專利名稱：一種分泌型畢赤酵母菌株及其構建方法
技術領域：
本發明涉及基因工程菌和微生物發酵領域，具體地說，是關于一種表達D-氨基酸氧化酶的分泌型畢赤酵母菌株及其構建方法。
背景技術：
D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase，DAO，EC 1.4.3.3)是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔基的典型黃素蛋白酶類，它催化D型氨基酸氧化脫氨反應生成相應的酮酸和氨，并伴隨著一分子氧還原，而釋放出過氧化氫。在兩步酶法生產7-氨基酸頭孢烷酸(7-ACA)工藝中，DAO用于轉化頭孢菌素C(CPC)的第一步反應。
巴斯德畢赤酵母已經成為一種主要的真核微生物表達系統(Cregg JM.，Vedvick TS.，Raschke WC.Bio/Technology.11905-910，1993)。畢赤酵母可以高密度發酵，畢赤酵母表達系統中整合質粒常用的啟動子是醇氧化酶啟動子(Alcohol oxidasel promoter，PAOX1)和三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，PGAP)。
甲醇誘導型畢赤酵母菌株能夠表達三角酵母來源的DAO(Yu J，Yang S，Yuan ZY.J.Mol.Catal B-Enzym.18291-297，2002)，但是誘導型畢赤酵母菌在發酵過程中，需要添加甲醇誘導，而且發酵過程中條件控制比較復雜；而產物的提取需要先對細胞進行破碎，因此也有必要進一步加以改進。
發明內容
本發明的目的就在于克服現有表達D-氨基酸氧化酶(DAO)的甲醇誘導型畢赤酵母菌的上述缺點和不足，從而提供一種表達DAO的分泌型畢赤酵母基因工程菌株。
本發明的另一個目的在于提供一種表達DAO的分泌型畢赤酵母基因工程菌株的構建方法。
本發明的表達DAO的分泌型畢赤酵母菌株轉化有重組質粒pMMWY01，該重組質粒以三磷酸甘油醛脫氫酶基因為啟動子，并含有D-氨基酸氧化酶基因和ZeocinTM抗性基因。
本發明的分泌型畢赤酵母重組菌株的構建方法包括以下步驟A、PCR擴增HDAO片段，割膠回收帶有組氨酸純化標簽的DAO基因(HDAO)片段；HDAO基因片段與pGEM-T載體用T4連接酶連接后得到重組質粒pMMWY。質粒pMMWY用PstI酶切，割膠回收HDAO基因片段。
B、畢赤酵母表達載體pGAPZαB含有釀酒酵母來源的信號肽(Saccharomyces cerevisiaeα-Factor Secretion Signal)，載體pGAPZαB用PstI單酶切，乙醇沉淀回收線性化載體片段，用T4連接酶連接pGAPZαB線性化片段和HDAO基因片段，得到重組質粒pMMWY01。
C、將重組質粒pMMWY01電擊轉化入畢赤酵母宿主菌中，構建成表達D-氨基酸氧化酶的分泌型畢赤酵母重組菌株。
與現有技術中已知的DAO生產菌株相比，本發明的帶組氨酸標簽的重組DAO的表達菌株在培養過程中能夠分泌重組D-氨基酸氧化酶，與胞內表達D-氨基酸氧化酶的重組菌株相比較，免除了細胞破碎步驟。
本發明中新構建的分泌型重組畢赤酵母菌株，借助釀酒酵母來源的信號肽分泌表達重組D-氨基酸氧化酶，免除了細胞破碎步驟。利用蛋白質工程在DAO基因的N端加上了6個組氨酸，我們稱為組氨酸純化標簽，利用金屬螯合親和層析一步法純化就可以去除雜酶，簡化了目的蛋白質提純工藝。
圖1為在畢赤酵母中分泌表達三角酵母DAO的重組整合質粒pMMWY01構建流程圖。
具體實施例方式
以下結合實施例對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而不用于限定本發明的范圍。
以下實施例中，DNA片段連接、質粒的制備，化學轉化法和克隆均參照分子克隆(Sambrook，J.，Fritsch，E.P.，Maniatis，T.(2001)“Molecular CloningA Laboratory Manual3rd ed，”Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
本發明構建的表達DAO的分泌型巴斯德畢赤酵母菌株MMWY01已于2005年8月9日提交中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC M 205089。
實施例1、質粒構建1、材料質粒pGEM-TPromega公司產品，大小為3.0kb，含有氨芐青霉素抗性基因。
質粒pGAPZαBInvitrogen公司產品，大小為3.1kb，含有Zeocin抗性基因，啟動子是三磷酸甘油醛脫氫酶基因。
質粒pLHB-3按照Liu HB.等(Liu HB.，Jiang WH.，Yang YL.Cloning，Sequencing andExpression of D-amino acid oxidase gene.Chinese Journal of Biotechnology 15337-342，1999)的方法構建，大小為6.4kb，含有帶組氨酸純化標簽的DAO基因(HDAO)，卡那霉素抗性基因，啟動子是T7lac，且帶有組氨酸純化標簽。
2、方法如圖1所示，以質粒pLHB-3為模板，設計擴增HDAO基因的一對引物如下上游引物5’-AA CA ATGGCTAAAATCGTTGTT-3’；下游引物5’-CTAAAGGTTTGGTCGAGTAAG-3’。
擴增條件為94℃，30s，56℃，30s，72℃，1min，30個循環。
PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收得到約1.1kb大小HDAO基因片段；HDAO基因片段與pGEM-T載體用T4連接酶連接后得到重組質粒pMMWY。質粒pMMWY用Pst I酶切，割膠回收約1.1kb大小HDAO基因片段；表達載體pGAPZαB用Pst I酶切線性化。T4連接酶連接上述兩個基因片段得到重組質粒pMMWY01，該重組質粒的啟動子是三磷酸甘油醛脫氫酶基因，含有HDAO基因和Zeocin抗性基因。
實施例2、質粒擴增實施例1得到的質粒pMMWY01采用常規的化學轉化法《參考分子克隆》轉化至大腸桿菌宿主菌DH5α(Takara)，挑取單個轉化子接種到LB液體培養基(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％氯化鈉)中，在37℃培養擴增pMMWY01質粒。
實施例3、質粒轉化重組大腸桿菌在LB培養液中過夜培養后，參照《分子克隆》用堿裂解法從大腸桿菌抽提重組質粒pMMWY01，抽提的質粒pMMWY01再用Bln I酶切線性化，乙醇沉淀回收線性化重組質粒約10μg，然后將線性化質粒與畢赤酵母宿主菌GS115(his-mut+)感受態細胞80μl混合放于電轉化杯，同時準備一份不添加線性化質粒pMMZY03的感受態細胞作為陰性對照，冰浴放置5min。采用Bio-rad電轉化儀，電轉化參數設置是1.5KV，25μF，200Ω，電擊時間是4.6ms，電擊轉化后立即加人1ml冰浴的山梨醇。電擊轉化產物涂在含有100μg/ml ZeocinTM的YPDS(2％蛋白胨，1％酵母膏，2％葡萄糖，1M山梨醇，2％瓊脂粉)平板上，放置28℃培養，2～3天后YPDS平板上長出轉化子。
實施例4、轉化子篩選從YPDS平板上挑取10個轉化子接種至YPD培養基(2％蛋白胨，1％酵母膏，2％葡萄糖)中，200rpm搖床培養，發酵溫度為28℃，發酵至24h時取發酵液樣品測定DAO活力。
一個酶活力單位(U)的DAO定義37℃，pH8.5條件下，每分鐘氧化脫氨生成1μmol酮酸所需的酶量。
采用比色法測定DAO活力(Nilsson.K.，Mosbach.K.，Appl.Biochem.Biotechnol.，6293-308，1981)，具體如下所取發酵液樣品經離心后取上清，加入用0.1mol/L、pH8.0的焦磷酸鈉緩沖液配制的50mmol/L DL-甲硫氨酸溶液，在37℃浴中振蕩反應30min，加入10％的三氯乙酸終止反應。將終止液稀釋10倍后加入0.2％的2，4-二硝基苯肼飽和溶液，混勻靜置10min。加入3mol/L的NaOH溶液，混勻后靜置15min，離心后測定OD550值。
按照上述方法測定10個轉化子的發酵液在24h時的DAO活力，結果如表1所示表1、DAO活力測定
上述結果是測定發酵上清液而得到，可見本發明的表達DAO的重組菌株是將DAO分泌到培養基中，因而是一種分泌型的表達菌株。
通過上述測定DAO活力的方法篩選出DAO表達最高的重組菌株，命名為MMWY01。該菌株并已于2005年8月9日提交中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC M 205089。
權利要求
1.一種表達D-氨基酸氧化酶的分泌型畢赤酵母重組菌株，其特征在于，所述菌株轉化有重組質粒pMMWY01，該重組質粒以三磷酸甘油醛脫氫酶基因為啟動子，并含有D-氨基酸氧化酶基因和ZeocinTM抗性基因。
2.如權利要求1所述的分泌型畢赤酵母重組菌株，其特征在于，所述重組質粒pMMWY01還帶有組氨酸標簽。
3.如權利要求1或2所述的分泌型畢赤酵母重組菌株，其特征在于，所述菌株的保藏號CCTCC M 205089。
4.一種分泌型畢赤酵母重組菌株的構建方法，其特征在于包括以下步驟A、PCR擴增帶有組氨酸純化標簽的D-氨基酸氧化酶基因片段，擴增的基因片段與pGEM-T載體連接后得到重組質粒pMMWY，質粒pMMWY用PstI酶切后回收帶有組氨酸純化標簽的D-氨基酸氧化酶基因片段；B、表達載體pGAPZαB用PstI酶切線性化后用連接酶與帶有組氨酸純化標簽的D-氨基酸氧化酶基因片段相連接，得到重組質粒pMMWY01。C、將重組質粒pMMWY01電擊轉化入畢赤酵母宿主菌中，構建成表達D-氨基酸氧化酶的分泌型畢赤酵母重組菌株。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟A和B中所使用的連接酶為T4連接酶。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，在將重組質粒pMMWY01電擊轉化入畢赤酵母宿主菌前還包括將重組質粒pMMWY01導入大腸桿菌進行擴增的步驟。
7.一種重組質粒，其特征在于，所述重組質粒以三磷酸甘油醛脫氫酶基因為啟動子，并含有D-氨基酸氧化酶基因和ZeocinTM抗性基因。
8.如權利要求7所述的重組質粒，其特征在于，所述質粒還帶有組氨酸純化標簽。
全文摘要
本發明構建了一種新的分泌型畢赤酵母表達載體用于表達帶組氨酸標簽的重組D－氨基酸氧化酶。工程菌培養過程中能夠分泌重組D－氨基酸氧化酶，與胞內表達D－氨基酸氧化酶的重組菌株相比較，免除了細胞破碎步驟。利用蛋白質工程在DAO基因的N端加上了6個組氨酸，利用金屬螯合親和層析一步法純化就可以去除雜酶，簡化了目的蛋白質提純工藝。
文檔編號C12R1/84GK1757708SQ20051002875
公開日2006年4月12日 申請日期2005年8月12日 優先權日2005年8月12日
發明者楊晟, 鄭華寶, 王筱蘭, 陳軍, 楊蘊劉, 姜衛紅 申請人:中國科學院上海生命科學研究院