專利名稱：制備細胞模擬物的方法
技術領域：
本發明涉及來自動物的血紅細胞醫用配制技術，特別是涉及利用動物的血紅細胞制備細胞模擬物的技術。
背景技術：
人外周白細胞主要由淋巴、單核、粒細胞3群細胞組成，它們在體積上是一個連續分布的整體，而血小板是體積更小的一個分布群體，典型的測試分布如圖1、圖2所示。人血液測定主要通過血液細胞分析儀進行，為了保證測試儀器的準確，需要制備長期穩定的質控和校準物進行質量控制和校準維護。在多參數的質控物中，含有一定大小的細胞粒子，稱為人細胞模擬物或類細胞。這些粒子一般為塑膠粒子或體積固定后的動物紅細胞粒子。美國專利US3541137、US4179398、US4264470、US4704364等描述了3分群血液細胞分析儀質控的白細胞和血小板研制方法，其中人粒細胞模擬物可以從爬行類、魚類紅細胞經過固定后進行模擬。特別指出了鱷魚和鯊魚可以使用，人單核細胞使用火雞紅細胞固定處理；淋巴使用人或其他哺乳動物紅細胞處理，血小板使用山羊紅細胞處理等等。
現有細胞模擬物存在一定的不足，如使用塑膠粒子成本比較高，不適合降低臨床工作的成本，廣泛應用限制大；而使用動物源的固定紅細胞粒子一般不容易使其體積處于人細胞正常分布范圍，特別是粒細胞容易產生體積變化而導致測量數據的變異較大而使質控失敗，或產生無意義的報警信息，如圖3、圖4-1和圖5-1所示。模擬白細胞的體積變化會導致整個白細胞3個分群比例發生變化，產生錯誤的質控信息，所以很多質控物產品無法提供分類信息的質量控制能力。
發明內容
本發明要解決的技術問題在于避免上述現有技術的不足之處而提出一種制備細胞模擬物的方法，解決固定粒子的體積變化問題，使人細胞模擬物的體積長期保持穩定。
本發明解決所述技術問題可以通過采用以下技術方案來實現提出一種制備細胞模擬物的方法，選用的所述動物紅細胞經過固定處理后繼續進行水浴處理，控制溫度使該紅細胞性質發生變化至更加穩定的階段，同時所述紅細胞的體積被調節而達到要制備的細胞模擬物體積要求，所述水浴的溫度為40℃～60℃。
同現有技術相比較，本發明的技術效果在于1、被處理的紅細胞的體積穩定性強，符合正常人細胞的分布，滿足質量控制要求；2、樣本來源豐富而且沒有限制，而現有技術中提到的樣本來源如鱷魚屬于保護動物，鯊魚加工難度比較高。
圖1是正常人外周血液白細胞體積測試分布示意圖；圖2是正常人血小板體積測試分布示意圖；圖3是粒細胞模擬物體積變化導致白細胞的3分群細胞比例發生變化的測試分布示意圖；圖4是本發明實施例一制備過程中細胞測試分布情況示意圖；其中圖4-1是細胞進行固定處理后的測試分布情況示意圖，圖4-2是細胞進行水浴處理后的測試分布情況示意圖；圖5是本發明實施例二制備過程中細胞測試分布情況示意圖；其中圖5-1細胞進行固定處理后的測試分布情況示意圖，圖5-2是細胞進行水浴處理后的測試分布情況示意圖；圖6是本發明實施例三制備過程中細胞測試分布情況示意圖；其中圖6-1是細胞進行固定處理后的測試分布情況示意圖，圖6-2是細胞進行水浴處理后的測試分布情況示意圖；圖中，橫坐標單位為細胞體積單位飛升(f1)，縱坐標單位為細胞數量單位；R2、R3、R4為細胞異常分布報警提示信息。
具體實施例方式
以下結合附圖所示之最佳實施例作進一步詳述。
將動物細胞體積固定后模擬人白細胞已經有多年歷史，但由于動物紅細胞不容易符合人細胞體積的正常分布，所以對細胞模擬物的處理和保存提出了很高要求。即使這樣，目前也缺乏非常穩定不變的紅細胞源性的細胞模擬物。
通過研究發現，細胞隨溫度變化體積會發生一定的變化，固定細胞也是如此，所以可以通過溫度的變化來將固定細胞體積處理到一個更穩定的階段。因而可以通過溫度控制處理的方法處理出希望的細胞模擬物。比如人淋巴細胞體積分布比較窄，使用人或其他哺乳動物紅細胞加工不容易滿足要求。含細胞核的禽類或鳥類紅細胞分布就比較窄符合人淋巴細胞體積分布特性，但其體積往往偏離人淋巴細胞體積范圍，此時使用溫度控制調節體積范圍，就可以制造比較好的淋巴細胞模擬物。再以人粒細胞模擬物為例，美國專利US4704364介紹的爬行類、魚類的紅細胞固定后雖然可以一定時間內符合人粒細胞正常分布，但隨著時間延長，可能會發生不穩定情況。而本專利則可以解決這一問題使用高溫度條件對紅細胞進行處理，處理后的紅細胞會到達一個更穩定的體積階段。另外，通過研究進一步證明，粒細胞模擬物體積最好使用更大的擬白細胞粒子來源，因為經過高溫處理后細胞體積一般會縮減。為了解決這一問題，通過使用兩棲類動物的固定紅細胞進行處理模擬，其紅細胞一般情況下比爬行類、魚類紅細胞大，經過高溫處理后體積縮減，所以可更好地符合人正常粒細胞的分布特征。對于其他淋巴細胞、單核、血小板模擬物也有同樣道理。
本發明方法是在將所述紅細胞進行固定處理后，繼續進行水浴處理，控制溫度使該紅細胞性質發生變化至更加穩定的階段，同時所述紅細胞的體積被調節而達到預制備的細胞模擬物體積要求，所述水浴的溫度為40℃～60℃。
所述取得動物紅細胞和將所述紅細胞進行固定處理和溫度控制處理的步驟具體如下1、配制試劑。
抗凝劑0.8％的生理鹽水加入1％的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA2鈉鹽)；基礎試劑1-5g聚乙二醇(PEG)1～5g葡萄糖0.5～5g檸檬酸鈉0.1～2g青霉素0.1～2g鏈霉素0.5～5g硫柳汞1～5g 氯化鈉將上述成份加入蒸餾水配制為1L，使用氯化鈉調節滲透壓到300mOsm/kgH2O(人正常滲透壓為300mOsm/kgH2O)，可以使用鹽酸和氫氧化鈉調節試劑ph范圍。
固定試劑使用基礎試劑配制0.5-5％甲醛溶液，還可以是一定濃度的聚甲醛、戊二醛、烯醛或混合醛。
2、處理過程(1)將取得的動物血液使用抗凝劑抗凝；(2)使用基礎試劑對抗凝后的血液進行離心洗滌1～3次，去掉上清中的血漿蛋白成分；可以將多個樣本進行混合以增加處理樣本總量；(3)固定處理加入固定試劑靜置30分鐘～3小時；(4)使用基礎試劑或者生理鹽水充分離心洗滌去掉甲醛，靜置沉淀紅細胞，此時固定紅細胞體積會比人粒細胞正常分布大；(5)溫度控制處理使用高溫水浴處理固定細胞，處理后固定紅細胞體積落在人粒細胞正常分布范圍，所述水浴處理溫度為40℃～60℃；(6)可以繼續洗滌最后保存，即得要制備的細胞模擬物。
實施例一取得牛娃紅細胞，首先進行固定處理，再進行溫度控制處理，具體處理過程如上述。所述固定試劑是使用上述基礎試劑配制的濃度為3％的甲醛溶液。進行溫度控制處理時，將水浴溫度控制為45℃，對經過固定處理的牛娃紅細胞水浴處理2小時，即得要制備的人粒細胞模擬物。經過固定處理和溫度控制處理的牛娃紅細胞測試分布情況如圖4所示。兩兩比較圖4-1、圖4-2和圖1，可以得知，經過固定處理和溫度控制處理的牛蛙紅細胞體積落在人粒細胞正常分布范圍，不再出現異常報警信息R4。
實施例二取得牛娃紅細胞，首先進行固定處理，再進行溫度控制處理，具體處理過程如上述。所述固定試劑是使用上述基礎試劑配制的濃度為3％的甲醛溶液。進行溫度控制處理時，將水浴溫度控制為60℃，對經過固定處理的牛娃紅細胞水浴處理30分鐘。經過固定處理和溫度控制處理的牛娃紅細胞測試分布情況如圖5所示。兩兩比較圖5-1、圖5-2和圖1，可以得知，經過固定處理和溫度控制處理的牛蛙紅細胞也落在人粒細胞正常分布范圍。
實施例三取得雞紅細胞，首先進行固定處理，再進行溫度控制處理。具體處理過程如上述。所述固定試劑是使用上述基礎試劑配制的濃度為3％的甲醛溶液。進行溫度控制處理時，將水浴溫度控制為40℃，對經過固定處理的雞紅細胞水浴處理2小時，經過固定處理和溫度控制處理的雞紅細胞測試分布情況如圖6所示。兩兩比較圖6-1、圖6-2和圖1，可以得知，經過固定處理和溫度控制處理的雞紅細胞落在人淋巴細胞正常分布范圍。
本發明的技術特色在于將體積固定處理過的細胞進行溫度控制進一步對細胞體積進行處理，使其結構達到更穩定的階段。所以本發明可以應用在其他相似研究領域。比如使用紅細胞模擬體積差異比較大的淋巴、單核、血小板等等。制備人粒細胞模擬物的紅細胞可以從兩棲類動物如蛙類取得；制備人淋巴細胞模擬物的紅細胞從禽類或鳥類動物取得，如家雞，鴿。
使用本發明方法還可以制備非人血細胞的其他細胞模擬物。
權利要求
1.一種制備細胞模擬物的方法，取得動物紅細胞后，將所述紅細胞進行固定處理，其特征在于選用的所述動物紅細胞經過固定處理后繼續進行水浴處理，控制溫度使該紅細胞性質發生變化至更加穩定的階段，同時所述紅細胞的體積被調節而達到要制備的細胞模擬物體積要求，所述水浴的溫度為40℃～60℃。
2.如權利要求1所述的制備細胞模擬物的方法，其特征在于所述取得動物紅細胞和將所述紅細胞進行固定處理的步驟具體如下下述基礎試劑是指1～5g聚乙二醇、1～5g葡萄糖、0.5～5g檸檬酸鈉、0.1～2g青霉素、0.1～2g鏈霉素、0.5～5g硫柳汞和1～5g氯化鈉，使用蒸餾水配制為1L，使用氯化鈉調節滲透壓到人正常滲透壓水平；下述固定試劑是指使用基礎試劑配制0.5～5％的醛類溶液，包括甲醛、聚甲醛、戊二醛、烯醛或混合醛；①將取得的動物血液使用抗凝劑抗凝；②使用基礎試劑對抗凝后的血液進行離心洗滌，去掉上清中的血漿蛋白成分；③加入固定試劑靜置30分鐘～3小時；④使用基礎試劑或者生理鹽水充分離心洗滌去掉固定試劑中的醛，靜置沉淀紅細胞，獲得的紅細胞體積比要制備的細胞模擬物體積大；⑤使用水浴處理固定所述紅細胞，處理后的固定紅細胞體積落在人細胞體積的正常分布范圍。
3.如權利要求2所述的制備細胞模擬物的方法，其特征在于所述抗凝劑是指0.8％生理鹽水加入1％的乙二胺四乙酸二鈉。
4.如權利要求1或2所述的制備細胞模擬物的方法，其特征在于所述細胞模擬物是血小板模擬物。
5.如權利要求1或2所述的制備細胞模擬物的方法，其特征在于所述細胞模擬物是白細胞模擬物。
6.如權利要求5所述的制備細胞模擬物的方法，其特征在于從兩棲類動物取得紅細胞制備人粒細胞模擬物，從禽類或鳥類動物取得紅細胞制備人淋巴細胞模擬物。
7.如權利要求6所述的制備細胞模擬物的方法，其特征在于所述禽類動物是家雞，所述鳥類動物是鴿。
8.如權利要求6所述的制備細胞模擬物的方法，其特征在于所述兩棲類動物是蛙類。
9.如權利要求2所述的制備細胞模擬物的方法，其特征在于從牛娃取血，所述經過固定處理后的牛娃紅細胞的水浴處理溫度為45度，水浴時間為2小時。
全文摘要
本發明涉及一種制備細胞模擬物的方法，選用的所述動物紅細胞經過固定處理后繼續進行水浴處理，控制溫度使該紅細胞性質發生變化至更加穩定的階段，同時所述紅細胞的體積被調節而達到要制備的細胞模擬物體積要求，所述水浴的溫度為40℃～60℃。同現有技術相比較，本發明的技術效果在于1.被處理的紅細胞的體積穩定性強，符合正常人白細胞的分布，使用過程中不會產生異常報警信息，滿足質量控制要求；2.樣本來源豐富而且沒有限制。
文檔編號C12N5/06GK1891815SQ200510035790
公開日2007年1月10日 申請日期2005年7月4日 優先權日2005年7月4日
發明者張暉, 徐祖越, 劉牧龍 申請人:深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司