專利名稱：一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋pcr快速定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及油田水系統中常規污水、含聚污水、地面工藝的水處理過程中硫酸鹽還原菌(SRB)的快速定量檢測方法。
背景技術：
目前，油田系統內SRB菌的計數主要執行中國石油天然氣行業標準，“油田注入水細菌分析方法——絕跡稀釋法(MPN)”(部頒標準)、SY-T0532-93。上述的這種方法存在的問題是檢測需要14天的時間，由于檢測周期較長，不能有效的和即時的指導生產實踐，在實際操作過程中有些嚴格的厭氧SRB菌無法生存，導致SRB菌的記數結果不準確，不能真實的反映生產實際情況，同時檢測費用較高；并且由于現有檢測方法是以核酸DNA為模板，存在著記數結果不準確的問題。
發明內容
針對現有的油田水質SRB菌檢測中存在檢測周期長、不能真實全面的反應水中的SRB菌的數量、不能即時的指導生產、檢測費用較高的問題，從而提供一種記數結果準確、可有效的縮短計數時間、真實的反映生產實際情況、降低檢測費用的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，它是以經倍比稀釋的硫酸鹽還原菌的菌體為模板直接進行PCR擴增檢測。它依次包括以下步驟(1).制備菌體前處理緩沖液；(2).菌體的制備；(3).倍比稀釋；(4).進行冰上的PCR操作；(5).PCR在擴增儀上的擴增；(6).1.0％的瓊脂糖電泳檢測；(7).結果觀察，查表記數；所述“(4).進行冰上的PCR操作”過程中的PCR反應體系為20μl包括Buffer(10×)2μl、0.3mmol·L-1的d NTP 2μl、濃度為0.1μmol·L-1的正向引物SRBF 1μl、濃度為0.1μmol·L-1的反向引物SRBR 1μl，rTaq酶0.3U，其余加去離子水11.7μl，然后加2μl的樣品。本發明方法針對硫酸鹽還原菌特意性引物，采用PCR的擴增方法，直接以菌體為模板，具有記數更加準確的優點；由于可以精確到一個菌體，所以有效的縮短了計數時間，整個發明從做樣到出結果只需要四個小時，遠遠小于14天的記數時間。由于真實的表證了水樣的實際的SRB菌的數量，準確的反應了當時生產實際情況，所以可以直接有效的指導生產，降低了檢測費用，利于推廣應用。
圖1是應用五管平行法計數1至4梯度電泳圖譜，圖2是應用五管平行法計數5至7梯度電泳圖譜。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式為一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，它依次包括以下步驟(1).制備菌體前處理緩沖液；(2).菌體的制備；(3).倍比稀釋；(4).進行冰上的PCR操作；(5).PCR在擴增儀上的擴增；(6).1.0％的瓊脂糖電泳檢測；(7).結果觀察，查表記數；所述“(4).進行冰上的PCR操作”過程中的PCR反應體系為20μl包括Buffer(10×)2μl、0.3mmol·L-1的d NTP 2μl、濃度為0.1μmol·L-1的正向引物SRBF 1μl、濃度為0.1μmol·L-1的反向引物SRBR 1μl，rTaq酶0.3U，其余加去離子水11.7μl，然后加2μl的樣品。
具體實施方式
二本實施方式的詳細操作過程依次如下(1).制備菌體前處理緩沖液“菌體前處理緩沖液”的母液成分為70gNaCi、2g Kci、12g Na2HPO4、2g KH2PO4、1‰ SDS；將母液稀釋10倍成為菌體前處理緩沖液；控制工作液的pH為7.5，在121℃條件下滅菌15～30min后即可。
(2).菌體的制備依次包括以下步驟a.菌體的制備在超凈工作臺下完成，需要先將超凈工作臺進行紫外線滅菌20～40min，然后將用含有高純氮氣的厭氧管取回的油田污水的水樣，或生物反應器的污泥，取1mL注入到經滅菌的1.5mL的離心管中；b.對油田污水的水樣在震蕩器上充分震蕩3～6min，對生物反應器的污泥在震蕩器上充分震蕩10～5min，13000r/min離心1min；從管中輕輕的棄上清液0.9mL；c.在剩余的0.1mL中加入“菌體前處理緩沖液”0.9mL，對油田污水的水樣在震蕩器上充分震蕩3～6min，對生物反應器的污泥在震蕩器上充分震蕩10～15min；d.13000r/min離心2min，棄上清液0.98mL，充分震蕩2min。
(3).倍比稀釋倍比稀釋在冰上進行，具體操作過程如下吸取2μl(2)步驟得到的菌體加入用于倍比稀釋的管中，加入18μl的去離子水，得稀釋液；然后再從稀釋管中取2μl稀釋液加入另一個稀釋管中繼續稀釋，最終水樣被稀釋十倍；重復上述過程，直至稀釋液中無SRB。
(4).進行冰上的PCR操作操作過程采用三管平行法，每個梯度3個或5個樣。PCR反應體系為20μl包括Buffer(10×)2μl、0.3mmol·L-1的d NTP 2μl、濃度為0.1μmol·L-1的正向引物SRBF1μl、濃度為0.1μmol·L-1的反向引物SRBR 1μl，rTaq酶0.3U，其余加去離子水11.7μl，然后加2μl的樣品。其中，正向引物SRBF的硫酸鹽還原菌特意性探針的堿基組成為5’-CCTGACGCAGCGACGCCG-3’，共18bp；反向引物SRBR的硫酸鹽還原菌特意性探針的堿基組成為5’-CTACCAGGGTATCTAATCC-3’，共19bp。
(5).PCR在擴增儀上的擴增操作程序為94℃預熱5min，94℃變性30s，58.8℃復性45s，72℃延伸90s，循環30次，最后72℃延伸10min。
(6).擴增產物于1.0％的瓊脂糖電泳檢測；需要一個半小時。
(7).結果觀察，查表記數。
具體實施方式
三本實施方式用含有高純氮氣的厭氧管取回的油田污水作檢測樣，采用五管平行法進行冰上PCR操作，每個梯度5個樣。1.0％的瓊脂糖電泳檢測，檢測結果如圖1、圖2所示。進行結果觀察，查表記數。
具體查表計算方法是選擇后三個連續稀釋梯度(10x、10x+1、10x+2)，將有菌體DNA條帶出現的管數按稀釋梯度由小到大的順序排列成一個三位數稱之為條帶近似值(abc)。其中，第一個稀釋梯度(10x)是最后一個5個試管中都有菌體DNA條帶出現的稀釋梯度，如果第三個稀釋梯度(10x+2)再往下的梯度稀釋管仍有菌體DNA條帶出現，可將此管數加到第三個稀釋梯度(10x+2)上。然后查閱哈爾濱工業大學出版社2002年出版的《污染控制微生物學實驗》32-38頁“每毫升稀釋液的細菌近似值表”得出對應數值，計算出1mL檢測樣中反硝化細菌的總數。計算公式如下1mL檢測樣中反硝化細菌的總數(個)＝條帶近似值(abc)表中對應數值×三個稀釋梯度中第一個稀釋梯度的稀釋倍數(10x)×10×102％；本實施方式選擇104、105、106三個稀釋梯度，條帶近似值(510)，查閱哈爾濱工業大學出版社2002年出版的《污染控制微生物學實驗》32-38頁“每毫升稀釋液的細菌近似值表”得出其對應數值13.5。
從而得出本實施方式中1mL檢測樣中反硝化細菌的總數(個)＝條帶近似值(510)×104×10×102％＝13.5×104×10×102％＝1.377×106(個)。
三管平行法記錄的結果無論在檢測樣濃度低或高的情況下，數量級上與五管平行法無差別。本實施方式結果表明，采用五管平行法可以精確到一個菌體，使檢測結果更加準確，置信度大于99％。
試驗驗證，采用五管平行法記數的結果與用硫酸鹽還原菌細菌檢測試劑瓶(北京華興化學試劑廠)14天的記數結果相比數量級上平均大102，更能反應水樣中實際的SRB菌的數量。
另外，本發明操作過程中所采用各成分的具體體積數值只在于表示相互間的比例關系，其在實際應用中不限于該數值的使用，只要符合相互間的比例關系即可實現本發明的目的，所以都應在本發明的保護范圍之內；同時，由于在檢測過程中有許可誤差的存在，本發明所提到的數值也只是具有指導性的意義，所以在實際應用中只要使用了本發明所述過程的檢測方法，即應在本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征在于它依次包括以下步驟(1).制備菌體前處理緩沖液；(2).菌體的制備；(3).倍比稀釋；(4).進行冰上的PCR操作；(5).PCR在擴增儀上的擴增；(6).1.0％的瓊脂糖電泳檢測；(7).結果觀察，查表記數；所述“(4).進行冰上的PCR操作”過程中的PCR反應體系為20μl包括Buffer(10×)2μl、0.3mmol·L-1的d NTP 2μl、濃度為0.1μmol·L-1的正向引物SRBF1μl、濃度為0.1μmol·L-1的反向引物SRBR1μl，rTaq酶0.3U，其余加去離子水11.7μl，然后加2μl的樣品。
2.根據權利要求1所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征在于正向引物SRBF的硫酸鹽還原菌特意性探針的堿基組成為5’-CCTGACGCAGCGACGCCG-3’，共18bp；反向引物SRBR的硫酸鹽還原菌特意性探針的堿基組成為5’-CTACCAGGGTATCTAATCC-3’，共19bp。
3.根據權利要求1或2所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征在于“(2).菌體的制備”過程依次包括以下步驟a.將用含有高純氮氣的厭氧管取回的油田污水的水樣，或生物反應器的污泥，取1mL注入到經滅菌的1.5mL的離心管中；b.對油田污水的水樣在震蕩器上充分震蕩3～6min，對生物反應器的污泥在震蕩器上充分震蕩10～15min，13000r/min離心1min；從管中輕輕的棄上清液0.9mL；c.在剩余的0.1mL中加入“菌體前處理緩沖液”0.9mL，對油田污水的水樣在震蕩器上充分震蕩3～6min，對生物反應器的污泥在震蕩器上充分震蕩10～15min；d.13000r/min離心2min，棄上清液0.98mL，充分震蕩2min。
4.根據權利要求3所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征在于(1).制備“菌體前處理緩沖液”過程中，“菌體前處理緩沖液”的母液成分為70g NaCi、2g Kci、12g Na2HPO4、2g KH2PO4、1‰SDS；將母液稀釋10倍成為菌體前處理緩沖液；控制工作液的pH為7.5，在121℃條件下滅菌15～30min后即可。
5.根據權利要求3所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征在于菌體的制備在超凈工作臺下完成，需要先將超凈工作臺進行紫外線滅菌20～40min。
6.根據權利要求1或2所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征在于(5).“PCR在擴增儀上的擴增”程序為94℃預熱5min，94℃變性30s，58.8℃復性45s，72℃延伸90s，循環30次，最后72℃延伸10min。
7.根據權利要求4所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征在于(5).“PCR在擴增儀上的擴增”程序為94℃預熱5min，94℃變性30s，58.8℃復性45s，72℃延伸90s，循環30次，最后72℃延伸10min。
8.根據權利要求1或2所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征在于(3).“倍比稀釋”過程要在冰上進行且需要達到稀釋液中無SRB。
9.根據權利要求8所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征在于倍比稀釋過程如下吸取2μl(2)步驟得到的菌體加入用于倍比稀釋的管中，加入18μl的去離子水，得稀釋液；然后再從稀釋管中取2μl稀釋液加入另一個稀釋管中繼續稀釋，最終水樣被稀釋十倍；重復上述過程，直至稀釋液中無SRB。
10.根據權利要求1或2所述的一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，其特征在于“(4).進行冰上的PCR操作”過程采用三管或五管平行法，每個梯度3個或5個樣。
全文摘要
一種硫酸鹽還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法，涉及水處理過程中硫酸鹽還原菌(SRB)的定量檢測方法。現在檢測方法存在檢測周期較長、不能有效的和即時的指導生產實踐和檢測費用較高等缺點。本發明依次包括以下步驟(1).制備“菌體前處理緩沖液”；(2).菌體的制備；(3).倍比稀釋；(4).進行冰上的PCR操作；(5).PCR在擴增儀上的擴增；(6).擴增產物于1.0％的瓊脂糖電泳檢測；(7).結果觀察，查表記數。本發明所述方法記數結果準確、可有效的縮短計數時間、真實的反映生產實際情況、降低檢測費用，利于推廣應用。
文檔編號C12Q1/04GK1769472SQ200510010459
公開日2006年5月10日 申請日期2005年10月21日 優先權日2005年10月21日
發明者馬放, 魏利 申請人:哈爾濱工業大學