地選自由煙草屬(tobacco)、諸如稻屬、甘薯等的主要農作物、和包括人參屬的藥用植物組成的組。
在本發明的優選實施方案中，使用農桿菌，將煙草(Nicotiana tabacum)的細胞用表達載體p110、p177、p306、p366、p433、p818、p1199、p1467、p1934和p2433轉染，每一個表達載體包含選自由SEQ.ID.No 2～No 11代表的序列組成的組的啟動子序列，導致制成分別表達上述表達載體的轉基因煙草細胞。在這些轉基因細胞中，用表達載體p1467轉染的一個細胞系表現出最高的啟動子活性，因此將其命名為‘p1467(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)細胞系’，并于2004年2月10日保藏在KRIBB(韓國生物科學和生物技術研究所)的KCTC(韓國典型培養物保藏中心)(保藏號KCTC10594BP)。
本發明還提供多重脅迫抗性的轉基因植物的制備方法，其包括下述步驟1)構建表達載體，其含有選自由SEQ.ID.No 2～No 11代表的堿基序列組成的組的每一啟動子序列、目標有價值物質編碼序列和轉錄終止子序列；和2)使用農桿菌用上述步驟1)的表達載體轉染宿主植物。
附圖簡述本發明優選實施方案的應用通過參考附圖而被最好地理解，其中圖1a和1b(圖1a的繼續)顯示本發明源于甘薯的基因組基因SWPA4編碼過氧化物酶的堿基序列和從其翻譯的氨基酸序列。用(-)標記的堿基序列部分是啟動子序列(圖1a)，用堿基序列和氨基酸序列一起標記的部分是外顯子以及只用堿基序列標記的部分為內含子(圖1b)。
圖2是顯示本發明的基因組基因SWPA4編碼過氧化物酶和用于產生包含缺失啟動子的缺失突變體的表達載體的結構的示意圖。E1、E2和E3是外顯子，以及I1和I2是內含子。
圖3a是顯示使用缺失不同的啟動子區域的缺失突變體(p2433，p1934，p1467，p1199，p818，p433)對啟動子活性進行研究的結果的圖表。
圖3b是顯示使用缺失不同的啟動子區域的缺失突變體(p433，p366，p306，p177，p110)對啟動子活性進行研究的結果的圖表。測量CsMV 35S的啟動子活性在圖3a和圖3b中作為對照。
實施例本發明的實用的和目前優選的實施方案如下述實施例中所示進行舉例說明。
然而，應該理解，考慮到該公開內容，本領域的技術人員可以在本發明的精神和范圍內進行修飾和改進。
實施例1甘薯源性的過氧化物酶基因組DNA SWPA4的分離和對其堿基序列的分析通過使用GenomWalker試劑盒(Clontech)按照制造者的用法說明分離甘薯源性的過氧化物酶基因SWPA4的基因組DNA。將通過常規方法提取的2.5μg的甘薯基因組DNA用限制性內切酶EcoRV、DraI、PvuII、SspI等進行消化。將消化的基因組DNA用酚/氯仿/乙醇進行純化。通過使用連接酶將純化的基因組DNA與試劑盒提供的銜接子連接構建GenomWalker文庫。基于該文庫，通過PCR獲得SWPA4基因組DNA。PCR用SEQ.ID.No 12代表的GSP1引物和SEQ.ID.No 13代表的銜接子引物AP1，通過使用上述基因組DNA作模板而進行，其中GSP1引物是基于關于SWPA4 cDNA的5’-端堿基序列的信息而建立的，銜接子引物AP1由上述試劑盒提供。PCR反應在94℃25秒和72℃4分鐘進行誘導，重復7次，并且進一步在94℃25秒和67℃4分鐘，重復32次。PCR后，進行電泳以確定一些產物。將初級PCR產物稀釋50倍后，PCR用SEQ.ID.No 14代表的GSP2引物和SEQ.ID.No 15代表的銜接子引物AP2而再一次進行，其中GSP2引物基于關于甘薯源性的過氧化物酶SWPA4 cDNA的5’-端堿基序列的信息而制備(韓國專利申請#2003-28811)，銜接子引物AP2由試劑盒提供。PCR條件如下在94℃25秒和在72℃4分鐘(5個循環)，在94℃25秒和67℃4分鐘(22個循環)。然后，進行電泳以確定PCR產物。將所述PCR產物克隆到pGEM-T Easy載體(Promega)，并且研究堿基序列。SWPA4基因的外顯子區通過使用SEQ.ID.No 16代表的引物和SEQ.ID.No 13代表的銜接子引物AP1進行擴增，同樣地，SWPA4基因的內含子區通過使用SEQ.ID.No 17代表的引物和SEQ.ID.No 15代表的銜接子引物AP2進行擴增。
按照如上所述相同的方法，將擴增的PCR產物克隆到pGEM-T Easy載體，并且確定堿基序列，以便獲得由SEQ.ID.No 1代表的基因組基因的序列(圖1a和1b)，并且命名為‘SWPA4’。從甘薯基因組分離的SWPA4全長為3945bp，并且由3個外顯子、2個內含子和2433bp長的啟動子組成。確定所述基因組基因的外顯子的堿基序列與SWPA4 cDNA的堿基序列一致(韓國專利申請#2003-28811)，并且每個內含子的5’起始于GT和其3’終止于AG，表明其遵守GT-AG法則(圖1a，1b和圖2)。
實施例2過氧化物酶基因組DNA SWPA4的啟動子活性研究野生型SWPA4的啟動子由SEQ.ID.No 11代表的堿基序列組成，其在從過氧化物酶SWPA4基因組DNA的翻譯起始點的上游到-2433bp點的范圍內(圖1a和1b)。SWPA4啟動子堿基序列的特征通過使用由計算生物學和信息學實驗室(Computational Biology & Informatics Laboratory)提供的PLACE和Transfac進行研究。
結果，確定SWPA4啟動子具有各種真核啟動子的調節元件，并且用于翻譯起始的TATA-框位于-92～-86之間(Zhu，Q.等.，Plant Cell，14，795-803，2002)。RSTGACTMANA(Lucibello，FC.等.，Oncogene，8，1667-1672，1993)，AP1的共有序列，其已知為與活性氧反應的相關因子并且轉錄調節蛋白附著在其上，位于-431～-421之間。TTGACC(Rushton，PJ.等.，EMBO J，15，5690-5700，1996)，ELRE的共有序列，其通過植物中抗微生物感染或創傷的防御機制產生的誘導子強烈地誘導基因表達，被發現作為反向重復序列位于-2227～-2232之間，和-1329～-1334之間。TAACGTA(Sutoh，K.等.，Plant J，34，636-645，2003)，GARE的共有序列，其表達由植物中的一種植物激素赤霉素(GA)調節，位于-382～-376之間。AWTTCAAA(Itzhaki，H.等.，Proc Natl Acad Sci USA，91，8925-8929，1994)，ERE的共有序列，其表達由一種植物激素-乙烯調節，位于-192～-185之間，所述植物激素-乙烯與植物的成熟和老化有關。W-框(Yu，D.等.，PlantCell，13，1527-1540，2001)，在其上附著了WRKY蛋白，該蛋白通過水楊酸(SA)表達，在抵抗疾病中起著重要作用，以TTGAC重復位于-1993和-1989之間與-1032和-1028之間的兩個區域，并且作為反向重復序列位于-2227和-2231之間與-1329和-1333之間的另外兩個區域。AGAAN(Fernandes，M.等.，Nucleic Acids Res，22，167-173，1994)，應答于熱激反應的HSE(熱激元件)的共有序列，位于啟動子-182和-178之間(圖1a)。
如上文所解釋，本發明的SWPA4啟動子包含許多識別包括ROS的各種脅迫的重要因子，以致其可以有效地用于開發抵抗環境脅迫的脅迫抗性植物。
實施例3SWPA4啟動子的缺失突變體的制備<3-1>2433bp～433bp長的啟動子的缺失突變體的制備為了制備本發明的SWPA4啟動子的缺失突變體，將SWPA4啟動子區通過PCR進行擴增，其使用ExTaq聚合酶(Takara)和序列特異性引物。此時，SEQ.ID.No 18和No 24代表的引物用于擴增2433bp長的啟動子，SEQ.ID.No 19和No 24代表的引物用于擴增1934bp長的啟動子，SEQ.ID.No 20和No 24代表的引物用于擴增1467bp長的啟動子，SEQ.ID.No21和No 24代表的引物用于擴增1199bp長的啟動子，SEQ.ID.No 22和No 24代表的引物用于擴增818bp長的啟動子，以及SEQ.ID.No 23和No 24代表的引物用于擴增433bp長的啟動子。將所有上游引物(SEQ.ID.No 18-No 23)制備成包含HindIII限制性內切酶區域，并且將下游引物(SEQ.ID.No 24)制備成包含XbaI限制性內切酶區域(圖2)。
將PCR產物用限制性內切酶HindIII/XbaI消化后，將DNA片段亞克隆到已經用相同的限制性內切酶消化的pBI221質粒載體中(Clontech，CaMV35S啟動子，包括GUS編碼序列和NOS轉錄終止子)。最后，制備了不同長度的缺失突變質粒載體，其每一個都具有SWPA4啟動子的不同缺失構建體(-2433，-1934，-1467，-1199，-818，和-433)，并且命名為‘p2433’，‘p1934’，‘p1467’，‘p1199’，‘p818’和‘p433’。
<3-2>少于433bp的啟動子缺失突變體的制備為了制備具有少于433bp的啟動子的缺失突變體，將-433bp長的DNA片段通過PCR進行擴增，其使用ExTaq聚合酶(Takara)和序列特異性引物，導致長度分別為433，366，306，177和110bp的缺失啟動子片段。此時，SEQ.ID.No 25和No 24代表的引物用于擴增366bp長的啟動子，SEQ.ID.No 26和No 24代表的引物用于擴增177bp長的啟動子，SEQ.ID.No 28和No 24代表的引物用于擴增110bp長的啟動子。將所有上游引物(SEQ.ID.No 25-No 28)設計成具有PstI限制性內切酶區域。
實施例4使用煙草原生質體研究SWPA4啟動子活性(瞬時測定)通過利用SWPA4啟動子的缺失突變體，按照缺失啟動子的長度，研究所述啟動子的活性。首先，將煙草培養細胞系BY-2(Nicotiana tabacum L.cv.Bright yellow 2)進行傳代培養。培養開始后3天，將細胞離心，以僅僅獲得細胞膜，然后將其用酶溶液(30ml，1％纖維素酶R-10，0.25％marcerozyme R-10，60mg MES，30mg BSA，400mM甘露糖醇，1mMCaCl2，蒸餾水28ml)處理3小時。將原生質體通過離心分離。將分離出的原生質體用W5溶液(154mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl，5mM葡萄糖，1.5mM MES-KOH，pH 5.0)洗滌2次，并且將終細胞濃度在MaMg溶液中(0.4M甘露糖醇，0.1％MES，15mM MgCl2，pH 5.6)調節到2×106個細胞/ml。將5μg熒光素酶表達載體(將Luc編碼區插入pBI221以作內部控制，Clontech)、300μl原生質體溶液和300μl PEG溶液(40％PEG 3350，100mM Ca(NO3)2，400mM甘露糖醇)全部與10μg每種<實施例4>中制備的缺失突變體質粒載體DNA混合，將其在室溫放置30分鐘。將所述混合物通過離心用W5溶液洗滌，并懸浮在300μl W5溶液中，接著在25℃繼續培養16小時。一完成培養，將細胞收集下來以研究熒光素酶和GUS的活性。具體地，熒光素酶的活性通過使用Promega提供的熒光素酶測定試劑盒進行研究，和通過測量產生的GUS蛋白的量研究GUS啟動子在插入缺失突變體質粒載體的原生質體中的活性，其按照Jefferson等使用MUG作為底物檢驗熒光的方法(Jefferson等，Plant Mol.Biol.，5，387-405，1987)進行。還通過同時測量插入到原生質體的熒光素酶的活性研究了質粒插入原生質體的效率。
結果，-2433SWPA4啟動子表現出比CaMV35S啟動子高約5.3倍的活性。與對照相比，-1934和-1467啟動子表現出約8.5倍更高的活性和-1199啟動子表現出約7.5倍，-818啟動子表現出約5.1倍，和-433啟動子表現出約4.8倍更高的活性(圖3a)。基于該結果，可以設想抑制表達的轉錄因子結合區位于-2433和-1934之間，并且促進表達的轉錄因子結合區位于表現出最高活性的-1467和活性開始下降的轉折點-818之間。將具有比CaMV35S啟動子更高的活性的-433啟動子重新制備成更短的缺失結構，然后研究其活性。結果，所述更短的缺失突變體的活性減少了并且在-177達到與CaMV35S啟動子活性相似的水平。因此，可以保持比CaMV35S更高的SWPA4活性的最小啟動子長度為301bp，并且相信誘導強SWPA4活性的轉錄調節因子的結合區位于-306和-177之間(圖3b)。
實施例5關于GUS基因在轉基因植物中通過使用SWPA4啟動子的表達的分析<5-1>轉基因植物的制備將煙草植物(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)用作制備轉基因植物的材料。只將包含SWPA4啟動子缺失突變體的質粒載體p2433、p1467和p433的啟動子區用HindIII和XbaI消化，將其插入到預先用相同的限制性內切酶消化而獲得的pBI121(Clontech)中，制成植物表達載體。將CaMV35S啟動子插入作為對照。通過使用根癌農桿菌LBA4404(Agrobacteriumtumefaciens LBA4404)(ATCC)將上述制備的每一種載體插入到農桿菌中，然后，用其感染煙草葉片片段。將感染的葉片片段在含有200mg/l卡那霉素和300mg/l claforan的MS培養基中培養(Murashige T和Skoog F，Physiol Plant，15，473-497，1962)。然后，選擇轉基因植物，將其通過生根和發芽使其適應水土。將該植物移植在小花盆中并且可以用作測試材料。
為了確定SWPA4啟動子缺失突變體是否正確地插入到轉基因植物中，進行了PCR，其使用1對由SEQ.ID.No 29和No 30代表的NPTII引物以及1對由SEQ.ID.No 23和No 24代表的用于擴增433bp啟動子的引物。當使用1對NPTII引物時，PCR在95℃1分鐘，在65℃1分鐘和在72℃1分鐘(30個循環)進行。當使用用于擴增433bp啟動子的1對引物時，PCR在95℃1分鐘，在62℃1分鐘和在72℃1分鐘(30個循環)進行。PCR之后在瓊脂糖上進行電泳以確定PCR產物。
結果，在轉基因植物中檢測到由NPTII引物對擴增的0.7kb DNA片段和由用于擴增433bp啟動子的引物對擴增的433bp DNA片段。因此，確定外來基因成功地插入到轉基因植物中。
<5-2>通過脅迫研究GUS存轉基因植物中的表達為了研究轉基因植物中SWPA4啟動子經環境脅迫的表達，將所述轉基因植物用甲基紫精(下文中稱為‘MV’)和病原菌處理，并且還將之損傷以測量由此誘導的GUS活性。
首先，研究了由創傷引起的SWPA4啟動子的表達。具體地，將轉基因植物損傷，然后測量由此誘導的GUS活性。此時，認為在CaMV35S啟動子植物中的GUS活性為100％，在SWP44啟動子轉基因植物中的GUS活性用相對活性代表。結果，當將其中插入含有CaMV35S啟動子-GUS基因的pBI121載體的轉基因植物不用任何物質處理時(意為‘對照’)，GUS活性(pmol/分鐘/mg蛋白)為7,200±135，其幾乎不被如創傷的脅迫改變。在分別插入p2433、p1467和p433載體的轉基因植物的情形下，創傷后3天GUS的表達極大地提高了。GUS在用p1467載體感染的轉基因植物中通過創傷誘導的表達，比在CaMV35啟動子中的表達高2.5倍。GUS在用p2433載體感染的轉基因植物中通過創傷誘導的表達，不能與CaMV35S啟動子中的表達相競爭，但是GUS在用p433感染的轉基因植物中的表達同在CaMV35S啟動子中的表達一樣多(表1)。因此，可以確定啟動子活性可以被創傷誘導。
還研究了SWPA4啟動子通過MV誘導的表達。具體地，從成熟的葉片上取直徑為7mm的葉片圓盤。將20個圓盤分別漂浮在含有3μM MV溶液的培養皿中，將其在25℃在黑暗中培養12小時，然后又在光照下培養。一完成培養，測量GUS活性以研究SWPA4啟動子通過MV誘導的表達。結果，光照培養12小時后，所述啟動子的表達在SWPA4缺失啟動子植物中受到強烈地誘導。GUS在用p1467載體感染的轉基因植物中的表達，比在CaMV35S啟動子中的表達高2.5倍。并且，與在CaMV35S啟動子中的表達相比，GUS在用p2433和p433感染的轉基因植物中的表達分別提高1.8倍和2.1倍(表1)。
另外，用在煙草植物中引起猛烈的疾病(wild fire disease)的病原菌(Pseudomonas syringae cv.Tabaci)感染轉基因煙草植物，該轉基因煙草植物中插入過氧化物酶基因組基因SWPA4啟動子的缺失突變體。48小時后，測量誘導的GUS活性。結果，與在CaMV35S啟動子中的表達相比，GUS在用p2433、p1467和p433感染的轉基因植物中的表達分別提高2.2倍、2.7倍和2.0倍(表1)。因此，與對照中的活性相比，在所有3種轉基因植物的情形中GUS的活性極大地增加了。
<表1>
在轉基因煙草植物中通過創傷、甲基紫精(MV)處理和病原菌(Pseudomonas syringae cv.tabaci)處理引起的GUS活性變化
考慮上述所有結果，確定SWPA4啟動子的活性由非生物的或生物的脅迫高度誘導。因此，本發明的SWPA4啟動子可以有效地用于開發工業的多重脅迫抗性的轉基因植物。
實施例6通過使用SWPA4啟動子研究GUS在轉基因植物細胞中的表達
<6-1>轉基因培養細胞的制備為了產生轉基因培養細胞，將其中插入外來基因的轉基因煙草植物的葉片在愈傷組織誘導培養基(callus-inducing medium)中培養，所述愈傷組織誘導培養基通過添加0.1mg/l BAP、2mg/l NAA和30g/l蔗糖到MS基礎培養基中而制備，并且通過常規步驟在其上誘導愈傷組織。具體地，使用分別用轉化載體p2433、p1934、p1467、p1199、p818、p433、p366、p306、p177和p110感染的轉基因煙草葉片誘導愈傷組織。在這些愈傷組織中，用p1467(-1467缺失啟動子)載體感染的愈傷組織表現出最高的啟動子活性，將其命名為‘p1467(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)細胞系’，并于2004年2月10日保藏在韓國生物科學和生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型培養物保藏中心(KCTC)(保藏號KCTC 10594BP)。
<6-2>轉基因愈傷組織中啟動子活性的研究為了研究本發明SWPA4啟動子的表達可以怎樣影響或調節培養細胞增殖，測量了分別用p2433、p1467、p433和pBI121感染的轉基因植物中誘導的轉基因愈傷組織中的GUS活性。GUS活性的測量按照上述相同的步驟進行。
結果，含有SWPA4啟動子的植物培養細胞的GUS活性(pmol/分鐘/mg蛋白)為12,000±250，該值是相對含有CaMV 35S啟動子的培養細胞的GUS活性的百分比(％)。所有GUS活性在轉基因愈傷組織中都高于在具有CaMV 35S啟動子的細胞中，并且特別地，用p1467感染的愈傷組織表現出比具有CaMV 35S啟動子的愈傷組織高約4.7倍的活性。分別用p2433和p433感染的愈傷組織，分別表現出比對照高3.1倍和2.5倍的活性(表2)。因此，證明SWPA4啟動子可以有效用于開發可用于生產高價值(high-value)蛋白的工業轉基因培養細胞系。
<表2>
轉基因煙草培養細胞(愈傷組織)的GUS活性。
工業適用性如在上文中所解釋的，過氧化物酶基因組基因SWPA4的啟動子包括許多特異性識別大量環境脅迫的區域，并且具有比CaMV 35S啟動子高至少8倍的啟動子活性，所述CaMV 35S啟動子廣泛地用于誘導轉基因植物中靶基因的表達。因此，其中插入了本發明的啟動子的植物或植物培養細胞的應用促進環境脅迫抗性植物的開發以及大量生產有價值的物質的轉基因生物體的開發。
本領域的技術人員應該理解在前述描述中公開的構思和具體實施方案可以容易地被用作用于修飾或設計實施本發明相同目的的其它實施方案的基礎。本領域的技術人員還應該理解所述等價的實施方案并不背離如在附加權利要求中提出本發明的精神和范圍。
用于專利程序的國際承認的微生物保藏布達佩斯條約國際表格微生物保藏證明按照細則Rule 7.1發行致郭尚洙韓國生物科學和生物技術研究所(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yuseong-gu，Daejeon，305-333，韓國
序列表<110>韓國生命工學研究院<120>源自甘薯的多重脅迫誘導的過氧化物酶啟動子<130>4fpo-02-03<160>30<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>1512<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<400>1atggcttcct ttgtcactcg gctcagcctg gcccttagct tcatcgccct agccctagct 60ggcttctcca tttaccagaa tacccataca gccatgaaag ggcagcttaa gctcacccca 120aagtggctgc tagacaacac tctagagtcg tcagtggccg acgtgctctc actacgccta 180ggcatctcct ccggcaagct ttccgacgaa gactgcatat tctccgccgt taaggaagtg 240gtggacgccg ccattgatgc agaaacccgc atgggtgctt ccctcattcg cctcttcttc 300catgactgct ttgttgatgt acgtacgcta attttgtacg atgatgtttt tttttttttt 360tttttttttc ccactgcatt atattaggaa attaaacaga ttgaaatgtg tgttattaat 420gtattatctg cagggttgtg acgcaggtct tctactaaac gatacaccta ctttcaccgg 480agaacagacc gccggcggca ataataactc agtcagaggt tttgaggtga tacaacaagc 540taaagagaat gtgataacca aatgtcccta catacaagta tcttgtgccg acatcttatc 600cattgctgcc cgtgattctt tccagagagt aagtccattt atttctaaag gttgaaatta 660ataagaacaa gaatccaaac aaataacaga cagtaaaaaa aaaagattta tgtggtttga 720caatatgttg aaattgtttt tatatttaat gactagtatt tatgcattat atttatatgc 780aactctaaac atgcagttta ctggagaaac gtacaccgtg actctgggaa gactcgatgc 840aagaacggcg aaccttaccg gagctaacac ccaactcgtc ggaccaaacg aggaattggc 900atcgcaagtc gagaaatttg cggcgaaagg gttctccgaa acggagctag tcgccttgtt 960aggtgttcac acggttgggt tttcgagatg tccgctttta tgcgttccca ttttcatcaa 1020tcccgcccgg gcctccacgc tgcaatgcaa ctgtccggtg agtcccgacg acaccgggct 1080ggtgggcctg gaccccactc cgttgacgtg ggaccaaagt ttttactccg acgtggctaa 1140
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<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSP1啟動子<400>12ctgagccgag tgacaaagga agccat 26<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AP1啟動子<400>13gtaatacgac tcactatagg gc 22<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSP2啟動子<400>14cacagcaaag gaagtatgaa gaagc 25<210>15<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AP2啟動子<400>15actatagggc acgcgtggt 19<210>16<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>外顯子啟動子
<400>16atggcttcct ttgtcactcg gctcag 26<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>內含子啟動子<400>17tcatcagctc gaccactcat ttcttcttca 30<210>18<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-2433缺失啟動子的上游啟動子<400>18gccaagcttg gtcctcatgg agtattctca taact35<210>19<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-1934缺失啟動子的上游引物<400>19gccaagcttt tgccatctca ccacttcgtc tta 33<210>20<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-1467缺失啟動子的上游引物<400>20gccaagcttg gctgtccgga attctgtctc t31
<210>21<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-1199缺失啟動子的上游引物<400>21gccaagctta tgcagggtga aagtaagatt gaa 33<210>22<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-818缺失啟動子的上游引物<400>22gccaagcttg cttcacgcac tcaact 26<210>23<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-433缺失啟動子的上游引物<400>23gccaagctta tggtgactta aagggctgaa tcc 33<210>24<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-2433，1934，1467，1199，818，433，366，306，177和110缺失啟動子的下游引物<400>24tcctctagag atgatgatta tcacagcaaa ggaa 34<210>25<211>31<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>-366缺失啟動子的上游引物<400>25ttcctgcaga tagtataatg aaataaagtt a31<210>26<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-306缺失啟動子的上游引物<400>26tttctgcagt aaggtgtttt atcgtg 26<210>27<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-177缺失啟動子的上游引物<400>27ttcctgcaga aattaaatct cagtt 25<210>28<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-110缺失啟動子的上游引物<400>28ttcctgcagt ttccctttca agtt24<210>29<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NPTII的上游引物<400>29gaggctattc ggctagatg 19
<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NPTII的下游引物<400>30atcgggagcg gcgataccgt a2權利要求
1.一種多重脅迫抗性啟動子序列或包含由SEQ.ID.No 2代表的堿基序列的啟動子序列，其用于生產可以大量生產有價值物質的轉化子。
2.權利要求1中提出的啟動子序列，其中所述啟動子序列選自由SEQ.ID.No 2～No 11代表的堿基序列組成的組。
3.一種表達載體，其用于大量生產多重脅迫抗性物質或其它有價值物質，其中依次包含選自由SEQ.ID.No 2～No 11代表的堿基序列組成的組的啟動子序列、目標有價值物質的編碼序列和終止子序列。
4.轉基因細胞，其用于大量生產多重脅迫抗性物質或其它有價值物質，其通過用權利要求3的表達載體轉染宿主植物細胞而制備。
5.權利要求4中提出的轉基因細胞，其中所述宿主植物細胞是選自由煙草屬、諸如稻屬、甘薯等主要農作物和包括人參屬的藥用植物組成的組的植物的細胞。
6.權利要求4或權利要求5中提出的轉基因細胞，其中所述細胞通過用含有SEQ.ID.No 9代表的堿基序列的表達載體轉染煙草細胞而制備(保藏號KCTC 10594BP)。
7.一種轉基因植物，其用于大量生產多重脅迫抗性物質或其它有價值物質，其通過使用農桿菌(Agrobacterium)用權利要求3的表達載體轉染宿主植物而制備。
8.權利要求7中提出的轉基因植物，其中所述脅迫選自由創傷、甲基紫精、過氧化氫、NaCl、茉莉酮酸甲酯、脫落酸、非生物脅迫(≤15℃或≥37℃)和病原菌(Pectobacterium chrysanhemi)組成的組。
9.一種制備用于大量生產多重脅迫抗性物質或其它有價值物質的轉基因植物的方法，其包括下述步驟1)構建表達載體，其含有選自由SEQ.ID.No 2～No 11代表的堿基序列組成的組的每一個啟動子序列、目標有價值物質的編碼序列和轉錄終止子序列；和2)使用農桿菌用上述步驟1)的表達載體轉染宿主植物。
全文摘要
本發明涉及多重脅迫誘導性啟動子，更具體地，涉及源于甘薯(Ipomoea batatas)的多重脅迫誘導的過氧化物酶啟動子，用于生產含有所述啟動子并具有增強的多重脅迫耐受性的轉基因植物的表達載體，由所述表達載體轉導的轉基因植物細胞和植物，以及用于產生所述轉基因植物的方法。本發明的啟動子將在生物工藝上用于開發具有增強的多重脅迫耐受性的工業轉基因植物以及植物細胞系，以生產有用的蛋白。
文檔編號C12N15/53GK1922312SQ200480042027
公開日2007年2月28日 申請日期2004年2月24日 優先權日2004年2月24日
發明者郭尚洙, 權錫胤, 李幸順, 柳善花 申請人:韓國生命工學研究院