專利名稱：應用于組織工程的細胞三維培養方法
技術領域：
本發明涉及組織工程領域，更具體地說，是涉及一種應用于組織工程的細胞三維培養方法。
背景技術：
細胞在組織中是三維分布的，構建工程化組織，建立一種細胞三維培養方法很重要。將細胞懸液直接接種在支架材料上進行細胞三維培養，由于重力作用，細胞沉降在支架底部，難以均勻分布，在操作過程中有大量細胞未能黏附在支架材料上而浪費了大量細胞；利用液態膠原、ECM膠等進行細胞三維培養，操作比較麻煩價格也比較昂貴，也難以達到細胞在支架中均勻分布；直接利用凝血酶-纖維蛋白，在操作過程中也難以使細胞均勻分布。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是，克服現有技術中存在的不足，提供一種應用于組織工程的細胞三維培養方法。
本發明應用于組織工程的細胞三維培養方法，通過下述技術方案予以實現(1)首先將100-500IU/mL工作濃度的凝血酶和20-60mmol工作濃度的氯化鈣添加在支架材料中，(2)接著將10-50mg/mL工作濃度的血纖維蛋白原和10-50U/mL工作濃度的XIII因子溶解在哺乳動物細胞培養用的液體培養基中，(3)然后將1×107-2×108/mL濃度的細胞添加在上述液體培養基中并充分混勻細胞，(4)再將上述細胞懸液接種在上述步驟(1)的支架材料中，細胞懸液在5-20秒內凝固，形成細胞-支架-血纖維蛋白凝膠三維復合體，
(5)37℃下放置1小時完全凝固后，添加上述液體培養基在5％二氧化碳的培養箱中培養該復合體，每1-2天換一次液體培養基，培養？(范圍)天后即得細胞的三維培養復合體。
本發明所述支架材料為應用于組織工程的各種支架材料，例如用殼聚糖、膠原、明膠、甲殼素天然聚合物及其衍生物以及聚乳酸、聚羥基乙酸合成的高分子聚合物，又例如脫細胞脫蛋白的生物衍生支架材料、生物陶瓷支架材料、多孔羥基磷灰石。
本發明所述凝血酶和纖維蛋白原以及XIII因子是以人和其他哺乳動物來源的凝血酶、纖維蛋白原和XIII因子。
本發明所述細胞為來源于人和其他哺乳動物的細胞，例如心肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞、成纖維細胞、干細胞。
本發明上述步驟(2)中液體培養基為DMEM培養基或RPMI1640培養基。
本發明與膠原凝膠和ECMge1膠相比，該發明提供的方法比前兩者更省錢和方便。
1.通過提高催化劑的劑量能很快凝固為凝膠(5-10秒)，這樣細胞在懸液中還來不及沉下去膠就凝固了，細胞在支架中很均勻，而膠原凝固較慢(約60秒)，操作復雜，要用堿中和價格也較貴。
2.構建三維培養系統時，比把細胞直接接種在支架材料上要節省細胞，幾乎百分百的細胞都直接在三維支架中了，而直接接種在支架材料上的細胞，在操作過程中有很多細胞脫落，最終細胞黏附率最大為50％(細胞接種密度為1×107/ml)3.價格比用ECMge1(Sigma)便宜，前者1ml為1000元，后者1ml約500元，操作也簡單，常溫下操作或者得保持低溫。
本發明利用血液凝固過程的最后階段反應即凝血酶斷裂纖維蛋白原的αβ和AB鏈而釋放酸性多肽，使纖維蛋白原轉化為纖維蛋白單體，各單體自發聚集成無橋鍵相連的多聚體；同時凝血酶激活XIII因子，激活的XIII因子在Ca2+的作用下催化各纖維蛋白單體間兩條γ鏈的谷氨酰胺殘基和賴氨酸殘基的ε-氨基酸形成共價鍵，叢而形成穩定的網狀的纖維蛋白多聚體。利用這個原理，將凝血酶、氯化鈣等催化劑添加在支架材料上，以含血纖維蛋白原和XIII因子的培養基懸浮各種細胞，然后將該細胞懸液接種于該支架材料上，很快就形成細胞-支架-血纖維蛋白凝膠三維復合體，由于凝固時間很短，細胞在三維支架中可均勻分布。利用該方法，可很方便快速構建細胞三維培養復合體，支架材料是什么形狀，形成的細胞三維培養復合體就是什么形狀。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步描述。
實施例1心肌細胞的三維培養1.在無菌條件下將膠原海綿支架材料浸泡在含400IU/ml牛凝血酶的PBS溶液中，浸泡2小時后用濾紙吸干備用(也可以在制備膠原海綿過程中直接添加凝血酶，得到含凝血酶的膠原海綿)；2.在無菌條件下取新生大鼠心肌細胞，離心收集細胞沉淀，以含25mg/ml牛血纖維蛋白原、20U/mlXIII、40mmolCaCl2的DMEM高糖培養基(含15％胎牛血清)重懸心肌細胞，細胞濃度為1×108/ml；3.將細胞懸液滴加在1中制備的膠原海綿支架材料中，幾秒鐘后細胞懸液就凝固了，形成形成心肌細胞-膠原-血纖維蛋白凝膠三維復合體；4.37℃下放置1小時后添加DMEM高糖培養基培養基在37℃、5％二氧化碳的培養箱中培養該復合體，每天換一次培養基，第三天至第五天換用含10mmolBrdU的培養基兩次，以后仍用原來的培養基，培養四周。
結果心肌細胞-膠原-血纖維蛋白凝膠三維復合體中的心肌細胞在第四天后開始跳動，兩周后該復合體開始一致跳動。
實施例2成骨細胞的三維培養1.在無菌條件下將膠原海綿支架材料浸泡在含100IU/mL的凝血酶和20mmol氯化鈣的PBS溶液中，2小時后用濾紙吸干備用。
2.在無菌條件下取新生大鼠成骨細胞，經體外傳代擴增培養后，離心收集細胞沉淀，以含50mg/mL工作濃度的血纖維蛋白原和10U/mL工作濃度的XIII因子的DMEM/F12培養基(含10％胎牛血清)重懸成骨細胞，使細胞濃度為2×107/mL。
3.將細胞懸液滴加在1中制備的膠原海綿支架材料中，約15秒鐘后細胞懸液就凝固了，形成成骨細胞-膠原-血纖維蛋白凝膠三維復合體，以普通膠原海綿支架材料(未添加凝血酶和氯化鈣)和直接用普通DMEM/F12培養基(未添加牛血纖維蛋白原和XIII)懸浮細胞的成骨細胞-膠原三維復合體為對照組。
4.37℃下放置20分鐘后添加DMEM/F12培養基培養基37℃、5％二氧化碳的培養箱中培養該復合體，每2天換一次液體培養基，即得成骨細胞的三維培養復合體。
結果倒置顯微鏡下發現細胞均勻分布在支架材料中，對照組中有大量細胞從支架脫落且細胞分布不均勻；體外培養一月后進行石蠟切片和組織化學染色觀察，發現該復合體堿性磷酸酶為強陽性，有大量鈣化結節形成，對照組中堿性磷酸酶活性較弱，鈣化結節也很少。
實施例3軟骨細胞的三維培養1.在無菌條件下將殼聚糖海綿支架材料浸泡在含200IU/mL的凝血酶和60mmol的氯化鈣的PBS溶液中，2小時后用濾紙吸干備用。
2.在無菌條件下分離家兔軟骨細胞，經體外傳代擴增培養后，離心收集細胞沉淀，以含10mg/mL工作濃度的血纖維蛋白原和50U/mL工作濃度的XIII因子DMEM/F12培養基(含10％胎牛血清)重懸軟骨細胞，使細胞濃度為1×107/mL。
3.將細胞懸液滴加在1中制備的殼聚糖海綿支架材料中，約10秒鐘后細胞懸液就凝固了，形成形成軟骨細胞-膠原-血纖維蛋白凝膠三維復合體，以普通殼聚糖海綿支架材料(未添加凝血酶和氯化鈣)和直接用普通DMEM/F12培養基(未添加牛血纖維蛋白原和XIII)懸浮細胞的軟骨細胞-殼聚糖三維復合體為對照組。
4.37℃下放置20分鐘后添加DMEM/F12培養基在37℃、5％二氧化碳的培養箱中培養該復合體，每2天換一次液體培養基，即得軟骨細胞的三維培養復合體。
結果倒置顯微鏡下發現細胞均勻分布在支架材料中，對照組中有大量細胞從支架脫落且細胞分布不均勻；體外培養該復合體一月后進行石蠟切片和組織化學染色觀察，該復合體II型膠原免疫染色為強陽性，糖胺多糖含量比對照組高1-2倍，甲苯胺藍染色也比對照組深，對照組中II型膠原免疫染色陽性較實驗組弱。
權利要求
1.一種應用于組織工程的細胞三維培養方法，其特征是，包括下述步驟(1)首先將100-500IU/mL工作濃度的凝血酶和20-60mmol工作濃度的氯化鈣添加在支架材料中，(2)接著將10-50mg/mL工作濃度的血纖維蛋白原和10-50U/mL工作濃度的XIII因子溶解在哺乳動物細胞培養用的液體培養基中，(3)然后將1×107-2×108/mL濃度的細胞添加在上述液體培養基中并充分混勻細胞，(4)再將上述細胞懸液接種在上述步驟(1)的支架材料中，細胞懸液在5-20秒內凝固，形成細胞-支架-血纖維蛋白凝膠三維復合體，(5)37℃下放置1小時完全凝固后，添加上述液體培養基在5％二氧化碳的培養箱中培養該復合體，每1-2天換一次液體培養基，即得細胞的三維培養復合體。
2.根據權利要求1所述的應用于組織工程的細胞三維培養方法，其特征是，所述支架材料為應用于組織工程的各種支架材料，例如用殼聚糖、膠原、明膠、甲殼素天然聚合物及其衍生物以及聚乳酸、聚羥基乙酸合成的高分子聚合物，又例如脫細胞脫蛋白的生物衍生支架材料、生物陶瓷支架材料、多孔羥基磷灰石。
3.根據權利要求1所述的應用于組織工程的細胞三維培養方法，其特征是，所述凝血酶和纖維蛋白原以及XIII因子是以人和其他哺乳動物來源的凝血酶、纖維蛋白原和XIII因子。
4.根據權利要求1所述的應用于組織工程的細胞三維培養方法，其特征是，所述細胞為來源于人和其他哺乳動物的細胞，例如心肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞、成纖維細胞、干細胞。
5.根據權利要求1所述的應用于組織工程的細胞三維培養方法，其特征是，所述步驟(2)中液體培養基為DMEM培養基或RPMI1640培養基。
全文摘要
本發明公開了一種應用于組織工程的細胞三維培養方法。本發明屬于組織工程領域，該方法將100－500IU/mL工作濃度的凝血酶和20－60mmol工作濃度的氯化鈣等催化劑添加在各種生物支架材料中，以含10－50mg/mL工作濃度的血纖維蛋白原和10－50U/mL工作濃度的XIII因子的培養基懸浮各種細胞，利用血凝固的原理，使細胞均勻接種在各種支架材料中，獲得細胞－支架材料－纖維蛋白凝膠三維培養系統。利用這種方法，可獲得良好的三維培養細胞，構建出各種工程化組織。
文檔編號C12N11/00GK1928077SQ20061001604
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月28日 優先權日2006年9月28日
發明者郭勇, 張西正, 李瑞欣, 魏嚴, 張永紅 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生裝備研究所