專利名稱：采用gs115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程的DNA或RNA、載體和質粒，或其分離、制備或純化，具體涉及重組人腸三葉因子的表達和純化。
背景技術：
腸三葉因子(以下簡稱ITF)是分布于腸道的特異小分子蛋白，分子量約6～7kD。ITF由59個氨基酸殘基構成，包含一個由38～39個氨基酸殘基組成的特定序列，其中的6個半胱氨酸以1-5，2-4，3-6的順序依次形成3個二硫鍵，從而產生特異而穩定的三葉結構。這種穩定的結構確保其在腸道中發揮活性，不受消化酶和pH變化的影響。正常情況下，ITF分布于整個小腸，特別是小腸絨毛環狀細胞的基底部。ITF在體內以20％單體和80％二聚體的形式存在，但只有二聚體才具有生物活性。ITF不僅能促進腸上皮細胞增殖和移行，還能同粘蛋白中的寡聚糖或多糖的側鏈相連，穩定腸粘液層。因此，ITF對腸道的保護作用非常強，。它在治療由各種致傷因子引起的胃腸粘膜損傷等方面具有顯著效果。
現有技術中，在《Biochemistry》，1995，344757-476，有一篇由Thim L，Woldike HF，Nielsen PF，et al.撰寫的論文“Characterization of human and rat intestinal trefoil factotproduced in yeast”，報道有腸三葉因子在酵母中的表達方法。該方法是利用第一代釀酒酵母發酵獲得重組腸三葉因子。但它存在的缺陷是它由實驗室擴展到工業規模時，其產量迅速下降，原因是培養基中維特質粒高拷貝數的選擇壓力消失，質粒變得不穩定，拷貝數下降，導致了產量的降低，僅為48mg/L；它的純化方法煩瑣，操作復雜、步驟較多。2002年5月2日公開有一件主題名稱為“腸三葉蛋白”的美國專利文獻US20020052483A1，在關于腸三葉因子的來源上，該文獻指出應用真核表達載體(如pMAMneo)，在COS細胞、CHO細胞等真核細胞中表達；直接從機體腸道粘膜中提取腸三葉因子。但按照它所介紹的方法具有以下不足1.利用真核細胞表達獲得腸三葉因子，雖然蛋白活性尚好，但成本較高、產量低，難以大規模生產；2.利用腸粘膜提取腸三葉因子，雖然可以得到天然的腸三葉因子，但其原料(腸粘膜)來源受限，產量更是極其有限。
發明內容
本發明的目的在于針對現有技術存在的缺陷，提供一種不同于現有技術的采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝，以便提高表達產量和純度，有利于ITF的開發應用。
采用以下技術方案來實現本發明的目的。
一種采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝，由目的基因的獲取、酵母表達載體的構建、酶切及測序鑒定、轉化入GS115酵母菌、誘導表達和純化六步過程組成。
1.目的基因的獲取從正常人小腸絨毛中提取總RNA，通過RT-PCR獲得編碼59個氨基酸的腸三葉因子的基因序列GAGGAGTACGTGGGCCTGTCTGCAAACCAGTGTGCCGTGCCAGCCAAGGACAGGGTGGACTGCGGCTACCCCCATGTCACCCCCAAGGAGTGCAACAACCGGGGCTGCTGCTTTGACTCCAGGATCCCTGGAGTGCCTTGGTGTTTCAAGCCCCTGCAGGAAGCAGAATGCACCTTCTGA同時利用上游引物5′-GAGAGAATTCCATCATCATCATCATCATGAGGAGTACGTGGGCCTGTC-3′(引物1)或5′-TTTAGCGGCCGCTCAGAAGGTGCATTCTGCTTC-3′(引物2)引入六個組氨酸標簽6×CAT。
2.酵母表達載體的構建由RT-PCR擴增出的人腸三葉因子基因序列，經EcoRI和NotI雙酶切，然后插入用同樣的限制性內切酶處理過的酵母表達載體pPICZaA，轉化入大腸桿菌Top10，以含25μg/ml Zeocin(一種特殊抗生素)的低鹽LB平板篩選重組質粒，得到含有重組酵母表達質粒pPICZaA-hITF的重組大腸桿菌Top10。
3.酶切及測序鑒定提取小量重組質粒pPICZaA-hITF，用EcoRI和NotI消化，切下預期大小片段，按設計編碼pPICZaA-hITF序列，分別為210bp和3600bp，用重組質粒pPICZaA-hITF酶切電泳圖和pPICZaA-hITF測序圖譜測序鑒定，測序結果證明所克隆pPICZaA-hITF序列完全正確，而且是按照設計準確進入載體。
4.轉化入GS115酵母菌將重組質粒線性化，然后化學轉化入GS115酵母菌，再進行抗性篩選，將篩選出的陽性克隆分別轉接到MMH(含組氨酸的最小甲醇培養基)、MDH(含組氨酸的最小葡萄糖培養基)平板上，2天后獲得克隆均為Mut+(甲醇利用型陽性)表型。提取酵母基因組DNA，作為模板進行PCR反應，做PCR反應電泳圖顯示，使擴增出的特異條帶與預期結果大小一致，證明所獲得克隆均有目的基因的成功整合。
5.誘導表達選取陽性克隆Mut+表型進行甲醇誘導表達，誘導至96小時后，離心分離胞體和上清，上清蛋白以三氯醋酸沉淀，SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍染色，獲得酵母菌GS115-hITF上清液；將其與陰性對照相比，在重組克隆的表達上清中出現與人腸三葉因子(hITF)非糖基化形式分子量一致的新生蛋白條帶；做酵母菌GS115-hITF上清液Western blotting(免疫印跡)分析，顯示重組克隆是以非糖基化形式分泌表達了hITF。
6.純化將酵母菌GS115-hITF上清液旋轉蒸發(冷凍干燥)從1000ml濃縮至100ml，把濃縮上清移入超濾離心管(截留分子量30KD)，離心約20～30分鐘去除大部分大分子量雜蛋白，再將濾出液通過鎳離子柱，10～50毫摩爾咪唑漂洗雜蛋白，100～800毫摩爾咪唑洗脫目的蛋白。然后把洗脫液移入超濾離心管(截留分子量3KD)，離心約20～30分鐘去除鹽分、咪唑等小分子物質，最后將目的蛋白用孔徑0.2微米的濾器過濾除菌，冷凍干燥成粉末狀，-80℃長期保存。重組腸三葉因子N端具有伸展的6個組氨酸殘基，能和Ni2+離子鰲合柱結合，進行快速親和純化；Ni2+離子是利用金屬和蛋白質有親和力的特點，將金屬離子與凝膠載體相連，制成鰲合吸附劑用來蛋白質的親和層析分離。Ni2+離子共有6個鰲合點，可以和6個組氨酸相結合，有利于目的蛋白的插入。純化后的樣品SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮蘭R250染色，顯示得到比較純hITF。取所得純化樣品做重組人腸三葉因子純化后Western blotting分析，結果顯示所表達蛋白確實為hITF。
按照本發明工藝獲得的重組人腸三葉因子，表達產量可達100mg/L，提純純度可達95％或更高，純化的蛋白產物經檢測結果表明用本發明工藝獲得的重組人腸三葉因子為高純度、無熱源、無內毒素，有正確的分子量，與天然的腸三葉因子有相同的等電點、氨基酸序列和紫外光譜，及其完好的生物學活性的重組蛋白。將其應用于治療由各種致傷因子引起的胃腸粘膜損傷療效明顯。
四.
圖1是酵母表達載體構建技術路線示意2是重組質粒PICZaA-hITF酶切電泳3是重組質粒pPICZaA-hITF測序圖譜圖4是酵母GS115-hITF基因PCR反應電泳5是酵母GS115-hITF上清液Western blotting6是重組人腸三葉因子純化后Western blotting圖五.具體實施方式
下面用實施例進一步說明本發明采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝的具體操作方法。
(一)目的基因的獲取從小腸粘膜中提取總RNA，通過RT-PCR獲得編碼59個氨基酸的腸三葉因子的基因序列GAGGAGTACGTGGGCCTGTCTGCAAACCAGTGTGCCGTGCCAGCCAAGGACAGGGTGGACTGCGGCTACCCCCATGTCACCCCCAAGGAGTGCAACAACCGGGGCTGCTGCTTTGACTCCAGGATCCCTGGAGTGCCTTGGTGTTTCAAGCCCCTGCAGGAAGCAGAATGCACCTTCTGA同時利用上游引物5′-GAGAGAATTCCATCATCATCATCATCATGAGGAGTACGTGGGCCTGTC-3′(引物1)或5′-TTTAGCGGCCGCTCAGAAGGTGCATTCTGCTTC-3′(引物2)引入六個組氨酸標簽6×CAT。
(二)酵母表達載體的構建1.酶切產物的純化1)割下含ITF DNA的瓊脂糖塊，放入1.5ml離心管。
2)加入400μl結合緩沖液，置于55-60℃水浴7分鐘，使瓊脂塊完全熔化，每2分鐘顛倒混勻一次。
3)將熔化的瓊脂糖液移入吸附柱，10000轉/分離心1分鐘，倒掉收集管中液體，再將吸附柱放入同一收集管中。
4)在吸附柱中加入750μl洗脫緩沖液，靜置2分鐘后，離心1分鐘倒掉收集管中液體，將吸附柱放入同一收集管中。
5)同(4)，離心1分鐘。
6)將吸附柱放入一個干凈的1.5ml的離心管中，在吸附柱中央加入30-50ml去離子水，離心1分鐘，將1.5ml離心管(DNA)貯存于-20℃冰箱。
2.連接取2.5μl目的基因片斷和5μl載體片斷，建立20μl連接體系，4℃連接過夜。
3.轉化1)取10μl連接產物加入到100μl大腸桿菌TOP10感受態細菌輕輕混合，冰上放置30分鐘。
2)42℃熱休克90秒，冰上放置2分鐘。
3)加人900μl LB培養基，37℃水平搖1小時。
4)取100μl分別涂于低鹽LB瓊脂平板(含Zeocin 25g/ml)，37℃過夜培養。
4.觀察結果第二天LB平板長出數十個陽性菌落.
(三)酶切及測序鑒定從大腸桿菌TOP10中提取小量質粒pPICZaA-hITF，用EcoRI和NotI消化，切下預期大小片段，按設計編碼pPICZaA-hITF序列，分別為210bp和3600bp，用重組質粒pPICZaA-hITF酶切電泳圖和pPICZaA-hITF測序圖譜測序鑒定，測序結果證明，所克隆pPICZaA-hITF序列完全正確，而且是按照設計準確進入載體。見圖2和圖3。
酶切體系質粒DNA 16μlEcoRI1μlNotI 1μl10X緩沖液2μl共計20μl反應條件37℃4-6小時(四)重組質粒轉化入GS115酵母菌及PCR鑒定目的基因
1.GS115酵母菌感受態的制備1)接種GS115酵母菌到50ml YPD培養基中，30℃搖菌過夜(約24～28h)培養到OD值為0.8～1.0(約108Cells/ml)。
2)收獲細胞，用25ml無菌水洗滌一次，室溫下1500g離心10分鐘。
3)重懸細胞于1ml 100mM氯化鋰溶液中，將懸液轉入1.5ml離心管。
4)離心機最大速度離心15秒沉淀菌體，重懸菌體于400μl 100mM氯化鋰溶液中。
5)按50μl/管分裝，立即進行轉化。
2.GS115酵母菌的化學轉化1)煮沸1ml鮭魚精DNA 5分鐘，迅速冰浴以制備單鏈擔體DNA。
2)將處于感受態的GS115酵母菌離心，去除殘余的氯化鋰溶液。
3)對于每一個轉化，按以下順序加入50％PEG3350 240μl1M LiCl 36μl2mg/ml單鏈Salmon sperm DNA 25μl5～10μg/50μl H20質粒DNA 50μl4)劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體完全分布均勻(約1min)。
5)30℃水浴孵育30分鐘。
6)42℃水浴熱休克20～25分鐘。
7)6000～8000轉/分離心收集酵母菌體(吸出液體)。
8)重懸酵母于1ml YPD培養基，30℃搖床孵育。
9)1～4h后，取25～100μl菌液鋪選擇性培養基平板，于30℃培養2～3天鑒定。
3.基因組PCR鑒定提取GS115酵母菌DNA，以公用引物α-因子及AOX引物進行PCR鑒定，結果見圖4PCR反應體系(50μl)H2O 35.5μl10xbuffer 5μldNTP 2μl上引(20μM)1μl下引(20μM)1μl模板 1μlTag酶 0.5μlMgCl24μl共計50μl反應條件94℃預變性4分鐘后進入循環；94℃變性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，共30個循環；循環完成后72℃繼續延伸7分鐘。
(五)基因型鑒定及誘導表達1.主要溶液配制1)YPD培養液將10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g葡萄糖溶至1000ml去離子水中，高壓消毒。
2)MD平板1L的組成含1.34％YNB，4×10-3％生物素，2％葡萄糖，1.5％瓊脂。
3)BMGY培養液將10g酵母提取物，20g蛋白胨，13.4gYNB，4×10-5g生物素，10g甘油溶至1000ml PH6.00.1M磷酸鉀緩沖溶液中。
4)BMMY培養液BMGY中10g甘油由5ml甲醇代替。
2.基因型鑒定分別挑取含Zeocin的YPD平板上形成的陽性克隆接種于MDH、MMH培養板的相應位置上，并接種試劑盒中所提供的Mut+、Mut-酵母細胞分別作為陽性陰性對照，置30℃恒溫箱培養直至克隆形成，參照陽性陰性對照對比同一位置點隆大小，確定表型。
3.Mut+表型重組酵母的誘導表達實驗
1)挑選一單菌落，置于裝有25ml MGY、BMG或BMGY培養基的250ml搖瓶中，于28-30℃，250-300轉/分，培養至0D＝2～6(λ＝600，16-18小時)。
2)室溫下1500-3000g離心5分鐘，收集菌體，用MM、BMM或BMMY重懸菌體，使OD600＝1.0左右(約100-200ml)。
3)將步驟2所得的菌液置于1L的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于28-30℃、250-300轉/分的搖床上繼續生長。
4)每24h向培養基中添加100％甲醇至終濃度為0.5～1.0％。
5)按時間點分別取菌液樣品，取樣量為1ml，置于1.5ml EP管中，最大轉速離心2-3分鐘，分別收集上清和菌體，分析目的蛋白的表達量和菌液最佳收獲時間。時間點一般取0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h。
5)分離樣品的上清液，于-80℃保存備用。
(六)表達產物的純化1、取上清1000毫升，冷凍干燥濃縮至100毫升。
2、將濃縮上清移入超濾離心管(截留分子量30KD)，離心約20～30分鐘去除大部分大分子量雜蛋白。
3、將濾出液通過鎳離子柱，10～50毫摩爾咪唑漂洗雜蛋白。
4、100～800毫摩爾咪唑洗脫目的蛋白。
5、將洗脫液移入超濾離心管(截留分子量3KD)，離心約20～30分鐘去除鹽分、咪唑等小分子物質。
6、將目的蛋白用孔徑0.2微米的濾器過濾除菌。
7、冷凍干燥成粉末狀，-80℃長期保存。
權利要求
1.一種采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝，包括目的基因的獲取、酵母表達載體的構建、酶切及測序鑒定、誘導表達和純化過程，其特征是在酶切及測序鑒定之后還有一個轉化入GS115酵母菌的過程將重組質粒線性化，然后化學轉化入GS115酵母菌，再進行抗性篩選，將篩選出的陽性克隆分別轉接到MMH、MDH平板上獲得陽性克隆Mut+表型。
2.按照權利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝，其特征在于所說的目的基因的獲取是從小腸粘膜中提取總RNA，通過RT-PCR獲得編碼59個氨基酸的腸三葉因子的基因序列GAGGAGTACGTGGGCCTGTCTGCAAACCAGTGTGCCGTGCCAGCCAAGGACAGGGTGGACTGCGGCTACCCCCATGTCACCCCCAAGGAGTGCAACAACCGGGGCTGCTGCTTTGACTCCAGGATCCCTGGAGTGCCTTGGTGTTTCAAGCCCCTGCAGGAAGCAGAATGCACCTTCTGA同時利用上游引物5′-GAGAGAATTCCATCATCATCATCATCATGAGGAGTACGTGGGCCTGTC-3′或5′-TTTAGCGGCCGCTCAGAAGGTGCATTCTGCTTC-3′引入六個組氨酸標簽6×CAT。
3.按照權利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝，其特征在于所說的酵母表達載體的構建是由RT-PCR擴增出的人腸三葉因子基因序列，經EcoRI和NotI雙酶切，然后插入用同樣的限制性內切酶處理過的酵母表達載體pPICZaA，轉化入大腸桿菌Top10，以濃度20～30μg/ml Zeocin的低鹽LB平板篩選重組質粒，得到含有重組酵母表達質粒pPICZaA-hITF的重組大腸桿菌Top10。
4.按照權利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝，其特征在于所說的酶切及測序鑒定是從大腸桿菌Top10中提取小量質粒pPICZaA-hITF，用EcoRI和NotI消化，切下預期大小片段，按設計編碼pPICZaA-hITF序列，分別為210bp和3600bp；再用重組質粒pPICZaA-hITF酶切電泳圖和pPICZaA-hITF測序圖譜測序鑒定。
5.按照權利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝，其特征在于所說的誘導表達是選取陽性克隆Mut+進行甲醇誘導表達，誘導至96小時后，離心分離胞體和上清，獲得酵母GS115-hITF上清液。
6.按照權利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝，其特征在于所說的純化是將酵母菌GS115-hITF上清液冷凍干燥，從1000ml濃縮至100ml，把濃縮上清移入超濾離心管，離心20～30分鐘去除大部分大分子量雜蛋白，再將濾出液通過鎳離子柱，10～50毫摩爾咪唑漂洗雜蛋白，100～g00毫摩爾咪唑洗脫目的蛋白，然后把洗脫液移入超濾離心管，離心20～30分鐘去除鹽分、咪唑等小分子物質，最后將目的蛋白用孔徑0.2微米的濾器過濾除菌，冷凍干燥成粉末狀，-80℃長期保存。
全文摘要
本發明涉及基因工程的DNA或RNA、載體和質粒，或其分離、制備或純化。是一種采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝包括目的基因的獲取、酵母表達載體的構建、酶切及測序鑒定、轉化入GS115酵母菌、誘導表達和純化六步過程。按照本發明表達方法獲得的重組人腸三葉因子，表達產量可達100mg/L，提純純度可達95％或更高，純化的蛋白產物經檢測結果表明用本發明表達方法獲得的重組人腸三葉因子為高純度、無熱源、無內毒素，有正確的分子量，與天然的腸三葉因子有相同的等電點、氨基酸序列和紫外光譜，及其完好的生物學活性的重組蛋白。它在治療由各種致傷因子引起的胃腸粘膜損傷等方面具有顯著效果。
文檔編號C12N15/81GK1782067SQ20051005729
公開日2006年6月7日 申請日期2005年9月27日 優先權日2005年9月27日
發明者彭曦, 孫勇, 汪仕良, 黃躍生 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院