專利名稱：有效提高西洋參懸浮細胞產量的生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物細胞懸浮培養技術，特別是有效提高西洋參懸浮細胞產量的生產工藝。
背景技術：
我國作為中草藥的發源地，雖然中藥資源豐富，但蘊藏量有限。由于生態環境的破壞、無計劃的采伐和栽培技術等原因而致使珍稀瀕危藥用植物種類不斷增加。如80年代后期，甘草資源比50年代減少60％，麝香資源此50年代減少70％，其它如厚樸、杜仲、黃柏、麻黃、肉蓯蓉、松貝等資源的破壞也十分嚴重。所以供需矛盾日益加劇。
在植物組織培養研究中，發現培養細胞中含有各種特殊的代謝產物如生物堿、色素、甾體、萜類等藥用成分及香精等，其中有些是微生物和人工不能合成的，有些則是在整株植物含量甚微或本身資源就十分匱乏，而在培養的細胞中含量有時卻很高。因此，利用植物細胞培養技術生產有用代謝產物，已成為繼微生物技術以后當代生物技術重要的發展領域。
西洋參(Panax quinquefoiium)是五加科人參屬的一種名貴中藥材，其所含的西洋參皂甙是主要的藥理成份，具有健胃、強心、鎮定、降血糖和降血脂的功效，并有一定的防癌和抗衰老的作用。西洋參，最適生長于海拔1000米左右的山地闊葉林地帶。喜陰，宜斜射光和散射光，忌強光怕高溫，生長期最適宜溫度18℃～24℃要求栽培土層深厚，土質為疏松、肥沃、腐殖質含量豐富、透水性強的偏酸性的壤土或沙質壤土。無論野生或是栽培的西洋參，由于其自身的生理特性，生長緩慢，一般需四至六年才能收獲入藥。它們的市場供需矛盾突出，價格昂貴，約1000元/kg。迄今為止其皂甙成分尚不能人工合成。因此，通過細胞培養方法大量生產西洋參皂甙，成為研究熱點。我國的鄭光植、方綺民、周立剛、原曉勇、張美萍等分別研究了西洋參細胞懸浮培養的培養條件，并測定了不同培養條件下懸浮培養物中有效成分的含量，為西洋參細胞培養的進一步研究提供了基礎。
目前，西洋參細胞懸浮培養技術仍有不完善之處，缺乏適合大規模懸浮培養的高產、穩定的細胞株，細胞懸浮培養工藝不完善，懸浮細胞培養水平及皂甙產量較低，使利用懸浮細胞培養技術大規模工業化生產西洋參皂甙受到限制。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種西洋參懸浮細胞大量生產工藝，以實現提高西洋參懸浮細胞的產量，降低工業化生產成本和增加有效物質含量的目的。
本發明采用如下技術方案本發明所述的有效提高西洋參懸浮細胞產量的生產工藝，采用以下步驟(1)配制儲備液；儲備液的成分及含量如下
(2)配制培養液在已配制好的儲備液中加入去離子水稀釋18-22倍，再依次加入白糖、水解乳蛋白、2，4-二氯苯氧乙酸、α-萘乙酸、激動素和吲哚丁酸，，終濃度分別為1.5％-6％、0.3％-1％、0.5-1.5mg/L、0-0.5mg/L、0.2-1.0mg/L和0.2-1.0mg/L，然后調節pH值為5.5-6.5，充分攪拌后裝瓶，100ml-500ml三角瓶，裝液量為三角瓶容積的1/5-1/2。
(3)培養液滅菌密封瓶口，將溫度控制在115-122℃，壓力控制在1.0-1.2kg/cm2，滅菌20-30分鐘，培養液冷卻后備用。
(4)接種、培養制成的培養液中，在無菌條件下接入西洋參對數生長期的懸浮細胞，每升培養液接入15-50克鮮重的懸浮細胞，放入搖床中懸浮暗培養，接種后2-6天收集懸浮細胞，重新接種到新培養液中繼續培養，每升培養液中接入15-50克鮮重的懸浮細胞，10-15天后補充培養液，補充量為培養體積的1/4-1/2，再培養5-10天，收獲細胞，提取西洋參皂甙。
本發明工藝接種后培養溫度控制在22-26℃，暗培養。
本發明工藝搖床轉速為90-150rpm。
本發明積極效果如下利用本發明工藝開展西洋參懸浮細胞培養，培養結束后，可使細胞生長量比接種量增長近15-30倍。比通常使用的懸浮細胞培養工藝，即接種后，在細胞培養過程中不換液，細胞生長量提高1-3倍。細胞的生長量(鮮重)可達到800g/L左右，細胞干重可達30g/L以上。
具體實施例方式
實施例1配制1000ml懸浮細胞培養液，pH5.5，分裝20個100ml三角瓶，每瓶30ml；分裝2瓶500ml三角瓶，每瓶200ml。高壓滅菌，壓力控制在1.0kg/cm2，120℃，20min。取對數期西洋參懸浮細胞接種到500ml培養瓶中，接種量為每升培養液接入15克鮮重的懸浮細胞，培養溫度24℃，搖床轉速90rpm，暗培養。4天后，無菌條件下收集懸浮細胞，再將懸浮細胞轉接到100ml三角瓶中，每升培養液接入15克鮮重的懸浮細胞，繼續培養15天，每瓶補充新培養液10ml，再培養5天，收獲細胞。平均每瓶收獲鮮細胞22.2g。
實施例2配制1000ml懸浮細胞培養液，pH6.0，分裝30個100ml三角瓶，每瓶30ml。高壓滅菌，壓力控制在1.1kg/cm2，115℃，22min。取對數期西洋參懸浮細胞分別接種到培養液中，每升培養液接入20克鮮重的懸浮細胞，接種15瓶。培養溫度22℃，搖床轉速100rpm，暗培養。2天后，無菌條件下分別收集細胞，再分別轉接到新的培養液中，每升培養液接入20克鮮重的懸浮細胞，繼續培養10天，每瓶補充培養液7.8ml，再培養8天，收獲細胞。平均每瓶收獲鮮細胞15.9g。
實施例3配制1000ml懸浮細胞培養液，pH6.5，分裝20個100ml三角瓶，每瓶30ml；分裝2瓶500ml三角瓶，每瓶200ml。高壓滅菌，壓力控制在1.2kg/cm2，122℃，30min。取對數期西洋參懸浮細胞接種到500ml培養瓶中，每升培養液接入30克鮮重的懸浮細胞，培養溫度26℃，搖床轉速150rpm，暗培養。6天后，無菌條件下收集懸浮細胞，再將懸浮細胞轉接到100ml三角瓶中，每升培養液接入30克鮮重的懸浮細胞，繼續培養10天，每瓶補充培養液12ml，再培養10天，收獲細胞。平均每瓶收獲鮮細胞27.0g。
實施例4配制1000ml懸浮細胞培養液，pH6.0，分裝20個100ml三角瓶，每瓶30ml；分裝2瓶500ml三角瓶，每瓶200ml。高壓滅菌，120℃，20min。取對數期西洋參懸浮細胞接種到500ml培養瓶中，每升培養液接入50克鮮重的懸浮細胞，培養溫度24℃，搖床轉速90rpm，暗培養。5天后，無菌條件下收集懸浮細胞，再將懸浮細胞轉接到100ml三角瓶中，每升培養液接入50克鮮重的懸浮細胞，，繼續培養10天，每瓶補充培養液10ml，再培養5天，收獲細胞。平均每瓶收獲鮮細胞16.1g。
權利要求
1.一種有效提高西洋參懸浮細胞產量的生產工藝，其特征在于采用以下步驟(1)配制儲備液；(2)配制培養液在已配制好的儲備液中加入去離子水稀釋18-22倍，再依次加入白糖、水解乳蛋白、2，4-二氯苯氧乙酸、α-萘乙酸、激動素和吲哚丁酸，，終濃度分別為1.5％-6％、0.3％-1％、0.5-1.5mg/L、0-0.5mg/L、0.2-1.0mg/L和0.2-1.0mg/L，然后調節pH值為5.5-6.5，充分攪拌后裝瓶，100ml-500ml三角瓶，裝液量為三角瓶容積的1/5-1/2。(3)培養液滅菌密封瓶口，將溫度控制在115-122℃，壓力控制在1.0-1.2kg/cm2，滅菌20-30分鐘，培養液冷卻后備用。(4)接種、培養制成的培養液中，在無菌條件下接入西洋參對數生長期的懸浮細胞，每升培養液接入15-50克鮮重的懸浮細胞，放入搖床中懸浮暗培養，接種后2-6天收集懸浮細胞，重新接種到新培養液中繼續培養，每升培養液中接入15-50克鮮重的懸浮細胞，10-15天后補充培養液，補充量為培養體積的10％-30％，再培養5-10天，收獲細胞，提取西洋參人參皂甙。
2.根據權利要求1所述的一種有效提高西洋參懸浮細胞產量的生產工藝，其特征在于儲備液的成分及含量如下
3.根據權利要求1所述的一種有效提高西洋參懸浮細胞產量的生產工藝，其特征在于接種后培養溫度控制在22-26℃暗培養。
4.根據權利要求1所述的一種有效提高西洋參懸浮細胞產量的生產工藝，其特征在于搖床轉速為90-150rpm。
全文摘要
本發明涉及一種提高西洋參懸浮細胞生長量的簡易生產工藝，該工藝包括以下步驟配制儲備液，裝瓶，滅菌，制成液體培養基，在無菌條件下接入西洋參對數生長期的懸浮細胞，放入搖床中懸浮暗培養，接種后2－6天，收集懸浮細胞，10－15天后補料，再培養5－10天，收獲細胞，提取西洋參人參皂甙，利用該工藝，可使細胞生長量增長近20倍，比對照提高1－3倍，懸浮細胞的生長量可達500－850g/L。
文檔編號C12N5/04GK1800365SQ200510048269
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月31日 優先權日2005年12月31日
發明者閆靜輝, 李書生, 張小兵, 李亞璞, 李春生, 吳萌, 陳英珠, 程華, 韓廣彥, 籍寶霞, 陳瑞芹, 辛春艷 申請人:河北省生物研究所