方法

專利名稱：方法
技術領域：
本發明涉及制備包括干微生物的組合物的改進方法，該方法產生提高的微生物生存力，并涉及通過改進方法制備的干微生物組合物的用途。
背景技術：
在農業中，接種物(innoculant)包括特定類型的微生物的使用是已知的。接種物通常被涂在種子或其它植物繁殖材料上，從而一旦播種或種植，就可建立支持種子發芽、刺激植物生長或生物保護種子和所得植物的增強環境。
例如，可使用能在豆科植物中起固氮作用的共生細菌如來自根瘤菌屬和慢生型根瘤菌屬的那些來接種豆科植物以幫助節(nodule)形成。可通過包覆種子、在農場對種子或莊稼噴粉或在種植時在犁溝中放置接種物來實現接種。
產生接種物的前述方法包括將活性的活微生物培養物如根瘤菌屬細菌培養物與載體如腐殖質或泥炭混合。水分載體保持微生物在活的狀態。但是，由于環境中養料和水分的消耗，這種活細菌培養物的保存期限短。
制備接種物的另一方法是通過將細菌轉化到休眠狀態如通過凍干細菌。為了防止細胞破裂，必須快速進行這種方法。
US 5,695,541中教導了制備干的休眠接種物的另一方法，該方法包括在生長培養基中培養微生物菌種，并將培養物和泥土載體混合，然后將混合物緩慢地空氣干燥至少約1天，從而微生物中的水分水平被逐漸降低以形成干組合物。與制備干的休眠接種物的其它方法相比，干組合物被認為具有優良的生存力。
脈沖電磁場(PEMP)已被教導能刺激生物組織，包括微生物(參見US6,561,968)。US 6,561,968中表明，在干燥過程中微生物如細菌的存活率可通過用PEMF處理得到提高。但是，US 6,561,968中表明PEMF處理只對部分干燥的微生物有用，即只對部分干燥但仍包含約20％水含量的微生物有用。也就是說，US 6,561,968只公開了PEMF處理用于將被保持在存活狀態的微生物(例如在20％水含量時，水分活性(water activity)(Aw)仍處在細菌群落為與休眠狀態相對的存活狀態的水平(在約1和0.95之間)的用途。另外，US 6,561,968教導PEMF處理只能使細菌更好地承受干燥過程(即細菌的初始存活率)。報道了對部分干燥微生物的長期保存期限沒有影響。
干微生物降低的存活率尤其是降低的保存期限是相當大的問題，尤其當干微生物的水含量在約1％至約6％w/w時。
發明概述本發明基于將微生物培養物和載體混合與用脈沖電磁場(PEMF)處理的組合顯著了增加干微生物保存期限的驚人發現。換句話說，與僅僅在載體上干燥的微生物相比或與單獨用PEMF處理的微生物相比，按照本發明處理的微生物在干燥階段能保持存活明顯較長的時間。觀察到的差異有協同性。
因此，在廣泛的方面，本發明提供使微生物培養物和載體混合與用脈沖電磁場(PEMF)處理的組合在制備包括干微生物的組合物中的用途。得到的微生物具有明顯增加的保存期限。
詳細方面在一個方面，本發明提供一種制備包括干微生物的組合物的方法，其包括培養一種或多種微生物；將培養的微生物與一種或多種載體混合；用脈沖電磁場處理微生物；將培養物∶載體混合物培育至少約6小時；和干燥微生物，以便將水分水平降低到約1wt％至約6wt％。
在另一個方面，本發明提供一種通過本發明的方法制備的包括干微生物的組合物。
在又一方面，本發明涉及干微生物在制備包覆的植物種子或其它植物繁殖材料中的用途，包括用通過本發明的方法制備的包括干微生物的組合物包覆植物種子或其它植物繁殖材料。
在本發明的另一方面中，提供了干微生物在生長介質制備中的用途，其包括將通過本發明的方法制備的包括干微生物的組合物和土壤混合。
在又一方面，本發明提供干微生物在廢水處理中的用途，包括使通過本發明的方法制備的包括干微生物的組合物與廢水接觸并分離處理的水和組合物。
通過本發明的方法制備的干微生物具有下列性質中的一種或多種與單獨用載體制備的微生物和/或單獨用PEMF處理制備的微生物相比，更好的初始存活率和增加的保存期限。
在其它實施方案中，本發明提供一種與單獨用載體制備的微生物和/或單獨用PEMF處理制備的微生物相比具有提高的初始存活率和/或保存期限的干微生物；包括所述干微生物的組合物；和其用途，包括例如在制備包覆的植物種子和/或其它繁殖材料中，在制備生長培養基中，和在廢水處理中的用途。
優選方面合適地，本發明可用于干燥能在干狀態下存活的任何微生物。
優選地，微生物處于休眠狀態。合適地，微生物可處于干燥或脫水狀態。
優選地，本發明用于干燥在農業中使用的有益微生物。尤其感興趣的是具有殺生物性質如殺真菌或殺蟲和其它性質的微生物，和例如能在將被保護植物存在下在土壤中存活的生長促進微生物。
合適地，根據本發明的微生物可為真菌，包括酵母，細菌，藻類或原生動物(protozoans)中的一種或多種。
合適地，微生物可為已知的殺生物微生物，包括真菌木霉屬(Trichoderma)和粘帚霉屬(Gliocladium)。
優選地，微生物為細菌、真菌或酵母。
在一個方面，優選微生物為細菌。
在一種實施方案中，優選微生物為來自以下屬的一種或多種的酵母假絲酵母屬(Candida)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、Cystofilobasidium、漢森酵母屬(Hansenula)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、白冬孢酵母屬(Leucosporidium)、梅奇酵母屬(Metschnikowia)、畢赤酵母屬(Pichia)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、Rodotorula、糖酵母屬(Saccharomyces)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)、Richosporon。
在另一實施方案中，優選微生物為來自以下屬中一種或多種的真菌Acrophialospora、Ampelomyces、短梗霉屬(Aureobasidium)、雙極菌屬(Bipolaris)、毛殼屬(Chaetomium)、Cladorrhinum、Clonostachys、盾殼霉屬(Coniothyrium)、附球菌屬(Epicoccum)、粘帚霉屬(Gliocladium)、Glomus、鐮孢屬(Fusarium)、Laetisaria、小球殼孢屬(Microsphaeropsis)、Mycothecium、Muscador、Mycoleptodiscus、新赤殼屬(Neocosmospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、隔孢伏革菌屬(Peniophora)、Phlebiopsis、瓶霉屬(Phialophora)、腐霉屬(Pythium)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、根霉屬(Rhizopus)、喙孢屬(Rhynchosporium)、葚孢屬(Sporidesmium)、Stephanonectria、籃狀菌屬(Talaromyces)、Tilletiopsis、木霉屬(Trichoderma)、單隔孢屬(Ulocladium)、輪枝孢屬(Verticillium)、被毛孢屬(Hirsutella)、漆斑菌屬(Myrothecium)、Nematophthora、指隔孢屬(Dactylella)、枝頂孢霉屬(Acremonium)、鏈枝菌屬(Catenaria)、柱孢屬(Cylindrocapon)、指隔孢屬(Dactylella)、單頂孢屬(Monacrosporium)、Pochonia。
合適地，真菌可為以下中的一種或多種局限枝頂孢霉(Acremoniumstrictum)、Caternaria auxiliaris、毀滅柱孢菌(Cylindrocarpon destructans)、Dactylella oviparasitica、Hirsutella rhossiliensis、Monacrosporiumellipsosporum、柱捕單頂孢菌(Monacrosporium cionopagum)、Nematophthoragynophila、馬昆德擬青霉(Paecilomyces marquandii)、普可尼亞厚垣菌(Pochonia chlamydosporium)、粉紅螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)、Coniothyrium minitans、黑附球菌(Epicoccum nigrum)、紫附球菌(Eppicoccumpurpurascens)、大刀鐮孢(Fusarium culmorum)、尖鐮孢(Fusarium oxysporum)、煙草鐮刀霉(Fusarium tabacinum)、腐皮鐮孢(Fusarium solani)、Gliocladiumatrum、鏈孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)、粉紅粘帚霉(Gliocladiumroseum)、綠粘帚霉(Gliocladium virens)、Glomus claroideum、Glomusfasciculatum、Glomus intraradices、Glomus mossae、Laetisaria arvalis、Microsphaeropsis ochracea、Muscador albus、Mycoleptodiscus terrestris、Mycothecium verrucaria、Necosmospora vasinfecta、玫煙色擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus)、淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)、常現青霉(Penicillium frequentans)、藍綠邊青霉(Penicillium godlewskii)、黑青霉(Penicillium nigricans)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、大隔孢伏革菌(Peniophora gigantea)、瓶霉屬菌種(Phialophora sp.)I-52、Phlebiopsisgigantea、棘腐霉(Pythium acanthicum)、刺器腐霉(Pythium acanthophoron)、Pythium mycoparasiticum、Pythium nunn、寡雄腐霉(Pythium oligandrum)、纏器腐霉(Pythium periplocum)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、Rhynchosporium alismatis、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、Sporidesmiumsclerotivorum、Stephanonectria keitii、Talaromyces flavus、Tilletiopsis sp.、Trichoderma asperellum、Trichoderma atroviride、Trichoderma hamatum、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、Trichoderma inhatum、康氏木霉(Trichoderma koningii)、木素木霉(Trichoderma lignorum)、長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、Trichoderma stromaticum、綠色木霉(Trichoderma viride)、Ulocladium atrum、Verticilium chlamydosporium、大麗花輪枝孢(Verticillium dahliae)、Verticillium suchlasporium。
在又一實施方案中，優選微生物為以下屬中的一種或多種的細菌游動放線菌屬(Actinoplanes)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、節桿菌屬(Arthrobacter)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、伯克霍爾氏德菌屬(Burkholderia)、金色單胞菌屬(Chryseomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)、腸球菌屬(Enterococcus)、歐文氏菌屬(Erwinia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、泛菌屬(Pantoea)、巴斯德氏芽菌屬(Pasteuria)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、拉恩氏菌屬(Rahnella)、Raoultella、沙雷氏菌屬(Serratia)、Sporotrix、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、根瘤菌屬(Rhizobium)、慢生型根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、Mezorhizobium、Sinorhizobium Seratia、歐文氏菌屬、鏈霉菌屬(Streptomycetes)和諾卡氏菌屬(Nocardia)。
優選細菌為選自以下的非孢子形成細菌游動放線菌屬、土壤桿菌屬、節桿菌屬、雙歧桿菌屬、短芽孢桿菌屬、伯克霍爾氏德菌屬、金色單胞菌屬、叢毛單胞菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬、歐文氏菌屬、黃桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、泛菌屬、片球菌屬(Pediococcus)、假單胞菌屬、拉恩氏菌屬、Raoultella、沙雷氏菌屬、Sporotrix、寡養單胞菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、根瘤菌屬、慢生型根瘤菌屬、Mezorhizobium、SinorhizobiumSeratia、歐文氏菌屬、鏈霉菌屬和諾卡氏菌屬。
合適地，細菌可為以下中的一種或多種放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)、根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、簡單節桿菌(Arthrobacter simplex)、Bacillus chitinosporus、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、Bacillus amylofaciens、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、緩病芽孢桿菌(Bacillus lentimorbus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides)、日本甲蟲芽孢桿菌(Bacilluspopilliae)、短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、雙歧雙歧桿菌(Bifidbacteriumbifidum)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、Bifidobacterium lactis、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacterium thermophilum)、短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)、洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia)、淺黃金色單胞菌(Chryseomonas luteola)、食酸叢毛單胞菌(Comamonas acidovorans)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)、大比目魚黃桿菌(Flavobacterium balustinum)、肝素黃桿菌(Flavobacterium heparinum)、Flavobacterium psycrophilium、Flavobacterium columnae、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、棒狀乳桿菌(Lactobacillus coryniformis)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbruekii)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、Lactobacillus grayii、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)、約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)、清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)、成團泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)、甜菜疫病假單胞菌(Pseudomonas aptata)、致金色假單胞菌(Pseudomonas aureofaciens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、pseudomonas brassicacearum、洋蔥假單胞菌(Pseudomonascepacia)、綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、皺紋假單胞菌(Pseudomonas corrugata)、脫氮假單胞菌(Pseudomonas denitrificans)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)、托拉氏假單胞桿菌(Pseudomonastolaasii)、Rahnella aqualis、Raoultella terrigena、粘質沙雷氏菌(Serratiamarcesscens)、普城沙雷菌(Serratia plymuthica)、Sporotrix flocculosa、嗜麥芽糖寡養單孢菌(Stenotrophomonas malthophilia)、乳鏈球菌(Streptoccuslactis)、唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、灰綠鏈霉菌(Streptomyces griseoviridis)。
合適地，微生物可為來自假單胞菌屬的細菌。合適地，微生物可為熒光假單胞菌。合適地，微生物可為產生環脂肽的熒光假單胞菌。
優選地，在合適的培養基中培養微生物。合適地，可在常規發酵罐或搖瓶內在生長培養基中培養微生物。合適地，發酵罐可為固定、半連續或連續發酵罐。優選地，培養微生物直到培養達到穩定期。
合適地，培養物和培養基可與載體混合。在與載體混合前，可用新鮮的或過濾的培養基和/或蒸餾水稀釋微生物培養物和/或培養基。優選恰好在使培養基與載體混合前用新鮮的或過濾的培養基稀釋微生物培養物。
合適地，可以以連續方式或分批方式進行混合。
優選地，載體可為粉狀形式或被造粒。載體為粉狀形式還是粒狀形式可取決于預定用途。
合適地，粉狀載體可具有例如約1μm-約0.5mm的平均顆粒直徑。合適地，粒狀載體可具有例如約0.5mm-約3mm的平均顆粒直徑。
在一種實施方案中，優選的載體為具有大的表面積的那些，優選表面積大于200m2/克、優選大于300m2/克的那些。
在另一實施方案中，優選的載體為具有低天然水含量(WC)的那些。低天然水含量為保持細菌處于休眠狀態的含量。優選地，低天然水含量為8.0％WC或以下，優選7.5％WC或以下，優選低于約7％WC。
合適地，優選的載體可為天然水含量在3％-7.5％范圍內的那些。這在例如使用混合物包覆種子或其它繁殖材料的應用中尤其有效。
在一種實施方案中，優選的載體為具有非常高的天然水含量的那種。非常高的天然水含量為能維持細菌處于新陳代謝階段的含量。通常，非常高的天然水含量可為例如＞20％。
載體的天然水含量為結合到陽離子的水量或在天然沸石或粘土的孔內攜帶的水量。不希望受理論約束，沸石為水合鋁硅酸鹽，意味著它們在它們的基本結構中包含水，即一種斜發沸石的結構式為(Na，K，Ca)2-3A13(Al，Si)2Si13O36-12H2O，其為水合鈉鉀鈣鋁硅酸鹽。
本文中使用的術語“天然水含量”是指在105℃的烘箱中保持4小時可從樣品載體中除去的水量。為了避免疑慮，該方法沒有必要從載體中除去全部水分子。
優選地，根據本發明的載體將在一段時間內(over time)具有相對穩定的水含量。載體水含量在一段時間內的穩定性將決定載體最適合的應用。例如，斜發沸石和膨潤土在一段時間內的水分含量是相對穩定的。因此，這些載體可特別好地適用于其中培養物∶載體混合物可在長期貯存后被再使用的應用，例如這可使這些載體特別好地適用于例如包覆種子或其它繁殖材料。另一方面，部分載體可能具有相對較不穩定的水含量。這可使這些載體特別好地適用于只在短期貯存而沒有長期貯存后就使用培養物∶載體混合物的應用。
確定載體水分含量的相對穩定性的一種方法是干燥載體得到％MC，然后在將載體放在控制環境(即控制溫度和/或相對濕度)中30天后測量載體的％MC。水分損失或增加指示載體的不穩定性。在30天時間內保持相同％MC的載體被認為非常穩定。載體吸收或損失的水分量與正對照載體(如膨潤土或斜發沸石)吸收或損失的水分量相比確定載體的“相對”穩定性。根據本發明，膨潤土和斜發沸石被認為是穩定載體。比膨潤土或斜發沸石吸收更多水分或失去更多水分的載體被認為是相對較不穩定的載體。
換句話說，在一段時間內具有較穩定的水分含量的載體可被認為是能充分“緩沖”水分變化的載體。相反，在一段時間內具有較不穩定的水分含量的載體可被認為是不能緩沖水分變化的載體。適當地，根據本發明的載體為能緩沖水分變化的載體。
合適地，載體可為下列載體中的一種或多種沸石載體；粘土載體；其它土質硅化合物。
沸石為具有明確結構的微孔結晶固體。通常它們在它們的框架內包含硅、鋁和氧，在它們的孔內包含陽離子、水和/或其它分子(如氨、碳酸鹽離子和硝酸鹽離子)。許多作為礦物天然存在。其它一些為合成的和商業制備的。在本發明中，可使用天然沸石和/或合成沸石。
沸石的定義特征在于它們具有連接的(Si，Al)O4四面體的三維框架結構，(Si，Al)和O以1∶2的比例存在。沸石由于這種三維結構而不同于粘土礦物，其中氧原子在化學上用陽離子平衡。
合適地，沸石載體可為下列沸石中的一種或多種方沸石(analcite)，鈣霞石(cancrinite)，菱沸石(chabazite)，斜發沸石(clinoptilolite)，堇青石(cordierite)，鋇沸石(edingtonite)，毛沸石(erionite)，八面沸石(faujasite)，鎂堿沸石(ferrierite)，鈉菱沸石(gmelinite)，片沸石(heulandite)，濁沸石(laumontite)，插晶菱沸石(levynite)，中沸石(mesolite)，絲光沸石(mordenite)，鈉沸石(natrolite)，鉀沸石(offretite)，方堿沸石(paulingite)，鈣十字沸石(phillipsite)，發光沸石(ptilolite)，鈣沸石(scolecite)，桿沸石(thomsonite)，ZSM和ZK。
在一些方面中，優選沸石載體為斜發沸石。適當地，本文中使用的斜發沸石可為斜發沸石-K、斜發沸石-Ca或斜發沸石-Na。優選地，本文中使用的斜發沸石為斜發沸石-Na。合適地，本文中使用的斜發沸石可具有4.7-5.4％的天然水含量，優選約5％。在一個實施方案中，優選斜發沸石為可從丹麥NorNatur得到的產品名為KlinominTM的斜發沸石-Na。合適地，按照本發明使用的斜發沸石由大于80％的斜發沸石組成。合適地，載體可具有6.9-7.1的pH值和/或260-290m2/g的表面積。
粘土為最初從至少部分因為膠質顆粒的尺寸和分布而具有物理性質的土中得到的天然存在的水合鋁硅酸鹽，并且性質包括塑性。通常，粘土中30％或更多顆粒的直徑在0.002mn以下。
合適地，粘土載體可為下列粘土中的一種或多種凹凸棒石(attapulgite)，膨潤土(bentonite)，漂白土(fuller’s earth)，埃洛石(halloysite)，伊利石(illite)，高嶺土(kaolin)，葉蠟石(pyrophyllite)，蛭石(vermiculite)，海泡石(sepiolite)，蒙脫石(montmorillonite)和莫來石(mulite)。
在一種實施方案中，優選載體可為膨潤土。膨潤土表示具有良好膨脹能力和可變蒙脫石含量的粘土。優選地，膨潤土的主要組分為蒙脫石，優選Na-蒙脫石。按照本發明使用的一種合適的膨潤土包含約50％蒙脫石、10％高嶺石、10％伊利石和20％蛭石。這種膨潤土可從丹麥Tierra Products ApS作為OB-lergranulate得到。為了避免疑慮，這在下面的實驗部分中稱為膨潤土。
在另一實施方案中，優選載體為蛭石。
本領域的普通技術人員將理解的是，天然粘土或沸石材料不必是純的。因此，在一些實施方案中，當通過名稱提到粘土或沸石，如斜發沸石時，它指主要由這種粘土或沸石組成的載體(即主要由例如斜發沸石組成)。優選地，粘土或沸石包括超過50％的指定粘土或沸石(例如斜發沸石)，優選超過60％，更優選超過70％，更優選超過80％指定的粘土或沸石。合適地，粘土或沸石可包括超過90％的指定粘土或沸石或者甚至100％的指定粘土或沸石。
一些土質硅化合物不被歸類為粘土或沸石。這種土質硅化合物包括例如以下中的一種或多種石棉，硬水鋁石，硅藻土，硅藻土，長石，硅藻土，硅藻土，云母，石英，砂和二氧化硅。
在一個方面，載體可適當地為一種或多種粘土載體與一種或多種沸石載體的組合。
不希望受理論約束，能預見到某些種類的微生物可具有優選的載體，即可在某些載體中存活得更好。一旦本領域的普通技術人員受到本發明教導，則在他們的常規技能內就能很好地確定任何給定微生物的優選載體。實現它的一種方法是進行以下試驗1.通過在105℃下培育載體4小時測定載體的天然水含量。
2.按1∶5比例混合液體微生物培養物和不同的載體。
3.培育1-2天以使細菌生長。
4.將MicxCarriers干燥至(1)中測定的天然水含量的1.5x、1x、0.75x(或更多點)，然后研磨成細粉末。
5.在室溫下培育＞7天。
6.通過平板培養計數CFU。優選的載體為在給定范圍內載有大量微生物的載體。
7.任選地-一旦確定一組優選的載體，就可確定WC和Aw之間的關系。優選的載體為在一段時間內在給定儲存條件下Aw不會改變(或只稍微變化，即變化可被攜載的微生物忍受)的載體。
特別地，優選的粘土/沸石載體為天然水含量類似于干燥后培養物∶載體混合物中的最終水分含量的那些載體，對于種子應用目的，通常在3％-7.5％(w/w)范圍內，和/或為在一段時間內具有相對穩定水分含量的那些載體。
在又一實施方案中，微生物在載體中的分布優選是均勻的。微生物在載體中的分布均勻性可通過將載體噴涂(spray coating)到表面上并測定每面積單位的微生物數目來確定。
優選地，將培養的微生物和載體混合使得培養物對載體的比例在約1∶2至約1∶6(w/w)之間，優選約1∶3至約1∶5(w/w)，更優選小于1∶4(w/w)，例如1∶4.1、1∶4.2、1∶4.5、1∶4.75或約1∶5。
在一種實施方案中，優選將培養的微生物和載體混合使得培養物對載體的比例小于1.5(w/w)。
不希望受理論約束，已經令人驚訝地發現，微生物培養物對載體的比例越低，存活的可培養細胞數(干載體中的菌落形成單位(CFU))就越多。發現優選將培養的微生物和載體混合使得培養物對載體的比例小于1∶4(w/w)，合適地小于例如1∶4.1、1∶4.2、1∶4.5、1∶4.75或1∶5。
為了制備標準載體配方，可適當地采取以下方法步驟以小于1.4(w/w)、適當地小于例如1∶4.1、1∶4.2、1∶4.5、1∶4.75或1∶5的微生物細胞∶載體比例將微生物細胞和載體混合；在10℃下放置混合物7天，然后可在3-4天的時間內在32.5-35％濕度的控制氣氛中將混合物干燥至5％水含量或更少。
合適地，在與載體即將混合前，微生物培養物中微生物(例如細菌)的濃度為大約107-109個微生物/ml培養基，優選大約108個微生物/ml培養基。
合適地，如果載體為干的(即具有0％水含量)，例如在烘箱殺菌后，可在將培養的微生物和載體混合前加入少量等分試樣的水和/或培養基。合適地，直到載體中的水分含量為被視為該載體的天然含量時才加入水和/或培養基。水和/或培養基的加入防止由于混合過程中產生的熱造成的細胞破壞。如果認為需要，可通過真空除去載體中積存的空氣。
優選地，在混合培養物∶載體混合物后，培育混合物約6小時以上，優選約8小時以上，優選12小時以上，優選約18小時以上，優選0.5-14天。更優選將培養物∶載體混合物培育約12小時以上。合適地，將培養物∶載體混合物培育約12小時至約14天。
合適地，在混合后，可在5℃-30℃下、優選10℃-15℃下將培養物∶載體混合物培育約0至約14天，優選0.5-約14天。在培育過程中，允許微生物生長并增殖。優選地，如果培育培養物∶載體混合物超過1天，則在該培育期間不發生除濕。
合適地，可在過程中的任何時刻進行脈沖電磁場(PEMF)-處理。例如，可在以下階段中的一個或多個中進行PEMF處理在微生物的培養過程中；在將培養的微生物和載體混合的過程中；在將培養的微生物和載體混合后；在培養物∶載體混合物(任選的)培育過程中；在培養物∶載體混合物的干燥過程中；在干燥的培養物∶載體混合物的儲存過程中；在施加到種子或種子成分上后；在將培養物∶載體混合物干燥后的任何時刻；在將干燥的培養物∶載體混合物再水化(re-hydration)后的任意時刻。
在一種實施方案中，優選在微生物的培養過程中進行PEMF處理。
在另一種實施方案中，合適地，可在微生物的培養過程中進行PEMF處理，并任選地在培養物∶載體混合物的培育過程中再次進行。
合適地，可有一次以上的PEMF處理。在一種實施方案中，可有二次以上的PEMF處理。
在一種實施方案中，可在連續發酵罐中培養微生物，并在全部或部分培養物被進一步處理前將微生物在發酵罐的一個區域中暴露于PEMF處理，任選地，部分培養物被再循環回到發酵罐中。通常，當從發酵罐通過管道(如管，合適地為盤管(wound tube))時，微生物可被暴露于PEMF。
合適地，每次PEMF處理可從約0.5h至約48h，優選在約4h至約24h，優選在約8h至約16h。
在一個方面中，優選恰好在將細菌培養物與載體混合前用PEMF處理細菌培養物1-16小時。
但是，可以預見，每次PEMF處理可包括大量PEMF處理，每次處理持續幾分鐘(即1-20分鐘，優選1-10分鐘，更優選1-5分鐘)。合適地，可將微生物暴露于一次以上處理，優選二次以上，優選三次以上，優選四次以上，優選五次以上，優選六次以上，優選七次以上，優選八次以上，優選九次以上，或優選10次以上處理。
如本領域的技術人員所理解的，在本發明的方法中可使用產生脈沖電磁場(PEMF)的任何裝置。
US 6,561,968中教導了一種這樣的裝置(該參考文獻并入本文作為參考)。US 6,5619,68中的裝置包括多個各自具有中心軸的導電線圈，每個中心軸定向于微生物；和操作上連接到每個線圈用于供應在每個線圈內傳導的一系列電流脈沖的脈沖產生器，系列脈沖適合從感應電場的每個線圈中產生周期性變化磁場。在US 6,561,968的裝置中，存在大量成對線圈，每對線圈包括第一線圈和相鄰的第二線圈。對于脈沖產生器提供的給定脈沖，第一線圈中心處的磁場定向于微生物上，第二線圈中心處的磁場定向遠離微生物。
線圈的中心軸為沿管狀線圈的中心軸對稱軸垂直定向或垂直(位于中心)于扁繞線圈(flat coil)的平面。
由于PEMF裝置可產生熱，因此可預見裝置可另外包括冷卻裝置。
脈沖型電磁場(PEMF)為最常用的電磁治療類型，尤其用于骨愈合、關節炎治療和運動以及重復性應激損傷。許多不同的商業型PEMF裝置已被報道用于保健。僅僅作為例子，一種這種PEMF裝置為Curatron 2000-系列；Wavetek；Bi Osteogen裝置。技術人員將容易地知道其它PEMF裝置。可以預知，根據本發明，可使用這些裝置中的任何一個。
優選地，將微生物干燥到接近載體天然水分含量的水分含量，一般其在約3至約6％(w/w)之間。
優選地，干燥微生物培養物∶載體混合物。合適地，將微生物培養物∶載體混合物干燥到接近載體天然水分含量的水分含量，其在約1wt％至約7wt％之間，優選約3wt％至約6wt％之間。
不希望受理論約束，已經令人驚訝地發現，具有少于6wt％水的載體中細胞的PEMF處理能大大增加微生物(尤其是細菌)的保存期限，少于6wt％水即其中Aw(水分活性)小于約0.7，合適地小于約0.5。發現可提高保存期限例如到1年以上。
水分活性(Aw)表示混合物中水對細菌的相對可用性。1或接近1的水分活性表示細菌不處于休眠狀態，而處于活的狀態；而小于0.9、優選小于約0.7的水分活性意味著微生物將處于休眠狀態。同樣，約0.4-0.6的水分活性意味著細菌將處于休眠狀態。優選地。根據本發明，干的培養物∶載體混合物的水分活性小于0.9，優選小于約0.7，優選約0.4-0.7，優選約0.6。
在本發明中，第一次顯示PEMF處理可用于延長干的休眠微生物的保存期限。
優選地，空氣干燥微生物和/或微生物培養物∶載體混合物。合適地，可使用強制通風干燥。例如，可將培養物∶載體混合物放置在出口柵格上方的空氣層流試驗臺上。在這種情況下，干燥可在小于1天內發生，優選在約16小時內。或者，可使用在盤中或類似容器中的簡單室內空氣干燥。優選在約10℃-30℃、一般約20℃-24℃的溫度下和小于75％、優選約30-60％、更優選約32.5-35％的相對濕度下進行室內空氣干燥。對于室內空氣干燥，干燥可能需要1至5天，優選1至4天，合適地為3-4天。合適地，在室內空氣干燥過程中，在氣氛中有Ca2+離子對微生物存活可為有利的。作為又一種替代方案，可通過將培養物∶載體混合物放在袋中進行干燥，所述的袋例如Milli-WrapRTM袋，該袋允許水分蒸發。
將水分水平逐漸降低到約1％至約6％(w/w)之間。
可在非無菌條件下進行干燥步驟。
根據本發明的方法可包括研磨微生物培養物∶載體混合物的組合物和/或用該組合物包覆種子或其它繁殖材料的更多步驟。
例如，可使用空氣分級磨(classifier mill)將干燥的產物磨碎到約0.1-約150微米的最終粒度。
在一種實施方案中，合適地，可在約10-15℃和約18-33％(濕重)的水分含量下培育培養物∶載體混合物，然后在飽和氯化鈣上在20℃下干燥3-4天，提供大約32.5％的相對水分，或然后在少于24小時內快速干燥。可將培養物∶載體混合物的水分含量減少到約4-約7％。
在一種實施方案中，載體的pH或微生物培養物∶載體混合物的pH為約6-約9，優選約7-約9，更優選約8-約9，更優選約8.2-約8.8，更優選約8.6。
在一種實施方案中，優選向載體中加入盡可能少的液體。通常在一些情況下，過多的培養基可能意味著干載體中細菌存活率的降低。
優點和令人驚訝的發現發現根據本發明的方法處理的微生物能明顯更好地在干燥后存活，即比如果僅使用載體和/或如果單獨進行PEMF處理具有更好的初始存活率。但是，特別發現，載體與PEMF處理的組合能使微生物在干燥階段存活明顯更長的時間且存活得更好，即增加了干微生物的保存期限。令人驚訝和意想不到地，與任何一種單獨處理相比，這些處理尤其對干微生物保存期限的組合效果是協同性的。
本文使用的術語“初始存活率”是指微生物在干燥例如0-約14天、合適地為1-約5天、合適地為2天后立即試驗時承受實際干燥過程的能力，在干燥后且不管干燥的微生物或干燥的培養物∶載體混合物是否被包覆到例如種子或其它繁殖材料上。
本文使用的術語干燥微生物的“保存期限”是指微生物在長時間儲存后一旦再水化時生長和/或增殖的能力，即微生物在干燥狀態下長時間(例如至少24小時，至少48小時，至少6個月，或至少12個月)儲存后存活、被再水化重新激活和成為活的可培養細胞的能力。
為了再進一步提高初始存活率和/或保存期限，可向培養物中加入滲透保護劑(osmoprotectant)或細胞穩定劑(cell stabiliser)。例如，向培養物中加入10-100mM蔗糖可使存活微生物如假單胞菌屬菌種的數目增加大約10倍。其它已知的保護劑和細胞穩定劑包括氨基酸和它們的衍生物、膽堿、ectoine、二價陽離子、碳水化合物、甘油、樹膠、抗氧化劑、非脂肪乳固體、結晶纖維素、羧甲基纖維素(CMC)和CMC衍生物。
根據本發明，使用本發明的方法干燥并被包覆到粒狀(pelleted)甜菜種子上的根移植的對抗性(root colonising antagonistic)假單胞菌可在種子上以足夠高的數量存活1.5年以上，并仍恢復它們對病原體的生物對抗性和它們的根移植特性。
用途可將包括通過本發明的方法制備的干微生物的組合物用于將以下中的一種或多種施用到種子或其它植物繁殖材料上生物控制劑；生長刺激劑；殺真菌劑；殺蟲劑。
可將包括通過本發明的方法制備的干微生物的組合物直接施加到溫室和土壤中的生長培養基中。
另外，可將包括通過本發明的方法制備的干微生物的組合物用于污水清潔和/或化學/生物溢出物(spills)如農場溢出物的清除。或者，當組合物包括有生物補救能力的微生物時，可將組合物用于清潔污染的固體，例如PCB污染的固體。有生物補救能力的微生物是眾所周知的，并可為能降解有毒化合物的任何微生物，包括但不限于基因修飾的微生物。
或者，可將包括通過本發明的方法制備的干微生物的組合物用于將微生物施加到食品和/或動物飼料上。用于食品工業的合適微生物是眾所周知的，并可為例如乳酸菌。
另外，可將包括通過本發明的方法制備的干微生物的組合物用于醫療應用，例如用于乳酸菌的供應。
協同效應在包括干微生物的組合物的制備中，使將微生物培養物和載體混合與用脈沖電磁場(PEMF)處理的組合產生對初始存活率和/或微生物保存期限的協同效應。
可通過觀察下列處理后活的可培養微生物細胞的數目來確定協同作用a)將微生物培養物和載體混合；b)用PEMF處理；或c)a)和(b)的組合。當組合(c)比單獨處理(a)或(b)的任何一個產生更好的效果(即當評價初始存活率和/或當評價微生物的保存期限時更多的活的可培養細胞)時顯示了協同作用。優選地，當評價初始存活率和/或當評價微生物的保存期限時，與通過處理(a)產生的活的可培養微生物細胞數加上通過處理(b)產生的活的可培養微生物細胞數相比，組合處理(c)產生更多的活的可培養微生物細胞。
食品本文使用的術語“食品”具有寬泛意義--并覆蓋了人的食品以及動物的食品(即飼料)。在優選的方面中，食品用于人食用。
食品可為溶液或固體形式—這取決于用途和/或應用模式和/或施用模式。
食品成分本發明的組合物可用作食品成分。
本文使用的術語“食品成分”包括加入或可加入到功能食品或食品中的配方，并包括可在要求例如酸化或乳化的各種產品中以低水平使用的配方。
食品成分可為溶液或固體形式--取決于用途和/或應用模式和/或施用模式。
食品補充劑本發明的組合物可為--或可被加入到--食品補充劑。
功能食品本發明的組合物可為--或可被加入到--功能食品。
本文使用的術語“功能食品”是指不僅能提供營養效果和/或味覺滿足，而且能為消費者帶來更多有益效果的食品。
盡管沒有功能食品的法定定義，但關注該領域的大多數團體都認為它們是作為具有特定保健作用而銷售的食品。
食品產品本發明的組合物可用于制備食品產品，如以下中的一種或多種糖果產品，乳制品，肉制品，家禽制品，魚制品，和面包制品。
例如，本發明的組合物可用作以下的成分軟飲料、果汁或包括乳清蛋白的飲料、保健茶、可可飲料、牛奶飲料和乳酸菌飲料、酸乳(yoghurt)、飲用酸乳和酒。
本發明還提供制備食品或食品成分的方法，該方法包括將通過本發明的方法產生的組合物或根據本發明的組合物與另外的食品成分混合。制備食品成分的方法也是本發明的另一方面。
藥物通過本發明的方法產生的組合物和/或根據本發明的組合物也可用作-或-用于制備-藥物。本文中，在廣泛的意義上使用術語“藥物”，并包括人的藥物以及動物的藥物(即獸醫應用)。在優選的方面中，藥物用于人應用和/或畜牧業(animal husbandry)。
藥物可用于治療目的--在性質上其可為治療性的或姑息性的(palliative)或預防性的。藥物甚至可用于診斷目的。
當用作--或用于制備--藥物時，可將本發明的組合物與以下中的一種或多種一起使用可藥用的載體，可藥用的稀釋劑，可藥用的賦形劑，可藥用的佐劑，藥物活性成分。
藥物可為溶液或固體形式--取決于用途和/或應用模式和/或施用模式。
藥物成分通過本發明的方法產生的組合物和/或本發明的組合物可用作藥物成分。本文中，本發明的產品和/或組合物可為單一活性組分或它可為多種(即2種或以上)活性組分中的至少一種。
藥物成分可為溶液或固體形式--取決于用途和/或應用模式和/或施用模式。
藥物成分可為泡騰劑(effervescent)產品形式以改善藥物的溶解性能。
化學工業通過本發明的方法產生的組合物和/或本發明的組合物也可用作生物補救劑，即消耗和分解環境污染物。
形式(Forms)通過本發明的方法產生的組合物和/或本發明的組合物可以以任何合適的形式使用。
形式的合適例子包括以下中的一種或多種片劑，丸劑，膠囊，胚珠(ovules)，溶液或懸浮液，它們可包含調味劑或著色劑，用于即時釋放、延時釋放、改進釋放、持續釋放、脈沖釋放或控制釋放應用。
例如，如果產品和/或組合物以片劑形式使用--如用作食品成分--片劑還可包含以下中的一種或多種賦形劑，崩解劑(disintegrant)，造粒粘合劑(granulation binder)或潤滑劑。
用于制備形式的營養學可接受載體的例子包括例如水、鹽溶液、醇、硅酮(silicone)、蠟、凡士林(petroleum jelly)等。
用于形式的優選賦形劑包括乳糖、淀粉、纖維素、奶糖或高分子量聚乙二醇。
對于含水懸浮液和/或酏劑(elixirs)，通過本發明的方法產生的組合物和/或本發明的組合物可結合各種甜味劑或調味劑、著色物質或染料、乳化劑和/或懸浮劑、和稀釋劑如水、乙醇、丙二醇和甘油，及其組合。
形式還可包括明膠膠囊、纖維膠囊、纖維片劑等。
實施例現在將僅通過實施例描述本發明，其中參考以下圖

圖1顯示了在4天內緩慢干燥前用PEMF(55V)處理0、8、16或48小時并與沸石載體混合后，包覆到粒狀甜菜種子上的干燥的熒光假單胞菌(處理后0-544天)的初始存活率和保存期限；圖2顯示了快速干燥前用PEMF(55V)處理0、8、16或48小時并與沸石載體混合后，包覆到粒狀甜菜種子上的干燥的熒光假單胞菌(處理后0-544天)的初始存活率和保存期限；圖3顯示了與載體水分含量相比的熒光假單胞菌的平均存活百分比。
實施例 1-PEMF處理與載體組合對干微生物的初始存活率和保存期限的影響在液體LB中培養熒光假單胞菌株DS96.578過夜至接近靜止期(stationary phase)，用新鮮LB稀釋10倍，并按1∶2比例混合到斜發沸石載體內(斜發沸石-Na，可從丹麥NorNatur作為KlinominTM得到)。然后通過在層流氣流試驗臺中進行空氣干燥以將混合物干燥至大約22％水分含量，裝袋，并在10℃在大約22％(w/w)水分水平下培育10天。在該階段結束時，將載體在55伏(55V)下暴露于脈動電磁場處理(PEMF處理-2mV/cm，50Hz下)不同的時間(8、16、24和48小時)或不暴露于PEMF處理(0小時)。PEMF裝置為US 6,561,968中教導的裝置。在培育期間，細菌菌落增加到2×108至7.1×108個細菌/克沸石。然后在包覆到粒狀甜菜種子上前將培養物∶沸石混合物干燥到3％-6％(w/w)水分含量。在16小時內通過強制空氣干燥或通過將混合物放置在相對濕度約35％的室中緩慢干燥4天完成將培養物∶沸石混合物干燥到3％-6％(w/w)。
在處理后第2、71和544天(基于菌落形成單位(CFU)/種子)評價甜菜種子上細菌的存活(包括初始存活率和保存期限)。
結果提供在下面的表中和圖示在圖1(慢干燥)和圖2(快干燥)中。
從圖可看出，PEMF處理(2mV/cm，50Hz下，55V)與載體組合增加了干燥種子包覆細菌在一段時間內的初始存活率和保存期限。與用PEMF處理的載體包覆的種子相比，在544天儲存后沒有從以未經PEMF處理的培養物∶載體混合物包覆的種子中分離出菌落形成細菌。
實施例 2-PEMF處理與載體組合對干微生物初始存活率和保存期限的影響在液體LB中培養熒光假單胞菌菌株DS96.578過夜。在液體培養后，用新鮮LB培養基將細菌培養物稀釋10倍，并按50ml細菌培養物對100g斜發沸石(1∶2)比例與滅菌的斜發沸石混合。在輕輕混合后，將1∶2培養物∶斜發沸石混合物緩慢空氣干燥到123g。然后在10℃下培育細菌培養物∶斜發沸石混合物10天。在培育期結束時，將培養物∶斜發沸石混合物分成兩等份，其中一份暴露于50V PEMF處理(2mV/cm，50Hz下，55V)16小時，而另一份按相同方式處理，除了不暴露于PEMF。在這種處理后，通過將混合物放置在盤中在35％濕度的氣氛中保持4天將細菌培養物∶斜發沸石混合物干燥至4-6％水分含量(w/w)。在10℃培育干燥的載體。通過將1g混合物溶解在10ml 0.9％NaCl中并在固體LB平板上涂布(plating)100微升這種溶液來測定能在固體LB-培養基上形成菌落的細菌數目。
0、73、121、182和408天后載體中菌落形成細菌的數目提供在下面的表中。
從表可看出，細菌在干燥的載體中能很好地存活許多個月。約半年后，未用PEMF(2mV/cm，50Hz下，55V)處理的載體中細菌數目開始減少，而菌落形成細菌的數目停留在大致同樣高的水平一年以上。顯然，對混入到載體內的細菌進行PEMF處理然后將混合物干燥到水分活性低于允許細菌活性生長的水平的水平，導致再水化后能形成菌落的細菌的可儲存性增強。
實施例3兩種載體的比較斜發沸石和海泡石在液體Luria-Bertoni(LB)培養基中培養熒光假單胞菌菌株DS96.788(Rif抗性)過夜，用新鮮的LB-培養基稀釋10倍，按大約1∶1(w/w)培養物∶載體混合物將稀釋的培養物混入到以下載體(斜發沸石和海泡石)中。然后將載體干燥至大約25％水分含量(w/w)并在10℃培育10天。然后，將載體干燥至10％和25％之間不同的水分水平，并在10℃再培育23天。在固化瓊脂上平板培養測定CFU/g載體
從上面的實施例可看出，每克載體的菌落形成細菌的數目在載體中不同的水分含量下相對穩定，為大約108個細菌/g斜發沸石，而在具有較低水分含量的載體中，海泡石載體中菌落形成細菌的數目則減少。
實施例4不同載體中的細菌存活率在三種不同的載體蛭石、膨潤土和斜發沸石中以菌落形成單位研究細菌存活率。膨潤土和蛭石都是粘土的代表。斜發沸石(斜發沸石-Na)為沸石。在用50mM蔗糖補充的LB中過夜培養熒光假單胞菌菌株DS96.578的兩份培養物。在培養的最后8小時，將培養物中的一份暴露于50V PEMF處理(2mV/cm，50Hz下，55V)。在培養結束時，用新鮮培養基將細菌培養物稀釋10倍，并將23ml培養物與100g預先滅菌的載體混合。然后在10℃培育載體6天。在第6天，將帶有未經PEMF處理的細菌的載體分成兩等份，一份用PEMF處理(16小時，50V)，另一份不用。在第7天時，再將所有載體分成兩份，其中一部分在濾袋(filterbag)中空氣干燥過夜，而另一部分載體通過在相對濕度約35％的室中放置4天來緩慢干燥。干燥過程產生水分含量稍微高于它們的天然水分含量的載體。干燥后，將載體包覆到粒狀甜菜種子上每100,000個種子使用60g載體。對于單個步驟，下面的表中給出了通過復制的平板培養測定的菌落形成單位的數目。關于CFU/種子的數據來自用緩慢干燥的載體包覆種子。
細菌培養物在與載體混合時的CFU對于未處理的培養物為7.55×107CFU/ml，對于PEMF處理的培養物為6.65×107CFU/ml。
在沒有載體材料的處理中，在細菌培養物中存在相同的細菌濃度。在這些處理中，將未與載體混合的細菌培養物包覆到種子上，按照處理的剩余物來評價包覆后2天的CFU/種子，并據此計算存活率％。
1.WC1所用載體材料中的天然水含量(WC)2.％surv通過下式計算的菌落形成單位期望數目的百分比(CFU/種子)×100,000個種子/(CFU/g載體×60)。
3.用配備設為0628 0024的Aw值的Testo 650測量的Aw。
4.通過在105℃下干燥4小時測量的％WC。
N/A＝不適用對于所用的全部載體材料，菌落形成單位(CFU)的數目在干燥載體中是高的，與所用的載體材料和干燥過程無關，雖然在大多數情況下，CFU數目在緩慢干燥的載體中更高。對于PEMF處理的細菌，可從包覆種子中重新分離出的菌落形成單位的百分比始終高于未處理的細菌。
如果不使用載體材料，不能從包覆的種子中分離出細菌或分離出數目非常少(1-100)的細菌。
因此，顯然單獨PEMF處理將不會增加包覆到種子上后細菌的存活率。另一方面，將細菌培養物加載到載體中(具有低的天然水保留能力)和PEMF處理(將培養物混合入載體材料之前或之后)的組合提高了可從種子中再分離的細菌的直接存活率(immediate survival)。
下面顯示脫水至水分活性低于細菌活性生長水平的狀態(休眠狀態)后，在PEMF處理的細胞中發現增強的活力(vigour)，這可從施加到種子上之后菌落形成單位更高的存活率看出。
在10℃下儲存緩慢干燥的載體322天，測定每克載體能形成菌落(CFU)的細菌數可在下面的表中看到該結果。
從上面可看出，在平板培養后能形成菌落的細菌的存活率在斜發沸石和膨潤土中是高的，在PEMF處理(2mV/cm，50Hz下，55V)后尤其高。與斜發沸石和膨潤土相比，蛭石中的存活率下降，但與未處理的對照相比，仍通過PEMF處理得到提高。
在15℃下儲存包覆的甜菜種子6個月。按如前所述測定每個種子的細菌數目(CFU/種子)。下面的表中給出了包覆后儲存2天、28天和182天的結果。
1.％surv通過下式計算的菌落形成單位期望數目的百分比(CFU/種子)×100,000個種子/(CFU/g載體×60g)。
從上圖可看出，相對于未經PEMF處理的對照，在與載體混合前的細菌培養過程中用PEMF處理(2mV/cm，50Hz下，55V)或在混入到載體后用PEMF處理(2mV/cm，50Hz下，55V)的細菌的存活率在一段時間內增加。對于斜發沸石中的細菌，所述的增加在包覆后第182天時超過10倍，在蛭石和膨潤土中增加為2-5倍。
實施例5細菌培養物∶載體的初始比例的影響細菌通常對酸性刺激非常敏感。將細菌暴露于低pH一段給定的時間然后平板計數給出細菌培養物刺激耐受性的量度(measure)。進行試驗以研究刺激耐受性作為細菌培養物與載體材料混合的初始比例的函數。
在20℃下在LB和補充有100mM蔗糖的LB中過夜培養熒光假單胞菌菌株96.578的液體培養物。按細菌培養物對干載體的不同比例(從大約1∶5到大約1∶2)將培養物混合入滅菌的斜發沸石載體內。在混合培養物∶載體混合物超過20.4％后，通過在層流氣流試驗臺中用空氣將細菌懸浮液干燥到20.4％。包含20.4％細菌培養物的載體不再進一步干燥。此后，將載體裝袋并在10℃培育7天。然后通過在盤中在32.5％相對水分水平下培育載體4天將載體干燥到大約5％水分。在干燥到5％水分水平后，將載體儲存在密封的塑料袋中14天，然后通過將1克載體與10ml水或與10ml的pH為4.5的100mM檸檬酸緩沖液混合來測定每克載體的菌落形成單位。在這些介質中30分鐘后，將細菌涂布到LB-板上并計數菌落形成單位。計算暴露于酸性刺激后菌落形成細菌相對于暴露于純水的相同培養物的比例。
在LB培養基或補充有100mM蔗糖的LB中培養的細菌DS96.578干燥至5％后14天時干燥載體中的CFU/g載體
從上面表可看出，載體中可培養細菌的絕對數以及能承受暴露于低pH30分鐘的細菌比例隨細菌懸浮液對斜發沸石載體混合時比例的降低而增加。微生物對暴露到低pH的耐受性增加表明，細菌培養物對載體的比低于大約1∶4的比例時，混合物中的細菌群落處于承受刺激的較好條件，如在低水分水平下的長期儲存，或物理刺激，如載體的處理，即把載體施加到種子上。
實施例6細菌培養物和載體初始混合時混合比例的重要性在液體LB中培養7個假單胞菌菌株和1個黃桿菌菌株(DS00.135)過夜。在液體培養后，用新鮮LB-培養基將細菌稀釋10倍，并按50ml細菌培養物對100g斜發沸石(1∶2)或23ml細菌培養物對100g斜發沸石(1∶4)的比例與滅菌的斜發沸石混合。在輕輕混合后，將1∶2培養物∶斜發沸石混合物緩慢地空氣干燥到123g，而1∶4培養物∶斜發沸石混合物未被干燥。因此，在這個階段，所有的載體都保持有相同量的水分。然后在10℃培育細菌培養物∶斜發沸石混合物10天。沒有進行PEMF處理。在培育10天后，通過將混合物放在盤中在35％濕度的氣氛中保持4天將細菌培養物∶斜發沸石混合物干燥到4-6％水分含量(w/w)。干燥后，將干燥的培養物∶斜發沸石混合物包覆到粒狀甜菜種子上，并通過在將培養溶解的甜菜粒的平板復制到固體LB-培養基上后計數菌落來確定每個種子的可培養細菌數(CFU/種子)。結果顯示在下面的表中。其清楚地表明了當與載體混合時不使用過多細菌培養物的重要性。
實施例7細菌培養物和載體初始混合時非常低的混合比下面給出的實施例說明，細菌培養物與載體初始混合時非常低的混合比將導致用干燥的細菌培養物∶載體混合物包覆種子后大量細菌的均勻分布。
在補充有50mM蔗糖的液體LB培養基中培養假單胞菌菌株DS00.103過夜。在培養的最后8小時，將培養物暴露于PEMF(2mV/cm，50Hz下，55V)。在液體培養物中的PEMF處理后，用新鮮LB培養基將細菌培養物稀釋10倍至1.15×108CFU/ml。將7ml、8ml、9ml或10ml稀釋的細菌培養物混入到50g膨潤土載體中(這分別相當于培養物∶載體比為1∶7.1、1∶6.25、1∶5.5和1∶5)，裝袋并在10℃下培育7天。在培育期間，細菌群落增長到5×108至1.3×109個細菌/克細菌載體。培育后，通過將混合物放置在35％相對濕度的室中3天將培養物∶載體混合物干燥至約5％水分含量。將這樣干燥的細菌培養物∶載體混合物磨碎成細粉，并將8ml/50g和10ml/50g混合物包覆到甜菜種子粒上(60g混合物/100,000個種子粒)。通過在0.9％NaCl-溶液中溶解25個種子粒30分鐘然后將100微升此溶液涂布在固體LB-培養基平板上來測定每個種子的菌落形成單位的平均數。為了測定每個單個種子的菌落形成單位的數目，將來自每次處理的單個種子粒溶解在0.9％NaCl-溶液中并在固體LB-培養基上平板培養。
對于每次初始混合變量，下面的表中給出了每克載體的菌落形成細菌數、干載體中的水分含量和每個種子的菌落形成細菌的平均數。
在下面的表中以增加順序給出了在20個隨機選擇的單個粒中每個種子粒的菌落形成細菌數。
從上面兩個表清楚看出，即使在細菌培養物對載體的比例低于1∶5時，每克載體的細菌數也是高的。還清楚的是將來自具有這些低細菌培養物∶載體混合物的載體的細菌施加于種子時的精確度足夠好以實際用于將細菌包覆到種子上。這個試驗中單個種子上的均勻分布強有力地表明，在初始培養物∶載體混合比例為1∶5(wt/wt)和低于1∶5(wt/wt)時細菌將被均勻地分布在載體材料中。
實施例8干燥至不同水分含量的斜發沸石載體在補充有10mM海藻糖(trehalose)的液體LB-培養基中培養熒光假單胞菌過夜。在液體培養后，用新鮮LB-培養基將細菌懸浮液稀釋10倍，將52ml培養物混入到天然水分含量為5.5％的100g斜發沸石載體中。然后將混合物空氣干燥至約22％水分含量，裝袋并在10℃培育10天。培育期后，通過將混合物在35％相對濕度中放置不同時間(多至4天)將培養物∶載體混合物干燥至不同的水分含量。通過在將載體樣品加熱到105℃保持4小時后測量失重(weight loss)來測定干燥載體的實際水分含量。重復試驗三次。在固化培養基上平板培養后測定第0天的每克載體的菌落形成細菌數。在10℃在密封塑料袋中儲存載體365天，并測定每克載體菌落形成細菌數。下面的表顯示了關于此的結果
將熒光假單胞菌的平均存活百分率對比載體的水分含量示于圖3。
從結果可看出，細胞在干載體中的儲存產生較少的活(菌落形成單位)細菌的相對損失。細菌在水分含量為7.5％-多至20％的相同載體中的儲存產生顯著的活細胞相對損失。
上面說明書中提到的所有出版物并入本文作為參考。只要不脫離本發明的范圍和精神，本發明所述方法和系統的各種改進和變化對于本領域那些技術人員將是顯而易見的。盡管已結合具體優選的實施方案描述了本發明，但應認識到所要求的發明不應不適當地限制于這些具體實施方案。事實上，對于生物化學和生物技術或相關領域的那些技術人員顯而易見的實施本發明的所述方式的各種改進應包含在下面權利要求的范圍內。
權利要求
1.一種制備包括干微生物的組合物的方法，其包括培養一種或多種微生物；將培養的微生物與一種或多種載體混合；用脈沖電磁場處理微生物；培育培養物∶載體混合物至少約6小時；和干燥微生物以便將水分水平降低到約1wt％至約6wt％。
2.根據權利要求1的方法，其中微生物為真菌、酵母、細菌、藻類或原生動物中的一種或多種。
3.根據權利要求2的方法，其中酵母來自以下屬中的一種或多種假絲酵母屬、隱球酵母屬、Cystofilobasidium、漢森酵母屬、克魯維氏酵母屬、白冬孢酵母屬、梅奇酵母屬、畢赤酵母屬、紅冬孢酵母屬、Rodotorula、糖酵母屬、擲孢酵母屬、Richosporon。
4.根據權利要求2的方法，其中真菌來自以下屬中的一種或多種Acrophialospora、Ampelomyces、短梗霉屬、雙極菌屬、毛殼屬、Cladorrhinum、Clonostachys、盾殼霉屬、附球菌屬、粘帚霉屬、Glomus、鐮孢屬、Laetisaria、小球殼孢屬、Mycothecium、Muscador、Mycoleptodiscus、新赤殼屬、擬青霉屬、青霉屬、隔孢伏革菌屬、Phlebiopsis、瓶霉屬、腐霉屬、絲核菌屬、根霉屬、喙孢屬、葚孢屬、Stephanonectria、籃狀菌屬、Tilletiopsis、木霉屬、單隔孢屬、輪枝孢屬、被毛孢屬、漆斑菌屬、Nematophthora、指隔孢屬、枝頂孢霉屬、鏈枝菌屬、柱孢屬、指隔孢屬、單頂孢屬、Pochonia。
5.根據權利要求2的方法，其中細菌為以下屬中的一種或多種游動放線菌屬、土壤桿菌屬、節桿菌屬、芽胞桿菌屬、雙歧桿菌屬、短芽孢桿菌屬、伯克霍爾氏德菌屬、金色單胞菌屬、叢毛單胞菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬、歐文氏菌屬、黃桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、巴斯德氏芽菌屬、泛菌屬、類芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、拉恩氏菌屬、Raoultella、沙雷氏菌屬、Sporotrix、寡養單胞菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、根瘤菌屬、慢生型根瘤菌屬、Mezorhizobium、Sinorhizobium Seratia、歐文氏菌屬、鏈霉菌屬和諾卡氏菌屬。
6.根據權利要求2的方法，其中細菌為非孢子形成細菌。
7.根據權利要求6的方法，其中非孢子形成細菌選自游動放線菌屬、土壤桿菌屬、節桿菌屬、雙歧桿菌屬、短芽孢桿菌屬、伯克霍爾氏德菌屬、金色單胞菌屬、叢毛單胞菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬、歐文氏菌屬、黃桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、泛菌屬、片球菌屬、假單胞菌屬、拉恩氏菌屬、Raoultella、沙雷氏菌屬、Sporotrix、寡養單胞菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、根瘤菌屬、慢生型根瘤菌屬、Mezorhizobium、SinorhizobiumSeratia、歐文氏菌屬、鏈霉菌屬和諾卡氏菌屬。
8.根據前述權利要求中任意一項的方法，其中載體為以下中的一種或多種沸石載體，粘土載體，土質硅化合物。
9.根據權利要求8的方法，其中沸石載體選自以下中的一種或多種方沸石，鈣霞石，菱沸石，斜發沸石，堇青石，鋇沸石，毛沸石，八面沸石，鎂堿沸石，鈉菱沸石，片沸石，濁沸石，插晶菱沸石，中沸石，絲光沸石，鈉沸石，鉀沸石，方堿沸石，鈣十字沸石，發光沸石，鈣沸石，桿沸石，ZSM和ZK。
10.根據權利要求8或9中任意一項的方法，其中沸石載體為斜發沸石。
11.根據權利要求8的方法，其中粘土載體為下列粘土中的一種或多種凹凸棒石，膨潤土，漂白土，埃洛石，伊利石，高嶺土，葉蠟石，蛭石，海泡石，蒙脫石和莫來石。
12.根據權利要求8的方法，其中土質硅化合物為下列中的一種或多種石棉，硬水鋁石，硅藻土，硅藻土，長石，硅藻土，硅藻土，云母，石英，砂和二氧化硅。
13.根據前述權利要求中任意一項的方法，其中將培養的微生物和載體混合使得培養物對載體的比例小于1.4(w/w)。
14.根據前述權利要求中任意一項的方法，其中將培養的微生物和載體混合使得培養物對載體的比例約為1∶5或小于1∶5。
15.根據前述權利要求中任意一項的方法，其中在下列階段的一個或多個中進行PEMF處理在微生物的培養過程中；在將培養的微生物和載體混合的過程中；在將培養的微生物和載體混合后；在(任選的)培養物∶載體混合物的培育過程中；在培養物∶載體混合物的干燥過程中；在將所述混合物施加到種子或種子成分上之后的任意時刻；在培養物∶載體混合物干燥后的任何時刻；在干燥的培養物∶載體混合物再水化后的任意時刻。
16.根據權利要求15的方法，其中在微生物的培養期間進行PEMF處理。
17.根據權利要求15的方法，其中在微生物的培養期間和再次在培養物∶載體混合物的培育期間進行PEMF處理。
18.根據權利要求15的方法，其中只有一次PEMF處理。
19.根據權利要求15的方法，其中有一次以上PEMF處理。
20.根據權利要求1的方法，其中將培養物∶載體混合物培育0-14天。
21.通過根據權利要求1-20中任意一項的方法制備的包括干微生物的組合物。
22.根據權利要求1-20中任意一項的方法在延長干的休眠微生物的保存期限中的用途。
23.干微生物在制備包覆的植物種子或其它植物繁殖材料中的用途，包括用通過根據權利要求1-20中任意一項的方法制備的包括干微生物的組合物包覆植物種子或其它植物繁殖材料。
24.干微生物在生長培養基制備中的用途，包括將通過根據權利要求1-20中任意一項的方法制備的包括干微生物的組合物和土壤混合。
25.干微生物在廢水處理中的用途，包括將通過根據權利要求1-20中任意一項的方法制備的包括干微生物的組合物與廢水接觸并分離處理的水和組合物。
26.將培養的微生物與一種或多種載體混合和用脈沖電磁場處理微生物的組合在包括干微生物的組合物的制備中的用途，其中所述干微生物具有顯著增加的保存期限。
27.本文中參照實施例一般描述的方法。
28.本文中參照實施例一般描述的組合物。
全文摘要
一種制備包括干微生物的組合物的方法，其包括培養一種或多種微生物；將培養的微生物與一種或多種載體混合；用脈沖電磁場處理微生物；培育培養物載體混合物至少約6小時；和干燥微生物以便將水分水平降低到約1wt％至約6wt％。將培養的微生物與一種或多種載體混合與處理組合物中的微生物的組合顯著提高了初始存活率和/或保存期限。
文檔編號C12N11/14GK1961066SQ200580017665
公開日2007年5月9日 申請日期2005年3月30日 優先權日2004年3月31日
發明者漢斯·C·佩德森, 英奇·韋爾岡 申請人:丹尼斯科公司