專利名稱：一個與小麥抗白粉病基因Pm21連鎖的共顯性PCR標記及其用法的制作方法
技術領域：
本發明公開了與小麥抗白粉病基因Pm21連鎖的標記，可用于小麥白粉病抗病育種分子標記輔助選擇；此標記同時可用來鑒別普通小麥種子純度，尤其用來鑒別細胞工程和染色體工程創造的涉及普通小麥第六同源群染色體6AS發生變異的材料。
二、技術背景小麥(T.aestivum L)作為世界性的重要的糧食作物，在農業生產中具有舉足輕重的地位，但是其生產卻受到很多生物脅迫和非生物脅迫的影響。由專性寄生真菌小麥白粉病菌(Erysiphegraminis DC)引起的小麥白粉病(Ergsiphe greminis f.sp.tritici)是中國和世界上許多國家小麥生產中危害日趨嚴重的病害之一，并且隨著肥水條件的改善，近年有不斷加重的趨勢。
普通小麥(T.aestivum L)有21對染色體，每對包含兩條一樣的染色體，這21條染色體通常表示為1A、1B、1D、2A、2B、2D、3A、3B、3D、4A、4B、4D、5A、5B、5D、6A、6B、6D、7A、7B、7D，普通小麥通常直接用AABBDD來表示(圖8)。簇毛麥(Haynaldia villosa L)有7對染色體，每對包含兩條一樣的染色體，這7條染色體分別為1V、2V、3V、4V、5V、6V、7V，簇毛麥通常用VV來表示(圖9)。普通小麥和簇毛麥的每條染色體又包含長臂和短臂，分別用L和S表示，比如簇毛麥6V染色體包括長臂6VL和短臂6VS。
我國原有的小麥品種大部分都含有Pm8抗源，但是隨著白粉菌小種的不斷變化，Pm8已經逐漸失去了抗性，尋找和利用新的抗白粉病病基因對于我國小麥生產的安全性有重要意義。南京農業大學細胞遺傳所從上世紀80年代初起就致力于把簇毛麥(Haynaldia villosa L)中的優異基因通過染色體工程技術轉入普通小麥，得到了高抗白粉病的涉及簇毛麥6V染色體易位系和添加缺失系(見參考文獻1、Chen PD，Qi LL Zhou B，et al.Development and molecular cytogenetic analysis ofwheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance to powdery mildew.TheorAppl Genet，1995，911125-1128.2、L.L.Qi，S.L.Wang，PD.Chen，D.J.Liu，B.S.Gill 1998Identification and physical mapping ofthree Haynaldia villosa chromosome-6V deletion lines TAG971042-1046)。其中小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL就是把普通小麥6A染色體短臂6AS代換成簇毛麥6V染色體短臂6VS，形成一條易位染色體，這條染色體由6AL和6VS組成，用6VS/6AL表示這條易位染色體。純合的小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL與普通小麥相比，兩條6A染色體變成了兩條6VS/66VS/6AL染色體(圖11)；雜合的小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL與普通小麥相比，只有一條6A染色體變成了6VS/6AL染色體，還保存一條6A(6AS/6AL)染色體(圖12)。經分子細胞遺傳學的進一步研究，簇毛麥中的抗白粉病基因Pm21被定位于簇毛麥染色體短臂6VSFL0.58區段內(見參考文獻L.L.Qi，S.L.Wang，PD.Chen，D.J.Liu，B.S.Gill 1998 Identification and physical mapping ofthree Haynaldia villosa chromosome-6V deletion lines TAG 971042-1046)。由于6VS染色體與普通小麥染色體親源關系比較遠，與普通小麥染色體發生交換比較難，目前還未發現與普通小麥染色體發生交換的現象。所以目前攜帶Pm21基因的材料都攜帶6VS染色體。Pm21是目前為止對白粉病抗性最強、抗譜最廣的基因，能抗中國現有的所有白粉病菌的菌系或小種及120個歐洲生理小種，為了在小麥育種中更好地利用這一抗病基因資源，將其通過基因聚合或者轉基因的方式導入不同農藝性狀的優良品種是當務之急。但是要在同一個群體中同時檢測到多個聚合的基因，傳統的常規育種方法很難勝任，因此找到與目標基因緊密連鎖的分子標記就變得非常重要了，并且分子標記對于這一基因的克隆和轉化來說也是必不可少的。
小麥中已經找到了一些與抗白粉病Pm21基因相關的分子標記RAPD以及SCAR(見參考文獻QiLL，Cao MS，Chen PD，Li WL，Liu DJ(1996).Identification，mapping，and appli-cation ofpolymorphic DNA associated with resistance gene Pm21of wheat.Genome 39，191-197Liu ZY，Sun QX，Ni ZF et al(1999).Development of SCAR markers linked with Pm21gene conferringresistance to the powdery mildew in common wheat.Plant Breeding 118，215-219)。在這些標記中RAPD標記方便但很不穩定，SCAR標記雖然方便而且穩定但是卻是一個顯性標記，不能區分出6AS/6VS這條染色體處于純合或雜合狀態。
利用Pm21基因來進行抗白粉病育種的時候，育種單位用的親本大多是南京農業大學細胞遺傳所發放的小麥-簇毛麥易位系(6VS/6AL)，已經有幾個品種經過了品種審定，還有很多品系處于審定過程中。由于6VS染色體與6AS染色體不交換，所以種子中攜帶Pm21基因的植株都攜帶6VS/6AL染色體。無論在品種選育過程中或是品種在生產使用過程中，6VS/6AL這條染色體處于純合狀態都很重要，否則后代白粉病抗性就會發生分離，而這恰恰是利用這個材料作為親本進行育種的目標。另外，品種在生產上使用時其純度要得到保證，對于利用小麥-簇毛麥易位系(6VS/6AL)作為親本選育出來的高抗白粉病小麥品種，可以利用6VS/6AL染色體處于純合狀態的種子占的比例作為種子純度的一個重要指標。但是，利用SCAR1400和SCAR1265進行分子標記輔助選擇或鑒定種子純度時，只能明確材料中是否含有6VS/6AL染色體，而這條染色體是處于純合或雜合狀態卻無法得知。所以，尋找一種不僅對6VS專化而且還能夠區分其純合或雜合狀態的標記，從而確定Pm21基因純合或雜合狀態，不僅可以提高分子標記輔助選擇效率，而且在檢測種子純度時也可以發揮很大的作用。
本實驗室在克隆Pm21基因的過程中試圖尋找基于PCR的能同時在一次PCR反應中鑒別第六群染色體6AS和6VS的標記，用于可鑒別普通小麥種子純度。
發明內容
技術問題本發明的目的在于提供基于PCR的與Pm21連鎖的分子標記，并且用該引物在一次PCR反應中通過擴增出的帶型能同時專化性地鑒別普通小麥第六同源群染色體6AS，從而確定Pm21基因的純合或雜合狀態，該引物還能夠用來鑒定普通小麥種子純度。此標記不僅可以用來提高分子標記輔助選擇效率，而且在檢測種子純度和鑒定涉及第六同源群染色體6AS發生變異的材料時也可以發揮很大的作用。
技術方案本發明與Pm21連鎖并可鑒別普通小麥種子純度的標記，其特征在于，該引物是以抗病基因類似物Ta-LRR2序列為模板設計而得到的。其序列為NAU/XiBao16F5′-GTAGACAGTGCCGCTATTTC-3′和NAU/XiBao16R5′-CAACTCATGTGTCCAGTTCA-3′。該標記從簇毛麥中擴增出的1586bp的片段位于6VS染色體距著絲粒FL0.58區段內，從普通小麥擴增出的1882bp特異帶位于6AS上距著絲粒FL0.34的遠端區段。
上述標記的使用方法(1)以待鑒定材料DNA作為模板，用NAU/XiBao16F和NAU/XiBao16R作為引物進行PCR，PCR試劑組成為DNA模板2μL，2.5μL10×PCR buffer，1.8μLMgCl2，2μLdNTP，左右引物各0.5μL，0.25μL Taq DNA polymerase，16μL d.d H2O；PCR程序為94℃預變性3；94℃變性30秒，56℃退火40秒，72℃延伸2分鐘，32個循環；72℃延伸10分鐘；4℃保存，PCR產物在非變性的聚丙烯酰胺39∶1膠上電泳分離，用銀染法進行染色。
(2)標記鑒定Pm21基因的結果為能擴增出1586bp片段特異帶的單株攜帶Pm21基因，其Pm21基因位于簇毛麥6VS染色體上；不能擴增出902bp片段特異帶的則不攜帶Pm21基因。
(3)標記鑒定單株的抗病染色體6VS/6AL純合或雜合狀態的結果為能擴增出1507bp、1886bp和1586bp三條帶的植株，其抗病染色體6VS/6AL處于雜合狀態1507bp帶來自于普通小麥BBDD染色體組，并且這些染色體都是成對存在；1886bp的條帶來自染色體6AS，1586bp的條帶來自6VS，表明該單株中同時存在染色體6AS/6AL和抗病染色體6VS/6AL，抗病染色體6VS/6AL不能成對存在，處于雜合狀態。
能擴增出1507bp和1586bp兩條帶的植株的抗病染色體6VS/6AL處于純合狀態來自6AS染色體的1886bp的帶擴增不出來，6AS染色體就不存在，所以6VS/6AL染色體成對存在，處于純合狀態。
該標記檢測攜帶Pm21基因種子純度的方法首先從待檢測種子中隨機挑選單粒種子，利用標記鑒定單粒種子的6VS/6AL染色體純合或雜合狀態，再統計6VS/6AL染色體處于純合狀態的種子在檢測種子總量中所占比例，即為種子純度指標。本發明與已有技術相比較的優點及有益效果1、本發明分子標記NAU/XiBao16與Pm21基因的連鎖更緊密。由于引物NAU/XiBao16F和NAU/XiBao16R在簇毛麥中擴增出來的帶和Pm21基因同時位于6VS染色體距著絲粒FL0.58區段內，而且6VS與普通小麥染色體不發生交換，所以NAU/XiBao16可以作為白粉病抗性基因Pm21的分子標記來使用，并且分析此引物擴增出來的序列發現其推倒的氨基酸中含有抗病基因保守結構域亮氨酸重復(LRRs)，而抗病基因一般都是以基因家族的形式存在于染色體上(見參考文獻Baker Barbara，Zambryski Patricia，Staskawicz Brian，Dinesh-Kumar SP(1997).Sig-naling inPlant-Microbe Interactions.Science 276，726-733.Geffroy V，Sicard D，De Oliveira JC et al.(1999).Identification of an ancestral resistance gene cluster involved in the coevolution process betweenPhaseolus vulgaris and its fungal pathogen Colletotrichum lindemuthianum.Mol Plant-Microbe Interact12，774-784.)，因此NAU/XiBao16擴增出來的基因片段可能就是Pm21基因家族的一部分，所以該標記與Pm21基因連鎖程度比標記SCAR1400和SCAR1265與Pm21基因連鎖程度更高。
2、本發明分子標記NAU/XiBao16在鑒定普通小麥6AS與簇毛麥6VS染色體時更高效。分子標記NAU/XiBao16能在6AS和6VS上擴增出大小不同的兩條帶，這兩條帶可以特異性追蹤這兩條染色體。在以往的研究中，往往需要用幾個標記來確定材料中含有這兩條染色體中的哪一條，而用分子標記NAU/XiBao16在一次PCR反應中就可以達到鑒別這兩條染色體的目的。在用小麥-簇毛麥易位系(6VS/6AL)作為親本進行抗白粉病育種時，用NAU/XiBao16來進行分子標記輔助選擇，不僅可以鑒定材料中是否含有6VS/6AL，還可以鑒定6VS/6AL染色體是否處于純合狀態，這樣可以大大提高育種的選擇效率。
3、本發明分子標記NAU/XiBao16在鑒定抗病染色體6VS/6AL純合或雜合狀態時更方便快捷、經濟。使用SCAR1400和SCAR1265這兩個分子標記時，只要材料中含有6VS染色體就能擴增出相應的特異帶，不能區分6VS/6AL處于純合或雜合狀態。以往鑒定材料中6VS/6AL染色體是否處于純合狀態，往往是采用根尖有絲分裂中期染色體C-分帶技術或者原位雜交技術來進行，這兩種技術不但實驗技術煩瑣，而且花費很高，所以在大量鑒定材料時使用具有局限性。如果使用NAU/XiBao16進行分子標記輔助選擇，可以很方便快捷地鑒定以小麥-簇毛麥易位系(6VS/6AL)和普通小麥為親本的后代材料中6VS/6AL染色體是否為純合狀態。
4、在用細胞工程或染色體工程創建育種材料時，可以用NAU/XiBao16標記來鑒別普通小麥第六同源群染色體6AS發生變異的材料。
四
圖1用揚麥5號、易位系(6VS/6AL)、簇毛麥DNA作為模板，用本發明中的引物NAU/XiBao16進行PCR擴增，含有簇毛麥和易位系都能擴增出一條共同分子量1586bp的帶，而普通小麥揚麥5號缺乏這條帶，因此推測這條1586bp條帶位于6VS上。
圖2用普通小麥中國春分別添加簇毛麥1V、2V、3V、4V、5V、6V、7V染色體的7個材料DNA以及簇毛麥6V染色體代換了普通小麥6A染色體的代換系DNA為模板，用本發明中的引物NAU/XiBao16進行PCR擴增，結果顯示只有6V染色體存在的材料能擴增出與簇毛麥一樣的1586bp的帶，說明這條1586bp的帶位于簇毛麥6V上。
圖3用普通小麥6V添加缺失系de16V#2S-1DNA作為模板，用本發明中的引物NAU/XiBao16進行PCR擴增，結果表明6V上的1586bp帶仍然存在，6VS上的帶位于著絲粒與FL0.58區段之間。圖4用普通小麥中國春的一套缺體四體(N1A/T1D，N1A/T1B，N1B/T1A，N1B/T1D，N1D/T1A，N1D/T1B，N2A/T2B，N2A/T2D，N2B/T2A，N2B/T2D，N3A/T3B，N3A/T3D，N3B/T3A，N3B/T3D，N4A/T4B，N4A/T4B，N4B/T4A，N4B/T4D，N4D/T4A，N4D/T4B，N5A/T5B，N5A/T5D，N5B/T5A，N5B/T5D，N5D/T5A，N5D/T5B，N6A/T6B，N6A/T6D，N6B/T6A，N6B/T6D，N6D/T6A，N6D/T6B，N7A/T7B，N7A/T7D，N7B/T7A，N7B/T7D，N7D/T7A，N7D/T7B)的DNA為模板進行PCR，用本發明中的引物NAU/XiBao16進行PCR擴增，結果表明缺6A的材料少了一條1886bp的帶，根據結果可以推測1886bp的帶位于6A染色體上。
圖5用揚麥5號、簇毛麥、硬簇麥(AABBVV)(硬簇麥由硬粒小麥AABB和簇毛麥VV人工合成)、一粒小麥、擬斯卑爾托山羊草、節節麥、提莫非維小麥、圓錐小麥以及6VS/6AL易位系和6VS/6DL易位系DNA未模板，用本發明中的引物NAU/XiBao16進行PCR擴增，結果表明揚麥5號、6DL/6VS易位系、硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體、一粒小麥、提莫非維小麥以及圓錐小麥中都存在1886bp這條帶，但是在6VS/6AL易位系以及其它不含有AA基因組的麥類作物簇毛麥、擬斯卑爾托山羊草和節節麥中卻不存在，這進一步說明1886bp的帶位于6AS染色體上。
圖6用中國春缺失系DNA作為模板，以本發明中的引物NAU/XiBao16進行PCR擴增，缺失系6AS-1擴增出的帶少了一條1886bp的帶，1886bp帶位于FL0.35染色體遠端。
圖7用揚麥5號×小麥-簇毛麥易位系(6VS/6AL)F2群體單株DNA為模板，用本發明中的引物NAU/XiBao16進行PCR擴增的結果。含有1586bp帶的材料田間鑒定全部抗白粉病，不含1586bp帶的材料全部感病。同時具有1886bp帶和1586bp帶的易位系是雜合易位；只有1586bp帶而不具有1886bp帶的材料為純合易位系。
圖8普通小麥染色體示9簇毛麥染色體示10小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL其染色體6VS/6AL為純合時的示11小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL其染色體6VS/6AL為雜合時的示12以易位系第一鏈cDNA為模板進行RT-PCR擴增得到的全長Ta-LRR2基因的核苷酸序列及推導的氨基酸序列。紅色部分的表示起始子和終止子。
圖13Ta-LRR2基因推導的氨基酸序列與水稻、擬南芥以及玉米LRR基因氨基酸序列比較結果。上劃線表示LRR單元所在位置，黑體子部分表示抗病基因保守結構域LRR單元的氨基酸殘基，數字表示LRR單元的個數。LRR單元常見結構為axxaxaxx，其中a表示任何脂肪類氨基酸殘基如I，F L，M，A或V；X表示任意殘基。星號和黑點分別表示四個物種LRR基因氨基酸序列比較后相同和相似的氨基酸。。
五具體實施例方式
1、篩選位于6VS染色體上的抗病基因類似物抗白粉病6VS/6AL易位系與揚麥5號回交7代，得到背景與揚麥5號接近的易位系，將此易位系和親本揚麥5號在盆缽中栽培，并用透明膠片制成的罩子隔離，以防外界雜菌污染。植株長到二葉期時，用白粉病混合菌種對易位系進行抖落法接種，分別誘導6h和12h，而揚麥5號不經白粉病菌誘導。然后取誘導后的易位系葉片與沒誘導的揚麥5號葉片提取RNA，分別構建以易位系葉片RNA為Tester，揚麥5號RNA為Driver的正向抑制性扣除雜交(SSH)文庫以及揚麥5號RNA為Tester，易位系葉片RNA為Driver的反向SSH文庫，以反向文庫cDNA為探針篩選正向SSH文庫，得到雜交信號、有表達量差異的陽性克隆，序列分析結果表明其中一個為抗病基因類似物(圖13)，該基因片段作為Pm21的侯選基因，可能位于6VS染色體上。
2、根據篩選的抗病基因類似物開發基于PCR的分子標記以上述得到的序列片段作探針搜索小麥表達序列標簽(EST)數據庫(http:∥www.graingenes.org)，得到三個與之高度同源的ESTs序列，通過電子拼接后形成全長序列，并根據此拼接的序列用Primer3軟件(http:∥www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)設計引物NAU/XiBao16F5′-GTAGACAGTGCCGCTATTTC-3′和NAU/XiBao16R5′-CAACTCATGTGTCCAGTTCA-3′，以易位系cDNA為模板進行擴增得到了全長基因(圖12)，并將此基因命名為Ta-LRR2，根據此序列推導的氨基酸序列具有抗病基因保守結構域(圖13)。
以普通小麥揚麥5號(AABBDD)(公知公用，引自揚州里下河農科所)、小麥-簇毛麥易位系(6VS/6AL)(公知公用，南京農業大學細胞遺傳實驗室對外提供)、簇毛麥(VV)的DNA為模板，以NAU/XiBao16F和NAU/XiBao16R為引物進行PCR擴增。PCR試劑組成DNA模板2μL(50-100ng)，2.5μL10×PCR buffer，1.8μLMgCl2，2μLdNTP(2.5mmoL/L)，各0.5μL左右引物(10mmol/L)，0.25μL Taq DNA polymerase(5u/μL)，16μL d.d H2O。PCR程序為94℃預變性3；94℃變性30秒，56℃退火40秒，72℃延伸2分鐘，33個循環；72℃延伸10分鐘；4℃保存。PCR產物經8％的聚丙希酰胺(39∶1)凝膠電泳銀染后表明易位系(6VS/6AL)和簇毛麥有一條共同的分子量為1586bp的帶，而揚麥5號缺乏這條帶(圖1)。以普通小麥中國春中分別添加簇毛麥1V-7V染色體的添加系以及代換系(公知公用，見Sears，E.R.1953.Addition of the genome ofHaynaldia villosa to Triticum aestivum.Am.J.Bot.40168-174.)DNA為模板，進行相同條件的PCR和電泳，結果表明6V染色體存在的材料能擴增出了分子量為1586bp特異帶，說明1586bp這條帶是從6VS上擴增得到的(圖2)。進一步以小麥一簇毛麥6V添加缺失系de16V#2S-1(見參考文獻Lili Qi，Mingshu Cao，Peidu Chen，Wanlong Li and Dajun Liu.Identification，mapping，andapplication of polymorphic DNA associated with resistance gene Pm21 of wheat.Genome39191-197，1998)的DNA作為模板進行PCR，仍然可以擴增出這條帶(圖3)，結合小麥-簇毛麥6V添加缺失系的缺失斷點研究結果表明6VS上的這條1586bp產物位于6VS距著絲粒FL 0.58的區段，由于del6V#2S-1田間鑒定仍然抗病，所以Pm21和1586bp條帶位于染色體6VS的同一個區域。
以中國春的42個缺體四體系(公知公用，見參考文獻KM Devos，ME Sorrells，JA Anderson，TE Miller，SM Reader，AJ Lukaszewski，J Dubcovsky，PJ Sharp，J Faris，MD Gale.1999.Chromosomeaberrations in wheat nullisomic-tetrasomic and ditelosomic lines.Cereal Research Communications27231-239)的DNA為模板，進行相同條件的PCR和電泳，缺6A的材料中擴增出的帶少了一條1886bp的帶(圖4)。結果表明從普通小麥擴增出來的1886bp的帶為6A染色體上的。用揚麥5號、簇毛麥、硬簇麥(AABBVV)(硬簇麥由硬粒小麥AABB和簇毛麥VV人工合成)、一粒小麥、擬斯卑爾托山羊草、節節麥、提莫非維小麥、圓錐小麥以及6VS/6AL易位系和6VS/6DL易位系DNA為模板，用本發明中的引物NAU/XiBao16進行PCR擴增，結果表明揚麥5號、6DL/6VS易位系、硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體、一粒小麥、提莫非維小麥以及圓錐小麥中都存在1886bp這條帶，但是在6VS/6AL易位系以及其它不含有AA基因組的麥類作物簇毛麥、擬斯卑爾托山羊草和節節麥中卻不存在，這進一步說明1886bp的帶位于6AS染色體上。
以中國春6A染色體的部分缺失系(即染色體缺失了靠染色體端部的一部分，公知公用，見參考文獻Endo TR，Gill BS.The deletion stocks ofcommon wheat.Heredity 87295-307，1996)DNA為模板，進行相同的PCR，產物在8％的聚丙希酰胺(39∶1)凝膠上電泳。結果表明以中國春缺失體6AS-1為模板擴增到的PCR產物少了1886bp的帶。根據缺失系的圖譜，1886bp這條帶位于6AS上距著絲粒FL0.34的染色體遠端(圖5)。
3、用標記NAU/XiBao16檢測揚麥5號(公知公用品種)×小麥-簇毛麥易位系F2群體以NAU/XiBao16F和NAU/XiBao16R為引物，揚麥5號×小麥-簇毛麥易位系的F2代33個單株DNA為模板進行PCR，結果表明田間鑒定抗病的單株9-33都能擴增出6VS上的特異帶，田間鑒定感病單株1-8都不能擴增出6VS上的特異帶(圖7)，并且抗感病比例接近3∶1。說明能否擴增出6VS上的特異帶與抗感病直接相關，并且該引物能作為Pm21基因緊密連鎖的分子標記使用。
抗病單株的擴增帶型又可以分成兩種類型，一類能擴增出三條帶，如單株19-33，這三條帶從大到小分別是6AS(1886bp)、6VS(1586bp)以及BBDD染色體(1509bp)上的，擴增出這種帶型的單株只攜帶一條6VS/6AL易位染色體；另一類只能擴增出兩條帶，如9-18，這兩條帶從大到小分別是6VS(1586bp)以及BBDD染色體(1509bp)上的，6AS上的帶沒有擴增出，能擴增出這種帶型的單株攜帶兩條6VS/6AL易位染色體。這個結果表明NAU/XiBao16標記不但可以鑒定揚麥5號×小麥-簇毛麥易位系的F2代各單株是否攜帶6VS/6AL易位染色體，而且還能鑒定該染色體的純合或雜合狀態。
權利要求
1.與小麥抗白粉病基因Pm21連鎖的標記，其特征在于，該引物是以抗病基因類似物Ta-LRR基因序列為模板設計而得到的。
2.根據權利要求1所述與小麥抗白粉病基因Pm21連鎖的標記，其序列為NAU/XiBao 16F5′-GTAGACAGTGCCGCTATTTC-3′和NAU/XiBao 16R5′-CAACTCATGTGTCCAGTTCA-3′
3.根據權利要求1或2所述與Pm21連鎖并可鑒別普通小麥種子純度的標記，其特征在于該引物從簇毛麥中擴增出的1586bp的片段位于6VS染色體距著絲粒FL0.58區段內，從普通小麥擴增出的1886bp的帶可以專化地追蹤6AS，并位于6AS染色體臂上距著絲粒FL0.34遠端。
4.權利要求1～3之一所述與小麥抗白粉病基因Pm21連鎖的標記的用法1)待鑒定材料DNA作為模板，用NAU/XiBao16F和NAU/XiBao16R作為引物進行PCR，PCR試劑組成為DNA模板2μL，2.5μL10xPCR buffer，1.85μLMgCl2，2μLdNTP，左右引物各0.5μL，0.25μL Taq DNA polymerase，16μL d.d H2O；PCR程序為94℃預變性3；94℃變性30秒，56℃退火40秒，72℃延伸2分鐘，33個循環；72℃延伸10分鐘；4℃保存，PCR產物在非變性的聚丙烯酰氨39∶1膠上電泳分離，在用銀染法進行染色；2)標記鑒定Pm21基因的結果為能擴增出1586bp片段特異帶的單株攜帶Pm21基因，其Pm21基因位于簇毛麥6VS染色體上；不能擴增出1586bp片段特異帶的則不攜帶Pm21基因。
5.根據權利要求4所述與小麥抗白粉病基因Pm21連鎖的標記的用法，其特征在于，能擴增出1886bp、1509bp和1586bp三條帶的植株的抗病染色體6VS/6AL處于雜合狀態1509bp帶是普通小麥BBDD染色體組擴增出來的；1886bp的條帶來自染色體6AS；1586bp的條帶來自抗病染色體6VS；表明該單株中同時存在染色體6AS/6AL和抗病染色體6VS/6AL，抗病染色體6VS/6AL不成對存在，處于雜合狀態；能擴增出1586p和1509bp兩條帶的植株的抗病染色體6VS/6AL處于純合狀態來自6AS染色體的1886bp的帶擴增不出來，6AS染色體就不存在，所以6VS/6AL染色體成對存在，處于純合狀態；用以鑒定單株的抗病染色體6VS/6AL純合或雜合狀態。
6.根據權利要求4或5所述與小麥抗白粉病基因Pm21連鎖標記的用法，其特征在于，用該標記檢測攜帶Pm21基因種子純度的方法首先從待檢測種子中隨機挑選單粒種子，利用標記鑒定單粒種子的6VS/6AL染色體純合或雜合狀態，再統計6VS/6AL染色體處于純合狀態的種子在檢測種子總量中所占比例，即為種子純度的指標。
全文摘要
本發明公開了與小麥抗白粉病基因Pm21連鎖的標記，可用于小麥白粉病抗病育種分子標記輔助選擇，同時可用來鑒別普通小麥種子純度。根據通過楊麥5號和易位系抑制性扣除雜交得到的抗病基因類似物Ta－LRR2序列設計引物NAU/ XiBao16F和NAU/ XiBao16R，經過一系列材料的驗證，標記NAU/XiBao16與易位系6VS/6AL抗白粉病基因Pm21連鎖，并且在一次PCR實驗中可以同時擴增出來自普通小麥6AS和簇毛麥6VS染色體的兩條專化帶。標記NAU/XiBao16可以用于小麥白粉病抗病育種分子標記輔助選擇，也可用來鑒別普通小麥種子純度，尤其可用來鑒別細胞工程和染色體工程創造的涉及普通小麥第六同源群染色體6AS發生變異的材料。
文檔編號C12Q1/68GK1737151SQ20051004099
公開日2006年2月22日 申請日期2005年7月12日 優先權日2005年7月12日
發明者陳雅平, 陳佩度, 王秀娥, 張守忠, 王蘇玲, 周波 申請人:南京農業大學