專利名稱：一種水稻epsp合酶突變體及其編碼基因、獲得方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種水稻來源的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase，EPSP合酶)突變體及其編碼基因、獲得該突變體的方法與其在培育抗草甘膦植物中的應用。
背景技術：
草甘膦是一種內吸傳導型非選擇性除草劑，是目前應用最廣泛的廣譜性除草劑，能有效地控制全世界危害最嚴重的78種雜草中的76種。它具有對動物無毒，土壤殘效期短，易于降解等優點。廣泛市售的商品除草劑RoundupTM中的主要成份即為草甘膦。自從二十世紀八十年代以來，人們一直熱衷于培育抗草甘膦農作物，并通過基因工程技術成功地獲得了很多抗草甘膦作物，這些作物的種植不但使田間的耕作管理更為簡潔有效、增產增收外更降低了很多除草劑的用量，有利于環境的保護。1996年美國種植抗草甘膦大豆，每公頃除草劑用量減少了9％-39％，在加拿大的種植也使得每公頃除草劑用量較常規減少了1.0千克。美國孟山都公司開發的RoundupReadyTM系列作物，即抗草甘膦作物，已經在一些國家大面積種植，并產生了可觀的經濟效益。
5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphatesynthase，EPSPS，EPSP合酶)是芳香族氨基酸(包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)合成途徑中的一個關鍵酶，同時也是草甘膦專一抑制的靶酶。EPSP合酶催化3-磷酸莽草酸(Shikimate-3-phosphate，S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyrurate，PEP)縮合成5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate，EPSP)，并釋放出一個無機磷分子，其中EPSP是合成芳香族氨基酸的重要前體物質。草甘膦在分子結構上類似于EPSP合酶的底物PEP，是PEP的競爭性抑制劑。它與EPSP合成酶相結合后會妨礙EPSP合成酶與正常底物PEP的結合，從而導致EPSP合成酶活力下降乃至喪失，這將嚴重干擾苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成，使細胞內染色體失常(Steinrucken HC，Amrhein N(1980)The herbicide glyphosate is a potentinhibitor of 5-enolpyruvyl-shikimic acid-3-phosphate synthase.BiochemBiophys Res Commun 941207-1212)。
對于植物抗草甘膦的基因工程改造，有兩種較為常見的策略
首先是在植物中過量表達EPSP合酶并以此拮抗草甘膦的競爭性抑制Amrhein等人通過逐漸增加草甘膦的濃度，加大草甘膦的選擇壓力，分離獲得一個耐草甘膦的矮牽牛細胞系。分析這個細胞系中的EPSP合成酶，結果表明該細胞系的核中的EPSP合酶基因的拷貝數擴增了20倍，使酶大量產生(Amrhein N，Johanning D，Schab J，Schulz A(1983)Biochemical basis for glyphosate-tolerance in a bacterium anda plant tissue culture.FEBS Lett 157191-196)。利用來源于花椰菜花葉病毒(CaMV)35S的啟動子和矮牽牛的EPSP合成酶基因cDNA構建了嵌合的EPSP合成酶基因。花椰菜花葉病毒(CaMV)35S的啟動子可使一些編碼序列在所有植物組織中顯示高水平的組成性表達，轉基因植株對草甘膦施用量的耐受程度為殺死非轉基因植株用量的4倍以上(Dilip M.Shah；et al，Engineering Herbicide Tolerance inTransgenic Plants，Science，New Series，Vol.233，No.4762.(Jul.25，1986)，pp.478-481.)。
其次是在植物中引入并表達突變的EPSP合酶基因，該突變的EPSP合酶在保持催化活性的同時具有對草甘膦的低親和性甚至不親合性。Stalker等研究人員1985年從鼠傷寒沙門氏菌中分離到對草甘膦表現抗性的菌株，研究表明其中aroA的結構基因發生點突變，導致酶第101位的脯氨酸為絲氨酸所取代，由此所產生的EPSP合酶降低了與草甘膦除草劑的親和性，該突變體EPSP合酶基因轉化的植物產生了一定程度的草甘膦抗性(Stalker DM，Hiatt WR，Comai L(1985)A single amino acidsubstitution in the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthaseconfers resistance to the herbicide glyphosate.J Biol Chem 2604724-4728)。Padgette等人則將大腸桿菌aroA基因編碼的EPSP合酶蛋白的第96位甘氨酸殘基突變為丙氨酸殘基，突變后的EPSP合酶基因對草甘膦的結合活性大大降低，在植物中表達后產生了較其野生型更高的草甘膦抗性(Padgette SR，Re DB，Gasser CS，Eichholtz DA，Frazier RB，Hironaka CM，Levine EB，Shah DM，Fraley RT，KishoreGM(1991)Site-directed mutagenesis of a conserved region of the5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase active site.J Biol Chem 26622364-22369)。
某個基因的過量表達必然在某種程度上影響植物的正常生長，如果外源基因的中低量表達即可使轉基因植物產生最佳表現型將是比較理想的，因此，篩選出具有良好草甘膦抗性的突變體基因是實現這一目標的必由之路。
另外，由于細菌及真菌來源的基因不能編碼植物蛋白所特有的的轉運肽(transitpeptide)序列，而EPSP合酶只有被轉運到葉綠體中才能發揮其作用，所以必須為其人為添加一條轉運肽序列(Della-cioppa G，Bauer SC，Klein BK，Shah DM，FraleyRT，Kishore GM(1986)Translocation of the precursor of 5-enolpyruvylshikimate3-phosphate synthase into chloroplasts of higher plants in vitro.Proc NatlAcad Sci USA 836873-6877)；同時，細菌或真菌的密碼子偏好性與植物大不相同，因此，將來源于細菌真菌的基因轉化到植物中表達時通常效率很低，甚至無法表達，大多數情況下必須經過密碼子的修飾才能順利在轉基因植物中得以表達，但密碼子修飾非常耗時且成本較高。
易錯PCR(Error-Prone PCR)，是指在進行PCR擴增目的基因的同時通過降低Taq DNA聚合酶的保真度來引入堿基錯配，從而導致目的基因隨機突變。根據文獻(Cadwell RC，Joyce GF(1992)Randomization of genes by PCR mutagenesis.PCRMethods Appl 228-33)報道，只需20pmol(約6.4μg)突變產物即可包含所有1-4個堿基的突變體以及2％五堿基以上的突變體，從而構成可供篩選的隨機突變庫。
發明內容
本發明的目的是提供一種具草甘磷抗性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突變體及其編碼基因。
本發明所提供的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突變體，名稱為EPSPS-MP，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質。
序列表中的SEQ ID №2由444個氨基酸殘基組成，將其與野生型水稻EPSP合酶的氨基酸殘基序列(序列表中的SEQ ID №1)進行比較，結果如圖6所示，其氨基酸殘基序列自N端至C端第106位由脯氨酸殘基突變為亮氨酸殘基。
上述5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突變體的編碼基因EPSPS-MP，具有序列表中SEQ ID №3的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №3由1485個堿基組成，其編碼序列為自5’端第74至第1408位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質；將其與野生型水稻EPSP合酶基因的核苷酸序列進行比較，結果如圖6所示，該EPSP合酶基因的核苷酸序列自5’端至3’端第390位堿基由“C”突變為“T”，導致其編碼的氨基酸殘基序列自氨基端至羧基端第106位由脯氨酸殘基突變為亮氨酸殘基。
含有本發明基因的表達載體、轉基因細胞系、宿主菌均屬于本發明的保護范圍。
擴增EPSPS-MP中任一片段的引物對也在本發明的保護范圍之內。
本發明的另一個目的是提供一種具草甘膦抗性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因突變體的獲得方法。
本發明所提供的獲得5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因突變體的方法，是構建含有EPSP合酶基因的大腸桿菌組成型表達載體，利用易錯PCR技術對大腸桿菌表達載體中的EPSP合酶基因進行隨機突變，再將含有EPSP合酶突變基因的大腸桿菌表達載體導入宿主菌獲得EPSP合酶基因的突變體庫，最后將整合有EPSP合酶突變基因的重組子轉移到含有不同濃度草甘膦的培養基上進行篩選得到抗草甘膦的重組子，測序得到5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因突變體。
利用上述方法可以從多種植物中得到EPSP合酶基因突變體，例如本發明的序列表中的SEQ ID №3就是利用本發明的方法自水稻中獲得的。
構建所述含有EPSP合酶基因的大腸桿菌表達載體的出發載體為可在大腸桿菌中繁殖的低拷貝數載體，如pBR322等。
所述大腸桿菌表達載體還應含有一個組成型的啟動子、終止子等調控元件，以及選擇抗性基因如氨芐青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等。
所述宿主菌為E.coli AB2829。轉移重組子的方法采用平板影印法。培養基采用不含氨基酸成分的限制型培養基，如M9、MOPS培養基。
本發明的又一目的是提供一種培育抗草甘膦植物的方法。
本發明所提供的培育抗草甘膦植物的方法，是構建含有EPSP合酶突變體編碼基因EPSPS-MP的植物表達載體，將構建的植物表達載體轉化目的植物，經培育得到抗草甘膦植物。
所述植物表達載體中的EPSP合酶突變體的編碼基因的5’端還添加有轉運肽序列，該基因的上游端沿有義方向與啟動子相連，下游端與控制轉錄終止的調控序列相連。
所述啟動子可為組成型啟動子、器官特異性啟動子、組織特異性啟動子、誘導型啟動子或由啟動子和調控元件組成的復合啟動子。
所述復合啟動子包含的調控元件為能增強外源基因表達或調控基因在植物中表達部位的各種來源的DNA序列；所述調控元件可為增強子或可進行組成型表達、組織特異性表達或誘導型表達的調控元件；所述增強外源基因表達的DNA序列位于啟動子下游；所述增強外源基因表達的序列可為水稻Actin1內含子1、玉米Ubiquitin內含子1、玉米蔗糖合成酶基因Sh1內含子1、玉米乙醇脫氫酶1-S基因內含子1、玉米蔗糖合成酶Sh1外顯子或水稻EPSP合成酶基因第一內含子。
所用轉化植物的方法可為基因工程領域常用的轉化方法，如農桿菌介導法、基因槍法、原生質體介導法、電擊法或整體水平的轉化方法等。
獲得了用上述方法轉化的轉基因單株后，可以通過卡那霉素來篩選抗性植株，并結合分子生物學的方法進行檢測，鑒定轉基因的整合情況，并用除草劑草甘膦鑒定獲得的轉化植株，最終得到抗草甘膦的轉基因植物。
所述植物可為水稻、玉米、小麥、大麥、高粱等單子葉植物或煙草、棉花、楊樹、大豆、甘薯、馬鈴薯、白菜、甘藍、青椒等雙子葉植物。
應用上述方法得到的轉基因植株及其子代也屬于本發明的保護范圍。
本發明基于定向進化原理即突變的最終形成是篩選壓力與基因上的隨機突變相互作用的結果。綜合易錯PCR、在缺陷型菌株AB2829中低水平組成型表達EPSP合酶、平板影印法等簡單的分子生物學及微生物學技術創造了一個高效篩選草甘膦抗性突變體EPSP合酶的體系。同時，本發明選擇植物來源的EPSP合酶基因作為篩選突變體的野生型前體，為突變體基因在轉基因植物中的表達奠定了良好的基礎。運用本發明的方法，獲得了突變體EPSPS-MP，該突變體由一個單一的脯氨酸殘基突變導致草甘膦抗性，其后轉基因煙草實驗證明轉化有該EPSP合酶突變體的植物具有較野生型EPSP合酶更高的草甘膦抗性。該水稻EPSP合酶突變體在對草甘膦產生高抗性的同時并未像以往所報道的EPSP合酶突變體(Eschenburg S，Healy ML，Priestman MA，Lushington GH，Schonbrunn E(2002)How the mutation glycine96 to alanineconfers glyphosate insensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphatesynthase from Escherichia coli.Planta 216129-135)那樣以大幅犧牲酶的催化活性為代價，而是具有更高的活性以及實際應用的可行性，可用于構建高抗草甘膦的田間作物。
圖1為重組表達載體pBREP的物理圖譜圖2為水稻EPSP合酶基因突變區域的分段圖示圖3為分別用含有5mM、20mM、50mM和100mM草甘膦的固體M9培養基篩選抗草甘膦的轉化子圖4A-圖4D為分別用含有1mM、5mM、10mM和20mM草甘膦的液體M9培養基檢測抗草甘膦的轉化子圖5為分別含有pBREP-MP與pBREP-MG載體的轉化子在含草甘膦的液體M9培養基中生長的比較圖6為pBREP-MP測序結果及與野生型的序列比較分析圖7A-圖7B為野生型EPSP合酶與EPSP合酶突變體EPSPS-MP活性中心立體結構的比較圖8為植物表達載體pCEP的物理圖譜圖9為轉基因煙草的PCR檢測結果圖10為轉基因植株在含有不同濃度草甘膦的分化培養基上進行分化的結果圖11為用草甘膦噴灑轉基因植株的實驗結果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參考(Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，所用術語和縮寫均是本領域技術人員通用的術語和縮寫。
實施例1、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突變體EPSPS-MP的獲得和檢測1、水稻EPSP合酶cDNA的克隆及中間克隆載體pGEP的構建根據Genbank中水稻EPSP合酶的cDNA全序列(Genbank AF413081)設計引物，引物序列如下引物15’TTCTCGTCGCGGAAGCAGCT 3’引物25’CAACAGAACCTAGACCTCAC 3’1)提取水稻品種明恢63葉片的總RNA，然后以此為模板合成水稻的cDNA；2)以步驟1)合成的水稻cDNA為模板，在引物1和引物2引導下，PCR擴增EPSP合酶基因，PCR反應體系為步驟1)獲得的水稻cDNA 2μL，EX-Taq DNA聚合酶1U(TaKaRa公司)，10×EX-Taq DNA酶緩沖液5μL，dNTPs(2.5umol/L)5μL，引物1和引物2各10pmol，最后加ddH2O水補至總體積為50μL；PCR反應條件為94℃預變性5min；然后94℃1min，55℃1min，72℃1min，共進行30個循環；最后72℃延伸10min。反應結束后，用低熔點瓊脂糖凝膠電泳進行回收，得到電泳純的PCR擴增產物。
3)將步驟2)回收的PCR擴增產物連接到克隆載體pGSMT-easy載體(Promega公司)上，然后將連接產物采用電激法(BIO-RAD公司電激儀)轉化E.coli DH5α，用含有X-gal和IPTG的氨芐青霉素選擇培養基篩選重組菌，挑選長出的白色單菌落搖菌提質粒并進行酶切鑒定，將成功轉化有重組載體的重組菌交與上海博亞生物技術公司測序，測序結果表明擴增的EPSP合酶cDNA序列正確并且獲得了正確的含有EPSP合酶基因的中間克隆載體，將其命名為pGEP。
2、含有EPSP合酶成熟蛋白編碼基因的大腸桿菌表達載體pBREP的構建大腸桿菌表達載體pBREP的構建過程如圖1所示，包括以下步驟根據水稻EPSP合酶成熟蛋白的編碼基因設計引物，引物序列如下引物35’ATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGGCGGAGGAGATC 3’引物45’AAACTGCAGCTCACTCTTTTAAAA 3’(劃線部分堿基為PstI識別位點)1)以步驟1獲得的質粒載體pGEP為模板，在引物3和引物4的引導下，PCR擴增水稻EPSP合酶成熟蛋白的編碼基因；2)將質粒載體pBR322用限制性內切酶SspI和PstI(均購自TaKaRa公司)酶切后，將其用T4DNA連接酶與經PstI酶切的上述PCR產物連接，得到含有EPSP合酶成熟蛋白編碼基因的重組表達載體pBREP。
3、大腸桿菌表達載體pBREP的功能驗證菌株E.coli AB2829(購自E.coli Genetic Stock Center)，該菌株系EPSP合酶缺陷型菌株，在其aroA基因上存在突變，不能表達有功能的EPSP合酶，因而不能正常合成芳香族氨基酸。在不含氨基酸成分的限制性培養基上(如M9、MOPS)該菌株的生長受到抑制，無法形成正常菌落；如轉入該菌的質粒含有可表達的EPSP合酶基因，則可以互補E.coli AB2829中aroA-的缺陷，恢復其在限制性培養基上生長的功能。
將步驟2構建的重組表達載體pBREP轉化E.coli AB2829后，將轉化子接種于M9培養基上，結果轉化子能在該限制性培養基上正常生長，說明該重組表達載體有效地表達了有功能的水稻EPSP合酶從而互補了E.coli AB2829中aroA-的缺陷。
4、水稻EPSP合酶突變體庫的構建采用Error-Prone PCR法將重組表達載體pBREP中的水稻EPSP合酶基因分為前后兩段分別進行隨機突變，如圖2所示，水稻EPSP合酶的cDNA全長1332bp，其中第一段位于水稻EPSP合酶基因上的BglII和ScaI酶切位點之間，長約500bp，第二段位于水稻EPSP合酶基因上的ScaI和PstI酶切位點之間，長約900bp。根據水稻EPSP合酶基因全長cDNA序列設計引物，引物序列如下用于第一段突變的引物序列引物5(上游)5’TTTAGATCTCCGGGGCGGTT引物6(下游)5’CAAGTACTGACTGCTGATGG用于第二段突變的引物序列為引物7(上游)5’TTAGTACTTGAGTGCCTTGC引物8(下游)5’AAACTGCAGCTCACTCTTTTAAAA1)以重組表達載體pBREP為模板，分別在引物5和引物6、引物7和引物8的引導下，進行PCR反應，PCR反應體系為上、下游引物各20pmol，除常規成分外還含有5.6mM Mg2+，0.2mM Mn2+，1mM dTTP和1mM dCTP；PCR反應條件為94℃ 1分鐘，45℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，共進行30個循環(無熱啟動)。
2)反應結束后，將上述PCR產物經限制性內切酶BglII和ScaI(對應第一段突變區)或ScaI和PstI(對應第二段突變區)分別消化后用低熔點瓊脂糖膠回收，將載體pBREP也分別用上述兩套酶消化并回收，以T4DNA連接酶與相應突變區PCR產物連接，然后將連接體系轉化E.coli AB2829，涂板于M9平板得到的克隆即為水稻EPSP合酶基因的突變體庫。
5、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS-MP的獲得及檢測1)將步驟4的轉化子于37℃溫箱中培養至菌落長出約1mm大小時，用平板影印法(replica plating)(Lederberg J，Lederberg EM(1952)Replica plating andindirect selection of bacterial mutants.J Bacteriol 63399-406)即以滅菌絲絨布包裹的木質印章將長出的菌落轉移到分別含有0-100mM遞增濃度草甘膦的固體M9培養基平板上篩選抗性菌落。對于前后兩段突變區分別篩選了超過2×105個克隆，使用隨機突變產物大于30ug，理論上覆蓋了足夠大的突變庫。
2)將篩到的抗性菌落單獨培養并提取質粒，然后將質粒再次轉化E.coli AB2829，在37℃下、含不同濃度(0-20mM)草甘膦的MOPS液體培養基中振蕩培養，觀察其生長狀況，并于24小時后測定600nm的紫外吸光值(OD600)。抗性較強生長較好的轉化子則相應具有較高的OD600值，通過此法再次驗證所得抗性轉化子的草甘膦抗性來源于宿主菌內的質粒載體所表達的EPSP合酶。最終篩選得到了一個對草甘膦抗性較高的突變體轉化子，將其命名為RM102，將其中所含質粒命名為pBREP-MP，將該突變體轉化子RM102接種于含有5mM、20mM、50mM、100mM不同濃度草甘膦的M9固體培養基上，結果如圖3所示(A，B，C，和D分別為含有5mM、20mM、50mM、100mM草甘膦的M9固體培養基，1為含有野生型EPSP合酶表達載體pBREP的AB2829轉化子，為野生型對照，2為含有突變體EPSP合酶表達載體pBREP-MP的AB2829轉化子RM102)，在含10mM草甘膦的M9固體培養基上RM102仍可正常生長，但野生型的生長已完全被抑制，而在含50mM草甘膦M9培養基上，RM102仍可生長，表明RM102較野生型具有較高的草甘磷抗性。
3)將RM102接種于含有1mM、5mM、10mM、20mM草甘膦的M9液體培養基中，在37℃下振蕩培養，分別于0、24、48、72h測定540nm的紫外吸光值(OD540)結果如圖4A-圖4D所示(圖4A，圖4B，圖4C，和圖4D分別為含有1mm、5mM、10mM、20mM草甘膦的M9液體培養基)，在含5mM草甘膦的M9液體培養基中野生型已無法生長而突變體生長良好，在20mM濃度的草甘膦M9液體培養基中突變體RM102仍有一定程度的生長。
6、EPSPS-MP突變體對草甘磷抗性的比較如表達載體所表達的EPSP合酶蛋白草甘膦抗性提高，則相應的轉化菌也能在含有更高濃度草甘膦的限制培養基上生長。按照已有文獻中提到的能提高EPSP合酶草甘膦抗性的保守位點(Eschenburg S，Healy ML，Priestman MA，Lushington GH，Schonbrunn E(2002)How the mutation glycine96 to alanine confers glyphosateinsensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase fromEscherichia coli.Planta 216129-135)將pBREP上的水稻EPSP合酶基因第101位的甘氨酸殘基定點突變為丙氨酸，得到載體pBREP-MG，并表達EPSP合酶突變體EPSPS-MG，轉化AB2829所得轉化子在含0-50mM濃度草甘膦的M9培養基上能正常生長，而野生型對照的生長卻明顯受到抑制，由此也證明了上述體系可以對具有草甘膦抗性的突變體進行有效篩選。
將分別轉化有pBR322(空載體對照)、pBREP(野生型EPSP合酶對照)、pBREP-MP、pBREP-MG質粒的E.coli AB2829菌株以相同的初始量分別接種于含有0mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM、20mM、50mM濃度草甘膦的液體MOPS培養基中并測定OD600值(初值)，然后在37℃下振蕩培養，觀察其生長狀況，于12小時后再次測定OD600值(末值)以確定上述五種菌株在不同草甘膦濃度下生長的增量，結果如圖5所示(％Increment為對應轉化子初、末值之差與0mM下的末值之比)，EPSPS-MG突變體在含0.5-50mM濃度草甘膦的培養基中生長速度均比野生型快，表明其草甘膦抗性比野生型高，而其在0-0.2mM濃度草甘膦的培養基中，生長情況則較野生型差，表明該突變體EPSP合酶的酶活確實降低；而RM102突變體轉化子在0-0.5mM草甘膦生長狀況比野生型還要良好且生長速率比EPSPS-MG突變體更高；其在含有更高濃度草甘膦的培養基中生長狀況也與EPSPS-MG突變體相當。以上結果說明突變體EPSP-MP較EPSP-MG而言在草甘膦抗性提高的同時仍保持較高的酶活性。
7、草甘膦抗性突變體的測序對抗性突變體RM102中的載體pBREP-MP進行測序，測序結果表明該EPSP合酶突變基因具有SEQ ID №3的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №3由1485個堿基組成，其編碼序列為自5’端第74到第1408位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質，序列表中的SEQ ID №2由444個氨基酸殘基組成。將SEQ ID №3與野生型水稻EPSP合酶基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸殘基序列(序列表中的SEQ ID №1)進行比較，結果如圖6所示，該EPSP合酶突變基因自5’端至3’端第390位堿基由“C”突變為“T”，導致其編碼的氨基酸殘基序列自氨基端至羧基端第106位由脯氨酸殘基突變為亮氨酸殘基。該突變氨基酸位于EPSP合酶蛋白功能保守區內，接近活性中心，用計算機軟件InisightII對其結構進行模擬，如圖7A-圖7B所示(圖7A為野生型EPSP合酶蛋白，圖7B為EPSP合酶突變體RM102)，軟件計算表明該氨基酸殘基變化對活性中心只產生輕微的影響。
實施例2、草甘膦抗性突變體的煙草轉化實驗及轉基因植株的功能分析1、含草甘膦抗性突變體的轉基因煙草的獲得1)構建雙子葉植物轉化載體根據水稻EPSP合酶的cDNA序列(Genbank AF413081)合成用于擴增編碼轉運肽部分的DNA片段的引物，序列如下引物95’TCTAGAATGGCGGCGACCATG引物105’CAAGTACTGACTGCTGATGG以前述水稻eDNA為模板，PCR反應條件依高保真GC-rich專用LA Taq酶(TaKaRa)擴增系統說明書進行，變性溫度為94℃，退火溫度為60℃，延伸溫度為72℃，循環后72℃保溫10min。PCR產物用低熔點瓊脂糖凝膠回收，并插入到隆載體pGSMT-easy載體(Promega公司)上，按照Bio-Rad公司電激儀的操作程序，采用電擊法轉化E.coliDH5α，在含有X-gal和IPTG的氨芐青霉素培養基上挑選白色菌落，篩選得到重組質粒pBREPT。由上海博亞生物技術公司測序證明序列無誤。質粒pBREPT經XbaI/BglII雙酶切獲得轉運肽及EPSPs成熟蛋白編碼區前段，質粒pBREP及pBREP-MP分別經BglII/PstI雙酶切得到包括突變位點在內的EPSPs成熟蛋白編碼區后段，后將二者前、后兩段分別插入到pBluescripKS(+)的XbaI/PstI雙酶切位點，通過藍白斑篩選獲得重組質粒pBREPE(野生型)及pBREPE102(突變型)。然后分別經XbaI/KpnI雙酶切獲得轉運肽和EPSPs成熟蛋白編碼區，插入到植物表達載體pC-GENERAL的XbaI/KpnI雙酶切位點，經過篩選得到雙子葉植物表達載體pCEP和pCEP102(構建過程如圖8)。
在pCEP和pCEP102中，包含水稻轉運肽編碼序列在內野生型及突變型EPSP合酶編碼序列被添加調控元件花椰菜花葉病毒35s啟動子和nos基因終止子。
2)轉化煙草采用根農桿菌介導的葉盤法(高越峰，朱禎，肖桂芳，等.1998大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因的分離及其在抗蟲植物基因工程中的應用.植物學報40405-411)將pCEP和pCEP102分別轉化到煙草(Nicotiana tabacum L.cv.Xanthi)中，用卡那霉素篩選后得到轉基因植株。
3)轉基因的植株的檢測根據EPSP合酶基因序列和NPTII基因的內部序列分別設計上下游引物，引物序列如下引物115’ATGAAGGCGGAGGAGATCGTG引物125’TCGGCAGGAGCAAGGTGAGA分別提取步驟1獲得的轉基因植株的基因組DNA，取0.1μg基因組DNA為模版，分別在引物11和引物12的引導下，用PCR法鑒定外源基因在基因組上的整合情況，電泳PCR產物結果如圖9所示(泳道M為Marker，泳道CK-為轉化有空載體的陰性對照植株，泳道2-17為轉基因植株，泳道CK+為以質粒pCEP(10pg)為模板的PCR產物(陽性對照)，可擴增出2.5kb左右大小特異片段的即為同時含有EPSP合酶基因序列和NPTII基因轉基因陽性植株，除泳道7和泳道14為假陽性植株外，其余均為陽性植株。
2、對轉基因植株進行草甘膦抗性的檢測隨機選取轉基因植株的葉片剪成小片置于含0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50mM不同濃度草甘膦的分化培養基(配方見高越峰，朱禎，肖桂芳，等.1998大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因的分離及其在抗蟲植物基因工程中的應用.植物學報40405-411)上進行分化，結果如圖10所示，表明轉化有pCEP102的葉片分化情況明顯優于轉化有pCEP的葉片及轉空載體的陰性對照。然后以2升/公頃劑量的農達(主要成分為草甘膦的市售除草劑)噴灑轉基因植株，結果如圖11所示該照片攝于農達噴灑后第十四天；1、2、3為沒有噴灑草甘膦的對照植株，4、5、6為噴灑了2.0L/ha劑量農達的植株；其中，1和4來自轉pC-GENERAL(空載體，只含卡那霉素抗性基因)煙草同一克隆的植株(野生型煙草對照)，2、5來自轉pCEP煙草同一克隆的植株(轉有野生型水稻EPSP合酶基因)，3、6來自轉pCEP102煙草同一克隆的植株(轉有突變型水稻EPSP合酶基因)，表明轉pCEP102的植株受損情況也明顯低于轉pCEP的植株，對草甘膦具有較高的抗性。
序列表<160>3<210>1<211>444<212>PRT<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>1Lys Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Arg Glu Ile Ser Gly Ala1 5 10 15Val Gln Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu20 25 30Ser Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu AsnSer35 40 45Glu Asp Val His Tyr Met Leu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Gly Leu Ser50 55 60Val Glu Ala Asp Lys Val Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys Gly65 70 75 80Gly Lys Phe Pro Val Glu Lys Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe85 90 95Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr100 105 110Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met115 120 125Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly130 135 140Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Glu Cys Pro Pro Val Arg Val145 150 155 160
Lys Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser165 170 175Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala180 185 190Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu IleSer Ile Pro195 200 205Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala210 215 220Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys225 230 235 240Tyr Lys Ser Pro Gly Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala245 250 255Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val260 265 270Gln Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu275 280 285Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Asp Thr Ser Val290 295 300Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Tyr Gly Lys Lys His Leu Lys305 310 315 320Ala Val Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu325 330 335Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val340 345 350Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr355 360 365Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys370 375 380Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Ile Thr Ala Ile Asp Thr Tyr385 390 395 400Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Asp405 410 415
Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro420 425 430Asn Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Arg Asn435 440<210>2<211>444<212>PRT<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>2Lys Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Arg Glu Ile Ser Gly Ala1 5 10 15Val Gln Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu20 25 30Ser Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn Ser35 40 45Glu Asp Val His Tyr Met Leu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Gly Leu Ser50 55 60Val Glu Ala Asp Lys Val Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys Gly65 70 75 80Gly Lys Phe Pro Val Glu Lys Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe85 90 95Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Leu Leu Thr Ala Ala Val Thr100 105 110Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met115 120 125Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly130 135 140Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Glu Cys Pro Pro Val Arg Val145 150 155 160
Lys Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser165 170 175Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala180 185 190Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro195 200 205Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala210 215 220Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys225 230 235 240Tyr Lys Ser Pro Gly Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala245 250 255Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val260 265 270Gln Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu275 280 285Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Asp Thr Ser Val290 295 300Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Tyr Gly Lys Lys His Leu Lys305 310 315 320Ala Val Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu325 330 335Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val340 345 350Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr355 360 365Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys370 375 380Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Ile Thr Ala Ile Asp Thr Tyr385 390 395 400Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Asp
405 410 415Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro420 425 430Asn Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Arg Asn435 440<210>3<211>1485<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sative var.Lansheng)<400>3ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa60aaggaagagt atgaaggcgg aggagatcgt gctccagccc atcagggaga tctccggggc120ggttcagctg ccagggtcca agtcgctctc caacaggatc ctcctcctct ccgccctctc180cgagggcaca acagtggtgg acaacttgct gaacagtgag gatgttcact acatgcttga240ggccctgaaa gccctcgggc tctctgtgga agcagataaa gttgcaaaaa gagctgtagt300cgttggctgt ggtggcaagt ttcctgttga gaaggatgcg aaagaggaag tgcaactctt360cttggggaac gctggaactg caatgcgact attgacagca gccgtgactg ctgctggtgg420aaatgcaact tatgtgcttg atggagtgcc acgaatgagg gagagaccga ttggtgactt480ggttgtcggg ttgaaacaac ttggtgcgga tgtcgactgt ttccttggca ctgaatgccc540acctgttcgt gtcaagggaa ttggaggact tcctggtggc aaggttaagc tctctggttc600catcagcagt cagtacttga gtgccttgct gatggctgct cctttggccc ttggggatgt660ggagatcgaa atcattgaca aactaatctc cattccttac gttgaaatga cattgagatt720gatggagcgt tttggtgtga aggcagagca ttctgatagt tgggacagat tctatattaa780gggagggcag aagtacaaat ctcctggaaa tgcctatgtt gaaggtgatg cctcaagcgc840gagctatttc ttggctggtg ctgcaatcac tggaggcact gtgacagttc aaggttgtgg900tacgaccagt ttgcagggtg atgtcaaatt tgctgaggta cttgagatga tgggagcaaa960ggttacatgg actgacacca gtgtaaccgt aactggtcca ccacgtgagc cttatgggaa1020gaaacacctg aaagctgttg atgtcaacat gaacaaaatg cctgatgttg ccatgaccct1080tgccgttgtt gcactcttcg ctgatggtcc aactgctatc agagatgtgg cttcctggag1140agtaaaggaa accgaaagga tggttgcaat tcggaccgag ctaacaaagc tgggagcatc1200
ggttgaagaa ggtcctgact actgcatcat caccccaccg gagaagctga acatcacggc1260aatcgacacc tacgatgatc acaggatggc catggccttc tccctcgctg cctgcgccga1320cgtgcccgtg acgatcaggg acctggttgc acccgcaaga ccttccccaa ctacttcgac1380gttctaagca ctttcgtcag gaactgaact gagcttttaa aagagtgagc tgcagcaatg1440gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctcta148權利要求
1.一種5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突變體，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突變體的基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID№3的DNA序列。
4.含有權利要求2或3所述的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突變體編碼基因的表達載體、轉基因細胞系、宿主菌和擴增權利要求2或3所述基因中任一片段的引物。
5.一種獲得5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因突變體的方法，特征是構建含有EPSP合酶基因的大腸桿菌組成型表達載體，并利用易錯PCR技術對大腸桿菌表達載體中的EPSP合酶基因進行隨機突變，再將含有EPSP合酶突變基因的大腸桿菌表達載體導入宿主菌獲得EPSP合酶基因的突變體庫，最后將其轉移到含有不同濃度草甘膦的培養基上進行篩選得到抗草甘膦的重組子，測序得到5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因突變體。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述EPSP合酶基因突變體來源于水稻，為序列表中SEQ ID №3。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于所述宿主菌為E.coli AB2829。
8.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于所述轉移重組子的方法為平板影印法；所述培養基為M9或MOPS限制型培養基。
9.一種培育抗草甘膦植物的方法，是構建含有權利要求2或3所述基因的植物表達載體，再將構建的植物表達載體轉化目的植物。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述目的植物為水稻、玉米、小麥、大麥、高粱、煙草、棉花、楊樹、大豆、甘薯、馬鈴薯、白菜、甘藍或青椒。
全文摘要
本發明公開了一種5－烯醇丙酮酰莽草酸－3－磷酸合酶突變體及其編碼基因、獲得該酶的方法與其在培育抗草甘膦植物中的應用。該5－烯醇丙酮酰莽草酸－3－磷酸合酶，是具有SEQ ID №2氨基酸殘基序列。本發明的5－烯醇丙酮酰莽草酸－3－磷酸合酶將在抗草甘膦植物的培育中發揮重要作用。
文檔編號C12N15/09GK1810962SQ200510002739
公開日2006年8月2日 申請日期2005年1月26日 優先權日2005年1月26日
發明者朱禎, 周敏 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所