專利名稱：在葉綠體中同時表達7個外源基因的載體構建方法
技術領域：
本發明涉及的是一種植物基因工程技術領域的方法，特別是一種在葉綠體中同時表達7個外源基因的載體構建方法。
背景技術：
利用基因工程進行農藝性狀的改良和利用植物作為生物反器生產某些藥用蛋白和藥用成份分子，已經成了植物基因工程的研究熱點。迄今為止，多數的遺傳轉化研究都是將單一的外源基因轉入受體植物中，但有些優良性狀是由多基因控制的，同時某些分子的合成代謝途徑也是有多基因參與的。常規的多基因的轉化方法是分別將單個基因裝入表達載體中，然后分別轉入受體植物中進行后代雜交篩選獲得多基因的轉化體，或者對獲得的轉化體再進行轉基因操作，或者進行多個載體共轉化，但是這些這種方法繁瑣，費時，同時由于多次的基因操作帶來了隨后的抗生素篩選的困難，另外多個載體共轉化的方法效率比較低，并且隨著載體數的增多，獲得的所需多基因轉化體的頻率大幅度下降，所以目前急需要一種可以一次同時進行多基因轉化的載體構建方法。
葉綠體是地球上獨特的將光能轉化為化學能的細胞器，隨著人們逐步研究清楚了葉綠體的遺傳和基因表達調控機制，利用葉綠體遺傳工程改良植物性狀和表達有價值的蛋白及其他代謝物質越來越受到科學家的重視。葉綠體遺傳工程除了具有葉綠體基因組的多拷貝導致的高表達量、母性遺傳帶來的沒有基因污染、定點整合消除了基因沉默的優點外，它還具有原核特性，即某些基因是以多順反子的形式形成一個operon進行表達的，這一特點為利用葉綠體遺傳工程同時表達多個基因奠定了理論基礎。新生仔豬腹瀉(又稱仔豬黃痢)，是一種發病迅速，發病率和死亡率均很高的傳染病，是養豬場，特別是集約化養豬場的常見傳染病。仔豬的發病率往往在90％以上，對于仔豬的成活、發育和增重等有嚴重影響，同時還降低飼料報酬等，估計全國每年經濟損失達十億元。新生仔豬腹瀉是由毒素源性大腸桿菌引起的，病菌感染仔豬以后，藉鞭毛的作用附著在仔豬的腸上皮細胞上，在那里大量繁殖，并產生大量毒素，受感染仔豬劇烈腹瀉，排出黃色或黃白色水樣糞便，并迅速脫水而死亡。目前預防新生仔豬腹瀉主要是采取基因工程的菌株來免疫接種妊娠后期的母豬，激發免疫反應，給哺乳仔豬腸道提供被動免疫保護。
毒素源性大腸桿菌表面的鞭毛抗原和菌體分泌的腸毒素是兩個重要的致病因子，根據菌株的不同，此類產腸毒素大腸桿菌攜帶有不同的鞭毛抗原類型，如K88、K99、P、Type 1、S、987P、CFA/I等。在這些菌株中以K88鞭毛抗原型的ETEC流行性最廣，K88鞭毛由大量的主要結構蛋白亞基FaeG和少量的小亞基(FaeC，FaeD，FaeE，FaeF，FaeG，FaeH，FaeI，FaeJ)組成，這些鞭毛亞基穿越細胞質膜到周質后按一定的機制組裝成鞭毛。
經對現有技術文獻的檢索發現，Overexpression of the Bt cry2Aa2 operon inchloroplast leads to formation of insecticidal crystals(在葉綠體中過量表達Bt cry2Aa2操縱子后形成抗蟲劑晶體).De Cosa et al(2001)首次報道了在葉綠體中表達多基因，他們證明了煙草的葉綠體能夠表達蘇云金芽孢桿菌cry2Aa2操縱子的三個基因，cry2Aa2本身是該操縱子中的第三個基因，前兩個基因編碼輔助蛋白，其中一個作為分子伴侶促進毒素蛋白折疊成穩定的結構并且形成晶體。這種方法得到的重組cry2Aa2蛋白表達量達到了45％/TSP，這些為利用葉綠體遺傳工程同時表達多個基因鋪平了道路，但是目前還沒有發現與本發明主題密切聯系的文獻與專利的報道。
發明內容
本發明的目的在于構建產腸毒素大腸桿菌K88ac鞭毛蛋白基因簇中從faeC到faeI的七個基因的煙草葉綠體表達載體，通過基因槍轉化的方法對煙草進行轉化，實現七個外源基因在轉基因植物中的表達。提供一種在葉綠體中同時表達7個外源基因的載體構建方法，使其首次在植物葉綠體中進行7個外源基因的表達，同時為生產誘導仔豬產生更為有效的抗體的植物疫苗提出了一種方法。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明構建了一種葉綠體表達載體含有組成K88ac鞭毛蛋白基因簇的faeC、faeD、faeE、faeF、faeG、faeH、faeI七個基因序列，提取編碼K88ac野生菌C83907的質粒，以野生菌C83907的質粒為模板，用核苷酸序列與SEQ ID NO1相同的引物1和核苷酸序列與SEQ ID NO2相同的引物2進行PCR擴增，獲得全長基因faeCD的擴增產物，為3011bp，且核苷酸序列與SEQ IDNO.5相同；將其與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，獲得含faeCD序列的大腸桿菌克隆pTCD，用核苷酸序列與SEQ ID NO3相同的引物3和核苷酸序列與SEQ ID NO4相同的引物4進行PCR擴增，獲得全長基因faeEI的擴增產物，為4186bp，且核苷酸序列與SEQ ID NO.6相同，將其與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，獲得含faeCD序列的大腸桿菌克隆pTEI。
所述的外源基因整合進葉綠體基因組中，是指(1)構建葉綠體表達載體時，都在外源基因表達盒的兩側各連接一段葉綠體的DNA序列，稱為同源重組片段或定位片段(Targeting fragment)。當載體被導入葉綠體后，通過這兩個片段與葉綠體基因組上的相同片段發生同源重組，就將外源基因整合到葉綠體基因組的特定位點。
(2)同時要求同源重組發生以后，外源基因的插入既不引起葉綠體基因原有序列丟失，又不致于破壞插入點處原有基因的功能。為滿足這一要求，已有的工作都選用了相鄰的兩個基因作為同源重組片段，例如rbcL/accD，16StrnV/rps12rps7，psbA/trnK，rps7/ndhB。當同源重組發生以后，外源基因定點插入在兩個相鄰基因的間隔區，保證了原有基因的功能不受影響。
(3)所構建的葉綠體表達載體選擇rbcL/accD，作為同源重組片段。
在外源基因整合進葉綠體基因組中，植物的葉綠體中轉錄目的基因中包含第一代和第二代轉基因植物的產生；所述的K88ac鞭毛蛋白是毒素源性大腸桿菌的鞭毛蛋白；所述的K88ac鞭毛蛋白，葉綠體的基因組中整合有K88ac鞭毛蛋白基因簇的faeC faeD、faeE、faeF、faeG、faeH、faeI七個基因；所述的faeC、faeD、faeE、faeF、faeG、faeH、faeI七個基因序列，蛋白表達在獲得的轉基因植物中。
所述的外源基因，其表達框以16S rRNA啟動子啟動外源基因的表達，1，5-二磷酸羧化/氧化酶大亞基基因3’端非翻譯區(ribulose-1，5-biphosphatecarboxylase/oxygenase large subunit gene 3’UTR)作為外源基因表達框的終止子。為了確保外源基因在煙草葉綠體中的表達，分別在基因faeC和faeE的起始密碼子前添加核糖體結合位點(RBS)GGAGG。
大腸桿菌克隆pTCD用SalI和BamH I雙切，回收3kb的條帶，pBSK用同樣的酶切，回收載體，連接轉化后獲得中間載體pBSKCD；pBSKCD用BamH I和Sac I酶切回收載體，大腸桿菌克隆pTEI用同樣的酶切回收4186bp的條帶，連接轉化，獲得中間載體pBSKCDEI。pBSKCDEI用Sac I和Sal I酶切，回收7kb的條帶，葉綠體表達載體pCAB用同樣的酶切，回收載體，連接轉化，獲得最后的全長基因的葉綠體表達載體pAB88。葉綠體表達載體pAB88，含有與SEQ ID NO5和SEQ ID NO6相同的核苷酸序列。通過基因槍轉化方法，將表達載體pAB88導入到煙草的葉綠體中，通過同源重組的方法將外源基因整合進葉綠體基因組中，并通過ELISA的方法檢測外源基因的表達。
選擇光系統IIDl蛋白基因(photosystem II Dl protein(psbA)gene)啟動子(PpsbA)作為抗性篩選基因aadA的啟動子。同時以該基因的3’端非翻譯區作為aadA的終止子。氨基糖苷3’-腺苷酸轉移酶(Streptothricinacetyltransferases and aminoglycoside adenyltransferase)基因aadA作為抗性篩選基因，提供壯觀酶素/鏈霉素抗性，來篩選葉綠體轉化植物。
由于高等植物每個細胞中含有數目眾多的葉綠體和葉綠體基因組，因此轉化后經過抗性篩選的到的轉基因植物一般是異質的(heteroplasmic)，即轉化葉綠體和未被轉化的野生型葉綠體同時存在于轉基因植物中，經過篩選后所有的葉綠體基因組都被轉化的狀態稱為同質化(homoplasmic)。
本發明獲得的七個基因的葉綠體同時轉化表達載體，所述的核苷酸序列與SEQID NO.5和SEQ ID NO.6相同，利用該載體對煙草進行基因槍轉化，獲得了七個基因的葉綠體表達植物，并且在轉基因植物中檢測到有FaeC、FaeD、FaeE、FaeF、FaeG、FaeH、FaeI蛋白的表達，對克服傳統的植物遺傳改良的多基因操作技術的關鍵缺陷，具有很大的實際應用價值，同時為生產誘導仔豬產生更為有效的抗體的植物疫苗提出了一種方法。
圖1K88基因簇在煙草葉綠體中表達的載體結構示意圖。
圖2FaeC等基因在轉基因煙草中的表達的ELISA檢測結果。
具體實施方案1.實驗材料1.1菌株與質粒大腸桿菌菌株DH5α、BL21(DE3)由本實驗室保存；K88野生菌株C83907購自中國獸藥監察所(China Institute of Veterinary Drug Control)；大腸桿菌表達載體pET-30a(+)購自Novagen公司；pMD18-T載體購自TaKaRa公司。
1.2主要生化試劑Taq DNA聚合酶，dNTPs，限制性內切酶，核酸分子量標準等均購自TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；pfu DNA聚合酶、IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二鈉鹽)、NBT(氯化氮藍四唑)等均購自Promega公司；蛋白質分子量標準購自Fermantas GmbH和NEB公司。
1.3煙草煙草(Nicotiana tabacum cv Kexin No.1)由本實驗室保存。
2.實驗方法2.1C83907野生菌質粒的提取從培養基平板上挑取含目的質粒的單菌落，接種于3ml不加抗生素的LB液體培養基中，振蕩培養18h以上(37℃，85rpm，)。在1.5ml離心管中，倒入1.5ml菌液，離心(4℃，3000rpm，2min)，倒去上清，收集菌體，將離心管倒扣在紙巾上，晾干管壁上的殘余液滴。加入100μl預冷的溶液I，劇烈震蕩，懸浮菌體；加入200μl新鮮的溶液II，將蓋關閉，迅速顛倒5次，混勻混合物，注意不要旋轉離心管；加入150μl溶液III，將蓋關閉，顛倒數次，使溶液III均勻分散在粘稠的菌裂解液中，-20℃放置30min。離心(4℃，13000rpm，10min)，將上清轉移到新的離心管中，加入2倍體積無水乙醇，混勻，-20℃放置10min以上，離心(4℃，13000rpm，10min)，倒去上清，加入1ml 70％乙醇，將蓋關閉，顛倒數次，離心(4℃，13000rpm，2min)。倒去上清，將離心管倒扣在紙巾上，室溫放置數分鐘，待管壁上的殘余乙醇液滴完全揮發，用30μl TE(pH8.0，含20μg/ml DNase-free RNase A)溶解DNA沉淀，37℃保溫30min，DNA保存于-20℃備用。
2.2PCR擴增在無菌PCR管中加入5μl 10×Pfu PCR緩沖液，5μl 2mM dNTPs，20μM上游及下游引物各1μl，模板DNA，5 U Pfu DNA聚合酶，加水至50μl總體積，最后加適量礦物油以防止蒸發。反應條件如下94℃，5min；94℃ 30sec，56℃ 30Sec，72℃ 2min(退火溫度及延伸時間根據引物及擴增產物長度不同作相應改變)，35個循環；終延伸72℃ 10min。
反應結束后，在PCR體系中加入1U Taq DNA聚合酶，72℃ 45min。
2.3DNA片段的回收PCR產物經1％的Agrose凝膠電泳，切取含有目的DNA條帶的膠塊進行回收，方法參照杭州維特潔公司的膠回收試劑盒說明。
2.4DNA連接反應在無菌Eppendorf管中加入1μl 10×T4 DNA ligase Buffer，8μl回收的PCR產物，0.25μl pMD18-T載體，1μl T4 DNA連接酶，總體積為10μl。將各組分混勻，4℃中連接16h。當PCR產物與載體DNA片段通過酶切形成的互補粘端相連時，兩者之間的質量比為5∶1。
2.5制備大腸桿菌感受態細胞在LB平板上劃線接種大腸桿菌DH5α，37℃培養過夜。用接種環挑取10-12個單菌落(2-3mm直徑)，接種于250mL的SOB培養液中。振蕩培養(18℃，200-250rpm)，至OD600＝0.6。菌液置于冰上10min。離心(4℃，3000rpm，10min)，收集細胞。用80ml預冷的TB溶液重懸細胞，冰浴10min。離心(4℃，3000rpm，10min)，收集細胞。用20ml預冷的TB輕輕地重懸細胞，加入DMSO至終濃度7％，輕輕混勻，置于冰上。10min后，按每管500μl分裝細胞懸液于無菌的eppendorf管中。用液氮快速冷凍，儲存于-70℃。
2.6DNA連接產物轉化大腸桿菌在1.5ml eppendorf管中加入200μl的感受態細胞與10μl的DNA連接產物，手指輕彈管壁，混勻混合物。冰浴30min。42℃，溫育混合物90sec。迅速放回冰上，冰浴10min。加入800μl SOC培養液，37℃，劇烈振蕩混合液1h。將混合液涂布在選擇性培養基上，37℃培養過夜。
2.7DNA序列分析采用ABI377型測序儀(購自美國ABI公司)測定DNA序列，用PCGENE軟件分析序列，由上海博亞生物公司完成。
2.8小量制備質粒DNA從培養基平板上挑取含目的質粒的單菌落，接種于3ml含相應抗生素的LB液體培養基中，振蕩培養過夜(37℃，200rpm，)。在1.5ml離心管中，倒入1.5ml菌液，離心(4℃，3000rpm，1min)，倒去上清，收集菌體，將離心管倒扣在紙巾上，晾干管壁上的殘余液滴。加入100μl預冷的溶液I，劇烈震蕩，懸浮菌體；加入200μl新鮮的溶液II，將蓋關閉，迅速顛倒5次，混勻混合物，注意不要旋轉離心管；加入150μl溶液III，將蓋關閉，顛倒數次，使溶液III均勻分散在粘稠的菌裂解液中，-20℃放置30min。離心(4℃，13000rpm，10min)，將上清轉移到新的離心管中，加入2倍體積無水乙醇，混勻，-20℃放置10min以上，離心(4℃，13000rpm，10min)，倒去上清，加入1ml 70％乙醇，將蓋關閉，顛倒數次，離心(4℃，13000rpm，2min)。倒去上清，將離心管倒扣在紙巾上，室溫放置數分鐘，待管壁上的殘余乙醇液滴完全揮發，用30μl TE(pH8.0，含20μg/ml DNase-free RNase A)溶解DNA沉淀，37℃保溫30min，DNA保存于-20℃備用。
2.9限制性內切酶酶切DNA酶切反應參照限制性內切酶試劑盒(購自TAKARA公司)說明書中的具體操作進行。反應結束，通過瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物，回收操作與PCR產物回收相同。
2.10煙草葉綠體轉化---基因槍法通過基因槍法實行葉綠體的轉化，方法參照(Svab and Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90913-917)。
用包裹有pAB88質粒DNA的直徑為1.0um的金粉，采用基因槍Bio-Rad PDS1000/He進行轟擊放置在ROMP培養基(MS鹽，加上0.2M/L山梨醇和0.2M/L的甘露醇，30g/L的蔗糖，0.7％瓊脂，PH5.8)野生型煙草葉片，轟擊壓力1，100psi；轟擊距離9cm.轟擊后的葉片移至到MS培養基上(MS鹽，30g/L的蔗糖，0.7％瓊脂，PH5.8)光培養4天后，將葉片剪成5mm見方的小塊放置到上選培養基(MS鹽，1.5mg/L 6BA，0.15mg/L IAA，500mg/L壯觀霉素30g/L的蔗糖，0.7％瓊脂，PH5.8)上進行分化培養，每2周根換一次分化培養基；待長出綠色小苗時，移栽至生根培養基(MS鹽，500mg/L壯觀霉素30g/L的蔗糖，0.7％瓊脂，PH5.8)上進行生根培養。
2.11外源蛋白的ELISA檢測取100mg轉基因煙草的葉片，加液氮研磨，加入適量的蛋白抽提buffer(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.6)，4℃放置2h后，12,000rpm，離心10min，取上清，即為煙草的總可溶性蛋白。
用大腸桿菌BL21(DE3)表達的純化的FaeC，FaeD，FaeE，FaeF，FaeH，FaeI蛋白經PBS稀釋后，加50μl到96孔酶標板中，作為陽性對照，同時以非轉基因煙草的總可溶性蛋白作為陰性對照，總蛋白量保持相同，25℃包被過夜。用無菌水沖洗三次，加入300μl封閉緩沖液(0.05％Tween-20，0.05％NaN3，1mM EDTA，0.25％BSA，0.17M H3BO4，0.12M NaCl，pH8.5)，25℃ 30min，用重蒸水沖洗三次，再加入50μl用封閉緩沖液稀釋(1∶300)的小鼠血清，4℃孵育2h。用重蒸水沖洗三次后，加入封閉緩沖液封閉10min，再用重蒸水沖洗三次，加入50μl用封閉緩沖液稀釋的第二抗體(羊抗鼠，1∶5000.Promega)，室溫2h。重蒸水沖洗三次后，加入75μl的NPP溶液[稱取5mg NPP，溶于50μl ddH2O中，取10μl用NPP緩沖液(0.1MGlycine，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，pH10.4)稀釋到1ml]。室溫顯色1h后，加入25μl 0.5N NaOH終止反應。在405nm波長測定各孔溶液的光吸收。
根據上述實驗條件和具體技術進一步結合具體實施闡述本發明。這些實施僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
如圖1、2所示，實施例1-6中K88基因簇在煙草葉綠體中表達的載體結構和FaeC等基因在轉基因煙草中的表達的ELISA檢測結果。
實施例1——轉基因植物中FaeC蛋白的表達1.溶液、試劑(1)植物組織蛋白抽提buffer15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，最后調節pH到9.6；(2)封閉buffer0.05％Tween-20，0.05％NaN3，1mM EDTA，0.25％BSA，0.17M H3BO4，0.12MNaCl，用NaOH調節pH至8.5；(3)NPP buffer0.1M Glycine，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，用NaOH調節pH至10.4。
2.操作步驟(1)取100mg轉基因煙草和非轉基因煙草的葉片，分別加液氮迅速研磨，之后加入適量的蛋白抽提buffer，4℃放置2h后，12，000rpm，離心10min，取上清，即為煙草的總可溶性蛋白。
(2)根據蛋白濃度標準曲線測定轉基因煙草和非轉基因煙草總蛋白中的蛋白濃度，各取50ug加入96孔酶標板中，同時加等量的大腸桿菌表達的FaeC蛋白作為陽性對照，PBS溶液作為陰性對照，4℃包被過夜。
(3)用無菌水沖洗三次，加入300μl封閉buffer，25℃ 30min，用重蒸水沖洗三次，再加入50μl用封閉buffer按1∶300稀釋的小鼠血清，4℃孵育2h。
(4)用重蒸水沖洗三次后，加入封閉buffer封閉10min，再用重蒸水沖洗三次，加入50μl用封閉buffer稀釋的第二抗體(羊抗鼠，1∶5000.Promega)，室溫2h。
(5)重蒸水沖洗三次后，加入75μl的NPP溶液(稱取5mg NPP，溶于50μlddH2O中，取10μl用NPP buffer稀釋到1ml)。室溫顯色1h后，加入25μl 0.5N NaOH終止反應。在405nm波長測定各孔溶液的光吸收。
結果表明，外源蛋白FaeC在轉基因煙草中是有所表達的，如圖2(1)。
實施例2——轉基因植物中FaeD蛋白的表達1.溶液、試劑(1)植物組織蛋白抽提buffer15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，最后調節pH到9.6；(2)封閉buffer0.05％Tween-20，0.05％NaN3，1mM EDTA，0.25％BSA，0.17M H3BO4，0.12MNaCl，用NaOH調節pH至8.5；(3)NPP buffer0.1M Glycine，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，用NaOH調節pH至10.4。
2.操作步驟(1)取100mg轉基因煙草和非轉基因煙草的葉片，分別加液氮迅速研磨，之后加入適量的蛋白抽提buffer，4℃放置2h后，12,000rpm，離心10min，取上清，即為煙草的總可溶性蛋白。
(2)根據蛋白濃度標準曲線測定轉基因煙草和非轉基因煙草總蛋白中的蛋白濃度，各取50ug加入96孔酶標板中，同時加等量的大腸桿菌表達的FaeD蛋白作為陽性對照，PBS溶液作為陰性對照，4℃包被過夜。
(3)用無菌水沖洗三次，加入300μl封閉buffer，25℃ 30min，用重蒸水沖洗三次，再加入50μl用封閉buffer按1∶300稀釋的小鼠血清，4℃孵育2h。
(4)用重蒸水沖洗三次后，加入封閉buffer封閉10min，再用重蒸水沖洗三次，加入50μl用封閉buffer稀釋的第二抗體(羊抗鼠，1∶5000.Promega)，室溫2h。
(5)重蒸水沖洗三次后，加入75μl的NPP溶液(稱取5mg NPP，溶于50μlddH2O中，取10μl用NPP buffer稀釋到1ml)。室溫顯色1h后，加入25μl0.5N NaOH終止反應。在405nm波長測定各孔溶液的光吸收。
結果表明，外源蛋白FaeD在轉基因煙草中是有所表達的，如圖2(2)。
實施例3——轉基因植物中FaeE蛋白的表達1.溶液、試劑(1)植物組織蛋白抽提buffer15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，最后調節pH到9.6；(2)封閉buffer0.05％Tween-20，0.05％ NaN3，1mM EDTA，0.25％ BSA，0.17M H3BO4，0.12MNaCl，用NaOH調節pH至8.5；(3)NPP buffer0.1M Glycine，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，用NaOH調節pH至10.4。
2.操作步驟(1)取100mg轉基因煙草和非轉基因煙草的葉片，分別加液氮迅速研磨，之后加入適量的蛋白抽提buffer，4℃放置2h后，12，000rpm，離心10min，取上清，即為煙草的總可溶性蛋白。
(2)根據蛋白濃度標準曲線測定轉基因煙草和非轉基因煙草總蛋白中的蛋白濃度，各取50ug加入96孔酶標板中，同時加等量的大腸桿菌表達的FaeE蛋白作為陽性對照，PBS溶液作為陰性對照，4℃包被過夜。
(3)用無菌水沖洗三次，加入300μ1封閉buffer，25℃ 30min，用重蒸水沖洗三次，再加入50μl用封閉buffer按1∶300稀釋的小鼠血清，4℃孵育2h。
(4)用重蒸水沖洗三次后，加入封閉buffer封閉10min，再用重蒸水沖洗三次，加入50μl用封閉buffer稀釋的第二抗體(羊抗鼠，1∶5000.Promega)，室溫2h。
(5)重蒸水沖洗三次后，加入75μl的NPP溶液(稱取5mg NPP，溶于50μlddH2O中，取10μl用NPP buffer稀釋到1ml)。室溫顯色1h后，加入25μl 0.5N NaOH終止反應。在405nm波長測定各孔溶液的光吸收。
結果表明，外源蛋白FaeE在轉基因煙草中是有所表達的，如圖2(3)。
實施例4——轉基因植物中FaeF蛋白的表達1.溶液、試劑(1)植物組織蛋白抽提buffer15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，最后調節pH到9.6；(2)封閉buffer0.05％Tween-20，0.05％NaN3，1mM EDTA，0.25％BSA，0.17M H3BO4，0.12MNaCl，用NaOH調節pH至8.5；(3)NPP buffer0.1M Glycine，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，用NaOH調節pH至10.4。
2.操作步驟(1)取100mg轉基因煙草和非轉基因煙草的葉片，分別加液氮迅速研磨，之后加入適量的蛋白抽提buffer，4℃放置2h后，12,000rpm，離心10min，取上清，即為煙草的總可溶性蛋白。
(2)根據蛋白濃度標準曲線測定轉基因煙草和非轉基因煙草總蛋白中的蛋白濃度，各取50ug加入96孔酶標板中，同時加等量的大腸桿菌表達的FaeF蛋白作為陽性對照，PBS溶液作為陰性對照，4℃包被過夜。
(3)用無菌水沖洗三次，加入300μl封閉buffer，25℃ 30min，用重蒸水沖洗三次，再加入50μl用封閉buffer按1∶300稀釋的小鼠血清，4℃孵育2h。
(4)用重蒸水沖洗三次后，加入封閉buffer封閉10min，再用重蒸水沖洗三次，加入50μl用封閉buffer稀釋的第二抗體(羊抗鼠，1∶5000.Promega)，室溫2h。
(5)重蒸水沖洗三次后，加入75μl的NPP溶液(稱取5mg NPP，溶于50μlddH2O中，取10μl用NPP buffer稀釋到1ml)。室溫顯色1h后，加入25μl 0.5N NaOH終止反應。在405nm波長測定各孔溶液的光吸收。
結果表明，外源蛋白FaeF在轉基因煙草中是有所表達的，如圖2(4)。
實施例5——轉基因植物中FaeG蛋白的表達1.溶液、試劑(1)植物組織蛋白抽提buffer15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，最后調節pH到9.6；(2)封閉buffer0.05％ Tween-20，0.05％ NaN3，1mM EDTA，0.25％ BSA，0.17M H3BO4，0.12MNaCl，用NaOH調節pH至8.5；(3)NPP buffer0.1M Glycine，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，用NaOH調節pH至10.4。
2.操作步驟(1)取100mg轉基因煙草和非轉基因煙草的葉片，分別加液氮迅速研磨，之后加入適量的蛋白抽提buffer，4℃放置2h后，12，000rpm，離心10min，取上清，即為煙草的總可溶性蛋白。
(2)根據蛋白濃度標準曲線測定轉基因煙草和非轉基因煙草總蛋白中的蛋白濃度，各取50ug加入96孔酶標板中，同時加等量的大腸桿菌表達的FaeG蛋白作為陽性對照，PBS溶液作為陰性對照，4℃包被過夜。
(3)用無菌水沖洗三次，加入300μl封閉buffer，25℃ 30min，用重蒸水沖洗三次，再加入50μl用封閉buffer按1∶300稀釋的小鼠血清，4℃孵育2h。
(4)用重蒸水沖洗三次后，加入封閉buffer封閉10min，再用重蒸水沖洗三次，加入50μl用封閉buffer稀釋的第二抗體(羊抗鼠，1∶5000.Promega)，室溫2h。
(5)重蒸水沖洗三次后，加入75μl的NPP溶液(稱取5mg NPP，溶于50μlddH2O中，取10μl用NPP buffer稀釋到1ml)。室溫顯色1h后，加入25μl 0.5N NaOH終止反應。在405nm波長測定各孔溶液的光吸收。
結果表明，外源蛋白FaeG在轉基因煙草中是有所表達的(結果未列出)。
實施例6——轉基因植物中FaeH蛋白的表達1.溶液、試劑
(1)植物組織蛋白抽提buffer15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，最后調節pH到9.6；(2)封閉buffer0.05％ Tween-20，0.05％ NaN3，1mM EDTA，0.25％ BSA，0.17M H3BO4，0.12MNaCl，用NaOH調節pH至8.5；(3)NPP buffer0.1M Glycine，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，用NaOH調節pH至10.4。
2.操作步驟(1)取100mg轉基因煙草和非轉基因煙草的葉片，分別加液氮迅速研磨，之后加入適量的蛋白抽提buffer，4℃放置2h后，12，000rpm，離心10min，取上清，即為煙草的總可溶性蛋白。
(2)根據蛋白濃度標準曲線測定轉基因煙草和非轉基因煙草總蛋白中的蛋白濃度，各取50ug加入96孔酶標板中，同時加等量的大腸桿菌表達的FaeH蛋白作為陽性對照，PBS溶液作為陰性對照，4℃包被過夜。
(3)用無菌水沖洗三次，加入300μl封閉buffer，25℃ 30min，用重蒸水沖洗三次，再加入50μl用封閉buffer按1∶300稀釋的小鼠血清，4℃孵育2h。
(4)用重蒸水沖洗三次后，加入封閉buffer封閉10min，再用重蒸水沖洗三次，加入50μl用封閉buffer稀釋的第二抗體(羊抗鼠，1∶5000.Promega)，室溫2h。
(5)重蒸水沖洗三次后，加入75μl的NPP溶液(稱取5mg NPP，溶于50μlddH2O中，取10μl用NPP buffer稀釋到1ml)。室溫顯色1h后，加入25μl 0.5N NaOH終止反應。在405nm波長測定各孔溶液的光吸收。
結果表明，外源蛋白FaeH在轉基因煙草中是有所表達的(結果未列出)。
實施例7——轉基因植物中FaeI蛋白的表達1.溶液、試劑(1)植物組織蛋白抽提buffer(1)植物組織蛋白抽提buffer15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，最后調節pH到9.6；(2)封閉buffer
0.05％ Tween-20，0.05％ NaN3，1mM EDTA，0.25％ BSA，0.17M H3BO4，0.12MNaCl，用NaOH調節pH至8.5；(3)NPP buffer0.1M Glycine，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，用NaOH調節pH至10.4。
2.操作步驟(1)取100mg轉基因煙草和非轉基因煙草的葉片，分別加液氮迅速研磨，之后加入適量的蛋白抽提buffer，4℃放置2h后，12,000rpm，離心10min，取上清，即為煙草的總可溶性蛋白。
(2)根據蛋白濃度標準曲線測定轉基因煙草和非轉基因煙草總蛋白中的蛋白濃度，各取50ug加入96孔酶標板中，同時加等量的大腸桿菌表達的FaeI蛋白作為陽性對照，PBS溶液作為陰性對照，4℃包被過夜。
(3)用無菌水沖洗三次，加入300μl封閉buffer，25℃ 30min，用重蒸水沖洗三次，再加入50μl用封閉buffer按1∶300稀釋的小鼠血清，4℃孵育2h。
(4)用重蒸水沖洗三次后，加入封閉buffer封閉10min，再用重蒸水沖洗三次，加入50μl用封閉buffer稀釋的第二抗體(羊抗鼠，1∶5000.Promega)，室溫2h。
(5)重蒸水沖洗三次后，加入75μl的NPP溶液(稱取5mg NPP，溶于50μlddH2O中，取10μl用NPP buffer稀釋到1ml)。室溫顯色1h后，加入25μl 0.5N NaOH終止反應。在405nm波長測定各孔溶液的光吸收。
結果表明，外源蛋白FaeI在轉基因煙草中是有所表達的(結果未列出)。
本發明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度33bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.1aaaaaagcttatgaaaaaagcattcttattagc(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度42bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.2aaaaaggatccttattactcacacgtaatctcctgtagtttc(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度27bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3ggatccagttgtagggagggatttatg(4)SEQ ID NO.4的信息
(i)序列特征(A)長度32bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.4gagctcttattactggtactcaatacttaccg(5)SEQ ID NO.5-6的信息<110>上海交通大學<120>一種在葉綠體中同時表達7個外源基因的載體構建方法<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>5<211>3011<212>DNA<213>Escherichia coli<400>5aagcttatga aaaaagcatt cttattagca tgtgtttttt ttctcactgg gggcggggtt 60tctcacgctg cggttcagaa aaccatattc agtgctgacg tggtggcctc ggtctgtcat120gtggtggtgg atgcggacag caccggcaac agtggccggc tgacgttcgg gacttaccgt180aagtccacgg gggcatctgt accgccgcgt gacttcacgg tgcgtctgta tgagtccggc240gccacggttc agggttgctc tgcgtttctt gccgggcagg tcgccaccct ggattttggt300aacccgggac aactggacgc tgccggcgtg gtcacccgcg gtgccggtga tggtattcgc360gtggatgtac gggctgttga tgcacaggct gattatcgcg gacgtctgac gcaggataac420cattccgtga aatatccggt ggattttgcc gctaagggcc agtttcgttt tcgtgcgcag480ccggtgtttc cggctgatgt gaaggcggga gagtattccg gggcgctgac ttttgttgtc540
acttatcagt agtagggatg ccaatgaaaa aatatgtgac aacaaaatca gtgcagccag600tggcgtttcg tctgacaacc ctgagtctgg ttatgtcggc ggtactgggc agcgcatcgg660ttattgccgg tgaaaaactg gatatgtcct ttatccaggg ggggggcggg gttaatccgg720aagtctgggc agccctgaac ggcagctatg cgccggggcg ttatctggtt gacctgtccc780tgaacgggaa ggaggccggg aaacagatac tggatgtgac accacaggac agtaatgaac840tgtgtctgac agaggcatgg ctgacgaagg ctggggttta cgtcagtgca gattactttc900gtgagggata tgacgccaca cgacagtgct atgtgctgac aaaagccccg tcagtgaagg960tggattttga tgtttccacc cagagtctgg cgctgtccat tccccagaag gggctggtga 1020agatgccgga gaatgtggac tgggattacg ggaccagtgc atttcgcgtg aactataacg 1080cgaacgccaa caccggccgt aataacacct cggcctttgg ctcagcggac ctgaaagcca 1140atatcgggca ctgggtggtg agttcttctg ccacggccag cggcggtgac agcggggata 1200actccaccac gataaatatg tttacggcca cccgggccat ccgcgcactg agtgcggacc 1260tggcggtcgg gaaaacatcc accggggaca gtctgctggg cagtacggga acgtacggcg 1320tgtcgctgag ccggaacaac agcatgaagc cgggcaatct ggggtatacc ccggtgttca 1380gcggcattgc gaacgggccg tcgagggtga cactgacaca gaacgggcgg ttgctgcatt 1440cggagatggt gccggcgggt ccgttctcca tcacggatgt gccgctgtac accagtggtg 1500atgtgaccat gaaaatcacc ggtgaagacg ggcgcgacga ggtacagaac ttcccgttgt 1560cggtgatggc cgggcagtta agtccggggc agcacgagtt cagtgtggca gccggtttgc 1620ctgacgatga cagtgacctg aaaggcggtg tgtttgcggc gtcatacggt tacggtctgg 1680acggactgac gctgcgagcc ggtggggtgt tcaaccagga ctggcagggg gccagtgccg 1740gtgtggttgc cgggctgggt tacctggggg cggtatctgc tgacggggct tatgccacgg 1800cgaaataccg tgacggcagc cacagcggga ataaggtgca gctgtcctgg agtaaacaac 1860tggagacgac gaacaccggg ctgcgggtaa gctggtcacg gcagagtgag gaatatgagg 1920gcatgtcctc ctttgacccg acagagctgt ggtcgcagtc aaatcatggg cgccggacga 1980aggatgaatg gaatgccggt atcagtcagc cggtgggcgg gttgttcagt ctgtcggtgt 2040ccggctggca gcggagttat taccctgcat ccatgaccgg aagttaccgg tacagcgatg 2100acaacggaaa agaaaccggt attaccggca gtctgagtac ccagataaag ggtgtcagtc 2160tgaacctggg ctggtccggc tcccggaact cccgggggga gaataactgg tcggcgtctg 2220cttcggtgtc ggtaccgttc acactgtttg accgtcgcta cagcagcagt gcgtcggtga 2280
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1.一種在葉綠體中同時表達7個外源基因的載體構建方法，其特征在于，構建了一種葉綠體表達載體含有組成K88ac鞭毛蛋白基因簇的faeC、faeD、faeE、faeF、faeG、faeH、faeI七個基因序列，提取編碼K88ac野生菌C83907的質粒，以野生菌C83907的質粒為模板，用核苷酸序列與SEQ ID NO1相同的引物1和核苷酸序列與SEQ ID NO2相同的引物2進行PCR擴增，獲得全長基因faeCD的擴增產物，為3011bp，且核苷酸序與SEQ ID NO.5相同；將其與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，獲得含faeCD序列的大腸桿菌克隆pTCD，用核苷酸序列與SEQ IDNO3相同的引物3和核苷酸序列與SEQ ID NO4相同的引物4進行PCR擴增，獲得全長基因faeEI的擴增產物，為4186bp，且核苷酸序列與SEQ ID NO.6相同，將其與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，獲得含faeCD序列的大腸桿菌克隆pTEI。
2.根據權利要求1所述的在葉綠體中同時表達7個外源基因的載體構建方法，其特征是，所述的外源基因整合進葉綠體基因組中，是指(1)構建葉綠體表達載體時，在外源基因表達盒的兩側各連接一段葉綠體的DNA序列，當載體被導入葉綠體后，通過這兩個片段與葉綠體基因組上的相同片段發生同源重組，將外源基因整合到葉綠體基因組的特定位點；(2)同時要求同源重組發生以后，都選用了相鄰的兩個基因作為同源重組片段，當同源重組發生以后，外源基因定點插入在兩個相鄰基因的間隔區；(3)所構建的葉綠體表達載體選擇rbcL/accD，作為同源重組片段。
3.根據權利要求1或者2所述的在葉綠體中同時表達7個外源基因的載體構建方法，其特征是，在外源基因整合進葉綠體基因組中，植物的葉綠體中轉錄目的基因中包含第一代和第二代轉基因植物的產生。
4.根據權利要求1所述的在葉綠體中同時表達7個外源基因的載體構建方法，其特征是，所述的K88ac鞭毛蛋白是毒素源性大腸桿菌的鞭毛蛋白。
5.根據權利要求1或者4所述的在葉綠體中同時表達7個外源基因的載體構建方法，其特征是，所述的K88ac鞭毛蛋白，葉綠體的基因組中整合有K88ac鞭毛蛋白基因簇的faeC、faeD、faeE、faeF、faeG、faeH、faeI七個基因。
6.根據權利要求1所述的在葉綠體中同時表達7個外源基因的載體構建方法，其特征是，所述的外源基因，其表達框以16S rRNA啟動子啟動外源基因的表達，1，5-二磷酸羧化/氧化酶大亞基基因3’端非翻譯區(ribulose-1，5-biphosphatecarboxylase/oxygenase large subunit gene 3’UTR)作為外源基因表達框的終止子。
7.根據權利要求1或者2或者3所述的在葉綠體中同時表達7個外源基因的載體構建方法，其特征是，所述的外源基因，外源基因在煙草葉綠體中的表達中，分別在基因faeC和faeE的起始密碼子前添加核糖體結合位點(RBS)GGAGG。
全文摘要
本發明涉及一種基因工程技術領域的在葉綠體中同時表達7個外源基因的載體構建方法。構建了一種葉綠體表達載體含有組成K88ac鞭毛蛋白基因簇的faeC、faeD、faeE、faeF、faeG、faeH、faeI七個基因序列，提取編碼K88ac野生菌C83907的質粒，用核苷酸序列與SEQ ID NO1相同的引物1和核苷酸序列與SEQ ID NO2相同的引物2進行PCR擴增，核苷酸序列3018bp與SEQ ID NO.5相同；用核苷酸序列與SEQ ID NO3相同的引物3和核苷酸序列與SEQ ID NO4相同的引物4進行PCR擴增，核苷酸序列與SEQ ID NO.6相同，將其與pMD18－T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，獲得含faeCD序列的大腸桿菌克隆pTEI。對克服傳統的植物遺傳改良的多基因操作技術的關鍵缺陷，同時為生產誘導仔豬產生更為有效的抗體的植物疫苗提出了一種方法。
文檔編號C12N15/09GK1793377SQ200510111228
公開日2006年6月28日 申請日期2005年12月8日 優先權日2005年12月8日
發明者張大兵, 申慧峰, 梁婉琪, 錢炳俊, 袁政 申請人:上海交通大學