真核細胞轉染的培養裝置和方法

專利名稱：真核細胞轉染的培養裝置和方法
技術領域：
在一個實施方案中，本發明涉及真核細胞轉染裝置。在另一個實施方案中，本發明涉及用于轉染裝置的細胞轉染試劑盒和制劑。還描述了使用轉染裝置進行細胞轉染的方法。
背景技術：
基因轉染方法可用于將核酸導入細胞中，還可用于研究基因調節和基因功能。高通量分析尤其有用，它可用于篩選多組DNA，以鑒定編碼具有所關注性質的產物的DNA。基因轉染是將在生物學上具有功能的核酸以核酸在細胞中保持其功能的方式送遞和導入細胞中，如真核細胞中。基因轉染廣泛應用于涉及基因調節、基因功能、分子治療、信號傳導、藥物篩選和基因治療的研究。隨著對高等生物基因的克隆和分類的進行，研究人員設法揭示基因功能并鑒定具有所需要的性質的基因產物。對基因序列日漸增長的收集需要開發表征基因產物和分析基因功能的系統的和高通量的方法，細胞和分子生物學研究的其它領域也是如此。
病毒基因載體和非病毒基因載體可用于基因送遞。病毒載體表現出較非病毒載體更高的轉染率，但是病毒載體的安全性妨礙了其可用性(Verma I.M and Somia N.Nature 389(1997)，pp.239-242；Marhsall E.Science 286(2000)，pp.2244-2245)。盡管非病毒轉染系統未表現出病毒載體的有效性，但由于非病毒載體與病毒載體相比其理論安全性較高，所以它們還是受到高度的關注。另外，病毒載體的制備是一個復雜而昂貴的過程，這限制了病毒載體的體外應用。與病毒載體的制備相比，非病毒載體的制備更為簡單并且費用效益更高，這使得合成基因載體成為體外研究中的理想轉染試劑。
大部分非病毒載體會模仿病毒進入細胞的重要特征以越過細胞障礙，該細胞障礙意味著防止外源基因物質的滲入。以基因載體骨架為基礎的非病毒基因載體可被分為a)脂質體/DNA復合物(lipoplex)、b)聚合物/DNA復合物(polyplex)和c)脂質體/聚合物/DNA復合物(lipopolyplex)。脂質體/DNA復合物是核酸和脂質組分的集合，通常為陽離子性的。采用脂質體/DNA復合物的基因轉染被稱為脂質轉染。聚合物/DNA復合物是核酸和陽離子性聚合物的復合物。脂質體/聚合物/DNA復合物包含脂質和聚合物組分。通常上述這些DNA復合物被進一步修飾，包含細胞靶向部分或細胞內靶向部分和/或膜不穩定組分，例如病毒蛋白、肽或破膜性合成肽。近來，細菌和噬菌體也被描述作為穿梭載體用于將核酸轉化到細胞中。
大部分非病毒轉染試劑為合成的陽離子性分子，并被報道通過陽離子上的陽離子位點和核酸上的陰離子位點的相互作用“包被”核酸。帶正電的DNA-陽離子性分子復合物與帶負電的細胞膜相互作用，有助于DNA通過非特異性胞吞作用穿過細胞膜(Schofield，Brit.Microencapsulated.Bull，51(1)56-71(1995))。在大部分常規基因轉染方法中，細胞在轉染前16到24h先接種到細胞培養裝置上。通常在單獨的試管中制備轉染試劑(如陽離子性聚合物載體)和DNA，并將每種溶液分別在培養基(不含胎牛血清和抗生素)中稀釋。然后在連續振蕩混合物的條件下小心緩慢地將一種溶液加入另外一種溶液中以混合溶液。然后將混合物在室溫下培養15-45分鐘，使得形成轉染試劑-DNA復合物。轉染前，除去細胞培養基，然后用緩沖液洗滌細胞以除去殘留的血清和抗生素。將含DNA-轉染試劑復合物的溶液加至細胞并將細胞培養約3-4小時。然后用新鮮培養基換掉含轉染試劑的培養基。最后在一個或多個具體時間點分析細胞。這顯然是一個耗費時間的方法，特別是當有待轉染的樣本數非常大時。
在常規轉染方法中存在幾個主要問題。第一，常規方法耗費時間，特別是當在轉染實驗中要用到很多細胞或基因樣本時。還有，由于所必需的步驟數，常規轉染方法所得到的結果難以重復。例如，在生產DNA轉染試劑中，復合物的形成受到如下因素的影響核酸和試劑的濃度和體積、pH、溫度、所使用的緩沖液類型、渦旋時間和速度、培養時間以及其它因素。盡管可采用相同試劑和方法，但是還是可能獲得不同的結果。多步法所獲得的結果通常受到在每一步的人為的或機械的錯誤或者其它偏差的影響。另外，轉染后更換細胞培養液打擾了細胞，可能會使它們脫離培養它們的表面，由此導致最終結果的偏差以及不可預見性。由于所提及的全部因素，常規轉染方法要求高度熟練的人員來進行轉染實驗或分析。
Sabatini(U.S.2002/0006664A1)描述了含混合物并放置在載玻片上的DNA。然而，該系統只能轉染事先放置的DNA。
美國專利申請No.10/341,059(通過援引納入本文)描述了一種細胞培養/轉染裝置，在其上的轉染由脂質體聚合物介導。申請號10/341,059的某些方法可用于本文所描述的轉染制劑。
本發明的一方面公開了一種減少轉染分析的費用的細胞培養/轉染裝置。以簡單的方法完成了使用目的分子進行的轉染。
如上所述，常規轉染是一個耗時并且技術復雜的方法。一般而言，需要三個步驟1)將細胞接種到細胞培養板或培養皿并培養，一直到獲得充分的匯合度；2)制備轉染試劑/核酸復合物；3)加入目的核酸和轉染試劑并再進行培養。需要兩次培養過程，并且一般需要兩天以上的時間完成所有步驟。相反地，本發明的實施方案提供了只需要一次培養的簡單方法。事先包被有轉染試劑的細胞培養裝置可通過連續加入目的核酸和細胞培養物進行轉染。然后將所轉染的細胞在該裝置中培養。因此，可在細胞培養裝置上轉染和培養細胞，無須在轉染之后立即對細胞進行進一步操作。轉染率與常規轉染相當。因此，本發明提供了一種簡易轉染方法，并且減少轉染方法所需時間1天多。可以高效率地轉染大量細胞。

發明內容
某些實施方案涉及用于轉染真核細胞的多孔板，其中在至少一些孔的底部至少部分包被有含金屬鹽的組合物。在優選的實施方案中，金屬鹽為鈣鹽。在更為優選的實施方案中，鈣鹽為氯化鈣或乙酸鈣。
在一些優選的實施方案中，多孔板包括基質復合物。優選地，含金屬鹽的組合物保留在多孔板上。更為優選地，組合物保留在具有基質復合物的多孔板上。在更為優選的實施方案中，基質復合物選自蛋白、糖蛋白、肽、多糖和聚合物及其組合。在一些優選的實施方案中，蛋白為明膠、膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白或牛血清白蛋白或其組合。在優選的實施方案中，聚合物選自水凝膠、可生物降解的聚合物以及生物相容性物質。
本發明的某些實施方案涉及一種轉染真核細胞、包括固體表面的細胞培養/轉染裝置，其中所述固體表面為凝膠基質中的氯化鈣所包被。在優選的實施方案中，該表面可為連續表面、培養瓶、培養皿、試管、多孔板、載玻片或植入裝置。在優選的實施方案中，該固體表面是玻璃、聚苯乙烯或環氧樹脂。在最優選的實施方案中，該固體表面為載玻片或多孔板。
本發明的某些實施方案涉及一種試劑盒，該試劑盒包括含有固體表面用于轉染真核細胞的上述細胞轉染裝置(其中，固體表面為凝膠基質中的氯化鈣所包被)、有待轉染的真核細胞以及用于轉染的核酸。在優選的實施方案中，真核細胞為哺乳動物細胞。優選地，真核細胞可為分裂細胞或非分裂細胞。優選地，真核細胞為轉化細胞或原代細胞。優選地，真核細胞為體細胞或干細胞。在一些優選的實施方案中，真核細胞為植物細胞。在另一些優選的實施方案中，真核細胞為昆蟲細胞。
在優選的實施方案中，試劑盒包括至少一種核酸，它選自DNA、RNA、DNA/RNA雜合體(hybrid)或經化學修飾的核酸。更為優選地，經化學修飾的核酸包括肽核酸。更為優選地，DNA為環狀、線性或單鏈寡核苷酸。更優選地，RNA為單鏈的或雙鏈的。更為優選地，該單鏈RNA為核酶。更優選地，該雙鏈RNA為siRNA。
本發明的某些實施方案涉及轉染真核細胞的方法，包括如下步驟提供至少部分為含金屬鹽的組合物所包被的固體表面，加入需要被導入固體表面上的真核細胞中的至少一種核酸或至少一種多肽，并且以充分的細胞密度以及在將核酸或多肽導入真核細胞的合適條件下將真核細胞接種到固體表面。優選地，該表面選自培養瓶、培養皿、試管、連續表面、多孔板、載玻片以及植入裝置。優選地，該固體表面為玻璃、聚苯乙烯或環氧樹脂。
在優選的實施方案中，金屬鹽為鈣鹽。更優選地，該鈣鹽為氯化鈣或乙酸鈣。
在優選的實施方案中，含金屬鹽的組合物還包括基質復合物。優選地，該組合物保留在固體表面上。更優選地，該組合物保留在具有基質復合物的固體表面上。在更為優選的實施方案中，該基質復合物選自蛋白、糖蛋白、肽、多糖和聚合物或其組合。更優選地，蛋白選自明膠、膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白和牛血清白蛋白或其組合。最優選地，聚合物選自水凝膠、可生物降解聚合物和生物相容性物質。
在更為優選的實施方案中，該固體表面為載玻片或多孔板。
在優選的實施方案中，真核細胞為哺乳動物細胞。在優選的實施方案中，真核細胞為分裂細胞或非分裂細胞。在優選的實施方案中，真核細胞為轉化細胞或原代細胞。在優選的實施方案中，真核細胞為體細胞或干細胞。更優選地，真核細胞為植物細胞。在另一更優選的實施方案中，真核細胞為昆蟲細胞。
在所述方法的優選的實施方案中，加入至少一種核酸，它選自DNA、RNA、DNA/RNA雜合體和經化學修飾的核酸。更優選地，經化學修飾的核酸包括肽核酸。更優選地，DNA為環狀、線性或單鏈寡核苷酸。更優選地，RNA為單鏈的或雙鏈的。在一個最優選的實施方案中，單鏈RNA為核酶。在另一最為優選的實施方案中，雙鏈RNA為siRNA。
本發明的某些實施方案涉及檢測生物分子能否進入細胞的方法，它包括如下步驟(a)提供為聚合物或脂質所包被的固體表面，所述生物分子可與之相互作用；(b)將生物分子加到固體表面，使生物分子與所述聚合物或脂質相互作用；(c)以充分密度以及在將生物分子導入細胞的合適條件下將細胞接種到表面；并(d)檢測生物分子是否送遞到細胞。
在優選的實施方案中，加到固體表面的生物分子為核酸、蛋白、肽、糖、多糖或有機化合物。更優選地，核酸為DNA、RNA、DNA/RNA雜合體或經化學修飾的核酸。最優選地，經化學修飾的核酸包括肽核酸。最優選地，DNA為環狀、線性或單鏈寡核苷酸。優選地，RNA為單鏈的或雙鏈的。最優選地，單鏈RNA為核酶。最優選地，雙鏈RNA為siRNA。
在優選的實施方案中，接種到表面的細胞為哺乳動物細胞。優選地，細胞為分裂細胞或非分裂細胞。優選地，細胞為轉化細胞或原代細胞。優選地，細胞為體細胞或干細胞。更優選地，細胞為植物細胞。在另一更優選的實施方案中，細胞為昆蟲細胞。
本發明的其他方面、特征和優點通過下列優選的實施方案的詳述將會變得顯而易見。


現在，參照旨在說明而非限定本發明的優選的實施方案的附圖，對本發明的各方面特征進行描述。
圖1示出在0-0.5mg明膠/孔和0.25-1.0μmol CaCl2/孔時所分析的293細胞的轉染率，使用GFP作為報道分子。
圖2示出在0-0.5mg明膠/孔和0.25-1.0μmol CaCl2/孔時所分析的COS-7細胞的轉染率，使用GFP作為報道分子。
圖3示出在0-0.5mg明膠/孔和0.25-1.0μmol CaCl2/孔時所分析的HeLa細胞的轉染率，使用GFP作為報道分子。
圖4示出CaCl2濃度為0.25μmol、0.5μmol和0.75μmol和siRNA濃度為0.12μM時siRNA送遞對熒光素酶活性的抑制。
圖5示出使用GFP質粒在三種不同類型的細胞293、COS-7和HeLa細胞中分析得到的共轉染率。
圖6示出使用熒光素酶質粒在三種不同類型的細胞293、COS-7和HeLa細胞中分析得到的共轉染率。
圖7示出小規模(96孔板和24孔板)和大規模(6孔板和10cm培養皿)應用的轉染細胞的落射熒光顯微照片。左圖示出發射光，右圖示出來自GFP的熒光。
具體實施例方式
本發明描述了一種新型轉染裝置和方法，與常規轉染方法相比，它簡單、便捷和有效。根據本發明所描述的方法，通過將轉染試劑附著在細胞培養裝置的固體表面制備轉染裝置。通過使用本裝置，研究人員僅需將一種核酸或其它生物分子載體系統加到細胞培養裝置的表面。無須事先將DNA或生物分子與轉染試劑相混合。這除去了常規轉染方法所要求的最主要的耗時步驟。與現有方法所要求的2到5小時或更長時間相比，科學家僅需要大約40分鐘就可對10個樣本完成全部轉染過程。這對于需同時檢測幾百個樣本的高通量轉染分析而言尤為有利。
同常規轉染方法相比，本發明所描述的新方法具有幾個優點。它提供了易于保存的轉染裝置，并提供了生物分子送遞或基因轉染的簡單方法，無需混合生物物質/轉染試劑的步驟。本文所描述的轉染方法可在短時間內完成，例如在約40分鐘完成，并提供了轉染或藥物送遞的高通量的方法，其中大量樣本可同時轉染。
本發明所描述的基因送遞的方法和裝置的實施方案克服了上文所述的在常規轉染方法中所遇到的普遍問題。轉染試劑被簡單地包被到細胞培養裝置表面上，這易于商業化和大規模生產。例如，消費者、研究人員僅需在轉染前將例如目的核酸的生物分子直接加入細胞培養裝置表面，以制備該裝置。然后將細胞接種到細胞培養裝置的表面并培養，無須更換培養基，然后分析細胞。無須在轉染過程中更換培養基。本發明所描述的方法通過降低所包含的步驟數大大降低了出錯風險，由此提高本系統的一致性和精確性。
根據本發明所描述的方法，將轉染試劑附著到載玻片、多孔板的表面或其它表面以形成轉染裝置。通過使用該裝置，人們只需加入DNA或其它生物分子到該表面，使得轉染試劑和DNA或生物分子形成復合物。該反應在約30分鐘時發生，然后將細胞接種到表面上并在將生物分子導入細胞的合適條件下培養。
可使用任何可用于將含混合物的核酸/生物分子附著到其表面的合適表面。例如，該表面可為玻璃、塑料(如聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯)、硅、金屬(如金)、膜(如硝酸纖維素、甲基纖維素、PTFE或纖維素)、紙、生物物質(如蛋白、明膠、瓊脂)、組織(如皮膚、上皮組織、骨、軟骨)、礦物質(如羥磷灰石、石墨)。根據優選的實施方案，該表面可為載玻片(玻璃或聚-L-賴氨酸包被的載玻片)或多孔板的孔。
就載玻片而言，如聚-L-賴氨酸(如Sigma公司)包被的玻璃載玻片，將轉染試劑固定在表面并干燥，然后導入目的核酸或有待導入細胞的核酸、蛋白、肽或小分子藥物。將載玻片在室溫下培養30分鐘以在轉染裝置的表面形成生物分子/轉染試劑復合物。該生物分子/轉染試劑復合物形成用于高通量微陣列的培養基，該微陣列可用于同時研究成百上千核酸、蛋白、肽和其它小分子藥物。在另一個實施方案中，轉染試劑或藥物送遞試劑可附著在轉染裝置表面離散的、確定的區域，以形成轉染試劑或藥物送遞試劑的微陣列。在該實施方案中，欲被導入細胞的分子，如核酸，可與轉染或送遞試劑一起散布在轉染裝置表面。本方法可用于從幾千種化合物中篩選轉染試劑或其它送遞試劑。該篩選方法的結果可通過計算機分析檢測。
在本發明的另一實施方案中，可將多孔板的一個或多個孔用轉染或藥物送遞試劑包被。常用于轉染和藥物篩選的板為96孔板和384孔板。可將轉染試劑或生物分子送遞試劑均勻涂布于板的底部。然后通過例如多孔加樣器或自動加樣器將幾百種核酸、蛋白、肽或其它生物分子加入孔中。然后使用微量培養板讀數器檢測轉染結果。這是分析轉染細胞的非常便利的方法，因為大部分生物醫學實驗室通常使用微量培養板讀數器。包被有轉染或生物分子送遞試劑的多孔板可廣泛應用于大部分實驗室以研究基因調節、基因功能、分子治療和信號傳導以及藥物篩選。同樣，若將不同類轉染試劑包被到多孔板不同孔中，該板可用于相當有效地篩選多種轉染或送遞試劑。最近，開發了1536和3456孔板，它們也可以用于本發明所述的方法。
轉染試劑或送遞試劑優選金屬鹽，它們可將生物分子如核酸、蛋白、肽、糖、多糖、有機化合物和其它生物分子導入細胞中。優選的實施方案使用鈣金屬鹽，特別是氯化鈣或乙酸鈣。
根據一個實施方案，轉染試劑或送遞試劑可與基質如蛋白、肽、多糖或其它聚合物混合。蛋白可為明膠、膠原、牛血清白蛋白或任何其它可用于將蛋白附著到表面上的蛋白。聚合物可為水凝膠、共聚物、不可降解的或可生物降解的聚合物和生物相容性物質。多糖可為任何可形成膜和包被送遞劑如脫乙酰殼多糖的化合物。其它試劑如細胞毒性還原劑、細胞結合試劑、細胞生長試劑、細胞刺激試劑或細胞抑制試劑以及用于培養特定細胞的化合物也可與轉染或送遞試劑一起附著在轉染裝置上。
根據另一實施方案，明膠-轉染試劑混合物包括轉染試劑(如諸如氯化鈣的金屬鹽)和溶于恰當溶劑(如水或雙去離子水)的明膠，它可被附著到轉染裝置上。在另一實施方案中，明膠-轉染試劑混合物還可含有細胞培養試劑。該混合物被均勻涂布在諸如載玻片和多孔板的表面上，由此生成攜帶明膠-轉染試劑混合物的轉染表面。在另一實施方案中，不同的轉染試劑-明膠混合物也可散布在轉染裝置表面的離散區域。所得到的產物可在合適的條件下完全干燥，以使明膠-轉染試劑混合物附著到混合物所應用的位點上。例如，所得到的產物可在特定溫度或濕度下或在真空干燥器中干燥。
混合物中轉染試劑的濃度取決于試劑的轉染率以及細胞毒性。一般而言，在轉染率和細胞毒性之間存在平衡。在轉染試劑濃度使得轉染率最高，同時細胞毒性保持在可接受的水平時，轉染試劑的濃度就是最佳水平。轉染試劑的濃度一般在約1到10mM，優選約2-7mM的范圍內。同樣，明膠或其它基質的濃度取決于有待進行的實驗和分析，但是其濃度一般為轉染試劑的0.1％到0.5％，優選0.5％到2％，最優選約1％-2％的范圍內。根據在實施例中所示出的實施方案，明膠濃度約為轉染試劑的2％。當然，在明膠基質中的轉染試劑的濃度在全部反應體積中較高，約為5mM到0.1M，優選10-40mM。在一個優選的實施方案中，基質中的轉染試劑涂布于轉染裝置并在無菌空氣中干燥。優選地，基質中的轉染試劑在無菌通風櫥中干燥2小時至過夜。
導入細胞的分子可為核酸、蛋白、肽、肽核酸(PNA)和其它生物分子。核酸可為DNA、RNA和DNA/雜合體等。若所用DNA存在于載體中，載體可為任何類型，如質粒(例如pCMV-GFP、pCMV-luc)或以病毒為基礎的載體(例如pLXSN)。DNA還可為具有在cDNA 5’端表達的啟動子序列(如CMV啟動子)和3’端的聚腺苷酸位點的線性片段。這些基因表達元件可使目的cDNA在哺乳動物細胞中瞬時表達。若DNA為單鏈寡脫氧核苷酸(ODN)，例如反義ODN，它可被導入細胞中調節靶基因表達。在實施方案中所使用的RNA核酸可為單鏈的(反義RNA和核酶)或雙鏈的(RNA干擾，siRNA)。大部分情況下，RNA被修飾以增強RNA的穩定性并增強其在下調基因表達中的功能。在肽核酸(PNA)中，核酸骨架被替換成肽，這使分子更穩定。在具體實施例中，本發明所描述的方法可就各種目的用于將蛋白、肽和其它分子導入細胞，例如分子治療、蛋白功能研究或分子機制研究。
在恰當條件下，生物分子被加入包被有轉染或送遞試劑的轉染裝置上形成生物分子/送遞試劑復合物。生物分子優選地溶于不含胎牛血清和抗生素的細胞培養基，例如Dulbecco’s Modified Eagles Medium(DMEM)或opti-MEM。若轉染或送遞試劑被均勻附著到載玻片上，那么生物分子就可散布到載玻片上的離散位置上。或者，轉染或送遞試劑可散布到載玻片上的離散位置，而將生物分子簡單加入以覆蓋轉染裝置的全部表面。若轉染試劑或送遞試劑附著到多孔板的底部，那么生物分子可通過多通道加樣器、自動進樣器或其它方法簡單加入到不同孔中。培養所得到的產物(包被有轉染或送遞試劑和生物分子的轉染裝置)以形成生物分子/轉染試劑(或送遞試劑)復合物。在某些實施方案中，培養在室溫下進行約25分鐘。在一些情況下，例如，不同種類的生物分子散布在載玻片上的離散位置，并在培養之后除去DNA溶液，以產生攜帶復合物中的生物分子和轉染試劑的表面。在其它實施方案中，生物分子溶液可保留在表面。
加入生物分子后，將在適當培養基中的適當密度的細胞接種到表面上。所得到的產物(攜帶生物分子和接種細胞的表面)維持在可使生物分子進入接種細胞的條件下。
根據本發明所描述的方法，所使用的合適的細胞包括原核細胞、酵母或高等真核細胞，包括植物和動物細胞，特別是哺乳動物細胞。真核細胞，如哺乳動物細胞(如人、猴、犬、貓、牛或鼠類的細胞)、細菌、昆蟲或植物細胞，以充足密度和在將生物分子導入/進入真核細胞和表達DNA或生物分子與細胞組分相互作用的適當條件下被接種到包被有轉染或送遞試劑和生物分子的轉染裝置上。在具體實施方案中，細胞可選自造血細胞、神經細胞、胰腺細胞、肝細胞、軟骨細胞、骨細胞或肌細胞。細胞可為完全分化的細胞或祖細胞/干細胞。
在優選的實施方案中，真核細胞在含10％熱滅活的胎牛血清(FBS)、L谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素(pen/strep)的Dulbecco’s ModifiedEagles Medium(DMEM)中培養。本領域的技術人員認為某種細胞應該在特定培養基中培養，因為某些細胞需要特定營養，如生長因子和氨基酸。細胞的最適密度取決于細胞類型和實驗目的。例如，70％-80％匯合的細胞群優選用于基因轉染，但是用于寡核苷酸送遞的最佳條件為30-50％匯合的細胞。在一個實施例中，若5×104293細胞/孔被接種到96孔板上，細胞在接種后18-24h可達到90％匯合率。就HeLa 705細胞而言，在96孔板中只需要1×104細胞/孔就可達到相似的匯合率。
細胞接種到含生物分子/送遞試劑的表面上后，細胞在就其細胞類型而言最佳條件(如37℃、5-10％CO2)下培養。培養時間取決于試驗目的。一般地，就基因轉染實驗而言，將細胞培養24到48小時以使細胞表達靶基因。在分析細胞內生物分子的胞內運輸時，需要培養幾分鐘到幾個小時并在確定的時間點觀察細胞。
生物分子送遞的結果可通過不同方法分析。就基因轉染和反義核酸送遞而言，靶基因表達水平可由例如綠色熒光蛋白(GFP)基因、熒光素酶基因或β-半乳糖苷酶基因的報道基因的表達檢測。GFP信號可在熒光顯微鏡下直接觀察，熒光素酶活性可由光度計檢測，由β-半乳糖苷酶催化的藍色產物可在顯微鏡下觀察或由微量培養板讀數器檢測。本領域的技術人員熟知這些報道分子如何起作用以及它們如何被導入基因送遞系統。根據本發明所描述的方法被送遞的核酸及其產物、蛋白、肽或其它生物分子以及由這些生物分子調節的靶物質可由多種方法檢測，如檢測免疫熒光或酶免疫細胞化學、自顯影或原位雜交。若使用免疫熒光來檢測編碼蛋白的表達，則要使用結合靶蛋白的熒光標記的抗體(如在抗體和蛋白結合的合適條件下加到載玻片上)。然后將含有蛋白的細胞通過檢測熒光信號而鑒定。若所送遞的分子可調節基因表達，靶基因表達水平還可通過諸如自顯影、原位雜交和原位PCR等方法測定。但是，鑒定方法取決于所送遞分子的性質、它們的表達產物，它們所調節的靶物質和/或由于生物分子的送遞而得到的終產物。
實施例實施例1制備細胞培養/轉染裝置使用氯化鈣和線性聚乙烯亞胺(L-PEI)在體外將質粒DNA轉染到哺乳動物細胞中，以評估轉染率。轉染試劑與明膠(B型；SIGMA-ALDRICH，Cat.No.G-9391)被附著到96孔細胞培養板(CorningCostar，Cat.No.3997)的孔底部。就氯化鈣而言，附著0.5μmol/孔氯化鈣與0.5mg/孔明膠。就PEI而言，附著3.5μmol/孔PEI與0.05mg/孔明膠。這些試劑和明膠溶于25μl去離子水中(每孔)并分裝到孔中。然后將這些孔空氣干燥。
實施例2用細胞培養/轉染裝置轉染293細胞將溶于25μl opti-MEM I(Invitrogen，Cat.No.31985-070)的50ng pCMV-GFP質粒加入各孔中并在室溫下放置25分鐘。然后，加入在100μl含有10％牛血清(Invitrogen)的Dulbecco’s ModifiedEagle Medium(DMEM)(Invitrogen，Cat.No.11965-084)中的5×104293細胞并在37℃、7.5％CO2培養。培養24h后，通過使用落射熒光顯微鏡(IX70，Olympus)觀察GFP熒光估算轉染率。
表1示出轉染率。兩種轉染試劑均適用于本發明的轉染系統并表現出非常高的轉染率。
表1使用可轉染細胞培養裝置的轉染率

實施例3常規方法轉染293細胞100μl 293細胞培養物(5×105細胞/ml DMEM)接種到96孔板中并在37℃、7.5％CO2培養24h。培養后，制備溶于opti-MEM的pCMV-GFP質粒-轉染試劑混合物(終濃度質粒；10ng/μl，轉染試劑，如表2中所示)并在室溫下培養15分鐘，使得形成質粒-轉染試劑復合物。然后將15μl質粒-轉染試劑復合物加入各孔中并在37℃、7.5％CO2培養24h。如實施例2中所描述的那樣估算轉染率。結果發現，L-PEI在常規方法中是有效的，但是氯化鈣不適用。在常規方法中，需要兩次培養以及一次復雜的制備過程。
如表2所示，在常規方法中CaCl2不是有效的轉染試劑。盡管轉染率較實施例2中的試驗所觀察到的(表1)低，但是L-PEI還是有效的試劑。
表2
常規方法的轉染率

實施例4多種細胞系分析檢測了對哺乳動物細胞(293細胞、COS-7細胞和HeLa細胞)的轉染率。通過在各種條件下將氯化鈣和明膠附著到96孔板的底部制備細胞培養/轉染裝置。通過遵照實施例2中描述的方法對pCMV-GFP進行轉染。但是，COS-7和HeLa細胞的接種數為在100μl含10％牛血清的DMEM中的2×104細胞，293細胞的接種數為在100μl含10％牛血清的DMEM中的5×104細胞。
圖1、2和3示出使用本發明的96孔轉染板的轉染率。通過使用該預處理的板，pCMV-GFP質粒被轉染到每一種細胞系中，結果表明該細胞培養/轉染板可用于多種常規培養的哺乳動物細胞類型。
實施例5通過使用細胞培養/轉染裝置的siRNA送遞siRNA是生命科學研究領域中研究特定基因的作用的重要工具。將上述用于細胞培養/轉染裝置的方法學用于siRNA送遞。
具有熒光素酶基因GL2的GT2-293-LUC細胞購自BD BiosciencesClonetech，Palo Alto，CA USA，siRNA購自Dharmacon Inc.，Lafayuette，CO USA。靶向GL2的siRNA序列如下所示正義序列CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT(SEQ ID NO1)
反義序列UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT(SEQ ID NO2)將這兩個片段退火形成雙鏈。
按下述方法制備細胞培養/轉染裝置將25μl的2％B型明膠加上10、20或30mM CaCl2溶液加入96孔板并過夜干燥。因此，各孔底部涂布了0.5mg明膠和0.25、0.50或0.75μmol的CaCl2。然后，將25μl的siRNA溶液(在opti-MEM中為36nM或0.12μM)加入各孔并培養25分鐘。加入100μl的GP2-293-LUC細胞(5×105細胞/ml含10％牛血清的DMEM)并在37℃、7.5％CO2培養48h。通過使用DynexMLX Microtiter板光度計和熒光素酶分析系統(Promega Corp.Madison，WI USA)測定細胞的熒光素酶活性。通過比較轉染細胞和未處理細胞的熒光素酶活性評估siRNA的效果(圖4)。siRNA對GP2-293-LUC細胞的熒光素酶活性的干擾最高達70％。因此，本發明的裝置也可用于siRNA送遞。
實施例6使用細胞培養/轉染裝置共轉染在典型的病毒載體生產中，兩個或多個質粒被轉染到細胞中。共轉染可模擬細胞培養/轉染裝置用于病毒載體生產的效率。
將攜帶熒光素酶基因的pCMV-luc質粒以及pCMV-GFP共轉染到哺乳動物細胞中。細胞培養/轉染裝置按照如下方法制備將25μl的2％B型明膠和20mM CaCl2溶液加入96孔板的孔中并過夜干燥。因此，各個孔的底部涂布了0.5mg明膠和0.50μmol的CaCl2。然后將25μl質粒溶液(溶于opti-MEM)加入各個孔中并培養25分鐘。每25μl溶液中的質粒量為(1)500ng的pCMV-GFP和500ng的pCMV-luc；(2)250ng的pCMV-GFP和250ng的pCMV-GFP；(3)500ng的pCMV-GFP；(4)250ng的pCMV-GFP；(5)500ng的pCMV-luc；(6)250ng的pCMV-luc。然后加入100μl細胞培養物(293細胞5×105細胞/ml，COS-7細胞2×105細胞/ml，HeLa細胞2×105細胞/ml，在含10％牛血清的DMEM中)。培養24h后，通過觀察GFP熒光以及測量熒光素酶活性估算轉染率。
圖5和6示出轉染率。對于GFP熒光，在所有細胞系中的常規轉染(一個質粒)和共轉染之間沒有明顯差異。共轉染的293細胞和COS-7細胞的熒光素酶活性較常規轉染細胞低10倍，但是，共轉染細胞的活性依然很高。這些結果表明所描述的細胞培養/轉染裝置可用于共轉染。而且該裝置在病毒載體生產上前景廣闊。
實施例7細胞培養/轉染裝置大規模應用還準備了適用于大規模應用的細胞培養/轉染裝置的實施方案。通常使用24孔板和6孔板，并且病毒載體生產非常重要，特別是對于體內研究。就此目的，轉染可在大的細胞培養皿中，例如在直徑為10cm或者25cm的細胞培養皿中進行。
按照如下所述制備裝置將含2％B型明膠和20mM的CaCl2、溶于去離子水中的包被溶液加入各孔或培養皿中。所加的包被溶液的量為1)96孔板中25μl，2)24孔板中100μl，3)6孔板中500μl，和4)10cm培養皿中2ml。將這些培養板和培養皿在無菌通風櫥中干燥。
干燥后，將20μg/ml溶于opti-MEM的pCMV-GFP加入培養板和培養皿中。溶液的量為1)96孔板中25μl，2)24孔板中100μl，3)6孔板中500μl，和4)10cm培養皿中3ml。然后將培養板和培養皿在室溫下放置25分鐘。接下來，將293細胞培養物加入培養板和培養皿中并在37℃、7.5％CO2培養24h。最后，通過觀察GFP熒光估算轉染率。
圖7示出轉染細胞的GFP熒光。在每個培養板或培養皿中轉染率均相當高，并且細胞狀況也很好。這些數據表明本發明所描述的方法適用于各種尺寸的細胞培養裝置。
本領域的技術人員可以理解的是在不背離本發明的宗旨的前提下，可對本發明作多種改變。因此，應清楚地理解的是本發明的形式僅僅為示例性的，無意于限制本發明的范圍。
序列表<110>日東電工株式會社田中安信俞磊季守平<120>真核細胞轉染培養裝置和方法<130>NDTCO.029VPC<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>打靶GL2的siRNA的正義序列<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<223>前19個殘基為RNA；最后2個殘基為DNA<400>1cguacgcgga auacuucgat t 21<210>2<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>打靶GL2的siRNA的反義序列<221>misc_signal<222>(1)...(21)<223>前19個殘基為RNA；最后2個殘基為DNA<400>2ucgaaguauu ccgcguacgt t 2權利要求
1.一種用于轉染真核細胞的多孔板，其中在至少一些孔的底部至少部分涂布了含金屬鹽的組合物。
2.根據權利要求1的多孔板，其中所述金屬鹽為鈣鹽。
3.根據權利要求2的多孔板，其中所述鈣鹽選自氯化鈣和乙酸鈣。
4.根據權利要求1的多孔板，其中所述組合物還包括基質復合物。
5.根據權利要求1的多孔板，其中所述組合物保留在多孔板上。
6.根據權利要求5的多孔板，其中所述組合物保留在具有基質復合物的多孔板上。
7.根據權利要求6的多孔板，其中所述基質復合物選自蛋白、糖蛋白、肽、多糖和聚合物或其組合。
8.根據權利要求7的多孔板，其中所述蛋白選自明膠、膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白和牛血清白蛋白或其組合。
9.根據權利要求7的多孔板，其中所述聚合物選自水凝膠、可生物降解的聚合物以及生物相容性物質。
10.一種用于轉染真核細胞的細胞培養/轉染裝置，該裝置包括固體表面，其中所述固體表面包被有在凝膠基質中的氯化鈣。
11.根據權利要求10的細胞培養/轉染裝置，其中所述表面選自連續表面、培養瓶、培養皿、試管、多孔板、載玻片以及植入裝置。
12.根據權利要求10的細胞培養/轉染裝置，其中所述固體表面為玻璃、聚苯乙烯或環氧樹脂。
13.根據權利要求10的細胞培養/轉染裝置，其中所述固體表面選自載玻片和多孔板。
14.一種試劑盒，包含權利要求10的細胞轉染裝置；待轉染的真核細胞；以及至少一種用于轉染的核酸。
15.根據權利要求14的試劑盒，其中所述真核細胞為哺乳動物細胞。
16.根據權利要求14的試劑盒，其中所述真核細胞為分裂細胞或非分裂細胞。
17.根據權利要求14的試劑盒，其中所述真核細胞為轉化細胞或原代細胞。
18.根據權利要求14的試劑盒，其中所述真核細胞為體細胞或干細胞。
19.根據權利要求14的試劑盒，其中所述真核細胞為植物細胞。
20.根據權利要求14的試劑盒，其中所述真核細胞為昆蟲細胞。
21.根據權利要求14的試劑盒，其中所述至少一種核酸選自DNA、RNA、DNA/RNA雜合體和經化學修飾的核酸。
22.根據權利要求21的試劑盒，其中所述經化學修飾的核酸包括肽核酸。
23.根據權利要求21的試劑盒，其中所述DNA為環狀、線性或單鏈寡核苷酸。
24.根據權利要求21的試劑盒，其中所述RNA為單鏈的或雙鏈的。
25.根據權利要求24的試劑盒，其中所述單鏈RNA為核酶。
26.根據權利要求24的試劑盒，其中所述雙鏈RNA為siRNA。
27.一種轉染真核細胞的方法，包括提供至少部分涂布有含金屬鹽的組合物的固體表面；將待導入真核細胞的至少一種核酸或至少一種多肽加到固體表面上；并且以充分密度在將核酸或多肽導入真核細胞中的合適條件下將真核細胞接種到固體表面。
28.根據權利要求27的方法，其中所述表面選自培養瓶、培養皿、試管、連續表面、多孔板、載玻片和植入裝置。
29.根據權利要求27的方法，其中所述固體表面為玻璃、聚苯乙烯或環氧樹脂。
30.根據權利要求27的方法，其中所述金屬鹽為鈣鹽。
31.根據權利要求30的方法，其中所述鈣鹽選自氯化鈣和乙酸鈣。
32.根據權利要求27的方法，其中組合物還包括基質復合物。
33.根據權利要求27的方法，其中所述組合物保留在固體表面上。
34.根據權利要求33的方法，其中所述組合物保留在具有基質復合物的固體表面上。
35.根據權利要求34的方法，其中所述基質復合物選自蛋白、糖蛋白、肽、多糖和聚合物或其組合。
36.根據權利要求35的方法，其中所述蛋白選自明膠、膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白和牛血清白蛋白或其組合。
37.根據權利要求35的方法，其中所述聚合物選自水凝膠、可生物降解的聚合物和生物相容性物質。
38.根據權利要求27的方法，其中所述固體表面選自載玻片和多孔板。
39.根據權利要求27的方法，其中所述真核細胞為哺乳動物細胞。
40.根據權利要求27的方法，其中所述真核細胞為分裂細胞或非分裂細胞。
41.根據權利要求27的方法，其中所述真核細胞為轉化細胞或原代細胞。
42.根據權利要求27的方法，其中所述真核細胞為體細胞或干細胞。
43.根據權利要求27的方法，其中所述真核細胞為植物細胞。
44.根據權利要求27的方法，其中所述真核細胞為昆蟲細胞。
45.根據權利要求27的方法，其中所述至少一種核酸選自DNA、RNA、DNA/RNA雜合體和經化學修飾的核酸。
46.根據權利要求45的方法，其中經化學修飾的核酸包括肽核酸。
47.根據權利要求45的方法，其中所述DNA為環狀、線性或單鏈寡核苷酸。
48.根據權利要求45的方法，其中所述RNA為單鏈的或雙鏈的。
49.根據權利要求48的方法，其中所述單鏈RNA為核酶。
50.根據權利要求48的方法，其中所述雙鏈RNA為siRNA。
51.一種檢測生物分子能否進入細胞的方法，包括(a)提供包被有聚合物或脂質的固體表面，所述生物分子能與之相互作用；(b)將該生物分子加到該固體表面，使得該生物分子與所述聚合物或脂質相互作用；(c)以充足密度在將生物分子導入細胞的合適條件下將細胞接種到表面上；并(d)檢測生物分子是否被送遞到細胞。
52.根據權利要求51的方法，其中所述生物分子選自核酸、蛋白、肽、糖、多糖和有機化合物。
53.根據權利要求52的方法，其中所述核酸選自DNA、RNA、DNA/RNA雜合體和經化學修飾的核酸。
54.根據權利要求53的方法，其中所述經化學修飾的核酸包括肽核酸。
55.根據權利要求53的方法，其中所述DNA為環狀、線性或單鏈寡核苷酸。
56.根據權利要求53的方法，其中所述RNA為單鏈的或雙鏈的。
57.根據權利要求56的方法，其中所述單鏈RNA為核酶。
58.根據權利要求56的方法，其中所述雙鏈RNA為siRNA。
59.根據權利要求51的方法，其中所述細胞為哺乳動物細胞。
60.根據權利要求51的方法，其中所述細胞為分裂細胞或非分裂細胞。
61.根據權利要求51的方法，其中所述細胞為轉化細胞或原代細胞。
62.根據權利要求51的方法，其中所述細胞為體細胞或干細胞。
63.根據權利要求51的方法，其中所述細胞為植物細胞。
64.根據權利要求51的方法，其中所述細胞為昆蟲細胞。
全文摘要
公開了一種用于轉染真核細胞的細胞培養裝置。該細胞培養/轉染裝置可為包被有如CaCl
文檔編號C12N15/64GK1918300SQ200480041809
公開日2007年2月21日 申請日期2004年2月18日 優先權日2004年2月18日
發明者田中安信, 俞磊, 季守平 申請人:日東電工株式會社