專利名稱：：一種pcr方法
技術領域：
：本發明涉及一種PCR方法。
背景技術：
：通過PCR步查法獲得插入位點的毗鄰序列較傳統的建庫篩選相比，操作簡便、快捷且成本低廉，是分離與已知序列毗鄰的未知序列或新基因的首選實驗方法。現有的PCR步查法，如inversePCR、連接介導PCR、TAIL-PCR等存在著方法過于復雜、受酶切位點的限制、擴增的片段小(達不到研究者所要求的長度)、特異性差等弊端，常常擴增不到研究者所需要的DNA片段。目前用于分離與已知序列毗鄰的未知序列的PCR方法已報道有幾十種，按其采用的原理，可歸納為三種1、反向PCR(InversePCR)將未知序列端反折回來，與已知序列相連接，再用已知序列上的兩引物作PCR。反向PCR主要有兩個技術問題(1)要求在已知序列和未知序列端有相同的酶切位點，當一端沒有或兩端皆沒有合適的酶切位點時，反向PCR不適用。(2)當兩端皆存在合適的酶切位點時，反向PCR也不十分有效，因為連接反應多發生于分子間，分子內連接(環化)的幾率很小。2、連接介導的PCR。連接介導的PCR是在未知序列端連接上一個接頭，用已知序列端的特異引物和未知序列端的接頭引物作PCR擴增。這類PCR方法的共同特點是特異性差。3、隨機退火的PCR(randomlyprimedPCR)這類PCR也有兩個技術問題，1)這類PCR要求在未知序列端有簡并引物(arbitrarydegenaratedprimer)的結合位點，而實際情況是在很多情況下在未知序列端缺乏簡并引物的結合位點。2)非特異性擴增問題十分突出，在多數情況下非特異性擴增掩蓋了特異性擴增，從而得不到所需要的特異性PCR擴增產物的條帶。
發明內容本發明的目的是提供一種具有較高特異性，并且操作簡單的PCR方法。本發明所提供的PCR方法，稱為SiteFind-PCR，包括以下步驟1)用SiteFinder起始PCR反應；所述SiteFinder包括46種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子，所述各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子的長度相同，均為50-100nt；所述各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子的3′末端的4至6個脫氧核苷酸組成的序列均相同，緊密連接于該4至6個脫氧核苷酸的5′方向的6個脫氧核苷酸組成的序列均不同，緊密連接于該6個脫氧核苷酸的5′方向的38-90個脫氧核苷酸組成的序列均相同；2)進行巢式PCR反應；所述巢式PCR反應的引物由根據SiteFinder合成的SPF1和SPF2，和根據與待擴增的目標序列相鄰的已知序列合成的基因特異引物GSP1，GSP2和GSP3組成；所述SPF1和SPF2的序列均選自步驟1)的SiteFinder的所述各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子的38-90個脫氧核苷酸組成的序列；所述SPF1的3′末端序列和SPF2的5′末端序列相同，形成嵌套引物；所述GSP1，GSP2和GSP3中，所述GSP3最接近待擴增的目標序列，其次是GSP2，離待擴增的目標序列最遠的是GSP1；所述GSP3的3′端第一個脫氧核苷酸與所述已知序列的結合位置，與所述已知序列的3′端最后一個脫氧核苷酸間至少相距5nt。其中，為了便于對待擴增的目標序列的PCR產物進行選擇和將得到的PCR產物克隆入載體，所述38-90個脫氧核苷酸組成的序列中，緊密連接于所述6個脫氧核苷酸5′方向的脫氧核苷酸組成的序列為一個限制性核酸內切酶識別序列的5′→3′走向的單鏈序列；所述限制性核酸內切酶的識別序列大于等于八個核苷酸對。其中，任何大于等于八個核苷酸對組成的限制性核酸內切酶的識別序列均可實現該目的，使用大于等于八個核苷酸對組成的限制性核酸內切酶的稀有識別序列的原因是避免將SiteFinder以外的目標序列切斷。所述方法中還包括利用所述SiteFinder包含的各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子中的限制性核酸內切酶識別序列對應的限制性核酸內切酶，對待擴增的目標序列的PCR產物進行選擇的步驟。識別序列大于等于八個核苷酸對的限制性核酸內切酶包括NotI(GCGGCCGC)，ASC(GGCGCGCC)，AsiSI(GCGATCGC)，FseI(GGCCGGCC)等。所述SPF1和SPF2的序列均選自所述40-90個脫氧核苷酸中，緊密連接于所述限制性核酸內切酶識別序列的5′方向的脫氧核苷酸組成的序列。所述起始PCR反應包括模板變性、SiteFinder中的單鏈寡聚脫氧核苷酸分子與模板退火、單方向延伸；所述SiteFinder中的單鏈寡聚脫氧核苷酸分子與模板退火的溫度條件可為16-25℃1分鐘；所述起始PCR反應的模板變性的溫度條件可為先92℃2分鐘，然后95℃1分鐘。所述起始PCR反應的單方向延伸的溫度條件為在至少3分鐘內升溫至68℃，然后68℃10分鐘。所述巢式PCR反應包括第一輪和第二輪擴增反應，所述第一輪擴增反應是由SPF1和GSP1組成的一對引物進行的反應，所述第二輪擴增反應包括由SPF2和GSP2組成的一對引物進行的反應。為了根據SPF2和GSP2、GSP3所擴增DNA片段的大小差異來辨認PCR產物是否為特異性分子，所述第二輪擴增反應還包括由SPF2和GSP3組成的一對引物進行的反應。所述第一輪擴增反應和第二輪擴增反應的溫度條件均為先94℃1分鐘；然后95℃10-15秒，68℃6分鐘，進行30-35個循環；最后72℃5分鐘。本發明首先獨特設計了用來起始PCR反應的由46種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子組成的SiteFinder。圖1示一種SiteFinder，其3’末端有4個特異的核苷酸，用來與DNA模板上相應位點互補配對，該4個特異的核苷酸上游有6個隨機核苷酸，用來輔助3’末端退火；緊接著有一個由8個核苷酸組成的NotI的識別序列的5′→3′走向的單鏈序列，用來選擇性地克隆目標分子。基于SiteFinder包含的各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子序列的5′端序列，合成2個嵌套引物，即SFP1和SFP2。圖1示根據上述SiteFinder的5′端序列合成的SFP1和SFP2。根據與待擴增的目標序列相鄰的已知序列，合成基因特異引物GSP1，GSP2和GSP3。GSP1，GSP2和GSP3中，所述GSP3最接近待擴增的目標序列，其次是GSP2，離待擴增的目標序列最遠的是GSP1。為了便于鑒定所擴增得到的產物是否為目的序列，所述GSP3的3′端第一個脫氧核苷酸與所述已知序列的結合位置，與所述已知序列的3′端最后一個脫氧核苷酸間至少相距5nt。SiteFind-PCR的原理如圖2(粗線示已知序列，細線為未知序列)所示(1)基因組DNA；(2)通過模板變性、SiteFinder在低溫下與基因組模板退火、單方向延伸，將SiteFinder序列引入基因組序列之中；(3)通過巢式PCR指數倍擴增目標DNA分子，而非目標分子因莖環結構的抑制作用而無法完成指數擴增，從而達到選擇性擴增目標分子的目的；(4)通過限制性核酸內切酶識別序列(如NotI識別序列)選擇性地克隆目標分子；(5)通過已知序列上GSP2下游的GSP3特異性地篩選目標分子。一般來說，為了保證PCR產物的特異性，在PCR過程中應該盡量避免非特異起始發生。但是，這種非特異起始是相對于整個引物來說的。對于引物的3’-末端的幾個堿基來說，即使是錯誤的起始，也必然是精確地與模板DNA分子配對的，否則將無法完成DNA分子的擴增。利用這一特點，依靠SiteFinder的3’-末端的4-6個堿基尋找基因組上與其配對的位點，起動整個基因組上相應位點下游的DNA分子的擴增(圖2)。隨后完成了對目標分子的選擇第一次選擇(選擇性擴增)，目標分子在基因特異引物的作用下，將SiteFinder的互補鏈填充完整，從而得到只有一端有SiteFinder序列而另一端是已知序列的DNA分子。在PCR過程中這種分子可以被指數倍擴增。然而，對于非目標DNA分子來說，絕大部分分子將只會在分子的一端具有SiteFinder序列，它們在后續的PCR過程中，只會被線性擴增；即使有少數分子兩端都具有SiteFinder序列，因為它們在分子的兩端構成反向重復序列，在PCR的變性退火過程中將因為空間距離接近而形成穩定的莖環結構，這種結構阻止了引物和模板的退火。第二次選擇(選擇性克隆)，在SiteFinder上設計了一個限制性內切酶的識別序列(如NotI識別序列)，一方面極大的方便了對目標分子的克隆，更重要的是又一次對目標分子進行了選擇。理論上只有目標分子才滿足一端是該限制性內切酶的識別序列(如NotI識別序列)，另外一端是平端，從而被連接到用該限制性內切酶(如NotI)和另一個核酸內切酶(如EcoRV酶切)線性化的載體(如pBlueScriptSK(+)質粒)中。非目標分子因兩端具有該限制性內切酶的識別序列(如NotI識別序列)或者一端是該限制性內切酶的識別序列(如NotI識別序列)另一端是環狀結構(loop)，而不能被克隆。第三次選擇(選擇性篩選)，克隆GSP2/SFP2引物對的產物而不是GSP3/SFP2引物對的產物，目的在于確保使用載體引物和GSP3篩選的時候，只有目標分子的特異擴增的產物能被篩選到，而其他來源的分子都不能被篩選出來。只有GSP3/SFP2引物對的擴增產物長度小于GSP2/SFP2引物對的擴增產物，才是目標分子的特異擴增的產物。本發明的SiteFind-PCR具有以下優點1.操作簡單操作過程中沒有酶切、沉淀、回收和連接過程，大大簡化了操作步驟，減小了受污染的幾率。2.高特異性在已有的步查PCR方法中只有反向PCR(InversePCR)和T-linkerPCR具有高特異性(Yan，Y.X.，An，C.C.，Li，L.，Gu，J.Y.，Tan，G.H.，andChen，Z.L.(2003).T-linker-specificligationPCR(T-linkerPCR)anadvancedPCRtechniqueforchromosomewalkingorforisolationoftaggedDNAends.NucleicAcidsRes.30，e68.)，但是它們都受酶切位點的限制，而且對于反向PCR來說，基因組內的目標DNA分子在非選擇性的連接條件下環化困難，致使在有合適酶切位點的情況下也難擴增到目標DNA分子。其它步查PCR方法特異性差，擴增到的往往是與研究目的不相干的非特異性分子。因為SiteFind-PCR中莖環結構的抑制效應，以及后續的選擇性克隆和篩選，保證了結果的高特異性。3.高成功率所進行的實驗中，成功地從8個樣品中得到8陽性結果，說明對于每一個樣品來說都能夠被有效地步查。4.容易得到大的片斷因為不用限制性內切酶處理模板，理論上其起始位點到已知序列的最大距離只受Taq酶的擴增能力的制約，所以用SiteFind-PCR做染色體步查很容易得到較大的片斷。SiteFind-PCR與現有PCR方法相比，具有操作簡單、快速、特異性高、通用性強、重復性好、一次擴增片段較長且成本低廉等優點。SiteFind-PCR可廣泛適用于分子生物學研究中多種目的的染色體步查，如轉基因動、植物及微生物中外源基因插入位點的鑒定、基因未知區段新基因的分離等。圖1為SiteFinder示意圖及根據其合成的SFP1和SFP2的序列圖2為SiteFind-PCR的原理3為DL3、DL2和DL1的序列圖4為用SiteFind-PCR鑒定第一個擬南芥插入突變體的插入位點的第二輪PCR產物電泳圖譜及對克隆產物的測序結果圖5為用SiteFind-PCR同時鑒定7個擬南芥插入突變體的插入位點的第二輪PCR產物電泳圖譜具體實施方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。實施實例1、利用SiteFind-PCR對復雜基因組上的未知序列的步查一、擬南芥突變體的獲得以pSki015(WeigelWorld)為轉化擬南芥的載體，按照文獻(Chang，S.S.，Park，S.K.，Kim，B.C.，Kang，b.J.，Kim，D.U.，andNam，H.G.(1994).StablegenetictransformationofArabidopsisthalianabyAgrobacteriuminoculationinplanta.PlantJ.5，551-558.；Gelvin，S.B.(2003).Agrobacterium-mediatedplanttransformationthebiologybehindthe″gene-jockeying″tool.MicrobiolMolBiolRev67，16-37，tableofcontents；Tzfira，T.，Li，J.，Lacroix，B.，andCitovsky，V.(2004).AgrobacteriumT-DNAintegrationmoleculesandmodels.TrendsGenet20，375-383)的方法，用浸花法轉化擬南芥(哥倫比亞型生態種)，經除草劑篩選，在子一代植株中得到8株抗除草劑的T-DNA插入突變體。二、用SiteFind-PCR鑒定1個擬南芥插入突變體的插入位點1、SiteFinder、SFP1和SFP2、GSP3，GSP2和GSP1的設計合成(1)設計合成SiteFinder所設計合成的SiteFinder包括46種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子SiteFinder，SiteFinder-4096。它們的大小均為61nt，它們的序列通式5’-CACGACACGCTACTCAACACACCACCTCGCACAGCGTCCTCAAGCGGCCGCNNNNNNGCCT-3’，其中，3’末端的4個特異的核苷酸GCCT用來與DNA模板上相應位點互補配對，該4個特異的核苷酸上游有6個隨機核苷酸NNNNNN(N為A或T或C或G)，用來輔助3’末端退火；緊接著有一個由8個核苷酸組成的NotI的識別序列5′→3′走向的單鏈序列GCGGCCGC，用來選擇性地克隆目標分子。(2)設計合成SFP1和SFP2基于SiteFinder包含的各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子序列的5’端序列，合成2個嵌套引物SFP1和SFP2。SFP15’-CACGACACGCTACTCAACAC-3’，SFP25’-ACTCAACACACCACCTCGCACAGC-3’。(3)設計合成GSP3，GSP2和GSP1以穿梭載體pSki015的左邊界序列附近的核苷酸序列作為已知序列，合成基因特異引物GSP3(DL3)，GSP2(DL2)和GSP1(DL1)。DL3的序列為5’-GCTTTCGCCTATAAATACGACGG-3’，DL2的序列為5’-TGGACGTGAATGTAGACACGTCGA-3’，DL1的序列為5’-GACAACATGTCGAGGCTCAGCAGG-3’(圖3)。DL3與序列1的起始結合位置是序列1的自5′端第172-194位脫氧核苷酸，DL2與序列1的起始結合位置是序列1的自5′端第113-136位脫氧核苷酸，DL1與序列1的起始結合位置是序列1的自5′端第1-24位脫氧核苷酸。2、用SiteFinder起始PCR反應以步驟一獲得的一株擬南芥突變體的基因組DNA為模板，用SiteFinder起始PCR反應。其中，反應體系為20μL，包括0.1μg基因組DNA(1μL)，1μL5μmol/L的SiteFinder，1單位的Taq酶，1μL2.5mM的dNTP。反應的溫度條件為先92℃(2min)，然后95℃(1min)使模板變性；再25℃(1min)使SiteFinder與模板退火；在3分鐘內升溫至68℃，然后在68℃(10min)，使SiteFinder向3′方向單方向延伸。3、用SFP1和SFP2，DL3，DL2和DL1進行巢式PCR反應在完成步驟2的起始PCR反應的20μL反應體系中，加入3.5μL10μmol/L的SFP1，1μL10μmol/L的DL1，0.5μL10×Taq酶緩沖液，進行第一輪擴增反應，溫度條件為先94℃1分鐘；然后95℃10秒，68℃6分鐘，進行30個循環；最后72℃5分鐘。在第一輪擴增反應結束后，取1μL產物稀釋1000倍，再取1μL稀釋產物作模板，再向反應體系中加入2μL10μmol/L的SFP2，2μL10μmol/L的DL2，0.5μL10mM的dNTP，1單位的Taq酶，用水補足到50μL，進行第二輪擴增反應。同時按上述體系設平行對照，所不同的是用DL3替換DL2。溫度條件為先94℃1分鐘；然后95℃10秒，68℃6分鐘，進行30個循環；最后72℃5分鐘。第二輪擴增反應結束后，將得到的PCR產物進行電泳，電泳結果如圖4A所示，泳道1和2分別是SFP2/DL2和SFP2/DL3引物對擴增的產物，泳道1中得到3條帶，泳道2中得到2條帶，泳道1中較大的兩條帶分別比泳道2中相應的兩條帶大，說明得到的PCR產物是目標分子的特異擴增產物。為了確保使用載體引物M13R和DL3篩選陽性克隆的時候，只有目標分子的特異擴增的產物能被篩選到，而其他來源的分子都不能被篩選出來，將DL2/SFP2引物對的產物進行克隆。回收泳道1中最大的條帶(2.2kb)對應的DNA片段，用NotI酶切后，與經NotI和EcoRV酶切的載體pBlueScriptSK(+)進行連接，按常規方法將連接產物轉化大腸桿菌、用M13R和DL3進行菌落PCR篩選陽性克隆，進行測序，測序結果顯示泳道1中最大的條帶對應的DNA片段的長度為2270bp，該片段中，在距DL3的783bp處有一個GCCT位點(圖4B)，這與電泳結果相吻合(圖4A中白色箭頭所指的條帶)。測序結果表明得到泳道1中最大的條帶為2.2kb。將所得到的序列與GeneBank中的序列比對分析T-DNA插入位點。結果表明在該擬南芥突變體中，外源片段的插入位置是擬南芥基因組的第三號染色體上。該插入位點的鑒定結果與按TAIL-PCR鑒定的插入位點相同，但是步查的片斷比通過TAIL-PCR步查的片斷長1.6kb。實施例2、對7個擬南芥突變體插入位點序列的特異性擴增為了驗證SiteFind-PCR的廣泛的適用性，對實施例1步驟一中的其它7個突變體進行插入位點的分析。除模板分別為該7個突變體的基因組DNA不同外，其它的反應材料(如SiteFinder，GSP3，GSP2和GSP1，SFP1，SFP2)和反應條件均與實施例1相同。結果如圖5所示，根據電泳條帶的差別判斷有7個樣品得到了特異擴增產物，其中樣品4有3條特異擴增的產物。圖5中，泳道II和III為每個突變體樣品的SFP2/DL2和SFP2/DL3引物對的擴增產物；1-7分別表示7個突變體的樣品。序列表<160><210>1<211>421<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1gacaacatgtcgaggctcagcaggacctgcaggcatgcaagcttatcgatatctagatct60cgagctcgagatctagatatcgatcgtgaagtttctcatctaagcccccatttggacgtg120aatgtagacacgtcgaaataaagatttccgaattagaataatttgtttattgctttcgcc180tataaatacgacggatcgtaatttgtcgttttatcaaaatgtactttcattttataataa240cgctgcggacatctacatttttgaattgaaaaaaaattggtaattactctttcttttcct300ccatattgaccatcatactcattgctgatccatgtagatttcccggacatgaagccattt360acaattgaatatatcctgccgccgctgccgctttgcacccggtggagcttgcatgttggt420t42權利要求1.一種PCR方法，包括以下步驟1)用SiteFinder起始PCR反應；所述SiteFinder包括46種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子，所述各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子的長度相同，均為50-100nt；所述各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子的3′末端的4至6個脫氧核苷酸組成的序列均相同，緊密連接于該4至6個脫氧核苷酸的5′方向的6個脫氧核苷酸組成的序列均不同，緊密連接于該6個脫氧核苷酸的5′方向的38-90個脫氧核苷酸組成的序列均相同；2)進行巢式PCR反應；所述巢式PCR反應的引物由根據SiteFinder合成的SPF1和SPF2，和根據與待擴增的目標序列相鄰的已知序列合成的基因特異引物GSP1，GSP2和GSP3組成；所述SPF1和SPF2的序列均選自步驟1)的SiteFinder的所述各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子的38-90個脫氧核苷酸組成的序列；所述SPF1的3′末端序列和SPF2的5′末端序列相同，形成嵌套引物；所述GSP1，GSP2和GSP3中，所述GSP3最接近待擴增的目標序列，其次是GSP2，離待擴增的目標序列最遠的是GSP1；所述GSP3的3′端第一個脫氧核苷酸與所述已知序列的結合位置，與所述已知序列的3′端最后一個脫氧核苷酸間至少相距5nt。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述38-90個脫氧核苷酸組成的序列中，緊密連接于所述六個脫氧核苷酸5′方向的脫氧核苷酸組成的序列為一個限制性核酸內切酶識別序列的5′→3′走向的單鏈序列；所述限制性核酸內切酶的識別序列大于等于八個核苷酸對。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法中還包括利用所述SiteFinder包含的各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子中的限制性核酸內切酶識別序列對應的限制性核酸內切酶，對待擴增的目標序列的PCR產物進行選擇的步驟。4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述SPF1和SPF2的序列均選自所述38-90個脫氧核苷酸中，緊密連接于所述限制性核酸內切酶識別序列的5′方向的脫氧核苷酸組成的序列。5.根據權利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所述起始PCR反應包括模板變性、SiteFinder中的單鏈寡聚脫氧核苷酸分子與模板退火、單方向延伸；所述SiteFinder中的單鏈寡聚脫氧核苷酸分子與模板退火的溫度條件為16-25℃1分鐘。6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所與模板退火的溫度條件為25℃1min；所述起始PCR反應的模板變性的溫度條件為先92℃2分鐘，然后95℃1分鐘。7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述起始PCR反應的單方向延伸的溫度條件為在至少3分鐘內升溫至68℃，然后68℃10分鐘。8.根據權利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所述巢式PCR反應包括第一輪和第二輪擴增反應，所述第一輪擴增反應是由SPF1和GSP1組成的一對引物進行的反應，所述第二輪擴增反應包括由SPF2和GSP2組成的一對引物進行的反應。9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述第二輪擴增反應還包括由SPF2和GSP3組成的一對引物進行的反應。10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述第一輪擴增反應和第二輪擴增反應的溫度條件均為先94℃1分鐘；然后95℃10-15秒，68℃6分鐘，進行30-35個循環；最后72℃5分鐘。全文摘要本發明公開了一種具有較高特異性，并且操作簡單的PCR方法。該PCR方法，通過模板變性、SiteFinder在低溫下與基因組模板退火、單方向延伸，將SiteFinder序列引入基因組序列之中；通過2輪PCR指數倍擴增目標DNA分子，而非目標分子因莖環結構的抑制作用而無法完成指數擴增，從而達到選擇性擴增目標分子的目的；通過限制性內切酶識別位點選擇性地克隆目標分子；最后，通過已知序列上GSP2下游的GSP3特異性的篩選目標分子。本發明的PCR方法與現有PCR方法相比，具有簡單快速、特異性高、通用性強、重復性好、一次擴增片段較長且成本低廉等優點，廣泛適用于分子生物學研究中多種目的染色體步查，如轉基因動、植物及微生物中外源基因插入位點的鑒定、基因未知區段新基因的分離等。文檔編號C12P19/00GK1891832SQ200510080550公開日2007年1月10日申請日期2005年7月4日優先權日2005年7月4日發明者安成才,譚桂紅,高音,石苗,張欣躍,何善平,陳章良申請人:北京大學