專利名稱：日本血吸蟲中國大陸株硫氧還蛋白基因及其克隆表達方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及日本血吸蟲(中國大陸株)硫氧還蛋白(SjcTrx)基因的序列及其克隆表達方法和應用。
背景技術：
日本血吸蟲病曾廣泛流行于我國長江流域及其以南的12省、市、自治區，1950年代初，全國約有1160萬血吸蟲病患者，中間宿主釘螺分布面積148億m2。經過半個多世紀不懈努力，我國的血吸蟲病防治工作取得了舉世矚目的成就，至1995年，已有廣東、上海、福建、廣西、浙江等5省(區、市)達到了血吸蟲病傳播阻斷標準。但是，近年來，我國血吸蟲病流行范圍有所擴大，血防工作形勢比較嚴峻，突出表現在血吸蟲病感染人數增多，局部地區出現急性感染暴發疫情；部分地區疫情死灰復燃，疫區范圍明顯擴大并向城市蔓延；釘螺大面積擴散，人畜感染的危險增加。近幾年報告病人數呈上升趨勢，其中，急性感染人數明顯增加，2002年比2001年增加59％，2003年又比2002年增加22％，并發生了30余起急性血吸蟲病暴發疫情。2003年，全國還有110個縣流行血吸蟲病，病人84.3萬，釘螺面積35億m2以上；2004年仍有病人84.25萬，釘螺面積38.46億m2。血吸蟲病的流行范圍和有螺面積之廣，病人數之多均居日本血吸蟲病流行國家之首。滅螺和吡喹酮大規模化療，實踐證明并未根本解決血吸蟲病防治問題。重復感染的問題嚴重存在、惟一有效化療藥物吡喹酮的長期使用可能產生抗藥株和大量哺乳動物保蟲宿主的存在，是我國血吸蟲病防治工作面臨的主要問題。因而尋找長效防治措施成為主要目標，鑒于疫苗預防作用的持效性和經濟的特點，被作為血吸蟲病綜合防治重要的措施之一而倍受關注化療手段(短效)與長效的措施(疫苗)相結合。尋找疫苗新的候選抗原分子是日本血吸蟲病疫苗研究的重點之一。
硫氧還蛋白(Trx)是一種有氧化還原作用的小分子量蛋白質，在體內具有抗過氧化、清除游離基、保護組織器官等作用，并與細胞凋亡、免疫調節、胚胎植入和發育有關。到目前為止，尚未見涉及本說明書中日本血吸蟲中國大陸株硫氧還蛋白(SjcTrx)基因及其應用研究的報道。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于
公開日本血吸蟲中國大陸株硫氧還蛋白(SjcTrx)基因序列，以及SjcTrx基因的克隆和在大腸桿菌中的表達方法，并公開SjcTrx基因在制備防治日本血吸蟲病疫苗中的應用。
本發明依據公布的日本血吸蟲菲律賓株硫氧還蛋白基因序列設計引物，以日本血吸蟲大陸株成蟲總RNA為模板，反轉錄PCR(RT-PCR)擴增SjcTrx基因的完整編碼框，分別克隆到原核表達載體pET28a和真核表達載體pcDNA3中，分別構建了重組質粒pET28a-SjcTrx和pcDNA3-SjcTrx，并對克隆的基因核苷酸序列進行了測定。
本發明公開的SjcTrx基因具有序列1所示的核苷酸序列及序列2所示的編碼相應的氨基酸序列。SjcTrx基因開放閱讀框編碼106個氨基酸，根據測序結果推導的氨基酸序列與日本血吸蟲菲律賓株硫氧還蛋白有97％的同源性(見附圖1)，與曼氏血吸蟲硫氧還蛋白有43％的同源性(見附圖2)。
本發明公開的SjcTrx基因在大腸桿菌中的表達方法是將SjcTrx基因克隆到原核表達質粒pET28a(+)中，構建重組質粒pET28a-SjcTrx，轉化BL21表達菌后，用IPTG誘導表達。SDS-PAGE電泳分析顯示，重組質粒獲得高效表達，表達蛋白分子量約14kDa，命名為reSjcTrx。
Western Blotting試驗顯示重組蛋白可被日本血吸蟲感染兔血清和reSjcTrx重組抗原免疫小鼠血清識別，而與正常兔血清和正常小鼠血清無反應，說明reSjcTrx具有良好的抗原性。用Ni柱親和層析法純化重組蛋白reSjcTrx，以純化的重組蛋白作為抗原，免疫C57BL/6小鼠，免疫劑量為15μg/鼠，共免疫3次，間隔2周。末次免疫后3周用日本血吸蟲尾蚴攻擊感染，攻擊感染后6周剖殺小鼠，計數成蟲數和肝內蟲卵數。結果表明，與感染對照組相比，reSjcTrx加ISA720佐劑免疫組小鼠攻擊感染后的減蟲率和肝組織減卵率分別為22.8％和29.5％。
本發明研究發現，SjcTrx基因可用于制備防治日本血吸蟲病疫苗。將SjcTrx基因克隆到真核表達質粒pcDNA3中，構建成DNA疫苗pcDNA3-SjcTrx。核酸疫苗注射C57BL/6小鼠，SjcTrx可以在小鼠肌肉注射局部的肌細胞中表達。在C57BL/6小鼠免疫保護試驗中，每只小鼠經股四頭肌注射100μg核酸疫苗，共注射3次，間隔2周。于末次免疫后3周用日本血吸蟲尾蚴攻擊感染，攻擊感染后6周剖殺小鼠，計數成蟲數和肝內蟲卵數。結果表明，與感染對照組相比，核酸疫苗免疫組減蟲率和肝組織減卵率分別為45.7％和41.4％，核酸疫苗和蛋白疫苗聯合免疫組減蟲率和肝組織減卵率分別為37.0％和31.6％。
下面結合實施例對本發明作進一步的描述。
圖1日本血吸蟲中國大陸株硫氧還蛋白與日本血吸蟲菲律賓株硫氧還蛋白同源比對分析圖2日本血吸蟲大陸株硫氧還蛋白與曼氏血吸蟲硫氧還蛋白同源比對分析圖3RT-PCR擴增目的基因及pET28a-SjcTrx重組質粒雙酶切及PCR鑒定11kb DNA marker；2pET28a空質粒；3pET28a-SjcTrx重組質粒；4pET28a空質粒雙酶切(BamHI和SalI)；5pET28a-SjcTrx重組質粒雙酶切(BamHI和SalI)；6pET28a空質粒DNA為模板PCR產物；7pET28a-SjcTrx重組質粒DNA為模板PCR產物；8SjcTrx RT-PCR產物；9100bp DNA Marker圖4SDS-PAGE分析重組蛋白的誘導表達及純化M蛋白標準分子量；1pET28a/BL21誘導前；2pET28a/BL21誘導后4h；3pET28a-SjcTrx/BL21誘導前；4pET28a-SjcTrx/BL21誘導后4h；5純化的重組蛋白reSjcTrx圖5Western Blotting對重組蛋白reSjcTrx的分析M蛋白標準分子量；1與日本血吸蟲感染兔血清反應；2與日本血吸蟲正常兔血清反應；3與reSjcTrx重組抗原免疫鼠血清反應；4與正常小鼠血清反應圖6ELISA檢測重組硫氧還蛋白(reSjcTrx)疫苗免疫小鼠血清特異性IgG抗體水平圖7RT-PCR擴增目的基因及pcDNA3-SjcTrx重組質粒雙酶切和PCR鑒定11kb DNA marker；2pcDNA3空質粒；3pcDNA3-SjcTrx重組質粒；4pcDNA3空質粒雙酶切(BamHI和SalI)；5pcDNA3-SjcTrx重組質粒雙酶切(BamHI和SalI)；6pcDNA3空質粒DNA為模板PCR產物；7pcDNA3-SjcTrx重組質粒DNA為模板PCR產物；8SjcTrx RT-PCR產物；9100bp DNA Marker圖8免疫染色試驗檢測核酸疫苗在小鼠肌肉組織中表達ApcDNA3-SjcTrx BpcDNA3圖9ELISA檢測核酸疫苗(pcDNA3-SjcTrx)免疫小鼠血清特異性IgG抗體
具體實施例方式
實施例1 日本血吸蟲硫氧還蛋白基因克隆和表達及重組蛋白小鼠免疫保護試驗1.材料1.1 日本血吸蟲大陸株尾蚴和成蟲含成熟尾蚴的陽性釘螺由本所重點實驗室提供，常規方法逸得尾蚴。日本血吸蟲大陸株成蟲(雌雄混合)，取自日本血吸蟲尾蚴感染6周的家兔。
1.2 菌株及質粒大腸桿菌BL21株和載體pET28a購自Novagen公司。
1.3 實驗動物6周齡C57BL/6雌性小鼠由中國科學院上海實驗動物中心提供。
1.4 主要試劑總RNA抽提試劑盒、質粒DNA抽提試劑盒、PCR產物純化試劑盒、酶切產物純化試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、反轉錄酶(AMV)、RNasin、T4DNA連接酶、限制性內切酶(BamHI和SalI)、羊抗鼠IgG-HRP等為美國Promega公司產品，Tris堿、瓊脂糖、鄰苯二胺(OPD)、二胺基聯苯胺(DAB)和4-氯-1-萘酚等為美國Sigma產品，蛋白質純化試劑盒購于Qiagen公司，MontanideISA720佐劑由法國Seppic公司提供，PVDF膜為美國BIO-RAD公司，Tryptone和Yeast Extract為OXOID公司產品，其它試劑均為國產分析純。
1.5 目的基因引物的設計分析日本血吸蟲菲律賓株硫氧還蛋白編碼基因，設計一對引物上游引物15′-GCGGATCCATGAGTAACGTACTGCATATAG-3′下 游 引 物1 5′-GCGTCGACTTAGCCATATTTCATATATAAGAGGCAC-3′上游引物5′端引入限制性內切酶BamHI酶切位點(劃線部分)和起始密碼子(黑體)，下游引物5′引入限制性內切酶SalI酶切位點(劃線部分)和終止密碼子(黑體)。引物由上海生工生物工程公司合成。
2.方法
2.1 SjcTrx基因的擴增按總RNA抽提試劑盒方法提取日本血吸蟲成蟲總RNA，反轉錄生成cDNA第一鏈，操作按試劑盒說明書進行。以反轉錄產物為模板，PCR擴增SjcTrx基因。反應體系為10×reaction Buffer5.0μl上游引物 11.0μl下游引物 11.0μldNTPs 2.0μl反轉錄產物 5.0μlTaq DNA聚合酶 0.5μl去離子水 35.5μl依次加入以上反應物，混勻后短時離心，進行PCR擴增。PCR反應條件為94℃預變性5min；94℃ 45sec，55℃ 1min，72℃ 1min，30個循環；最后72℃延長7min。
2.2 重組表達載體pET28a-SjcTrx的構建上述PCR產物進行1％低熔點瓊脂糖凝膠電泳，用PCR產物純化試劑盒對目的片段進行割膠純化。純化PCR產物和質粒pET28a用限制性內切酶BamHI和SalI雙酶切，雙酶切后的DNA片段用1％低熔點瓊脂糖凝膠電泳，用酶切產物純化試劑盒進行割膠純化。雙酶切質粒pET28a(+)DNA和PCR產物酶切片段經T4DNA連接酶進行連接，4℃連接過夜。連接產物轉化BL21(DE3)感受態細菌(冷氯化鈣法制備)，將菌液涂布于含卡那霉素(Kan)(30μg/ml)的LB固體培養基上，于37℃培養過夜。
2.3 重組質粒pET28a-SjcTrx的鑒定采用限制性酶切酶BamHI和SalI雙酶切、PCR和瓊脂糖凝膠電泳對重組質粒DNA進行鑒定。對篩選獲得的重組質粒進一步進行核苷酸序列測定進行鑒定，確定外源目的基因片段是否正確插入pET28a(+)載體中。
2.4 重組蛋白的誘導表達和純化重組質粒pET28a-SjcTrx轉化BL21菌液劃LB固體培養基板(含Kan 30μg/ml)培養過夜，挑取單個菌落接種于3ml LB液體培養基(含Kan 30μg/ml)培養過夜，以1∶100稀釋過夜培養菌于LB液體培養基(含Kan 30μg/ml)中，于37℃ 250轉/分鐘培養4h，加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度1mmol/L，誘導表達4h。離心收集菌體，超聲破裂菌體后，離心取上清液通過Ni-NTA的親和層析柱純化目的蛋白，純化的蛋白以紫外吸收法定量。
2.5 免疫印跡試驗(Western blotting)純化日本血吸蟲大陸株硫氧還蛋白重組蛋白(reSjcTrx)經SDS-PAGE電泳后，電轉移至PVDF膜，轉膜條件為30V恒壓轉移1h。吸附蛋白的PVDF膜浸在含1％脫脂奶粉的0.01mol/L磷酸緩沖液(PBS)中4℃封閉過夜。浸入一抗反應液(日本血吸蟲感染兔血清1∶100稀釋或reSjcTrx免疫小鼠血清1∶500稀釋，5％小牛血清，稀釋液為PBS)中37℃輕微振搖反應1h；用PBS-T(0.1％Tween-20)室溫輕微振搖洗滌3次，每次5min；浸入二抗反應液(HRP標記羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG1∶1000稀釋，5％小牛血清，稀釋液為PBS)，37℃輕微振搖反應1h，PBS-T洗滌3次，每次5min；用PBS洗滌1次，二胺基聯苯胺(DAB)和4-氯-1-萘酚顯色，觀察重組蛋白條帶是否被以上血清抗體識別。
2.6 reSjcTrx免疫保護作用的觀察將30只6周齡雌性C57BL/6小鼠隨機分為3組，每組10只reSjcTrx疫苗免疫組、ISA720佐劑對照組和感染對照組。疫苗免疫組每只小鼠經項背部多點皮下注射乳化的15μg reSjcTrx重組抗原和ISA720佐劑，共免疫3次，間隔2周；佐劑對照組小鼠則注射乳化的生理鹽水加ISA720佐劑，感染對照組小鼠不注射任何抗原或佐劑。末次免疫3周后，實驗組及對照組每鼠經腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴(30±1)條。尾蚴攻擊感染6周后，解剖小鼠門脈灌注收集血吸蟲成蟲，計數每只小鼠中收集的血吸蟲成蟲數，計算疫苗免疫小鼠的減蟲率
每只小鼠肝組織分別剪碎后按常規方法用8％氫氧化鉀消化，計數每只小鼠肝組織內血吸蟲卵數，計算肝組織減卵率 2.7 ELISA檢測免疫小鼠血清特異性IgG抗體疫苗免疫組和2個對照組小鼠分別于免疫前、攻擊感染前和剖殺前采血，分離血清，-20℃保存備用。用ELISA方法測定小鼠血清日本血吸蟲硫氧還蛋白特異IgG抗體水平。reSjcTrx重組抗原1μg/孔包被；加小鼠血清稀釋液(待測小鼠血清1∶80稀釋，稀釋液為0.01mol/LPBS)100μl/孔于37℃孵育1h，然后用PBS-T洗滌3次，每次5min；加羊抗鼠IgG稀釋液(1∶1000稀釋，稀釋液同上)，于37℃孵育1h，PBS-T洗滌3次，每次5min；OPD顯色液中顯色20min，加2mol/LH2SO4終止反應，測得各組A492值。
2.8 統計方法用SAS軟件包對數據進行t檢驗分析。
3 結果3.1 RT-PCR擴增目的基因及pET28a-Trx重組質粒鑒定SjcTrx編碼基因PCR擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測約334bp(見附圖3)，與預計的大小一致。pET28a-Trx重組質粒DNA經BamHI和SalI雙酶切及以重組質粒DNA為模板PCR反應產物經瓊脂糖凝膠電泳，均見RT-PCR產物大小相似條帶，而pET28a空質粒DNA經雙酶切(BamHI和SalI)和PCR均未見此條帶。
3.2 SjcTrx基因核苷酸序列測定和分析測序結果表明重組質粒pET28a-SjcTrx構建成功，證實SjcTrx編碼106個氨基酸(序列2)，表達蛋白的相對分子量14000(14kDa，含載體6個組氨酸)，經同源比對分析后發現與日本血吸蟲菲律賓株硫氧還蛋白氨基酸序列的同源性為97％(見附圖1)，與曼氏血吸蟲硫氧還蛋白氨基酸序列的同源性為43％(見附圖2)。
3.3 重組體誘導表達和重組抗原(reSjcTrx)的純化將pET28a-SjcTrx/BL21工程菌用IPTG誘導表達后，在Mr14000(14kDa)處有一條特異的表達條帶，而pET28a/BL21空質粒對照菌誘導后無此條帶。表達蛋白經Ni-NTA純化后也在Mr14000處有一條帶(附圖4)。
3.4 Western Blotting純化reSjcTrx與日本血吸蟲感染兔血清和重組抗原免疫小鼠血清有明顯反應(附圖5)。這說明重組硫氧還蛋白具有較好的抗原性和免疫反應性。
3.5 reSjcTrx免疫小鼠保護效果觀察免疫小鼠攻擊感染后6周剖殺，經門脈灌注收集成蟲并計數，疫苗免疫組(reSjcTrx加ISA佐劑)與ISA720佐劑對照組和感染對照組比較，檢獲成蟲數差異均有顯著意義(P＜0.05)。與感染對照組相比，疫苗免疫組小鼠的減蟲率為22.8％(表1)。
攻擊感染后6周剖殺小鼠，收集分離小鼠肝組織內血吸蟲蟲卵并計數，疫苗免疫組(reSjcTrx加ISA佐劑)與ISA720佐劑對照組和感染對照組比較，蟲卵數差異均有顯著意義(P＜0.05)。與感染對照組相比，疫苗免疫組小鼠的減卵率為29.5％(表1)。
表1 日本血吸蟲重組硫氧還蛋白(reSjcTrx)疫苗免疫小鼠的減蟲率和減卵率
注與ISA720佐劑對照組和感染對照組比較，*P＜0.053.6 ELISA檢測重組蛋白reSjcTrx免疫小鼠血清特異性IgG抗體
重組蛋白疫苗免疫組小鼠免疫后血清特異性IgG A值比佐劑對照組和感染對照組小鼠顯著升高(P＜0.01)(附圖6)。
實施例2、日本血吸蟲硫氧還蛋白核酸疫苗的構建及核酸疫苗小鼠免疫保護試驗1 材料1.1 日本血吸蟲大陸株尾蚴和成蟲含成熟尾蚴的陽性釘螺由本所重點實驗室提供，常規方法逸得尾蚴。日本血吸蟲大陸株成蟲(雌雄混合)，取自日本血吸蟲尾蚴感染6周的家兔。
1.2 菌株及質粒大腸桿菌JM109株購自Invotrogen公司和載體pcDNA3購自Novagen公司。
1.3 實驗動物6周齡C57BL/6雌性小鼠由中國科學院上海實驗動物中心提供。
1.4 主要試劑總RNA抽提試劑盒、質粒DNA抽提試劑盒、PCR產物純化試劑盒、酶切產物純化試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、反轉錄酶(AMV)、RNasin、T4DNA連接酶、限制性內切酶(BamHI和EcoRI)、羊抗鼠IgG-HRP等為美國Promega公司產品，Tris堿、瓊脂糖、氨芐青霉素和鄰苯二胺(OPD)等為美國Sigma產品，Tryptone和Yeast Extract為OXOID公司產品，其它試劑均為國產分析純。
1.5 目的基因引物的設計分析日本血吸蟲菲律賓株硫氧還蛋白基因，分析讀碼框，設計一對引物上游引物25′-gcggatccATG AGTAACGTACTGC-3′下游引物25′-gcgaattcTCATTTGTGTTTCCGG-3′上游引物引入BamHI酶切位點，下游引物引入EcoRI酶切位點。引物由上海生工生物工程公司合成。
2.方法2.1 SjcTrx基因的擴增按總RNA抽提試劑盒方法提取日本血吸蟲成蟲總RNA，常規方法反轉錄生成cDNA第一鏈。以反轉錄產物為模板，PCR擴增SjcTrx基因。反應體系為10×reaction Buffer5.0μl上游引物2 1.0μl下游引物2 1.0μldNTPs 2.0μl反轉錄產物 5.0μlTaq DNA聚合酶 0.5μl去離子水 35.5μl依次加入以上反應物，混勻后短時離心，進行PCR擴增。PCR反應條件為94℃預變性5min；94℃ 45sec，55℃ 1min，72℃ 1min，30個循環；最后72℃延長7min。
2.2 重組表達載體pcDNA3-SjcTrx的構建上述PCR產物進行1％低熔點瓊脂糖凝膠電泳，用PCR產物純化試劑盒對目的片段進行割膠純化。純化PCR產物和質粒pcDNA3用限制性內切酶BamHI和EcoRI雙酶切，雙酶切后的DNA片段用1％低熔點瓊脂糖凝膠電泳，用酶切產物純化試劑盒進行割膠純化。純化pcDNA3雙酶切DNA片段和純化PCR產物酶切片段經T4DNA連接酶進行連接，4℃連接過夜。連接產物轉化JM109感受態細菌(冷氯化鈣法制備)，將菌液涂布于含氨芐青霉素(Amp)(100μg/ml)的LB固體培養基上，于37℃培養過夜。次日挑取分隔良好的單個菌落分別于含Amp(100μg/ml)的LB培養液中培養擴增，抽提質粒DNA，用于進一步鑒定。
2.3 真核表達重組質粒pcDNA3-SjcTrx的鑒定和大量制備采用限制性內切酶BamHI和EcoRI雙酶切、PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳對重組質粒DNA進行鑒定。對篩選獲得的陽性克隆重組質粒進一步用核苷酸序列測序進行鑒定。鑒定正確的pcDNA3-SjcTrx/JM109工程菌單個菌落接種于含Amp(100μg/ml)的LB培養液中培養擴增，次日按1∶100比例加入LB液體培養基(含Amp100μg/ml)于37℃ 250轉/分鐘培養4h。離心收集菌體，用堿裂解法大量提取重組質粒pcDNA3-SjcTrx，溶于無菌生理鹽水，經BamHI和EcoRI雙酶切和核苷酸序列測定進行鑒定。紫外分光光度計測定質粒的A260和A280，計算含量和純度分析。同法制備pcDNA3空質粒DNA作為對照。
2.4 免疫酶染色試驗(IEST)觀察DNA疫苗在肌肉注射的局部組織中的表達取6只6周齡雌性C57BL/6小鼠，每鼠經股四頭肌注射pcDNA3-SjcTrx DNA疫苗100μg，分別于注射后24小時、48小時和72小時取肌肉注射部位局部組織制備冰凍切片，用IEST檢測注射局部組織中目的基因的表達情況，以注射pcDNA3空質粒者為對照(2只C57BL/6小鼠)。取出冰凍切片，回復至室溫，0.01mol/L PBS漂洗，用含3％小牛血清的0.01mol/L PBS于37℃封閉2h；加抗reSjcTrx免疫小鼠血清(1∶50稀釋，5％小牛血清)37℃孵育1h，用PBS-T(1％Tween-20)洗滌3次，每次5min；加HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶100稀釋)，37℃孵育1h；PBS-T洗滌3次，加DAB顯色液，室溫顯色20min，PBS-T洗滌3次終止反應，光學顯微鏡下觀察。
2.5 小鼠免疫保護作用觀察將30只6周齡雌性C57BL/6小鼠隨機分為3組pcDNA3-SjcTrx核酸疫苗免疫組、pcDNA3空質粒對照組和攻擊感染對照組，每組10只小鼠。按10μl/克體重經腹腔注射0.75％戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠，核酸疫苗免疫組每只小鼠經股四頭肌注射100μg pcDNA3-SjcTrx質粒DNA，共注射3次，間隔2周；空質粒對照組每只小鼠在相應時間經股四頭肌注射100μg pcDNA3質粒DNA；感染對照組則不注射任何質粒DNA。末次免疫后3周，各組每鼠經腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴(30±1)條。于攻擊感染后6周，剖殺小鼠，門脈灌注收集成蟲，小鼠肝組織用8％氫氧化鉀消化后于顯微鏡下計數血吸蟲蟲卵數，并計算減蟲率和減卵率。
各組小鼠分別于免疫前、攻擊感染前和剖殺前采血，分離血清，-20℃保存，用于特異性抗體的檢測。
2.6 ELISA檢測免疫小鼠血清特異性抗體(IgG)水平用ELISA方法測定上述小鼠血清特異性IgG水平。重組抗原reSjcTrx 1μg/孔包被，加含5％小牛血清的0.01mol/L PBS 37℃封閉2h；加待測小鼠血清(1∶80稀釋)37℃孵育1h；用PBS-T(含0.1％Tween-20)洗滌3次，每次5min；加HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶1000稀釋)，37℃孵育1h；PBS-T洗滌3次，加OPD顯色液顯色，2mol/LH2SO4終止反應，測定各組A492值。
2.7 統計方法用SAS軟件包對數據進行t檢驗分析。
3.結果3.1 RT-PCR擴增SjcTrx基因及pcDNA3-SjcTrx重組質粒鑒定SjcTrx編碼基因PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測約334bp(附圖7)，與預計大小一致。SjcTrx基因與pcDNA3原核表達載體連接而構建的重組質粒(pcDNA3-Trx)經BamHI和EcoRI雙酶切及以重組質粒DNA為模板PCR反應產物經瓊脂糖凝膠電泳，均見類似大小條帶，而pcDNA3空質粒DNA經雙酶切及PCR均未見此條帶。
3.2 SjcTrx基因核苷酸序列測定經核苷酸序列測定驗證，SjcTrx編碼基因與上述蛋白疫苗基因完全一致(序列1和2)，表明SjcTrx的cDNA以正確的方向克隆入真核表達載體pcDNA3，重組pcDNA3-SjcTrx質粒構建成功。
3.3 核酸疫苗在小鼠肌肉組織中表達pcDNA3-SjcTrx注射小鼠肌肉組織免疫后，于不同時間取注射部位小鼠肌肉組織制備冰凍切片，IEST檢測局部表達蛋白情況。結果，注射24h就有明顯的SjcTrx蛋白表達，小鼠肌細胞內可見特異性片狀或點狀棕黃色染色，而空質粒免疫小鼠骨骼肌細胞內未見特異性染色顆粒(附圖8)。表明pcDNA3-SjcTrx可在注射部位肌細胞內表達。
3.4 核酸疫苗免疫保護性作用觀察攻擊感染后6周，疫苗免疫組、空質粒對照組和攻擊感染對照組平均檢獲成蟲數分別為10.0、15.2和18.0條，疫苗免疫組與空質粒對照組和攻擊感染對照組相比，差異均有顯著性(P＜0.05)。與感染對照組相比，疫苗免疫組和空質粒對照組的減蟲率分別為45.7％和17.4％(表2)。
疫苗免疫組、空質粒對照組和攻擊感染對照組平均蟲卵數分別為7086、8098和12095，疫苗免疫組與感染對照組相比差異有非常顯著性(P＜0.01)。與感染對照組相比，疫苗免疫組和空質粒對照組的減卵率分別為41.4％和33.0％(表2)。
表2 pcDNA3-SjcTrx核酸疫苗免疫小鼠減蟲率和減卵率
與感染對照組比較，(1)P＜0.01，(2)P＜0.053.5 免疫小鼠血清特異性IgG水平核酸疫苗免疫組小鼠免疫后血清特異性IgG A值比空質粒和攻擊感染對照組顯著升高(P＜0.05)，而空質粒對照組與攻擊感染對照組無明顯差異(P＞0.05)(附圖9)。
序列表<110>中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所<120>日本血吸蟲中國大陸株硫氧還蛋白基因及其克隆表達方法和應用<130>說明書、權利要求書<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>321<212>DNA<213>日本血吸蟲中國大陸株硫氧還蛋白(SjcTrx)基因序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(318)<400>1atg agt aac gta ctg cat ata gaa acc gat gac gat ttt gat tct ttc48Met Ser Asn Val Leu His Ile Glu Thr Asp Asp Asp Phe Asp Ser Phe1 5 10 15tta aag gaa aat aag gat aaa tta att gtt gtt gat ttt ttc gca act96Leu Lys Glu Asn Lys Asp Lys Leu Ile Val Val Asp Phe Phe Ala Thr20 25 30tgg tgt ggg ccg tgt aaa aaa ata gct cct gct ttc gaa gcg ttg agc 144Trp Cys Gly Pro Cys Lys Lys Ile Ala Pro Ala Phe Glu Ala Leu Ser35 40 45gct gat cgt tcg gca tta tat gtg aag gtt gac gtg gat aaa ctt gaa 192Ala Asp Arg Ser Ala Leu Tyr Val Lys Val Asp Val Asp Lys Leu Glu50 55 60gaa act gcc aaa aga tac gat gta aca gct atg cca acg ttt att gtg 240
Glu Thr Ala Lys Arg Tyr Asp Val Thr Ala Met Pro Thr Phe Ile Val65 70 75 80ata aaa aat ggc gaa aaa gtc gat aca gtg gtt gga gct tct ata gaa288Ile Lys Asn Gly Glu Lys Val Asp Thr Val Val Gly Ala Ser Ile Glu85 90 95aat gtt gaa gct gcg atc agg aaa cac aaa taa321Asn Val Glu Ala Ala Ile Arg Lys His Lys100 105<210>2<211>106<212>PRT<213>日本血吸蟲中國大陸株硫氧還蛋白(SjcTrx)基因序列<400>2Met Ser Asn Val Leu His Ile Glu Thr Asp Asp Asp Phe Asp Ser Phe1 5 10 15Leu Lys Glu Asn Lys Asp Lys Leu Ile Val Val Asp Phe Phe Ala Thr20 25 30Trp Cys Gly Pro Cys Lys Lys Ile Ala Pro Ala Phe Glu Ala Leu Ser35 40 45Ala Asp Arg Ser Ala Leu Tyr Val Lys Val Asp Val Asp Lys Leu Glu50 55 60Glu Thr Ala Lys Arg Tyr Asp Val Thr Ala Met Pro Thr Phe Ile Val65 70 75 80Ile Lys Asn Gly Glu Lys Val Asp Thr Val Val Gly Ala Ser Ile Glu85 90 95Asn Val Glu Ala Ala Ile Arg Lys His Lys100 10權利要求
1.一種編碼日本血吸蟲中國大陸株硫氧還蛋白基因的核苷酸序列，其特征在于該核苷酸序列及編碼相應的氨基酸序列如下atg agt aac gta ctg cat ata gaa acc gat gac gat ttt gat tct ttc 48Met Ser Asn Val Leu His Ile Glu Thr Asp Asp Asp Phe Asp Ser Phe1 5 10 15tta aag gaa aat aag gat aaa tta att gtt gtt gat ttt ttc gca act 96Leu Lys Glu Asn Lys Asp Lys Leu Ile Val Val Asp Phe Phe Ala Thr20 25 30tgg tgt ggg ccg tgt aaa aaa ata gct cct gct ttc gaa gcg ttg agc 144Trp Cys Gly Pro Cys Lys Lys Ile Ala Pro Ala Phe Glu Ala Leu Ser35 40 45gct gat cgt tcg gca tta tat gtg aag gtt gac gtg gat aaa ctt gaa 192Ala Asp Arg Ser Ala Leu Tyr Val Lys Val Asp Val Asp Lys Leu Glu50 55 60gaa act gcc aaa aga tac gat gta aca gct atg cca acg ttt att gtg 240Glu Thr Ala Lys Arg Tyr Asp Val Thr Ala Met Pro Thr Phe Ile Val65 70 75 80ata aaa aat ggc gaa aaa gtc gat aca gtg gtt gga gct tct ata gaa 288Ile Lys Asn Gly Glu Lys Val Asp Thr Val Val Gly Ala Ser Ile Glu85 90 95aat gtt gaa gct gcg atc agg aaa cac aaa taa 321Asn Val Glu Ala Ala Ile Arg Lys His Lys100 105。
2.一種權利要求1所述的日本血吸蟲中國大陸株硫氧還蛋白基因的核苷酸序列的克隆方法，其特征在于為獲得完整ORF的核酸序列，所設計的引物序列為上游引物15′-GCGGATCCATGAGTAACGTACTGCATATAG-3′下游引物15′-GCGTCGACTTAGCCATATTTCATATATAAGAGGCAC-3′或，上游引物25′-GCGGATCCATGAGTAACGTACTGC-3′下游引物25′-GCGAATTCTCATTTGTGTTTCCGG-3′。
3.一種權利要求1所述的日本血吸蟲中國大陸株硫氧還蛋白基因的核苷酸序列在大腸桿菌中的表達方法，其特征在于該方法所使用的宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)，原核表達質粒為pET28a(+)，構成的重組質粒為pET28a-sjcTrx。
4.一種權利要求1所述的日本血吸蟲中國大陸株硫氧還蛋白基因在制備防治日本血吸蟲病重組蛋白疫苗和核酸疫苗中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于其中所述的核酸疫苗是由sjcTrx和真核表達質粒pcDNA3組成，構建重組表達質粒為pcDNA3-SjcTrx。
全文摘要
本發明涉及日本血吸蟲(中國大陸株)硫氧還蛋白(SjcTrx)基因的序列及其克隆表達方法和應用。本發明公開的SjcTrx基因具有序列1所示的核苷酸序列及編碼相應的氨基酸序列。本發明還公開了SjcTrx基因在大腸桿菌中的表達方法。經制備純化重組蛋白和DNA疫苗，免疫C57BL/6小鼠，發現本發明SjcTrx基因可用于制備防治日本血吸蟲病的重組蛋白疫苗和DNA疫苗。
文檔編號C12N15/70GK1763199SQ20051002892
公開日2006年4月26日 申請日期2005年8月17日 優先權日2005年8月17日
發明者曹建平, 韓海勃, 劉述先, 徐馀信, 湯林華, 沈玉娟, 李小紅, 盧濰媛 申請人:中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所