專利名稱：犬的冷和薄荷醇敏感受體1的制作方法
技術領域：
本發明涉及熱受體離子通道蛋白。具體地說，本發明涉及新型犬的冷和薄荷醇敏感受體CMR1的分離核酸分子和多肽及其用途。
背景技術：
為闡明涉及神經元組織中熱感和冷感檢測、轉導和傳送的生物機制，已付出了相當大的努力。熱刺激活化位于感覺神經元(例如來源于背根神經節(DRG)和三叉神經節(TG)的感覺神經元)上的特化受體。當這些刺激在傷害范圍(即非常熱或非常冷)內時，其活化稱為疼痛感受器的感覺神經元亞群(疼痛感受神經元)上的某一小類熱受體。在活化時，熱受體(例如離子通道)將有傷害刺激轉導為電信號，該電信號沿著感覺神經元傳播至脊髓，在脊髓中其被轉播至腦，最終產生痛感。因此，這些熱受體代表用于開發各種疼痛病癥治療藥物的高度有前景的靶。
幾種溫度活化型受體參與感受熱。TRPV1(VR1一種辣椒素和熱活化通道)在接近43℃-大部分哺乳動物感受為傷害的溫度時被活化。與TRPV1的氨基酸水平同一性高于40％的其它TRPV通道也已被克隆，并表征為熱傳感器。這些通道在不同熱閾值被活化，由TRPV3的39℃(溫熱)至TRPV2/VRL1的55℃(高閾值傷害熱)之間變動(參見Story等，Cell，2003，112819-829，以及其中的參考文獻)。相反，TRPV4于室溫組成型開啟，在高于約27℃的溫度被活化(Güler等，J.Neurosci.2002)。這些溫度活化受體屬于非選擇性陽離子通道的瞬時受體電位(TRP)家族，其在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)和黑腹果蠅(D.melanogaster)中參與機械調節和滲透調節。TRP通道被分為3個亞家族，稱為TRPC(陽離子或電容性亞家族)、TRPV(香草酸亞家族)和TRPM(促黑素抑制素亞家族)。全部亞家族都具有6個推定的跨膜結構域，在跨膜結構域5和6之間提出具有孔區。TRP通道被認為具有胞質N-和C-端(參見Story等，出處同上，以及其中的參考文獻)。
新近，已發現屬于TRP蛋白家族并調節對冷刺激反應的蛋白。大鼠CMR1蛋白(代表“冷和薄荷醇敏感受體”；McKemy，D.D.等，Nature，41652-58，2002)和小鼠TRPM8蛋白(代表“瞬時受體電位通道，促黑素抑制素亞家族，8型”；Peier，A.M.等，Cell 108705-715，2002)似乎起興奮性離子通道的作用，此興奮性離子通道在接觸相對低溫時被活化。TRPM8活化的域值約為23℃。大鼠CMR1和小鼠TRPM8還對激起冷感的化合物敏感，例如薄荷醇和Icilin。令人感興趣的是，大鼠CMR1和小鼠TRPM8在其全長氨基酸序列中共有90％以上的序列同一性。
有需要鑒別其它的熱受體，因為其是治療疼痛的潛在靶。還有需要鑒別不同物種中的熱受體，因為其可用作研究測試化合物作用的模型系統。具體地說，需要可用于測試化合物的系統，該化合物潛在地增加或降低熱受體對冷刺激的反應活性。這種化合物的鑒別和測試應能治療各種與慢性疼痛相關的疾病或用于其中需要組織冷卻的其它病癥。
發明概述現在已經發現，本文稱為犬CMR1(cCMR1)的犬蛋白調節對冷刺激的反應，屬于TRP蛋白家族。
在一個一般方面，本發明提供分離的核酸分子，其包含的核苷酸序列編碼的多肽能夠檢測和轉導冷刺激，與SEQ ID NO2具有至少96％的序列同一性。在一個實施方案中，本發明提供分離的核酸分子，其包含的核苷酸序列編碼的cCMR1蛋白具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。本發明還提供含本發明核酸分子的表達載體或重組宿主細胞。本發明進一步提供在嚴格雜交條件下與本發明的核酸分子選擇性雜交的核酸探針，以及含這種探針的試劑盒。
在另一個一般方面，本發明提供基本純化的多肽，其能夠檢測和轉導冷刺激，并與SEQ ID NO2具有至少96％的序列同一性。在一個實施方案中，本發明提供基本純化的多肽，其包含的cCMR1蛋白具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。本發明還提供表達本發明多肽的方法，其包括以下步驟a)將能夠編碼本發明多肽的表達載體導入細胞中；和b)在允許表達載體表達該多肽的條件下培養細胞。本發明進一步提供選擇性結合本發明多肽的抗體和包含這種抗體的試劑盒。
本發明提供檢測本發明的核酸分子或多肽的方法，其包括以下步驟使核酸分子或多肽與能夠特異性結合該核酸分子或多肽的物質接觸。
本發明提供增加或降低cCMR1蛋白表達的化合物的鑒別方法，其包括以下步驟(a)使測試化合物與含cCMR基因表達調節機制的細胞接觸；和(b)測定測試化合物是否增加或降低細胞的所述機制控制的基因表達。
本發明還提供增加或降低cCMR1離子通道電導率的化合物的鑒別方法，其包括以下步驟(a)使測試化合物與離子通道接觸；和(b)測定測試化合物是否增加或降低離子通道的電導率。
本發明的其它方面包括增加或降低哺乳動物CMR1離子通道電導率的化合物的鑒別方法，其包括以下步驟(a)在含亞失活量鈣的緩沖溶液中溫育離子通道；(b)活化離子通道；(c)使離子通道與測試化合物接觸；(d)增加緩沖溶液中的鈣量；和(e)測定胞內鈣量，并將該量與其中離子通道未接觸測試化合物的對照的胞內鈣量對比。
另外，本發明提供用于治療疼痛的化合物的鑒別方法，其包括以下步驟(a)使測試化合物與cCMR1離子通道接觸；和(b)測定測試化合物是否增加或降低離子通道的電導率。在某些實施方案中，該方法進一步包括以下步驟(a)給予動物測試化合物；和(b)測定測試化合物改變動物的傷害感受/傷害防御反應的程度。
由以下的公開內容，包括本發明的詳述及其優選實施方案和所附權利要求書，本發明的其它方面、特征和優勢是顯而易見的。
附圖簡述
圖1圖示了用犬CMR1表達載體穩定轉染的重組細胞的細胞型鈣內流實驗的結果。在10μM Icilin(實心圓)或100μM(-)-薄荷醇(空心圓)作用下，細胞顯示鈣介導的熒光增加。于200秒的時間點向細胞加入化合物。當將單獨的緩沖液加入細胞中時(空心三角)，未觀測到鈣內流。
圖2圖示了使用基本無鈣的荷載緩沖液的細胞型鈣內流實驗的結果。用大鼠CMR1表達載體穩定轉染的重組細胞(實心圓)在加入4mM Ca2+時顯示出鈣介導的熒光增加。未轉化細胞(空心圓)在加入4mM Ca2+時Ca2+內流較少。在10秒的時間點向細胞中加入C2+。
圖3圖示了用刺激性化合物芥子油活化cCMR1。當力加入1mM芥子油(劃線)或作為陽性對照的100nM Icilin(實線)時，用cCMR1穩定轉染的重組細胞顯示出鈣介導的熒光增加。單獨的緩沖液用作陰性對照(點線)。
圖4表明，cCMR1強外向整流，對陽離子是非選擇性的。實線代表在100μM薄荷醇存在下進行的cCMR1全細胞膜片鉗記錄，而虛線代表緩沖液對照。
圖5圖示了cCMR1的溫度敏感性。通過細胞的電流隨著cCMR1表達細胞灌注溶液溫度的降低而顯著增加，這表明活化域值約為17℃。
圖6表明胞外Ca2+脫敏cCMR1通道。最低的軌跡代表在100μM薄荷醇存在下及沒有胞外Ca2+時的cCMR1全細胞膜片鉗記錄，而最上部對無Ca2+軌跡歸一化以顯示清晰性的黑色軌跡代表在1.8mM胞外Ca2+存在下由100μM薄荷醇活化的電流。
圖7表明胞外Ca2+濃度依賴性抑制cCMR1通道的電流幅度。通道的電壓鉗位為-80mV，由1mM薄荷醇活化。虛線是代表對數據最佳擬合的邏輯函數，IC50值為1.6mM。
圖8表明胞外Ca2+電壓依賴性抑制cCMR1通道的電流幅度。通道由1mM薄荷醇活化。
發明詳述本文提及的所有出版物通過引用結合到本文中。除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語所具有的含義都和本發明所屬領域一般技術人員通常理解的含義相同。
本文使用的術語“包含”、“含有”、“具有”和“包括”以其開放無限制的意義使用。
以下是在本說明書中時常使用的縮寫詞Bp＝堿基對cDNA＝互補DNACMR1＝冷和薄荷醇敏感受體1；cCMR1＝犬的冷和薄荷醇敏感受體1；DRG＝背根神經節ELISA＝酶聯免疫吸附測定FLIPR＝熒光成像讀板儀kb＝千堿基對，1000個堿基對nt＝核苷酸PAGE＝聚丙烯酰胺凝膠電泳
PCR＝聚合酶鏈反應RT-PCR＝反轉錄聚合酶鏈反應SDS＝十二烷基硫酸鈉SSC＝氯化鈉/檸檬酸鈉TG＝三叉神經節TRPM8＝瞬時受體電位通道，促黑素抑制素亞家族，8型UTR＝非翻譯區多肽或核酸的“活性”、“生物活性”或“功能活性”指多肽或核酸分子產生的活性，其按照標準技術體內或體外測定。這種活性可為直接活性，例如離子通道活性、與第二種蛋白結合或對第二種蛋白的酶活性，或者可為間接活性，例如由蛋白與一種或多種其它蛋白或其它分子相互作用(包括但不限于在多步系列融合中發生的相互作用)而介導的細胞信號轉導活性。
本文使用的“生物樣品”指含細胞或組織物(例如分離自受試者的細胞或生物液體)或由其組成的樣品。所述“受試者”可為已成為治療、觀測或實驗對象的哺乳動物，例如大鼠、小鼠、猴或人。生物樣品的實例包括例如痰、血液、血細胞(例如白細胞)、羊水、血漿、精液、骨髓、組織或細針活檢樣品、尿、腹膜液、胸膜液和細胞培養物。生物樣品還可包括組織切片，例如為組織學用途而制作的冷凍切片。測試生物樣品是已成為分析、監測或觀察目標的生物樣品。對照生物樣品可為測試生物樣品陽性對照或陰性對照中的任一種。對照生物樣品經常包含與測試生物樣品相同類型的目標組織、細胞和/或生物液體。
“細胞”指適于檢測方法靈敏度的至少一個細胞或多個細胞。適于本發明的細胞可為細菌，但優選真核細胞，最優選哺乳動物細胞。
“克隆”是由單個細胞或共同祖先通過有絲分裂產生的一群細胞。“細胞系”是初級細胞，其產生克隆擴充的細胞，并能夠在體外穩定生長許多代。
“冷和薄荷醇敏感受體”、“CMR1”、“瞬時受體電位通道，促黑素抑制素亞家族，8型”或“TRPM8”蛋白均指能夠感覺和轉導冷刺激的蛋白，所述冷刺激例如為低溫或激起冷感的化合物，包括但不限于薄荷醇和Icilin。“CMR1”可形成興奮性離子通道CMR1通道，其可由低溫或激起冷感的化合物活化。活化的CMR1通道門控Ca++離子經該通道內流，引起膜去極化。CMR1蛋白可(1)與SEQ ID NO2所示犬CMR1(cCMR1)蛋白具有約80％以上的氨基酸序列同一性；或(2)結合針對SEQ ID NO2所示cCMR1蛋白產生的抗體，例如多克隆或單克隆抗體。在某些實施方案中，CMR1與SEQ ID NO2具有約85％、90％或95％以上的氨基酸序列同一性。代表性的CMR1包括cCMR1，其包括SEQ ID NO2所示cCMR1蛋白的結構和功能多態性。“多態性”指在群的個體中的特定遺傳基因座上的一組遺傳性變體。CMR1還包括犬CMR1在其它動物(包括人、大鼠、小鼠、豬、狗和猴)中的直向同源物，例如大鼠CMR1(GenBank蛋白IDNP_599198)或小鼠TRPM8(GenBank蛋白IDNP_599013)的結構和功能多態性。CMR1基因在某些神經元組織(例如DRG和TG)中天然表達。
“CMR1活化溫度”是CMR1通道表現出的電導率和基線相比增加至少10％的溫度。本領域技術人員可用實驗方法確定CMR1通道的活化溫度。在某些實施方案中，“CMR1活化溫度”是CMR1通道表現出的電導率和基線相比增加至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的溫度。“CMR1活化溫度”通常為約6℃-28℃。在某些實施方案中，CMR1活化溫度約為15℃-28℃、19℃-28℃、23℃-28℃或19℃-24℃。
“CMR1非活化溫度”是處于“CMR1活化溫度”范圍以外的溫度。代表性的CMR1非活化溫度為37℃。
“基因”是涉及生產肽、多肽或蛋白的DNA節段以及編碼此蛋白種類的mRNA，包括編碼區、編碼區之前的非編碼區(“5′UTR”)和之后的非編碼區(“3′UTR”)。“基因”還可包括各個編碼節段(“外顯子”)之間的間插非編碼序列(“內含子”)。“啟動子”指涉及RNA聚合酶結合以啟動基因轉錄的DNA調節序列。啟動子經常位于基因轉錄起始位點的上游(“5′”)。“調節序列”指可控制基因表達的基因部分。“調節序列”可包括啟動子、增強子和其它表達控制元件，例如聚腺苷酸化信號、核糖體結合位點(用于細菌表達)和/或操作子。“增強子”指可以以距離或方向依賴性方式調節基因表達的DNA調節序列。“編碼區”指通過三聯體堿基密碼子編碼氨基酸以及用于對應多肽翻譯的起始和終止信號的基因部分。
“核酸序列”或“核苷酸序列”指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸殘基以單鏈或雙鏈形式在聚合物中的排列。核酸序列可由以下堿基的天然核苷酸和/或合成類似物組成胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶；分別縮寫為T、A、C、G和U。
術語“寡核苷酸”指相對較短長度的單鏈DNA或RNA序列，例如少于100個殘基長。對于許多方法，長度約16-25個核苷酸的寡核苷酸是有用的，盡管有時可使用約25個核苷酸以上的較長寡核苷酸。某些寡核苷酸可用作合成互補核酸鏈的“引物”。例如，DNA引物可在使用DNA聚合酶的反應中與互補核酸序列雜交，以引發互補DNA鏈的合成。寡核苷酸還在幾種核酸檢測方法(例如RNA印跡或原位雜交)中用于雜交。
“多肽序列”或“蛋白序列”指氨基酸殘基在聚合物中的排列。多肽序列可由標準的20種天然氨基酸組成，還可加上稀有氨基酸和合成氨基酸類似物。較短的多肽一般稱為肽。
“分離的”核酸分子是與該核酸天然來源中的其它核酸分子分離的核酸分子。“分離的”核酸分子可為例如沒有至少一種核苷酸序列的核酸分子，該核苷酸序列在為該核酸來源的生物體基因組DNA中天然位于核酸分子側翼的5′和3′末端。分離核酸分子包括但不限于獨立于其它序列的分離核酸分子(例如通過PCR或限制性核酸內切酶處理產生的cDNA或基因組DNA片段)，以及整合到載體、自主復制質粒、病毒(例如逆轉錄病毒、腺病毒或皰疹病毒)中或整合到原核或真核生物基因組DNA中的核酸分子。另外，分離核酸分子可包括為雜合或融合核酸分子一部分的核酸分子。分離核酸分子可為(i)通過例如聚合酶鏈反應(PCR)體外擴增的核酸序列；(ii)通過例如化學合成而合成的核酸序列；(iii)通過克隆重組產生的核酸序列；或(iv)通過切割和電泳或層析分離而純化的核酸序列。
“分離的”或“純化的”蛋白或其生物活性部分基本沒有獲得該蛋白的細胞或組織來源的細胞物質或其它雜蛋白，或者基本沒有化學合成時的化學前體或其它化學物質。表述“基本沒有細胞物質”包括其中蛋白與分離或重組生產該蛋白的細胞的細胞組分分離的蛋白制備物。因此，基本無細胞物質的蛋白包括異源蛋白(在本文也稱為“雜蛋白”)少于約30％、20％、10％或5％(干重)的蛋白制備物。當蛋白或其生物活性部分重組生產時，還優選其基本無培養基，即培養基占蛋白制備物體積少于約20％、10％或5％。當蛋白通過化學合成生產時，優選其基本無化學前體或其它化學物質，即其與參與合成該蛋白的化學前體或其它化學物質分離。因此，在這種蛋白制備物中，目的多肽以外的化學前體或化合物少于約30％、20％、10％、5％(干重)。分離的生物活性多肽可具有幾種不同的物理形式。分離的多肽可作為全長的新生或未加工多肽存在，或作為部分加工的多肽存在，或作為加工多肽的組合存在。全長新生多肽可通過導致形成全長新生多肽片段的特異性蛋白水解切割事件翻譯后修飾。片段或物理結合的片段可具有與全長多肽相關的生物活性；但是，與單個片段相關的生物活性程度可能有所不同。分離的或基本純化的多肽可為由分離核酸序列編碼的多肽，以及通過例如化學合成法合成的多肽，和由生物材料分離的多肽，然后使用常規蛋白分析或制備步驟將其純化至允許按照本文所述方法使用的程度。
“重組體”指已使用分子生物學技術修飾為不同于其天然狀態的核酸、由核酸編碼的蛋白、細胞或病毒顆粒。例如，重組細胞可包含不存在于天然(非重組)形式細胞中的核苷酸序列，或者可表達在其它情況下異常表達、低表達或根本不表達的天然基因。重組細胞還包含存在于天然形式細胞中的基因，其中所述基因通過人工方法被修飾并再導入細胞中。該術語還包括含未由細胞中取出核酸就已被修飾的內源核酸的細胞；這種修飾包括例如通過基因置換和位點特異性突變獲得的修飾。
“重組宿主細胞”是其中已導入重組DNA序列的細胞。可使用任何合適的方法，包括例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、顯微注射、轉化、基因槍和病毒感染，將重組DNA序列導入到宿主細胞中。重組DNA可整合或不整合(共價連接)入組成細胞基因組的染色體DNA中。例如，重組DNA可保持在游離型元件(例如質粒)上。或者，對于穩定轉化或轉染的細胞，重組DNA已整合入染色體中，使得其通過染色體復制遺傳給子細胞。此穩定性由穩定轉化或轉染細胞建立由含外源DNA的子細胞群組成的細胞系或克隆的能力證實。重組宿主細胞可為原核或真核細胞，包括細菌，例如大腸桿菌；真菌細胞，例如酵母；哺乳動物細胞，例如人、牛、豬、猴和嚙齒動物來源的細胞系；以及昆蟲細胞，例如果蠅和蠶源細胞系。更要理解的是，術語“重組宿主細胞”不僅指具體的所述細胞，而且指該細胞的子代或潛在子代。因為某些修飾可由于突變或環境影響而在以后的各代中出現，所以這種子代可能實際上與親代細胞不完全相同，但仍包括在本文使用的術語范圍內。
本文使用的“有效連接”指兩個核酸序列之間的功能關聯。例如，控制編碼序列表達(例如轉錄)的啟動子序列有效連接至該編碼序列。有效連接的核酸序列可為連續的，以許多啟動子序列為代表，或者可為非連續的，例如核酸序列編碼阻抑蛋白的情況。在重組表達載體中，“有效連接”意指例如在體外轉錄/翻譯系統中或在宿主細胞(當載體導入到宿主細胞中時)中，目的編碼序列以允許編碼序列表達的方式連接至一個或多個調節序列。
“載體”或“構建物”指異源核酸可插入或已插入其中的核酸分子。某些載體可導入到允許載體復制或由允許載體或構建物編碼的蛋白表達的宿主細胞中。載體通常具有選擇標記(例如所編碼蛋白提供藥物抗性的基因)、復制序列起點和允許插入異源序列的多克隆位點。載體通常為質粒型，以小寫字母“p”后接字母和/或數字的組合表示。本文公開的起始質粒可市售獲得、在無限制基礎上公開地獲得或可通過應用本領域已知的方法由可獲得的質粒構建。可按照本發明使用的許多質粒和其它克隆和表達載體對本領域技術人員來說是眾所周知的，并可容易地獲得。而且，技術人員可容易地構建許多適用于本發明的其它質粒。根據本文公開內容，技術人員顯而易見這種質粒以及其它載體在本發明中的特性、結構和用途。
“序列”指其中單體在聚合物中存在的線性順序，例如氨基酸在多肽中的順序或核苷酸在多核苷酸中的順序。
本領域已知的“序列同一性或相似性”是通過對比序列確定的兩個或更多個多肽序列或兩個或更多個多核苷酸序列之間的關系。在兩個或更多個核酸序列或兩個或更多個多肽序列之間關系的上下文下，本文使用的“同一性”分別指在序列最優比對和分析時相同的核苷酸或氨基酸殘基的百分率。為對比查詢序列和例如氨基酸序列SEQ IDNO 2，將查詢序列與SEQ ID NO 2最優比對，獲得在全長SEQ ID NO2(1104個氨基酸)中的最佳局部比對。
可人工或使用序列比較算法進行分析。對于序列比較，通常一個序列起參比序列的作用，查詢序列與其比較。當使用序列比較算法時，將測試和參比序列輸入到計算機中，指定子序列坐標，如果有需要，指定序列算法程序參數。
例如，可通過使用Needleman & Wunsch，J Mol.Biol.，48443(1970)的同源性比對算法，對比較的序列進行最優比對。Needleman &Wunsch分析的軟件可通過巴斯德研究所(法國)生物學軟件站點http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/needle.html公開地獲得。NEEDLE程序使用Needleman-Wunsch全局比對算法，以在考慮其全長時獲得兩個序列的最優比對(包括空位)。按照所報告的比對區域(包括在長度中的任何空位)內兩個序列之間的相同匹配百分率計算同一性。還提供相似性記分，其中按照所報告的比對區域(包括在長度中的任何空位)內兩個序列之間的匹配百分率計算相似性。標準比較利用用于蛋白序列的EBLOSUM62矩陣和用于核苷酸序列的EDNAFULL矩陣。空位開放罰分是建立空位時減去的記分；默認設置使用的空位開放罰分為10.0。對于空位延伸，罰分加入空位中每個堿基或殘基的標準空位罰分；默認設置為0.5。
雜交還可用作測試，以表明兩個多核苷酸彼此基本相同。共有高度同一性的多核苷酸在嚴格雜交條件下彼此雜交。“嚴格雜交條件”具有本領域已知的含義，如Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，(1989)所述。代表性的嚴格雜交條件包括約45℃下在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，接著根據雜交多核苷酸共有互補性的長度，50-65℃下在0.2x SSC和0.1％SDS中進行一次或多次漂洗。
“報告基因”指編碼報告基因產物的核酸序列。如本領域所知，報告基因產物通常易于通過標準方法檢測。代表性的合適報告基因包括但不限于編碼熒光素酶(lux)、β-半乳糖苷酶(lacZ)、綠色熒光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰轉移酶(CAT)、β-葡糖醛酸酶、新霉素磷酸轉移酶和鳥嘌呤黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶蛋白的基因。
“增加CMR1通道電導率的化合物”包括導致通過CMR1通道的離子增加的任何化合物。在一個實施方案中，這種化合物是結合CMR1通道以增加其電導率的CMR1通道激動劑。在另一個實施方案中，這種化合物是正別構調節物，其與CMR1通道在不同于激動劑結合位點的變構部位相互作用，但加強了通道對激動劑的反應。
“降低CMR1通道電導率的化合物”包括導致通過CMR1通道的離子減少的任何化合物。在一個實施方案中，這種化合物是結合CMR1通道以競爭或非競爭方式阻遏、降低或限制激動劑作用的CMR1通道拮抗劑。在另一個實施方案中，這種化合物是負別構調節物，其與CMR1通道在不同于激動劑或拮抗劑結合位點的變構部位相互作用，并降低通道對激動劑的反應。在又一實施方案中，這種化合物是結合CMR1通道并在沒有任何其它化合物(例如激動劑)存在下降低通道電導率的反向激動劑。
本文使用的“膜電位”、“跨膜電位”或“跨膜電位差”均指跨越質膜(細胞的外界脂雙層膜)的電位差。幾乎所有的動物細胞內部都是負電位，靜息電位在-20至-100mV的范圍內。本文使用的“靜息電位”指當細胞靜止時細胞內部相對于其外界環境的電位。
本文使用的“去極化”指細胞膜電位變成為更正電的趨勢，例如由-90mV至-50mV。
本文使用的“超極化”指細胞膜電位變成更負電的趨勢，例如由-50mV至-90mV。在實施本發明時，使用分子生物學、微生物學和重組DNA中的許多常規技術。這些技術是眾所周知的，闡述于例如CurrentProtocols in Molecular Biology，I、II和III卷，F.M.Ausubel編輯，(1997)；和Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2001)。
在一個方面，本發明涉及新cCMR1(cCMR1)核酸、由這些核酸編碼的多肽、重組cCMR1物質以及涉及這些物質的生產、檢測和使用的方法。
CMR1命名法由McKemy，D.D.等，(Nature，41652-58，2002)建立，用于描述在大鼠的DRG和TG中表達的冷和薄荷醇敏感受體。人CMR1(也稱為人TRPM8)與大鼠CMR1的氨基酸序列92％相同，先前已被鑒定為前列腺特異性轉錄物，還已發現其在各種腫瘤組織中表達，包括前列腺癌、黑素瘤、結直腸癌和乳癌(Tsavaler，L.等，Cancer Res.613760-3769，2002)。小鼠CMR1(也稱為小鼠TRPM8)由小鼠DRG cDNA制備物克隆，已表明其與人CMR1氨基酸序列93％相同(Peier，A.M.等，Cell 108705-715，2002)。
在本發明中，由從犬DRG組織制備的cDNA文庫克隆犬cCMR1基因。對cCMR1 cDNA測序，包括對應mRNA的cCMR1可讀框(ORF)以及5′和3′非翻譯區。cCMR1 cDNA序列如SEQ ID NO1(表1)所示。SEQ ID NO1編碼一個1104個殘基的多肽(SEQ ID NO2)，也示于表1，其與人、小鼠和大鼠的CMR1蛋白序列進行比對(參見表2)。基于此比對，cCMR1多肽與人CMR1共有95.23％的最高氨基酸同一性。
在本發明中，還將cCMR1核酸亞克隆入表達載體中，并轉化入用于表達cCMR1蛋白的宿主細胞中。已表明，此重組cCMR1細胞系統表達功能性cCMR1蛋白，當重組cCMR1細胞于低溫溫育或接觸薄荷醇或Icilin時，該功能性cCMR1蛋白允許Ca++離子內流。重組cCMR1系統用于篩選和鑒別調節cCMR1功能或表達的化合物。調節cCMR1功能或表達的化合物在治療上可能是有用的。這些化合物可使用例如表達cCMR1蛋白的重組系統鑒別，然后在狗或任何其它合適的哺乳動物中體內測試，以確定可用于人的給藥參數。
調節CMR1蛋白的功能或表達可能有利于治療各種疼痛病癥。因為CMR1受體響應于冷以及模擬冷樣感覺的化合物如薄荷醇和Iicilin，所以預期調節cCMR1活性也適用于其中冷或薄荷醇治療用作疼痛緩解或其它緩解方法的治療適應癥，例如充血性鼻炎、咳嗽或氣喘性支氣管炎。例如，調節CMR1蛋白的功能或表達可用于患真皮和粘膜病癥的患者，所述病癥例如為皮膚炎癥和真皮灼傷(包括曬傷和刮傷)，或咽喉痛。調節CMR1活性還可適用于對冷高靈敏度而引起冷痛覺超敏的患者。調節CMR1活性還可適用于治療急性疼痛，例如牙痛(齒痛)和其它三叉神經分布式疼痛，例如三叉神經痛(ticdouleureux)和顳下頜關節痛。
另外，因為人CMR1已被鑒別為與腫瘤生長相關的標記物(Tsavaler，L.等，Cancer Res.613760-3769，2002)，所以cCMR1還可用于在狗中診斷各種細胞增殖疾病。
在克隆cCMR1同系物的嘗試中，使用基于PCR的策略。按照SEQ ID NO3(cmr1-23)和SEQ ID NO4(cmr1-26)所示序列合成寡核苷酸引物。這些引物能夠成功地擴增SEQ ID NO1的1761位至2886位的部分cCMR1序列。純化大小約1.1 kb的PCR產物，然后亞克隆入測序載體中。基于1.1kb cCMR1片段的序列開發新引物，并同RACE(cDNA末端快速擴增)-修飾的犬DRG cDNA一起用于單獨的PCR反應。獲得cCMR1 cDNA的完整序列(SEQ ID NO1)，包括5′和3′非翻譯區。cCMR1的可讀框編碼如表1所示的1104個殘基的多肽(SEQ ID NO2)。
因此，在一個實施方案中，本發明提供含SEQ ID NO1的69-3380位序列的分離核酸序列。SEQ ID NO1的69-3380位是可讀框序列(編碼區)，其可編碼SEQ ID NO2的CMR1多肽。本發明還提供對應于cCMR1可讀框上游區域(例如SEQ ID NO1的1-69)的分離核酸序列，以及對應于cCMR1可讀框下游區域(例如SEQ ID NO1的3380-3815)的分離核酸序列。因此，在另一個實施方案中，本發明提供分離的核酸序列，其包含SEQ ID NO1的1-69位序列，在另一個實施方案中，其包含SEQ ID NO1的3380-3815位序列。
含SEQ ID NO1片段的分離核酸用于各種用途。例如，這些序列可用作檢測CMR1核酸或檢測CMR1核酸側翼序列的寡核苷酸探針。它們可用作擴增CMR1核酸的寡核苷酸引物。它們還可用于制備嵌合核酸，其編碼融合至另一多肽序列的部分或全部cCMR1多肽，例如cCMR1序列的一個或多個基序或結構域與一種或多種異源序列的一個或多個基序或結構域重組。此外，它們可用于操作cCMR1基因的結構。
在再另一個實施方案中，本發明提供分離的核酸，其包含的核酸序列編碼含SEQ ID NO2的多肽。由于遺傳密碼的簡并性，可使用一種以上的密碼子編碼特定氨基酸，因此，cCMR1氨基酸序列(例如SEQ ID NO2)可由多種核酸序列中的任一種編碼。分離的核酸包括序列中一個或多個密碼子被不同序列的、但編碼相同氨基酸殘基的密碼子取代的序列(在本文被稱為“保守密碼子置換”)。因此，本發明包含具有一個或一個以上保守密碼子置換的SEQ ID NO2編碼核酸序列。本領域技術人員基于本文提供的序列信息，應能夠測定具有一個或一個以上保守密碼子置換并編碼SEQ ID NO2的特定核酸序列。保守密碼子置換可在編碼CMR1多肽的核酸序列中進行，例如密碼子TTT和TTC(統稱為TTT/C)可編碼Phe(苯丙氨酸)殘基；其它密碼子置換如下TTA/G和CTT/C/A/GLeu；ATT/CIle；ATGMet；GTT/C/A/GVal；TCT/C/A/GSer；CCT/C/A/GPro；ACT/C/A/GThr；GCT/C/A/GAla；TAT/CTyr；CAT/CHis；CAA/GGln；AAT/CAsn；AAA/GLys；GAT/CAsp；GAA/GGlu；TGT/CCys；CGT/C/A/GArg；AGT/CSer；AGA/GArg；GGT/C/A/GGly。保守密碼子置換可在cCMR1多肽編碼核酸序列中的任何位置進行。
如本文所示，SEQ ID NO1的69位至3380位編碼1104個氨基酸殘基的多肽(SEQ ID NO2)，其是天然表達的犬CMR1的預測序列。如表2所示，SEQ ID NO2與人、小鼠和大鼠CMR1蛋白序列比對。通過比對，cCMR1多肽序列(SEQ ID NO2)與人CMR1蛋白序列的同一性最高，在1104個殘基中共有1052個殘基(95.23％同一性)。cCMR1蛋白序列與小鼠(1042/110494.38％同一性)和大鼠(1043/110494.47％同一性)CMR1多肽序列共有的同一性程度較低。
正如所示，表2所示的狗、人、小鼠和大鼠CMR1序列一般共有90％以上的氨基酸同一性。但是，在某些氨基酸位點，犬序列與人、小鼠和大鼠序列中的一種或多種不同。其中犬殘基與一種或多種其它物種不同的氨基酸位點比其中殘基在人、狗、小鼠和大鼠序列中相同的位點更可變。例如，根據序列比對，SEQ ID NO2的1、2和3位的氨基酸殘基與人、小鼠和大鼠序列相同。但是，SEQ ID NO2的4和5位的氨基酸殘基相對于人序列是不同的，SEQ ID NO2的28位的氨基酸殘基相對于人、小鼠和大鼠序列是不同的。其中犬序列和任一種人、小鼠和大鼠CMR1序列之間存在至少一個不同的氨基酸位點在本文被稱為“CMR家族變體位點”。表3提供了CMR家族變體位點的清單。
基于此分析，預期具有一個或多個CMR家族變體氨基酸置換的cCMR1多肽具有CMR1生物活性。也就是說，可在一個或多個CMR家族變體氨基酸位點，用選自存在于人、小鼠或大鼠序列中相同位置的氨基酸殘基的氨基酸或等價氨基酸置換SEQ ID NO2。置換cCMR1氨基酸的氨基酸在本文被稱為“CMR家族變體氨基酸”。“CMR家族變體氫基酸”由不同于cCMR1氨基酸并存在于其它哺乳動物(例如人、小鼠或大鼠)CMR1序列中的氨基酸組成。合適的CMR家族變體氨基酸的清單也可見于表3，其中任一個均可用于替換原cCMR1氨基酸殘基。例如，適于替換SEQ ID NO2的谷氨酸(E)的4位CMR家族變體氨基酸為精氨酸(R，其存在于人CMR1中)。
在某些CMR家族變體氨基酸位點，犬、人、小鼠和大鼠氨基酸殘基共有相同的化學特性。例如，在SEQ ID NO2的18和34位的CMR家族變體氨基酸可包括疏水氨基酸殘基，例如甲硫氨酸(M)或亮氨酸(L)。其它的疏水氨基酸包括甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和脯氨酸。其它氨基酸分組包括“堿性氨基酸”，其包括組氨酸、賴氨酸和精氨酸；“酸性氨基酸”，其包括谷氨酸和天冬氨酸；“芳香族氨基酸”，其包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；“小氨基酸”，其包括甘氨酸和丙氨酸；“親核氨基酸”，其包括絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸；和“酰胺氨基酸”，其包括天冬酰胺和谷氨酰胺。
因此，在另一方面，本發明提供編碼SEQ ID NO2的CMR1多肽的核酸，其包含CMR家族變體氨基酸。在某些實施方案中，cCMR1多肽含有的CMR家族變體氨基酸不到原始cCMR1氨基酸殘基的4％。優選cCMR1多肽包含的CMR家族變體不到原始cCMR1氨基酸殘基的約2％，最優選不到原始cCMR1氨基酸殘基的約1％。
本發明還提供與本文描述的任何分離核酸分子互補的分離核酸分子。
本發明的分離核酸還可包含編碼具有額外氨基酸殘基的cCMR1多肽的核酸序列。在某些實施方案中，額外氨基酸存在于cCMR1序列的氨基端、羧基端、內部或這些位置的組合。具有這些類型的額外氨基酸序列的cCMR1多肽可稱為“cCMR1融合蛋白”。在某些情況下，根據額外氨基酸序列的性質，將它們另外稱為“嵌合”或“標記”cCMR1蛋白等可能更合適。盡管如此，在已知本文提供的序列信息的情況下，人們還是能夠辨別具有額外氨基酸序列的CMR1多肽。額外氨基酸殘基可為短的，例如1至約20個額外氨基酸殘基，或為較長的，例如超過約20個額外氨基酸殘基。額外氨基酸殘基可提供一種或多種功能或用途，包括例如用作蛋白(例如抗體)或小分子結合的表位；用作胞內和胞外運輸的標記；提供額外酶活性或其它活性；或提供檢測信號。
例如，核酸序列可編碼cCMR1融合蛋白，其可包含額外氨基酸殘基，提供用于鍵合(例如離子、共價、配位、氫鍵或范德華鍵合或其組合)有機或無機化合物的坐標。有用的額外氨基酸序列包括例如通過Ni+-偶合殘基用于蛋白純化的聚組氨酸殘基、免疫球蛋白(IgA、IgE、IgG、IgM)的恒定結構域或其部分(CH1、CH2、CH3)、白蛋白、用于形成檢測或純化用免疫復合物的血凝素(HA)或myc親和表位標記(抗這些部分的抗體可市售獲得)、檢測用多肽如綠色熒光蛋白(GFP)、酶(例如β-半乳糖苷酶(B-Gal)、氯霉素乙酰轉移酶(CAT)、熒光素酶和堿性磷酸酶(A))、用于蛋白運輸的信號序列和如果有需要的話用于分離額外氨基酸序列與cCMR1序列的蛋白酶切割序列。
在另一方面，提供能夠檢測cCMR1(例如cCMR1蛋白或核酸)表達的診斷實驗。cCMR1蛋白的表達可通過可檢測標記或可隨后標記的探針檢測。通常，探針是如上所述識別表達蛋白的抗體，尤其是單克隆抗體。因此，在一個實施方案中，能夠檢測cCMR1蛋白表達的實驗包括使犬組織樣品與一種或多種結合cCMR1的單克隆和/或多克隆抗體接觸。
可用可檢測試劑標記cCMR1核酸和蛋白、抗CMR1的抗體和含任何這些組分的生物系統，或者可用可檢測試劑標記對cCMR1具有特異性的化合物，并使用該化合物檢測cCMR1實體。可檢測試劑包括可通過顯微鏡、生物化學、光化學、生物電子、免疫化學、電學、光學或化學技術檢測的化合物和組合物。可檢測部分的實例包括但不限于放射性同位素(例如32P、33P、35S)、化學發光化合物、標記的結合蛋白、重金屬原子、光譜標記物(例如熒光標記物和染料)、連接酶、質譜標記物和磁性標記。
使用抗體的免疫檢測法包括但不限于點印跡、蛋白質印跡、競爭性和非競爭性蛋白結合實驗、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、免疫組織化學、熒光激活細胞分選(FACS)、免疫-PCR、免疫沉淀和通常使用的其它方法。
可使用常用的分子生物學方法，例如RNA印跡、原位雜交、核酸酶保護實驗、RT-PCR(包括實時、定量PCR)、高密度陣列和其它雜交方法，檢測對應于cCMR1基因的mRNA的表達水平。因此，在另一個實施方案中，提供能夠檢測犬組織樣品中一種或一種以上cCMR1基因的表達的實驗，其包括使犬組織樣品與能夠和cCMR1核酸雜交的寡核苷酸接觸。用于PCR/引物延伸實驗的寡核苷酸引物一般長10-20個核苷酸。約40-50個核苷酸的較長寡核苷酸更通常用于原位或印跡雜交。即便長于50個核苷酸的序列也可用于檢測實驗。可通過本領域技術人員眾所周知的方法，例如描述于Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.(1996)的方法，由組織樣品中分離RNA。檢測由cCMR1基因轉錄的mRNA水平的一個優選方法是利用RT-PCR。RT-PCR技術的細節眾所周知，本文也有描述。
檢測由一種以上的公開基因獲得的mNA轉錄物水平的另一個優選方法包括標記mRNA與寡核苷酸或組織的有序陣列雜交。這種方法允許同時測定多種這些基因的轉錄水平，以產生基因表達譜或基因表達模式。
用于此雜交方法的寡核苷酸通常結合至固相支持體。固相支持體的實例包括但不限于膜、濾膜、載玻片、紙、尼龍、晶原、纖維、磁珠或非磁珠、凝膠、管、聚合物、聚氯乙烯平皿等。可使用任何寡核苷酸可直接或間接、共價或非共價結合的固體表面。特別優選的固體基質是高密度陣列或DNA芯片。這些高密度陣列在陣列上的預先選定位置包含特定的寡核苷酸探針。各個預先選定位置都可包含一個以上的特定探針分子。因為寡核苷酸在基質上的特定位置，所以可依據特定基因的表達水平解釋雜交模式和強度(其一起產生特有的表達譜或表達模式)。
優選寡核苷酸探針足夠長，以僅可與以上鑒別的目的基因的互補轉錄物特異性雜交。
任選全部或部分cCMR1核酸序列可用于探測其它物種的核酸制備物，以測定相似序列的存在情況。例如，全部或部分cCMR1核酸可用作探針，以鑒別其它物種中類似于cCMR1序列的cDNA或基因組核酸序列。可將與cCMR1探針雜交的克隆確定為陽性克隆。
另外，可在計算機輔助程序中使用本發明提供的全部或部分cCMR1核酸或多肽序列，以鑒別其它有用的信息，例如與cCMR1序列具有同源性的蛋白或結合cCMR1序列的分子。例如，可使用全部或部分cCMR1序列篩選各種電子數據庫，以確定電子數據庫成員是否與cCMR1序列具有同源性。可使用本文列出的犬核酸或多肽序列的任何部分查詢眾多種特異性的遺傳數據庫。可進行核酸和蛋白檢索中的任一項或二者。
在另一方面，可確定cCMR1多肽的三維模型，并使用其鑒別結合蛋白結構的各部分的分子。例如，使用本文描述的分離的cCMR1核酸，可在細胞系統中表達cCMR1蛋白并純化，然后結晶，以獲得有關蛋白結構的信息。可通過進行例如X射線衍射或核磁共振光譜獲得結構信息。氨基酸殘基及其側鏈的位置可在三維模型中以坐標表示。然后可將此信息提供給計算機程序。
分子建模程序可用于確定小分子是否能適合cCMR1多肽的功能相關部分，例如活性位點。關于分子建模的基礎信息提供于例如M.Schlecht，Molecular Modeling on the PC，1998，John Wiley & Sons；Gans等，Fundamental Principals of Molecular Modeling，1996，Plenum Pub.Corp.；N.C.Cohen(編輯)，Guidebook on Molecular Modeling in DrugDesghign，1996，Academic Press；和W.B.Smith，Introduction to TheoreticalOrganic Chemistry and Molecular Modeling，1996。提供分子建模詳細信息的美國專利包括美國專利第6,093,573號、6,080,576號、5,612,894號和5,583,973號。
可用于分子建模研究的程序包括例如可得自Oxford University，Oxford，UK的GRID(Goodford，P.J.，“A Computational Procedure forDetermining Energetically Favorable Binding Sites on BiologicallyImportant Macromolecules”J.Med.Chem.，28，849-857頁，1985)；可得自Molecular Simulations，Burlington，Mass.的MCSS(Miranker，A.和M.Karplus，“Functionality Maps of Binding SitesA Multiple CopySimultaneous Search Method.”ProteinsStructure，Function and Geneties，11，29-34頁，1991)；可得自Scripps Research Institute，La Jolla，Calif.的AUTODOCK(Goodsell，D.S.和A.J.Olsen，“Automated Docking ofSubstrates to Proteins by Simulated Annealing”ProteinsStructure.Function，and Genetics，8，195-202頁，1990)；和可得自University ofCalifomia，San Francisco，CA.的DOCK(Kuntz，I.D.等，“A GeometricApproach to Macromolecule-Ligand Interactions”J.Mol.Biol.，161，269-288頁，1982)。
除了編碼cCMR1多肽的核酸序列以外，本發明還包括cCMR1多肽、cCMR1多肽變體、cCMR1多肽片段和具有額外氨基酸的cCMR1多肽。本文描述了由核酸編碼的cCMR1多肽的多個方面，這些方面也可應用于cCMR1多肽。
在一個實施方案中，本發明提供分離的多肽，其包含SEQ ID NO2的序列。
在另一個實施方案中，本發明提供分離的多肽，其包含的SEQ IDNO2序列所具有的CMR家族變體氨基酸少于原始cCMR1氨基酸殘基的4％。優選cCMR1多肽包含的CMR家族變體少于原始cCMR1氨基酸殘基的約2％，最優選少于原始cCMR1氨基酸殘基的約1％。
如本文所述，cCMR1多肽在其氨基端、羧基端或兩端還可具有額外氨基酸殘基。這種額外殘基用于各種用途，包括例如免疫檢測、純化、細胞運輸、酶活性等。
本發明還提供cCMR1多肽片段。cCMR1多肽片段可用于多種目的，包括例如抗體生產。cCMR1多肽序列的部分或其整個序列可用于產生抗CMR1抗體。
在另一方面，本發明涉及特異性識別SEQ ID NO2的氨基酸序列中的表位的抗體。有用的抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、人源化或嵌合抗體，以及能夠結合部分cCMR1蛋白的生物功能抗體片段。對前述序列編碼蛋白有特異性的抗體可用于幾類用途。這些抗體可用于診斷試劑盒，例如用于其中需要檢測cCMR1的任何種類實驗。其還可用于制備治療性物質，例如其中抗cCMR1抗體自身是治療性的，或其中抗cCMR1抗體偶聯治療性物質。預期抗cCMR1抗體可用于治療疼痛。在這些情況下，抗cCMR1抗體可調節cCMR1活性，例如提供激動(例如催化)或拮抗活性。
本發明還提供生產犬特異性單克隆抗CMR1抗體的方法。為生產這些單克隆抗體，可使用提供獨特抗cCMR1決定簇的肽。單克隆抗體是針對特定抗原(即表位)的抗體的同源克隆群。為制備抗cCMR1單克隆抗體，使用具有cCMR1特異性序列或“cCMR1表位”的肽。cCMR1序列是在相對于狗、小鼠和大鼠CMR1序列的一個或多個位置不同的序列。為測定cCMR1特異性序列，人們可查閱本文提供的表2。
可通過利用培養的連續細胞系提供抗體分子生產的任何技術獲得單克隆抗體(mAb)。這些技術包括例如雜交瘤技術術(ohler和Milstein，Nature，256495-497，1975)；人B細胞雜交瘤技術(Kosbor等，Immunology Today，472，1983)和EBV雜交瘤技術(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁，1985)。這種抗體可為任何免疫球蛋白型，例如IgG、IgM、IgE、IgA、IgD或其任何亞型。生產本發明的單克隆抗體的雜交瘤可在體外或體內培養。
為生產CMR1蛋白的抗體，可通過用cCMR1多肽或其部分注射免疫各種宿主動物。如果使用完整的cCMR1多肽，則可產生cCMR1特異性抗體以及與不同物種的其它CMR1蛋白交叉反應的抗CMR抗體。例如，多克隆抗體制備物是來源于抗原(例如CMR1多肽)免疫動物血清的異質抗體分子群。在此多克隆群中，抗體與CMR1多肽的不同部分交叉反應，這些抗體中有一些與cCMR1特異性反應，另一些與其它物種的CMR1多肽交叉反應。為生產多克隆抗體，通常重復地用cCMR1蛋白或其部分免疫宿主動物，以加強動物中的抗體滴度，并通常補加本文所述的佐劑。常用于生產抗CMR1抗體的宿主動物包括兔、小鼠和大鼠；但是，如果有需要的話，可使用其它動物。根據宿主物種，可使用各種佐劑增強免疫應答，例如弗氏(完全和不完全)佐劑和礦物凝膠，例如氫氧化鋁。還可將綴合物(例如KLH)納入免疫，尤其是對于將較短的cCMR1肽用于免疫和抗體生產用途的情況。
可使用任何類型的合成或分子生物學技術產生cCMR1多肽或cCMR1多肽片段。可使用標準合成肽技術產生較小的cCMR1多肽片段，例如長30個氨基酸或更短的肽片段。合成肽片段的技術眾所周知，描述于例如Barany和Merrifield，Solid-Phase Peptide Synthesis；3-284頁，載于The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology.第2卷Special Methods in Peptide Synthesis，Part A.，Merrifield等，J.Am.Chem.Soc.，852149-2156(1963)，和Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chem.Co.，Rockford，III.(1984)。
重組技術可用于表達cCMR1，包括例如cCMR1的部分、來源于用cCMR1核酸轉化的原核或真核宿主細胞的變體和融合蛋白。這些方法包括例如體外重組DNA技術和體內遺傳重組(參見例如描述于Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版，ColdSpring Harbor Press，NY(2001)；和Ausubel等編輯，Short Protocols inMolecular Biology，第4版，John Wiley & Sons，Inc.，NY(1999)的技術)。
因此，可通過(a)提供含cCMR1序列的核酸，(b)將核酸插入到宿主細胞中，和(c)在允許cCMR1多肽表達的情況下保持宿主細胞，生產cCMR1。當需要純化的cCMR1多肽時，還可進行一個步驟，以分離和純化(如果有需要的話)cCMR1多肽。
在另一個實施方案中，本發明提供異源核酸構建物，其包含有效連接至調節序列的全部或部分cCMR1編碼序列。這些異源核酸構建物包含適于在宿主細胞中表達cCMR1核酸的重組表達載體。重組表達載體包含一個或多個有效連接至cCMR1核酸序列的調節序列，其可基于用于cCMR1表達的宿主細胞類型來選擇。調節序列包括啟動子、增強子和其它表達控制元件，例如poly(A)+序列。調節序列可為原核細胞(例如細菌細胞，例如大腸桿菌)或真核細胞(例如酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞(例如HEK、CHO或COS細胞))特異性的。調節序列可相對于cCMR1核酸序列以順式或反式定位。調節序列可包括組成型表達序列、組織特異性調節序列和可誘導調節序列，組成型表達序列通常在廣泛的生長條件下和廣泛的宿主細胞中驅動核酸表達，組織特異性調節序列在特定宿主細胞或組織中驅動表達，可誘導調節序列在繼發性因素作用下驅動表達。可根據使用的具體宿主細胞和需要的多肽表達水平之類的因素選擇和設計表達載體。其它表達載體元件可包括但不限于以下的一種或多種信號序列、復制起點、一個或多個選擇基因和轉錄終止序列。選擇基因編碼的蛋白(a)賦予對抗生素或其它毒素(例如氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環素)的抗性，(b)補充營養缺陷或(c)提供由復合培養基無法獲得的關鍵營養物。
用于表達cCMR1多肽的異源核酸構建物還可包括可被體外轉錄和翻譯的構建物，例如具有T7啟動子調節序列的構建物。
適于表達cCMR1的載體是本領域已知的，可市售獲得。合適的載體包括例如pET-14b、pCDNAlAmp和pVL1392，其可由Novagen和Invitrogen獲得，分別可用于在大腸桿菌、COS細胞和桿狀病毒感染的昆蟲細胞中表達。
在另一個實施方案中，本發明提供含cCMR1核酸的重組細胞。重組細胞包括其中已導入核酸序列的細胞。通常，通過使用分子生物學技術將特定核酸導入細胞中建立重組細胞。但是，重組細胞還包括已以其它方式操作來促進目的核酸序列表達的細胞。例如，可改變鄰近靶核酸序列的區域，以促進靶核酸的表達，或者可將起調節靶核酸表達作用的基因導入到細胞中。
重組細胞在生長和分裂期后可能與起始親代細胞不同；但是，這些細胞仍被稱為重組細胞，并包含在本文使用的術語范圍內。
適于攜帶和提供用于cCMR1表達的細胞機器的宿主細胞既原核細胞和真核細胞兩者。原核宿主細胞的合適實例為真細菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌)、腸桿菌屬(Enterobacter、沙門氏菌屬(Salmonella)(例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium))，以及芽孢桿菌屬(Bacilli)(例如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和鏈霉菌屬(Streptomycea)。
真核細胞，例如絲狀真菌或酵母，是適于cCMR1表達載體的克隆或表達宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，也稱為面包酵母，是常用的表達系統，提供各種啟動子和選擇標記序列。其它用作宿主細胞的真菌或酵母包括粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、畢赤氏巴斯德酵母(Pichia Pastors)、念珠菌屬(Candida)、粗糙脈孢菌(Neurospora crasssa)和構巢曲霉(Asspergillus nidulans)。
可使用許多高等真核宿主細胞，包括昆蟲細胞，例如果蠅S2和夜蛾Sf9細胞；哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、猴腎(COS)細胞、犬腎(MDCK)細胞、人宮頸癌(HeLa)細胞和人胚胎腎(HEK)細胞；以及植物細胞。
轉化宿主細胞的生長可在本領域已知的條件下發生。所述條件一般取決于宿主細胞和所用載體類型。可使用合適的誘導條件，例如溫度和化學物質，這取決于使用的啟動子類型。合適培養基的實例包括最小必需培養基(MEEM)、RPMI-1640和Dulbecco改良型Eagle培養基(DMEM)。
可通過常規轉化或轉染技術將核酸(包括表達構建物)導入原核或真核細胞中。本文使用的術語“轉化”和“轉染”意指本領域公認的各種將外源核酸分子(例如DNA)導入宿主細胞中的技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂轉染、基因槍或電穿孔。適于轉化或轉染宿主的方法可見于Sambrook等(出處同上)和其它實驗室手冊。
可用具有選擇標記和目的基因的表達構建物穩定轉染哺乳動物細胞。通常用于哺乳動物細胞的選擇標記包括抗生素抗性基因，例如在化合物(例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)存在下允許轉化細胞生長的基因。
重組細胞可用于生產cCMR1多肽，用于純化用途或涉及cCMR1多肽的功能研究。例如，重組cCMR1細胞可用于測試多種化合物改變cCMR1多肽活性的能力。重組cCMR1細胞還可用于測試如何改變cCMR1多肽的各種特性，例如如何改變cCMR1多肽的氨基酸序列、如何影響cCMR1活性。
具有cCMR1核酸序列的重組細胞還可用于生產非人轉基因動物。轉基因是整合入細胞(由該細胞發育成轉基因動物)基因組中的外源DNA，并保留在成熟動物的基因組中，由此引導編碼基因產物在轉基因動物的一種或多種細胞類型或組織中表達。例如，可使用合適的技術，例如顯微注射，將含cCMR1核酸序列的核酸導入宿主細胞中，例如受精的卵母細胞或胚胎干細胞。然后，這些含cCMR1的宿主細胞可用于創建非人轉基因動物。特別有用的動物包括具有cCMR1基因的轉基因小鼠或大鼠，其還可具有物理或遺傳特征，使其例如作為疼痛模型用于研究。
cCMR1轉基因動物可用于鑒別、篩選或測試調節cCMR1功能或表達的潛在有用化合物或已知化合物。這些轉基因動物還可通過改變其氨基酸序列用于研究cCMR1多肽的功能。
利用胚胎操作和顯微注射產生轉基因動物(具體地說是小鼠之類的動物)的方法已成為本領域常規方法，描述于例如美國專利第4,736,866和4,870,009號、美國專利第4,873,191號，以及Hogan，Manipulating the Mouse Embryo(Cold SPpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。構建同源重組載體和同源重組動物的方法進一步描述于Bradley(Current Opinion in Bio/Technology，2823-829，1991)和PCT公開WO 90/11354、WO 91/01140、WO 92/0968和WO 93/04169。還可按照Wilmt等(Nature，385810-813，1997)以及PCT公開WO 97/07668和WO 97/07669描述的方法生產本文描述的非人轉基因動物的克隆。
在某些情況下，例如為了測試推測為CMR1調節劑的化合物的特異性，可能需要減少系統中存在的CMR1的量。可操作如本文所述的重組細胞或轉基因動物，以便減少在其表面上表達或存在的CMR1的量。例如，細胞可包含減少細胞中存在的cCMR1 RNA量的分子，由此降低cCMR1蛋白表達。合適的分子包括反義核苷酸、核酶、雙鏈RNA、干擾RNA(iRNA)以及拮抗劑或激動劑。
可使用各種方法純化cCMR1多肽。例如，可使用硫酸銨沉淀、離心或其它已知技術進行粗純化。可通過合適的層析技術實現高度純化，包括例如陰離子交換、陽離子交換、高效液相層析(HPLC)、凝膠過濾、疏水相互作用層析和親和層析，例如使用抗cCMR1蛋白的抗體的親和層析。當蛋白在胞內合成、分離或純化過程中變性時，如果有必要，可使用重折疊cCMR1蛋白的步驟，以獲得蛋白的活性構象。
本發明還包括檢測生物樣品(測試樣品)中本發明多肽或核酸存在情況的試劑盒。這種試劑盒優選包含適于密閉保持在至少一個容器中的區室化載體。載體可包含檢測工具，例如標記抗原或酶底物等。例如，該試劑盒可包含能夠檢測多肽或多肽編碼mRNA的標記化合物或物質，以及測定樣品中多肽或mRNA量的工具(例如結合多肽的抗體或結合多肽編碼DNA或mRNA的寡核苷酸探針)。該試劑盒還可包含說明書，用于確定如果多肽或多肽編碼mRNA的量高于或低于正常水平，測試者是否患有或有風險患與多肽異常表達相關的疾病。
對于抗體型試劑盒，該試劑盒可包含例如(1)第一種抗體(例如附著至固體支持體的抗體)，其選擇性結合所含氨基酸序列與SEQ IDNO2具有至少96％序列同一性的多肽；和任選的(2)第二種抗體，其結合第一種抗體或第一種抗體結合的多肽(但在不同表位結合)，并綴合至可檢測物質；和(3)作為陽性對照的純化重組cCMR1蛋白。優選第一種抗體僅結合cCMR1，但不結合其它物種(例如人、大鼠或小鼠)的CMR1。
對于寡核苷酸型試劑盒，該試劑盒可包含例如(1)寡核苷酸，例如可檢測的標記寡核苷酸，其在嚴格條件下與SEQ ID NO1雜交，或(2)一對用于擴增編碼多肽(其與SEQ ID NO2具有至少96％的序列同一性)的核酸分子的引物。該試劑盒還可包含例如緩沖劑、防腐劑或蛋白穩定劑。該試劑盒還可包含檢測可檢測物質必需的組分(例如酶或底物)。該試劑盒還可包含可被檢測并與測試樣品對比的對照樣品或一系列對照樣品。試劑盒的各個組分通常都封裝在單個容器中，各種容器優選全部包含在單個包裝中。
因為CMR1在涼爽至寒冷的溫度被活化并在神經組織中表達，所以該基因可用作治療靶，用于鑒別可用于治療疼痛、炎癥和皮膚病(例如與曬傷和其它敏化狀態相關的疾病)的藥物。因此，在另一個一般方面，本發明涉及cCMR1核酸和蛋白在治療性化合物鑒別方法中的用途，所述治療性化合物例如為用于治療疼痛、調節對低溫的反應的化合物和為皮膚提供冷感的化合物。可使用含cCMR1多肽或cCMR1核酸的系統鑒別這些類型的化合物。還可在動物模型系統(例如大鼠、小鼠或犬模型系統)體內直接測試化合物。特別有用的系統包括疼痛動物模型。這些方法包括測定各種化合物增加或降低cCMR1蛋白表達、cCMR1通道電導率或動物傷害感受行為的能力。
可使用常規實驗室形式或以適于高通量的實驗進行化合物鑒別方法。術語“高通量”指允許多個樣品同時和/或快速連續地簡易篩選的實驗設計，其可包含機器人操作能力。高通量實驗的另一個需要特征是優化實驗設計，減少試劑使用或最小化操作次數來實現預期分析。實驗形式的實例包括96孔或384孔板、懸浮液滴(levitatingdroplet)和用于液體處理實驗的“芯片實驗室”微通道芯片。本領域技術人員眾所周知，隨著小型化塑料模具和液體處理裝置的發展，或者隨著設計出改良的實驗裝置，可使用本發明的設計處理較大量的樣品。
候選化合物包含眾多化學類別，包括但不限于小有機或無機化合物、天然或合成分子，例如抗體、蛋白或其片段、反義核苷酸、干擾RNA(iRNA)和核酶。優選地，其為小有機化合物，即分子量大于50但低于約2500的化合物。候選化合物包含對于與多肽的結構性相互作用必需的功能化學基團，通常包括至少酰胺、羰基、羥基或羧基，優選包括這些功能化學基團中的至少兩個，更優選包括這些功能化學基團中的至少3個。候選化合物可包含用一個或多個上述官能團取代的環狀碳或雜環結構和/或芳香族或多芳香族結構。候選化合物還可為生物分子，例如肽、糖、脂肪酸、甾醇、類異戊二烯、嘌呤、嘧啶、上述物質的衍生物或結構類似物或其組合等。當化合物為核酸時，化合物通常為DNA或RNA分子，盡管也設想了具有非天然鍵或亞單位的修飾核酸。
候選化合物得自各種來源，包括合成或天然化合物庫。例如，可利用眾多工具，隨機和定向合成各種有機化合物和生物分子，包括表達隨機寡核苷酸、合成有機組合文庫、隨機肽的噬菌體展示文庫等。還可使用任何本領域已知組合文庫方法中的眾多方案，包括生物文庫、空間可定位平行固相或液相文庫、需要去卷積的合成文庫法、“一珠一化合物”文庫法和使用親和層析選擇的合成文庫法(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12145)，獲得候選化合物。或者，可獲得或容易地生產細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫。另外，可通過常規化學、物理和生物化學方法容易地修飾天然和合成產生的文庫和化合物。
而且，已知的藥用物質可進行定向或隨機的化學修飾，例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，以生產該物質的結構類似物。候選化合物可隨機選擇，或者以結合和/或調節CMR1活性功能的現有化合物為基準。因此，候選物的來源是基于一種或多種增加或降低CMR1通道電導率的已知化合物的一種或多種分子文庫，其中已知化合物的結構在分子的一個或多個位置改變，以包含或多或少的化學部分或不同化學部分。在創建類似物活化劑/抑制劑文庫時對分子進行的結構改變可以是定向、隨機的置換和/或添加，或為定向和隨機置換和/或添加二者的組合。在制備組合文庫時，本領域一般技術人員可基于現有的化合物容易地制備這種文庫。
混合物中還可包含各種其它試劑。這些試劑包括例如鹽、緩沖液、中性蛋白(例如白蛋白)、變性劑等，其可用于促進優化的蛋白-蛋白和/或蛋白-核酸結合。這種試劑還可降低反應組分的非特異性或背景相互作用。還可使用其它促進實驗效力的試劑，例如核酸酶抑制劑、抗微生物劑等。
合成分子文庫的方法實例可見于本領域，例如載于Zuckermann等(1994).J Med.Chem.372678。化合物文庫可存在于溶液中(例如Houghten(1992)Biotechniques 13412-421)或珠(Lam(1991)Nature35482-84)、芯片(Fodor(1993)Nature 364555-556)、細菌(美國專利第5,223,409號)、孢子(專利第5,571,698號)、質粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865-1869)或噬菌體(參見例如Scott和Smith(1990)Science 249386-390)上。
在一個方面，本發明提供增加或降低cCMR1蛋白表達的化合物的鑒別方法，其包括以下步驟(a)使測試化合物與含cCMR基因表達調節機制的細胞接觸；和(b)測定測試化合物是否增加或降低由細胞的所述機制控制的基因表達。調節cCMR基因表達的機制包括核、胞質或胞內因子在轉錄或翻譯水平上影響基因作用控制的機制。例如，該機制包括基因活化或基因抑制。含cCMR基因表達調節機制的細胞可為內源表達cCMR的天然宿主細胞，例如犬DRG細胞。該細胞還可為含重組DNA序列的重組細胞，其中所述重組DNA序列具有cCMR基因調節序列，所述調節序列與基因(優選報告基因)有效連接。
可通過各種方法檢測化合物對CMR1調節序列控制的基因表達的作用。例如，可通過細胞中基因的mRNA或蛋白的量或通過細胞的基因產物的活性檢測該作用。當使用報告基因時，可由細胞的報告基因產物水平檢測作用。例如，當CMR1調節序列有效連接至GFP基因時，可使用熒光計，以化合物對細胞的綠色熒光發射的作用檢測化合物對基因表達的作用。當使用內源cCMR1細胞時，可使用上文描述的方法(即RNA印跡、RT-PCR、SDS-PAGE、蛋白質印跡、免疫組織化學或免疫細胞化學、放射性受體配體結合等)，以細胞內cCMR1 mRNA或蛋白的量檢測化合物對基因表達的作用。或者，可使用cCMR1通道的電導率檢測化合物對cCMR1蛋白表達的作用。
本文描述的細胞型方法不僅鑒別通過結合一種或多種cCMR1基因調節序列直接調節cCMR1表達的化合物，而且鑒別通過結合其活性影響cCMR1表達或蛋白穩定性的其它細胞組分間接調節cCMR1表達的化合物。例如，可使用本文描述的方法鑒別調節cCMR1基因轉錄活化劑或抑制劑的活性的化合物。還可鑒別調節體內降解cCMR1蛋白的蛋白酶活性的化合物。
本發明還提供增加或降低cCMR1離子通道電導率的化合物的鑒別方法，其包括以下步驟(a)使測試化合物與離子通道接觸；和(b)測定測試化合物是否增加或降低離子通道的電導率。在某些實施方案中，cCMR1離子通道表達在宿主細胞表面上。細胞可為內源表達cCMR1的cCMR1天然宿主細胞，例如狗DRG或TG細胞。細胞還可為cCMR1的重組宿主細胞，例如重組表達cCMR1的CHO或COS細胞。
在某些其它實施方案中，cCMR1離子通道與分離的膜制備物結合。膜制備物可分離自在其細胞表面上表達cCMR1的天然宿主細胞，或分離自在其細胞表面上表達cCMR1的重組宿主細胞。其還可由生物膜制備，例如含cCMR1通道的組織膜、質膜、細胞膜或內部細胞器膜。本領域技術人員已知分離和制備生物膜制備物的方法。例如，這種方法可包括以下步驟機械或酶破裂組織或細胞，離心以分離膜和其它組分，將膜碎片或囊泡重懸浮在合適的緩沖溶液中。或者，含膜制備物還可來源于人工膜。純化的cCMR1蛋白可重構入脂雙層中，以形成人工膜囊泡(參見Chen等，1996，J. Gen.Physiol.108237-250)。此類膜囊泡對目的通道的特異性可非常高，避免了其它通道污染的問題。本領域技術人員已知制備人工膜囊泡的方法。
在某些實施方案中，含cCMR1的膜囊泡可提供較簡單形式的本發明實驗和方法，因為實驗過程中的細胞裂解和/或剪切沒有很大關系。但是，在其它實施方案中，優選表達cCMR1的細胞，例如，當細胞膜制備步驟破壞或失活目的通道時。
可評價測試化合物增加或降低cCMR1通道的離子電導率的能力。本領域技術人員已知測定CMR1通道電導率的方法，例如通過刺激細胞去極化或增加胞內鈣離子水平。可使用鈣離子敏感型熒光指示劑，例如鈣離子敏感型熒光染料，評價胞內鈣水平。合適的鈣離子敏感型熒光染料包括例如quin-2(參見例如Tsien等，J Cell BioL，94325，1982)、fura-2(參見例如Grynkiewicz等，J BioL Chem.，2603440，1985)、fluo-3(參見例如Kao等，J BioL-43 Chem.，2648179，1989)和rhod-2(參見例如Tsien等，J Biol.Chem.，Abstract 89a，1987)。合適的鈣離子敏感型熒光染料可由例如Molecular Probes(Eugene，OR)市售獲得。還可使用熒光計或具有熒光燈和檢測儀的流式細胞儀監測細胞熒光。
cCMR1陽離子通道不僅起轉運二價陽離子(例如Ca++)的作用，而且起轉運單價陽離子如Na+或K+的作用。因此，還可進行測定單價陽離子轉運中的變化的實驗，以監測cCMR1通道電導率。Na+和K+敏感型染料是本領域已知的，可由例如Molecular Probes(Eugene，OR)市售獲得。
還可通過電生理學技術(例如膜片鉗)檢測cCMR1通道的電導率。膜片鉗技術常規地用于研究細胞、細胞膜和分離組織中的電活性。其包括在微電極和質膜之間形成電密封高阻封接。然后可檢測通過質膜中的各個離子通道的電流。不同的技術變化允許質膜的不同表面暴露于培養基(bathing medium)。4種最常見的方案包括細胞貼附式膜片、內面向外式膜片、外面向內式膜片和全細胞鉗。
膜片鉗法常用控制跨膜電壓并檢測電流的電壓鉗。在電壓鉗方法中，將微電極插入到細胞中，電流通過電極注入，以便將細胞膜電位保持在某一預定水平。膜片鉗法還可使用與電流鉗法，其中控制電流并檢測電壓。
優選在其中特定離子通道活化的條件下進行實驗，鑒別降低cCMR1通道電導率的化合物。例如，這種實驗可在CMR1活化的溫度下進行。全細胞膜片鉗記錄研究表明，cCMR1在約17℃或以下的低溫活化(實施例7，見下文)。或者，這種實驗可在活化cCMR1的化合物(例如冷化合物薄荷醇或Icilin，或刺激性化合物芥子油)存在下進行。另外，這種實驗可在cCMR1通道去極化的條件下進行，例如通過在去極化電位下鉗住通道。
相反地，在設法鑒別增加cCMR1通道電導率的化合物時，優選調整測試條件，其中cCMR1通道無活性或以另外的方式封閉。例如，可在CMR1非失活溫度進行這種實驗。與在室溫仍有活性的大鼠CMR1不同，cCMR1在室溫失活(實施例7，見下文)。或者，可在降低cCMR1通道電導率的化合物存在下進行這種實驗。另外，可在足以脫敏cCMR1通道的胞外Ca2+存在下進行這種實驗。本領域一般技術人員能夠通過常規實驗測定足以脫敏cCMR1通道的合適胞外Ca2+濃度。而且，這種實驗可在cCMR1通道超極化的條件下進行，例如通過在超極化電位下鉗住通道。
可人工或使用自動化系統進行cCMR1調節物鑒別實驗。如果進行高通量篩選，則優選自動化系統。例如，一類自動化系統使用多孔培養板，例如96孔、384孔或1536孔培養板，其中各個孔包含具有cCMR1蛋白編碼核酸的重組細胞。將板裝入熒光計中，例如FlexStationTM(得自Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)，其可檢測各個孔中細胞的鈣通量和/或膜電位。含鈣離子敏感型熒光指示劑染料或測試化合物的溶液可自動化加至各個孔中。熒光計中的溫度可按照所進行實驗的類型來控制，例如可將溫度調節至CMR活化溫度以上的溫度(例如28℃以上)，以測試疑為CMR1激動劑的化合物。同樣，可將溫度調節至CMR活化溫度，例如28℃或以下，以測試疑為CMR1拮抗劑的化合物。
在活化CMR1通道并允許陽離子(例如Ca++離子)內流后，Ca++離子的胞內累積促進負反饋和CMR1通道失活。在通過例如將Ca++泵出細胞外或吸收入胞內細胞器降低胞內Ca++水平后，CMR1被再活化。
盡管CMR1通道可允許Ca++離子在涼爽至寒冷溫度作用下內流，但其是輕度的漏離子通道。某些CMR1通道即使在非活化溫度(例如在28℃以上)也允許Ca++離子內流。在常規實驗系統中，通常使用mM范圍的胞外Ca++濃度，其甚至在非活化溫度也可導致胞內鈣累積，引起CMR1負反饋失活。
因此，本發明的另一方面是增加或降低哺乳動物CMR1離子通道電導率的化合物的鑒別方法，其包括以下步驟(a)在含亞失活量鈣的緩沖溶液中溫育離子通道；(b)活化離子通道；(c)使離子通道與測試化合物接觸；(d)增加緩沖溶液中的鈣量；和(e)測定胞內鈣量，并比較該量與其中離子通道未接觸測試化合物的對照的胞內鈣量。“亞失活量鈣”是應不引起Ca++離子胞內累積至促進負反饋和CNR1通道失活程度的胞外Ca++量。本領域技術人員可用實驗方法確定具體CMR1通道的“亞失活量鈣”。在某些實施方案中，“亞失活量鈣”為緩沖溶液中的鈣基本為0。在其它實施方案中，“亞失活量鈣”為緩沖溶液中的鈣在μM范圍內。本發明方法包括含本文所述步驟(a)-(e)的方法，其中步驟(c)在步驟(b)之前。
在已鑒別出滿足調節CMR1活性或表達的要求標準的化合物之后，接著可將化合物給予活體動物。這可用于確定對建立給藥方案很重要的毒性和其它藥理學參數。例如，在使用含cCMR1多肽的離體系統鑒別化合物之后，可將化合物給予狗，以檢測該化合物在狗中的各藥理學方面。本文所述的cCMR1系統對鑒別和建立人類中的給藥方案特別有優勢，因為狗，具體地說是大型繁殖動物，在體重上比大鼠和小鼠更接近人，因此提供了更合適的推定人給藥劑量的動物模型。
該化合物也可給予動物，以評價該化合物改變傷害感受過程的能力。存在各種疼痛動物模型，例如神經損傷的脊神經結扎(SNL)模型，其是由Kim和Chung (Pain，50355-363，1992)開發的大鼠神經性疼痛模型。
其它合適的疼痛動物模型可結合本文的教導一起使用。通常研究的神經性疼痛嚙齒動物動物模型包括慢性壓迫性損傷(CCI)或Bennett模型；神經瘤或軸索切斷模型；以及部分坐骨神經橫斷或Seltzer模型(Shir等，Neurosci.Lett.，11562-67，1990)。示例性神經性疼痛模型包括幾種外傷性神經損傷標本(Bennett等，Pain 3387-107，1988；Decosterd等，Pain 87149-58，2000；Kim等，Pain 50355-363，1992；Shir等，Neurosci Lett 11562-7，1990)、神經炎癥模型(Chacur等，Pain 94231-44，2001；Milligan等，Brain Res 861105-16，2000)、糖尿病性神經病(Calcutt等，BrJPharmacol1221478-82，1997)、病毒誘導的神經病(Fleetwood-Walker等，J Gen Virol 802433-6，1999)、長春新堿神經病(Aley等，Neuroscience 73259-65，1996；Nozaki-Taguchi等，Pain 9369-76，2001)和紫杉醇神經病(Cavaletti等，Exp Neurol 13364-72，1995)，以及急性傷害感受測試模型和炎癥模型(Brennan，T.J.等Pain 64493，1996；D’Amour，F.E.和Smith，D.L.J Pharmacol 7274-79，1941；Eddy，N.B.等J Pharmacol Exp Ther98121，1950；Haffner，F.Dtsch Med Wochenschr 55731，1929；Hargreaves，K等Pain 3277-88，1988；Hunskaar，S.等J Neurosci Meth 1469，1985；Randall，L.O.和Selitto，J.J.Arch.Int.Pharmacodyn 111409-419，1957；Siegmund，E.等Proc Soc Exp Bio Med 95729，1957)。
因此，在另一個實施方案中，本發明提供用于治療疼痛的化合物的鑒別方法，其包括以下步驟(a)使測試化合物與cCMR1離子通道接觸；和(b)測定測試化合物是否增加或降低離子通道的電導率。在某些實施方案中，該方法進一步包括以下步驟(a)給予動物測試化合物；和(b)測定測試化合物改變動物的傷害感受/傷害防御反應的程度。
在某些實施方案中，疼痛動物模型包括嚙齒動物，例如大鼠或小鼠；在另一方面，疼痛動物模型包括狗，例如皮膚抽搐測試(Kamerling等Pharmacol.Biochem.Behav.17733-740，1982；另參見Burns JC等Perspect BiolMed. Autumn；35(1)68-73，1991)。
可利用標準藥學方法，通過計算例如ED50(對群體的50％治療有效的劑量)和LD50(使群體的50％致死的劑量)，在細胞培養物或實驗動物中測定治療效力和毒性。毒性和治療作用之間的劑量比率是治療指數，其可表示為比率LD50/ED50。在配制人用劑量范圍時，使用由使用重組CMR1的細胞培養實驗和動物研究(例如犬研究)獲得的數據。在這種組合物中包含的劑量優選產生一定范圍的循環濃度，其包含基本無毒或無毒的ED50。在此范圍內的劑量變化取決于使用的劑型、患者敏感度和給予途徑。確切的劑量由給予劑量的人按照與需要治療的對象相關的因素確定。調整劑量和給予，以提供足夠水平的活性物質或保持需要的作用，例如有效的疼痛緩解。可考慮的因素包括疼痛的嚴重性和其它因素，包括對象的身體狀況、對象的年齡、體重和性別、膳食、給予的時間和頻率、藥物組合、反應敏感性和對治療的耐受/響應。
可通過任何各種途徑給予含已鑒別為調節CMR1活性的化合物的藥用組合物，所述途徑包括但不限于口服、靜脈內、肌內、關節內、動脈內、髓內、鞘內、硬膜外、心室內、經皮、皮下、腹膜內、鼻內、腸內、局部、舌下、吸入、眼內、耳內或直腸途徑。
除了活性成分以外，這些藥用組合物還可包含合適的藥物可接受載體，包括便于將活性化合物加工入藥學上可使用的制品中或便于吸收或分散活性化合物的賦形劑和輔助劑。配制和給予技術的更多細節可參見Remington′s Pharmaceutical Sciences，Maack PublishingCo.，Easton，PA。
可使用本領域眾所周知的藥物可接受載體，以適于口服給予的劑量，配制用于口服給予的藥用組合物。這種載體能夠使藥用組合物被配制成為片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊劑、溶液劑、凝膠劑、糖漿、漿劑、懸浮劑等，以由患者攝取。
表1SEQ1 ACGCGGGGAAGGCCGGCAGGATCTTTCCAGGGAAAGCAAATCCTGCCTCACAAACCTCAA1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60TGCGCCCCTTCCGGCCGTCCTAGAAAGGTCCCTTTCGTTTAGGACGGAGTGTTTGGAGTTCCGGAGAGATGTCCTTCGAGGGGGCCAGGCTCAGCATGAGGAACAGAAGGAACGGCACGC61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120GGCCTCTCTACAGGAAGCTCCCCCGGTCCGAGTCGTACTCCTTGTCTTCCTTGCCGTGCGSEQ2 M S F E G A R L S M R N R R N G T L -TGGACAGCACCCGGACCCTGTACTCCAGCACGTCTCGGAGCACCGACGTGTCCTACAGCG121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180ACCTGTCGTGGGCCTGGGACATGAGGTCGTGCAGAGCCTCGTGGCTGCACAGGATGTCGCD S T R T L Y S S T S R S T D V S Y S E -AAAGCGACTTGGTGAATTTTATTCAAGCAAATTTTAAGAAACGAGAATGTGTCTTCTTCA181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240TTTCGCTGAACCACTTAAAATAAGTTCGTTTAAAATTCTTTGCTCTTACACAGAAGAAGTS D L V N F I Q A N F K K R E C V F F T -CCAAAGATTCCAAGGCCACGGAAAATGTGTGCAAGTGTGGCTATGCCCAGAGCCAGCACA241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300GGTTTCTAAGGTTCCGGTGCCTTTTACACACGTTCACACCGATACGGGTCTCGGTCGTGTK D S K A T E N V C K C G Y A Q S Q H I -TAGAAGGCACCCAGATCAACTCAAACGAGAAATGGAATTACAAGAAACACACCAAGGAAT301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360ATCTTCCGTGGGTCTAGTTGAGTTTGCTCTTTACCTTAATGTTCTTTGTGTGGTTCCTTAE G T Q I N S N E K W N Y K K H T K E F -TTCCGACTGACGCCTTTGGGGATATTCAGTTTGAGACTCTGGGGAAGAAAGGGAAGTATA361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420AAGGCTGACTGCGGAAACCCCTATAAGTCAAACTCTGAGACCCCTTCTTTCCCTTCATATP T D A F G D I Q F E T L G K K G K Y I -TCCGCCTGTCCTGTGACACGGATGCGGAGACCCTCTATGAGCTGCTGACCCAGCACTGGC421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480AGGCGGACAGGACACTGTGCCTACGCCTCTGGGAGATACTCGACGACTGGGTCGTGACCGR L S C D T D A E T L Y E L L T Q H W H -ACCTGAAAACGCCCAACCTGGTCATATCTGTCACCGGCGGCGCCAAGAACTTCGCCCTGA481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540TGGACTTTTGCGGGTTGGACCAGTATAGACAGTGGCCGCCGCGGTTCTTGAAGCGGGACTL K T P N L V I S V T G G A K N F A L K -AGCCGAGGATGCGCAAGATCTTCAGCCGCCTCATCTACATCGCGCAGTCCAAAGGTGCTT541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600TCGGCTCCTACGCGTTCTAGAAGTCGGCGGAGTAGATGTAGCGCGTCAGGTTTCCACGAAP R M R K I F S R L I Y I A Q S K G A W -GGATTCTCACTGGAGGAACCCATTATGGCCTGATGAAGTACATCGGGGAGGTGGTGAGAG601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 660CCTAAGAGTGACCTCCTTGGGTAATACCGGACTACTTCATGTAGCCCCTCCACCACTCTCI L T G G T H Y G L M K Y I G E V V R D -ACAACACCATCAGCAGGAATTCAGAGGAGAACATTGTGGCCATTGGCATAGCGGCTTGGG661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720TGTTGTGGTAGTCGTCCTTAAGTCTCCTCTTGTAACACCGGTAACCGTATCGCCGAACCCN T I S R N S E E N I V A I G I A A W G -GCATGGTCTCCAACAGGGACACTCTCCTCAGGAATTGCGATGCTGAGGGATATTTTTCAG721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780CGTACCAGAGGTTGTCCCTGTGAGAGGAGTCCTTAACGCTACGACTCCCTATAAAAAGTCM V S N R D T L L R N C D A E G Y F S A -CTCAGTACATAATGGATGACTTCAAGAGAGACCCTCTGTATATCTTGGACAACAACCACA781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840
GAGTCATGTATTACCTACTGAAGTTCTCTCTGGGAGACATATAGAACCTGTTGTTGGTGTQ Y I M D D F K R D P L Y I L D N N H T -CCCATCTGCTGCTTGTGGACAACGGCTGCCATGGACATCCTACAGTTGAAGCAAAACTCC841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900GGGTAGACGACGAACACCTGTTGCCGACGGTACCTGTAGGATGTCAACTTCGTTTTGAGGH L L L V D N G C H G H P T V E A K L R -GGAATCAGCTGGAGAAGTACATCTCCGAGCGCACTATTCAAGATTCCAACTATGGTGGCA901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 960CCTTAGTCGACCTCTTCATGTAGAGGCTCGCGTGATAAGTTCTAAGGTTGATACCACCGTN Q L E K Y I S E R T I Q D S N Y G G K -AGATCCCCATTGTGTGTTTTGCCCAAGGAGGTGGCAGAGAAACTTTGAAAGCCATCAACA961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020TCTAGGGGTAACACACAAAACGGGTTCCTCCACCGTCTCTTTGAAACTTTCGGTAGTTGTI P I V C F A Q G G G R E T L K A I N T -CCTCCATCAAAAGCAAAATCCCCTGTGTGGTGGTGGAAGGCTCAGGGCAGATTGCAGACG1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080GGAGGTAGTTTTCGTTTTAGGGGACACACCACCACCTTCCGAGTCCCGTCTAACGTCTGCS I K S K I P C V V V E G S G Q I A D V -TGATCGCGAGCCTGGTGGAGGTGGAGGACGTCCTGACGTCATCTGTGGTCAAGGAGAAGT1081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1140ACTAGCGCTCGGACCACCTCCACCTCCTGCAGGACTGCAGTAGACACCAGTTCCTCTTCAI A S L V E V E D V L T S S V V K E K L -TGGTGCGCTTCTTACCCCGCACAGTGTCCCGGCTGCCTGAGGAGGAGACCGAGAGTTGGA1141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200ACCACGCGAAGAATGGGGCGTGTCACAGGGCCGACGGACTCCTCCTCTGGCTCTCAACCTV R F L P R T V S R L P E E E T E S W I -TCAAATGGCTCAAAGAAATTCTCGAAAGTTCTCACCTATTAACAGTTATTAAAATGGAAG1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1260AGTTTACCGAGTTTCTTTAAGAGCTTTCAAGAGTGGATAATTGTCAATAATTTTACCTTCK W L K E I L E S S H L L T V I K M E E -AAGCTGGAGACGAAATTGTGAGCAATGCTATTTCTTATGCTTTGTACAAAGCCTTTAGCA1261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1320TTCGACCTCTGCTTTAACACTCGTTACGATAAAGAATACGAAACATGTTTCGGAAATCGTA G D E I V S N A I S Y A L Y K A F S T -CCAATGAACAAGATAAGGATAACTGGAATGGGCAGCTGAAGCTTCTGCTGGAATGGAACC1321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1380GGTTACTTGTTCTATTCCTATTGACCTTACCCGTCGACTTCGAAGACGACCTTACCTTGGN E Q D K D N W N G Q L K L L L E W N Q -AGCTGGACCTAGCCAATGAGGAGATATTCACCAACGACCGCCGATGGGGGTCTGCTGATC1381 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1440TCGACCTGGATCGGTTACTCCTCTATAAGTGGTTGCTGGCGGCTACCCCCAGACGACTAGL D L A N E E I F T N D R R W G S A D L -TGCAAGAGGTCATGTTTACAGCTCTCATAAAGGACAGACCCAAGTTTGTCCGCCTCTTCC1441 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500ACGTTCTCCAGTACAAATGTCGAGAGTATTTCCTGTCTGGGTTCAAACAGGCGGAGAAGGQ E V M F T A L I K D R P K F V R L F L -TGGAGAATGGGTTGAACCTGCGCAAGTTTCTCACCAATGACGTCCTCACTGAACTCTTCT1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1560ACCTCTTACCCAACTTGGACGCGTTCAAAGAGTGGTTACTGCAGGAGTGACTTGAGAAGAE N G L N L R K F L T N D V L T E L F S -CCAACCACTTCAGCACCCTTGTCTACCGGAACCTGCAGATTGCCAAGAATTCCTATAACG1561 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1620GGTTGGTGAAGTCGTGGGAACAGATGGCCTTGGACGTCTAACGGTTCTTAAGGATATTGCN H F S T L V Y R N L Q I A K N S Y N D -ATGCCCTCCTCACATTCGTCTGGAAACTGGTGGCCAACTTCCGGAGAGGCTTCCGAAAGG1621 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1680TACGGGAGGAGTGTAAGCAGACCTTTGACCACCGGTTGAAGGCCTCTCCGAAGGCTTTCCA L L T F V W K L V A N F R R G F R K E -AAGACAGAAGTAGCAGGGATGACATAGATGTAGAACTTCACGATGTGTCTCCTATCACTC1681 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1740TTCTGTCTTCATCGTCCCTACTGTATCTACATCTTGAAGTGCTACACAGAGGATAGTGAGD R S S R D D I D V E L H D V S P I T R -GGCACCCGCTGCAAGCACACTTCATCTGGGCCATTCTTCAGAACAAGAAGGAACTGTCCA
1741 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800CCGTGGGCGACGTTCGTGTGAAGTAGACCCGGTAAGAAGTCTTGTTCTTCCTTGACAGGTH P L Q A H F I W A I L Q N K K E L S K -AGGTCATTTGGGAGCAGACCAGGGGCTGCACGTTGGCAGCCCTGGGAGCCAGCAAGCTTC1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1860TCCAGTAAACCCTCGTCTGGTCCCCGACGTGCAACCGTCGGGACCCTCGGTCGTTCGAAGV I W E Q T R G C T L A A L G A S K L L -TGAAGACTCTGGCCAAGGTGAAGAATGACATCAATGCTGCAGGGGAGTCCGAGGAGCTGG1861 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1920ACTTCTGAGACCGGTTCCACTTCTTACTGTAGTTACGACGTCCCCTCAGGCTCCTCGACCK T L A K V K N D I N A A G E S E E L A -CAAATGAGTATGAGACCCGTGCAGTTGAGCTGTTCACGGAGTGCTACAGCAGCGACGAGG1921 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1980GTTTACTCATACTCTGGGCACGTCAACTCGACAAGTGCCTCACGATGTCGTCGCTGCTCCN E Y E T R A V E L F T E C Y S S D E D -ACCTGGCCGAGCAGCTGCTGGTGTACTCCTGCGAAGCCTGGGGCGGGAGCAACTGCTTGG1981 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2040TGGACCGGCTCGTCGACGACCACATGAGGACGCTTCGGACCCCGCCCTCGTTGACGAACCL A E Q L L V Y S C E A W G G S N C L E -AGCTGGCGGTGGAGGCCACGGACCAGCACTTCATCGCCCAGCCCGGGGTCCAGAATTTTC2041 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100TCGACCGCCACCTCCGGTGCCTGGTCGTGAAGTAGCGGGTCGGGCCCCAGGTCTTAAAAGL A V E A T D Q H F I A Q P G V Q N F L -TTTCCAAGCAATGGTATGGAGAGATTTCCCGAGACACCAAGAACTGGAAGATTATCCTGT2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2160AAAGGTTCGTTACCATACCTCTCTAAAGGGCTCTGTGGTTCTTGACCTTCTAATAGGACAS K Q W Y G E I S R D T K N W K I I L C -GTTTGTTTATTATACCCTTGGTGGGCTGTGGCTTTGTATCCTTTAGGAAGAGGCCCATCG2161 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2220CAAACAAATAATATGGGAACCACCCGACACCGAAACATAGGAAATCCTTCTCCGGGTAGCL F I I P L V G C G F V S F R K R P I D -ACAAGCACAAGAAGATCCTGTGGTACTACGTGGCGTTCTTCACCTCCCCCTTTGTGGTCT2221 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2280TGTTCGTGTTCTTCTAGGACACCATGATGCACCGCAAGAAGTGGAGGGGGAAACACCAGAK H K K I L W Y Y V A F F T S P F V V F -TCGCCTGGAACGTGGTCTTCTACATCGCCTTCCTCCTGCTCTTTGCCTACGTGCTGCTCA2281 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2340AGCGGACCTTGCACCAGAAGATGTAGCGGAAGGAGGACGAGAAACGGATGCACGACGAGTA W N V V F Y I A F L L L F A Y V L L M -TGGATTTTCACTCAGTGCCACACTCCCCCGAGCTGGTCCTCTACGCACTGGTCTTTGTCC2341 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400ACCTAAAAGTGAGTCACGGTGTGAGGGGGCTCGACCAGGAGATGCGTGACCAGAAACAGGD F H S V P H S P E L V L Y A L V F V L -TGTTCTGTGATGAAGTGAGACAGTGGTACATGAATGGGGTGAATTATTTTACCGACCTGT2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2460ACAAGACACTACTTCACTCTGTCACCATGTACTTACCCCACTTAATAAAATGGCTGGACAF C D E V R Q W Y M N G V N Y F T D L W -GGAATGTCATGGACACACTTGGGCTTTTTTACTTCATAGCAGGCATTGTGTTTCGGCTCC2461 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2520CCTTACAGTACCTGTGTGAACCCGAAAAAATGAAGTATCGTCCGTAACACAAAGCCGAGGN V M D T L G L F Y F I A G I V F R L H -ACCCTTCTAATAAAACCTCTTTGTATTCCGGACGAGTCATCTTTTGCCTGGATTACATTA2521 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2580TGGGAAGATTATTTTGGAGAAACATAAGGCCTGCTCAGTAGAAAACGGACCTAATGTAATP S N K T S L Y S G R V I F C L D Y I I -TATTCACCCTAAGGTTGATCCACATTTTCACCGTAAGCAGAAATTTGGGACCGAAGATTA2581 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2640ATAAGTGGGATTCCAACTAGGTGTAAAAGTGGCATTCGTCTTTAAACCCTGGCTTCTAATF T L R L I H I F T V S R N L G P K I I -TAATGTTGCAGAGGATGCTGATCGACGTGTTTTTCTTCCTGTTTCTGTTTGCCGTGTGGA2641 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700ATTACAACGTCTCCTACGACTAGCTGCACAAAAAGAAGGACAAAGACAAACGGCACACCTM L Q R M L I D V F F F L F L F A V W M -
TGGTGGCCTTCGGCGTGGCCAGGCAAGGGATCCTCAGGCAAAATGAGCATCGCTGGAGGT2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2760ACCACCGGAAGCCGCACCGGTCCGTTCCCTAGGAGTCCGTTTTACTCGTAGCGACCTCCAV A F G V A R Q G I L R Q N E H R W R W -GGATATTCCGCTCGGTTATCTACGAGCCCTACCTGGCCATGTTCGGCCAAGTGCCCAGCG2761 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2820CCTATAAGGCGAGCCAATAGATGCTCGGGATGGACCGGTACAAGCCGGTTCACGGGTCGCI F R S V I Y E P Y L A M F G Q V P S D -ACGTGGATGGTACCACATATGACTTTGCCCACTGCACTTTCACTGGGAATGAGTCCAAGC2821 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2880TGCACCTACCATGGTGTATACTGAAACGGGTGACGTGAAAGTGACCCTTACTCAGGTTCGV D G T T Y D F A H C T F T G N E S K P -CGCTGTGTGTGGAGCTGGATGAGCACAACCTCCCCCGGTTCCCCGAGTGGATCACCATCC2881 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2940GCGACACACACCTCGACCTACTCGTGTTGGAGGGGGCCAAGGGGCTCACCTAGTGGTAGGL C V E L D E H N L P R F P E W I T I P -CTCTGGTGTGCATCTACATGCTCTCCACCAACATCCTGCTGGTCAATCTGCTCGTTGCCA2941 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000GAGACCACACGTAGATGTACGAGAGGTGGTTGTAGGACGACCAGTTAGACGAGCAACGGTL V C I Y M L S T N I L L V N L L V A M -TGTTTGGCTACACAGTGGGAACGGTCCAGGAGAACAACGATCAGGTCTGGAAGTTCCAGA3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3060ACAAACCGATGTGTCACCCTTGCCAGGTCCTCTTGTTGCTAGTCCAGACCTTCAAGGTCTF G Y T V G T V Q E N N D Q V W K F Q R -GGTACTTCTTGGTGCAGGAGTACTGCAACCGCCTGAACATCCCCTTCCCCTTTGTGGTCT3061 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3120CCATGAAGAACCACGTCCTCATGACGTTGGCGGACTTGTAGGGGAAGGGGAAACACCAGAY F L V Q E Y C N R L N I P F P F V V F -TCGCCTACTTCTACATGGTGGTCAAGAAGTGCTTCGGATGCTGCTGCAGGGAGAAACACG3121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3180AGCGGATGAAGATGTACCACCAGTTCTTCACGAAGCCTACGACGACGTCCCTCTTTGTGCA Y F Y M V V K K C F G C C C R E K H A -CCGAGCCTTCTGCCTGCTGTTTCAGAAATGAAGACAATGAGACTCTGGCATGGGAGGGTG3181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3240GGCTCGGAAGACGGACGACAAAGTCTTTACTTCTGTTACTCTGAGACCGTACCCTCCCACE P S A C C F R N E D N E T L A W E G V -TCATGAAAGAAAATTACCTTGTCAAGATCAACACGGAGGCCAATGACACCTCACAGGAAA3241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300AGTACTTTCTTTTAATGGAACAGTTCTAGTTGTGCCTCCGGTTACTGTGGAGTGTCCTTTM K E N Y L V K I N T E A N D T S Q E M -TGAGGCATCGGTTTAGACAGCTGGATACAA GATTAATGATCTCAAGGGCCTTCTGAAAG3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3360ACTCCGTAGCCAAATCTGTCGACCTATGTTTCTAATTACTAGAGTTCCCGGAAGACTTTCR H R F R Q L D T K I N D L K G L L K E -AGATCGCTAATAAAATCAAATAGAACTTCATGGACTGTACTGGAGAAAAACCTAATTATA3361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3420TCTAGCGATTATTTTAGTTTATCTTGAAGTACCTGACATGACCTCTTTTTGGATTAATATI A N K I K *GCAAGGTGACACCAGAAATCGAAGTGGGAACCAGTCAAGAAAAGCTGATGAACAGTTTTG3421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3480CGTTCCACTGTGGTCTTTAGCTTCACCCTTGGTCAGTTCTTTTCGACTACTTGTCAAAACTTACTGACTGCTCAGTAAGAACTGTTCAGGCCGTGGGTATTTAGCAGATGGCTTTCATCA3481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3540AATGACTGACGAGTCATTCTTGACAAGTCCGGCACCCATAAATCGTCTACCGAAAGTAGTCCCCAGTGTGCTCAAATCTGGGAAACAGACGTGTGATTGGTTTCCCCCGAGAAGATAGAC3541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+3600GGGGTCACACGAGTTTAGACCCTTTGTCTGCACACTAACCAAAGGGGGCTCTTCTATCTGACCCAGGAAGAGCTTCCCCTGAAGGCCACCCTGTTACTTCCTGAGTCTCCACCACTCATA3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3660TGGGTCCTTCTCGAAGGGGACTTCCGGTGGGACAATGAAGGACTCAGAGGTGGTGAGTATCCCACTGCGGGTCATCTTAGAGTGTGTTCCTGCACTCTTCTTCTTTCTTCACTTTTCCTA3661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3720GGGTGACGCCCAGTAGAATCTCACACAAGGACGTGAGAAGAAGAAAGAAGTGAAAAGGAT
CTTCTAACTCTGTGCATATTACATCTCTCCTGCAAGGGGGTCATGCCTTCCCTCCCATAA3721---------+---------+---------+---------+---------+---------+3780GAAGATTGAGACACGTATAATGTAGAGAGGACGTTCCCCCAGTACGGAAGGGAGGGTATTAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3781---------+---------+---------+ 3815TTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT表2C MSFEGARLSM RNRRNGTLDS TRTLYSSTSR STDVSYSESD LVNFIQANFK KRECVFFTKD 60|||**||||| |||||*|||| |||||||*|| |||*|||||| |||||||||| |||||||*||H MSFRAARLSM RNRRNDTLDS TRTLYSSASR STDLSYSESD LVNFIQANFK KRECVFFIKD|||||||||| |*|||||**| |||||||*|| |||||||*|| |||||||||| ||||||||*|M MSFEGARLSM RSRRNGTMGS TRTLYSSVSR STDVSYSDSD LVNFIQANFK KRECVFFTRD|||||||||| |*||||||*| |||||||*|| |||||||||| |||||||||| ||||||||*|R MSFEGARLSM RSRRNGTLGS TRTLYSSVSR STDVSYSESD LVNFIQANFK KRECVFFTRDC SKATENVCKC GYAQSQHIEG TQINSNEKWN YKKHTKEFPT DAFGDIQFET LGKKGKYIRL 120|||||||||| |||||||*|| ||||**|||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||H SKATENVCKC GYAQSQHMEG TQINQSEKWN YKKHTKEFPT DAFGDIQFET LGKKGKYIRL|||*||*||| |||||||||| ||||*||||| |||||||||| |||||||||| |||||||*||M SKAMENICKC GYAQSQHIEG TQINQNEKWN YKKHTKEFPT DAFGDIQFET LGKKGKYLRL|||*|**||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||*||R SKAMESICKC GYAQSQHIEG TQINQNEKWN YKKHTKEFPT DAFGDIQFET LGKKGKYLRLC SCDTDAETLY ELLTQHWHLK TPNLVISVTG GAKNFALKPR MRKIFSRLIY IAQSKGAWIL 180|||||||*|| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||H SCDTDAEILY ELLTQHWHLK TPNLVISVTG GAKNFALKPR MRKIFSRLIY IAQSKGAWIL|||||*|||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||M SCDTDSETLY ELLTQHWHLK TPNLVISVTG GAKNFALKPR MRKIFSRLIY IAQSKGAWIL|||||*|||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||R SCDTDSETLY ELLTQHWHLK TPNLVISVTG GAKNFALKPR MRKIFSRLIY IAQSKGAWILC TGGTHYGLMK YIGEVVRDNT ISRNSEENIV AIGIAAWGMV SNRDTLLRNC DAEGYFSAQY 240|||||||||| |||||||||| |||*|||||| |||||||||| ||||||*||| ||||||*|||H TGGTHYGLMK YIGEVVRDNT ISRSSEENIV AIGIAAWGMV SNRDTLIRNC DAEGYFLAQY|||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||*|*| |*||*|||||M TGGTHYGLMK YIGEVVRDNT ISRNSEENIV AIGIAAWGMV SNRDTLIRSC DDEGHFSAQY|||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||*||| |*||*|||||R TGGTHYGLMK YIGEVVRDNT ISRNSEENIV AIGIAAWGMV SNRDTLIRNC DDEGHFSAQYC IMDDFKRDPL YILDNNHTHL LLVDNGCHGH PTVEAKLRNQ LEKYISERTI QDSNYGGKIP 300*||||*|||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||H LMDDFTRDPL YILDNNHTHL LLVDNGCHGH PTVEAKLRNQ LEKYISERTI QDSNYGGKIP|||||*|||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||* ||||||||||M IMDDFTRDPL YILDNNHTHL LLVDNGCHGH PTVEAKLRNQ LEKYISERTS QDSNYGGKIP|||||*|||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||* ||||||||||R IMDDFMRDPL YILDNNHTHL LLVDNGCHGH PTVEAKLRNQ LEKYISERTS QDSNYGGKIPC IVCFAQGGGR ETLKAINTSI KSKIPCVVVE GSGQIADVIA SLVEVEDVLT SSVVKEKLVR 360|||||||||* |||||||||| |*|||||||| |||||||||| |||||||*|| ||*|||||||H IVCFAQGGGK ETLKAINTSI KNKIPCVVVE GSGQIADVIA SLVEVEDALT SSAVKEKLVR|||||||||| |||||||||* |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||*|||||||M IVCFAQGGGR ETLKAINTSV KSKIPCVVVE GSGQIADVIA SLVEVEDVLT SSMVKEKLVR|||||||||| |||||||||* |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||*|||||||R IVCFAQGGGR ETLKAINTSV KSKIPCVVVE GSGQIADVIA SLVEVEDVLT SSMVKEKLVRC FLPRTVSRLP EEETESWIKW LKEILESSHL LTVIKMEEAG DEIVSNAISY ALYKAFSTNE 420|||||||||| |||||||||| ||||||*||| |||||||||| |||||||||| ||||||||*|H FLPRTVSRLP EEETESWIKW LKEILECSHL LTVIKMEEAG DEIVSNAISY ALYKAFSTSE|||||||||| |||*|||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||M FLPRTVSRLP EEEIESWIKW LKEILESSHL LTVIKMEEAG DEIVSNAISY ALYKAFSTNE|||||||||| |||*|||||| |||||||*|| |||||||||| ||*||*|||| ||||||||||R FLPRTVSRLP EEEIESWIKW LKEILESPHL LTVIKMEEAG DEVVSSAISY ALYKAFSTNEC QDKDNWNGQL KLLLEWNOLD LANEEIFTND RRWGSADLQE VMFTALIKDR PKFVRLFLEN 480|||||||||| |||||||||| |||*|||||| |||*|||||| |||||||||| ||||||||||H QDKDNWNGQL KLLLEWNQLD LANDEIFTND RRWESADLQE VMFTALIKDR PKFVRLFLEN|||||||||| |||||||||| ||**|||||| |||*|||||| |||||||||| ||||||||||M QDKDNWNGQL KLLLEWNQLD LASDEIFTND RRWESADLQE VMFTALIKDR PKFVRLFLEN|||||||||| |||||||||| ||**||||*| |||*|||||| |||||||||| ||||||||||R QDKDNWNGQL KLLLEWNQLD LASDEIFTHD RRWESADLQE VMFTALIKDR PKFVRLFLENC GLNLRKFLTN DVLTELFSNH FSTLVYRNLQ IAKNSYNDAL LTFVWKLVAN FRRGFRKEDR 540|||||||||* |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||
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H RFRQLDTKLN DLKGLLKEIA NKIK||||||*|*| |||*|||||| |*||M RFRQLDSKLN DLKSLLKEIA NNIK||||||||*| |||||||||| |*||R RFRQLDTKLN DLKGLLKEIA NKIK表3
表4
實施例1由狗DRG神經元克隆CMR1A.poly(A+)RNA的分離作為cCMR1克隆中的第一步，使用OligotexTM離心柱(Qiagen Inc.，CA)由100μg犬DRG的總RNA[(由Analytical Biological Service Inc.DE定做)]分離poly(A+)RNA。簡而言之，將150μl無RNA酶的水、250μl緩沖液OBB[20mM Tris，pH7.5，1M NaCl，2mM EDTA和0.2％SDS]和15μl Oligotex珠的懸浮液力加入到100μl總RNA溶液(1μg/μl)中。然后在70℃加熱RNA/Oligotex珠混合物3分鐘，以破壞RNA的任何二級結構，接著于室溫溫育10分鐘。離心poly(A+)RNA/Oligotex顆粒復合物，并用400μl緩沖液OW2[10mM Tris，pH7.5，150mM NaCl和1mM EDTA]漂洗2次，然后轉移至用于洗脫步驟的離心柱。使用200μl預溫熱(70℃)的緩沖液OEB[5mM Tris，pH7.5]由Oligotex珠洗脫poly(A+)RNA。最后，在20μg糖原和150mM乙酸鈉存在下以乙醇沉淀犬DRG poly(A+)RNA，并重懸浮在10μl無RNA酶的水中。
B.雙鏈cDNA的合成混合4μl(1μg)犬DRG poly(A+)RNA和1μl cDNA合成引物(一種具有序列5’-TTCTAGAATTCAGCGGCGC(T)30N-1N-3′(N-1＝G、A或C；N＝G、A、C或T)(Clontech，CA SEQ ID NO10)的52聚寡核苷酸)，并于70℃溫育2分鐘，然后在冰上冷卻2分鐘。在10μl的1mMdNTP混合物和第一鏈合成緩沖液(50mM Tris，pH8.5，8mM MgCl2，30mM KCl和1mM DTT)存在下，使用20單位AMV逆轉錄酶，于42℃進行1小時的第一鏈cDNA合成(逆轉錄)。通過加入80μl的酶混合物(由24單位大腸桿菌DNA聚合酶I、5單位大腸桿菌DNA連接酶I、單位大腸桿菌RNA酶H組成)、0.25mM dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各0.25mM)和第二鏈緩沖液(100mM KCl、10mM硫酸銨、5mM MgCl2、0.15mM β-NAD、20mM Tris pH7.5和50μM/ml牛血清白蛋白)進行cDNA第二鏈的合成。反應首先于16℃進行90分鐘，接著加入20單位T4 DNA聚合酶，以相同的溫度繼續溫育45分鐘。通過加入10mM EDTA和8μg糖原終止反應。進行苯酚和氯仿提取，接著乙醇沉淀。然后將雙鏈cDNA懸浮在200μlTE緩沖液中，并儲存于-20℃。
C.狗CMR1近羧基端的PCR擴增使用兩種稱為cmr1-23(5′-ttcatctgggccattcttcag-3′(SEQ ID NO3)，其與SEQ ID NO 1的核苷酸1761-1781雜交)和cmr1-26(5′-cacagtggcttggactcatt-3′(SEQ ID NO4)，其與SEQ ID NO1的核苷酸2868-2886雜交)的引物，通過PCR成功擴增部分cCMR1序列。在含5μl犬DRG雙鏈cDNA、提供Advantage2 DNA聚合酶的5μl 10X反應緩沖液、200μM dNTP、200nM正向引物cmr1-23、200nM反向引物cmr1-26和1μl 50X AdvantageTM-HF2 DNA聚合酶混合物(Clontech，CA)的50μl終體積中進行PCR反應。通過94℃、1分鐘的初始變性步驟，接著30個循環(a)于94℃變性30秒，(b)于55℃退火30秒，和(c)于72℃延伸60秒，進行PCR。
進行瓊脂糖凝膠電泳，其揭示PCR產物約為1.1kb。在PCR后，純化1.1kb PCR片段，并按照供應商的方法將其亞克隆入pPCRscript(Stratagene)中。揀出2個獨立的克隆，進行DNA測序分析。
序列結果揭示，PCR擴增的片段與小鼠、大鼠和人CMR1近羧基端的同一性分別為83％、84％和87％。
D.cCMR1序列5′和3′末端的RACE-PCR為獲得cCMR1基因的完整5′和3′cDNA序列，進行RACE-PCR技術。首先，用SMARTTMRACE DNA擴增試劑盒(BD Clontech，CA)，按照生產商的說明，分別合成5′-和3′-RACE-Ready cDNA。為制備用于5′RACE的cDNA，在一個0.5ml管中，將A中獲得的3μl狗DRG poly(A+)RNA與1μl 5′-CDS引物和1ml SMART II A寡核苷酸混合。為制備用于3′RACE的cDNA，在另一個0.5ml管中將3μl狗DRG poly(A+)RNA與1μl 3’-CDS引物和1μl無RNA酶的水混合，然后于70℃溫育2分鐘，接著在冰上冷卻2分鐘。接著，將2μl 5X第一鏈緩沖液、1μl 20mM DTT、1μl 10mM dNTP混合物和1μlPowerScript逆轉錄酶加入到各個管中，并于42℃進行90分鐘的合成。通過加入200μl TE緩沖液并于72℃加熱樣品7分鐘終止反應。將反應產物儲存于-20℃。
對于RACE-PCR，基于接近cCMR1 cDNA 5′部分的1.1kb cDNA序列合成兩個引物。3′RACE-PCR的正向引物稱為dcmr1-3，具有以下序列5′-GCCCATCGACAAGCACAAGAAGATC-3′(SEQ ID NO5)，其與SEQ ID NO1(互補鏈)的核苷酸2213-2237雜交；用于5′RACE-PCR的反向引物稱為dcmr1-1，具有以下序列5′-GATCTTCTTGTGCTTGTCGATGGGC-3′(SEQ ID NO6)，其與SEQID NO1的核苷酸2213-2237雜交。在含5μl cDNA模板(如上所述的5′-或3′-RACE-Ready cDNA中的任一種)、5μl 10X反應緩沖液、200μM dNTP、200nM通用引物混合物(UPM)(Clontech)、SEQ ID NO7(5′-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3′)、200nMcCMR1特異性引物(用于5′-RACE PCR的dcmr1-1或用于3′-RACEPCR的dcmr1-3)和1μl 50X AdvantageTM-HF2 DNA聚合酶混合物(Clontech)的50μl終體積中進行5′和3′-RACE PCR兩者。用于RACE-PCR的熱循環儀參數是a)于94℃初始變性2分鐘；b)5個循環94℃、30秒，72℃、3分鐘；c)5個循環94℃、30秒，70℃、30秒，72℃、3分鐘；和d)25個循環94℃、5秒，68℃、30秒，72℃、3分鐘。在反應后，純化、精修RACE-PCR產物，并直接亞克隆入pPCRscript中。由5′-RACE或3′-RACE揀出4個獨立克隆，并進行DNA測序分析。
E.全長cCMR1 cDNA的序列基于通過RACE-PCR獲得的5′和3′末端的序列，通過合成PCR引物，證實全長犬CMR1 cDNA的序列。用正向引物dcmr1-7(其具有以下序列5′-AAGCTTCAT ATG TCC TTC GAG GGG GCC AGGCTC AGC ATG AGG AA-3′(SEQ ID NO8))和反向引物dcmr1-8(其具有以下序列5′-CTCGAG CTA TTT GAT TTT ATT AGC GAT CTCTTT CAG AAG GCCC-3′(SEQ ID NO9))，通過高保真度DNA聚合酶，由在B中制備的犬DRG雙鏈cDNA擴增全長cCMR1 cDNA。在含5μl上述狗DRG雙鏈cDNA、5μl 10x反應緩沖液、200μMdNTP、200nM正向引物dcmr1-7、200nM反向引物dcmr1-8和1μl 50x AdvantageTM-HF2 DNA聚合酶混合物(Clontech，CA)的50μl終體積中進行PCR。PCR反應參數為1個循環于94℃初始變性2分鐘；35個循環a)于94℃變性30秒，b)于70℃退火和延伸5分鐘。在PCR后，純化3.4kb PCR片段，并按照與C相同的克隆方法亞克隆入pPCRscript中。揀出4個獨立的克隆，并進行DNA測序分析。克隆NQC562用于進一步亞克隆和研究。測序結果揭示，cCMR1 cDNA核酸序列(SEQ ID NO1的核苷酸69-3380)與小鼠(登錄號AY095352)、大鼠(登錄號AY072788)和人(登錄號NM_024080)CMR1 cDNA序列的同一性分別為86.2％、86.6％和90.9％。
F.序列分析5′-和3′-RACE-PCR允許測定5′非翻譯區的68個核苷酸的序列；3′-RACE-PCR允許測定3′非翻譯區含37聚poly(A+)尾的431bp。未鑒別出符合讀框的終止密碼子。
預測的cCMR1可讀框由3315bp的序列組成，預測其編碼1104個氨基酸(SEQ ID NO2)的多肽，該多肽具有127.6kDa的理論分子量(參見表1)。初級序列的Kyte-Doolitle親水性分析(未顯示)推測存在8個聚簇在羧基端附近的推定疏水結構域。鑒別出卷曲螺旋結構域位于由殘基1070至末端的非常羧基端的幾率很高，這可能暗示通道寡聚化。此外，用GCG SeqWeb進行初級序列分析揭示，cCMR1含多個N-糖基化位點，分別位于殘基15、256、317、812、934、1050和1072。cCMR1還在殘基92含一個推定PKA(蛋白激酶A)磷酸化位點，在殘基30、228和288含3個酪氨酸磷酸化位點，并含17個PKC(蛋白激酶C)磷酸化位點。
使用Accelrys的Seqweb第2版的Gap程序比對cCMR1氨基酸序列和人(GenBank登錄號NP_076985)、大鼠(GenBank登錄號NP_599198)和小鼠(GenBank登錄號AAM23261)序列，結果揭示分別具有95.1％、94.1％和93.9％同一性。Gap程序使用Needleman和Wunsch(J Mol.Biol.，48443(1970))的算法，以研究兩個完整序列的比對。其使匹配數最大，使空位數最小。
實施例2CMR1的重組表達A.將cCMR1克隆入哺乳動物表達載體中為在哺乳動物細胞系中表達cCMR1，通過進行三向連接，將cCMR1的全長cDNA亞克隆入pcDNA3.1中。首先，用HindIII和NcoI消化全長cCMR1克隆NQC562，產生0.8kb的5′片段。接著，在獨立的限制性反應中，用NcoI和SalI消化NQC562，產生2.5kb的3′片段。純化0.8kb的5′cCMR1片段和2.5kb的3′cCMR1片段，并與用HindIII和SalI預消化的pcDNA3.1連接，產生載體pcDNA3.1-cCMR1。
對于體外翻譯分析，將全長cCMR1 cDNA亞克隆入pAGA4載體(由Promega的pGEM3改進，Sanford 1991和Qin等，1997)中。簡單地說，通過用NdeI和NcoI消化NQC562獲得0.8kb的N端片段，并通過用NcoI和XhoI消化NQC562獲得2.5kb的C端片段。將兩個純化片段與用NdeI和SalI預消化的載體pAGA4連接在一起，產生構建物cCMR1/pAGA4。通過DNA測序檢驗全部最終構建物。
B.cCMR1的體外翻譯用TnTTM T7快速偶合轉錄/翻譯系統(Promega)，按照供應商推薦的方法，進行犬CMR1的體外翻譯。簡單來說，將1μl 0.1μg/μlcCMR1/pAGA4和0.2μl[35S]-甲硫氨酸(1000Ci/mmol，10mCi/ml)加入到9μl TNT Quick Master Mix中。將反應混合物于30℃溫育90分鐘。通過加入等體積的2X SDS/PAGE荷載緩沖液終止反應，然后，對樣品進行4-20％梯度SDS-PAGE分析。在電泳后，用考馬斯藍R250染色凝膠，干燥并對X光膠片曝光。如同由對應核酸序列如實翻譯的氨基酸序列的預測，體外翻譯的cCMR1遷移至約135kDa的分子量。
還通過蛋白質印跡分析體外翻譯的cCMR1蛋白。對5μl體外翻譯的cCMR1蛋白進行4-20％梯度SDS-PAGE。然后將凝膠上的蛋白轉移至硝酸纖維素。接著用5％奶粉的TTBS(0.5％Tween20，100mMTris-HCl和0.9％NaCl，pH＝7.5)溶液于室溫封閉印跡1小時，然后與抗-cCMR1多克隆抗體(1∶500)于4℃溫育過夜。第二天，用100ml TTBS漂洗印跡3次，并與綴合辣根過氧化物酶(Pierce)的山羊抗兔IgG抗體于室溫溫育1小時。用100ml TTBS漂洗印跡3次，按照生產商的說明用ECL-Plus發光試劑(Amersham-Pharamacial Biotech)顯像。
使用GeneJammerTM試劑盒(Stratagene，CA)，按照生產商的方法，將pcDNA3.1-cCMR1構建物轉染入HEK293(人胚胎腎細胞(ATCCCRL-1573))中。通過在G418存在下生長選擇穩定的細胞克隆。分離并純化單個G418抗性克隆。使用鈣內流實驗分析含cCMR1 cDNA的克隆。
實施例3cCMR1的鈣內流功能實驗進行FLIPR實驗，以研究cCMR1通道在細胞群中的特性。
為證實在重組細胞中表達的cCMR1的功能性，將CMR1/HEK293穩定轉染細胞以6.7×105細胞/孔的濃度接種在384孔板中，于37℃溫育過夜。第二天，用緩沖液和鈣染料(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)加載細胞至40μl終體積，并于室溫溫育30分鐘。在加入薄荷醇或Icilin之前和之后，通過FLIPR檢測熒光強度，其中薄荷醇或Icilin分別各以100μM或10μM的濃度加入細胞中。結果示于圖1。
實施例4采用降低的Ca++荷載濃度的CMR1功能實驗CMR1在激動劑(例如薄荷醇或Icilin)以及輕度低溫(15-25℃)作用下開放。因此，在室溫(22-24℃)下CMR1可為活化的，并誘導Ca2+內流。但是，Ca2+內流又誘導Ca2+依賴性失活，導致負反饋調節CMR1。在此情況下，CMR1由室溫活化后將失活，并一直到溫度提高至約25℃以上才被再活化。因此，在正常測試條件(室溫并有含2mM Ca2+的緩沖液)下，某些物種的CMR1，例如大鼠CMR1，對任何激動劑都無反應。為制備其中應使用CMR1于室溫篩選拮抗劑的系統，通過去除染料荷載緩沖液的Ca2+，然后用4mM Ca2+刺激含CMR1的系統，開發Ca2+內流實驗。在此條件下，盡管CMR1有活性(于室溫)，但沒有鈣通過通道進入細胞，未發生失活。在這些實驗條件下，CMR1具有組成型活性，Ca2+一加入到胞外溶液中，CMR1就被激發而允許Ca2+內流。
將用大鼠CMR1轉染的人胚胎腎細胞(HEK293)接種在384孔板中(6.7×105細胞/孔)。第二天，去除培養基，用完全Hank緩沖液漂洗細胞。然后用緩沖液和鈣染料(Mol.Dev.)加載細胞至40μl終體積，并于室溫溫育30分鐘。然后，將板轉移至FLIPR裝置，其中，在0時將要測試其拮抗劑活性的化合物加至4.2μM終濃度。在約10秒的時間將鈣加至4mM終濃度，通過FLIPR檢測熒光強度。代表性的結果示于圖2，其中在0時未加測試化合物。
實施例5用于CMR1通道脫敏劑或失活劑的篩選實驗一般來說，當離子通道長時間接觸活化刺激(例如激動劑)時或在直接脫敏或失活刺激作用下，通道可采取改變的構象，該構象在活化刺激作用下幾乎不能被活化。這些幾乎不能活化或失活的構象在功能上可稱為脫敏或失活的，產生這些狀態的化合物分別稱為脫敏劑或失活劑。此構象可通過這些所謂的脫敏劑或失活劑或在其存在下誘導或穩定，并可通過脫敏劑或失活劑對開放或關閉的通道的優先作用而產生。另外，這種構象在可變的時程和條件內可以是可逆的，或者在重新合成新生通道的過程中是不可逆的。鑒別為可逆或不可逆的脫敏劑或失活劑的化合物可用于治療其中降低CMR1活性有治療作用的某些疾病，例如疼痛病癥。
因此，在另一個實施方案中，本發明提供CMR1活性的可逆和不可逆脫敏劑或失活劑的鑒別方法。第一種方法設計用于鑒別將通道由關閉狀態誘導和/或穩定在脫敏或失活狀態的化合物，其包括以下步驟(a)提供含cCMR1蛋白編碼核酸的重組細胞，(b)使重組細胞于活化閾值以上的溫度(通常約28℃以上)和測試化合物接觸不同的時間長度，(c)徹底洗除測試化合物，和(d)于變化的時間點測定測試化合物在隨后接觸CMR1活化刺激的作用下降低CMR1活性的程度。第二種方法設計用于鑒別將通道由開啟狀態誘導和/或穩定在脫敏或失活狀態的化合物，其或者包括以下步驟(a)提供含cCMR1蛋白編碼核酸的重組細胞，(b)使重組細胞于活化閾值以上的溫度(通常約28℃以上)和CMR1激動劑接觸，(c)使重組細胞與測試化合物接觸不同的時間長度，(d)徹底洗除測試化合物和激動劑，和(e)于變化的時間點測定測試化合物在隨后接觸CMR1活化刺激的作用下降低CMR1活性的程度，或者該方法包括以下步驟(a)提供含cCMR1蛋白編碼核酸的重組細胞，(b)于活化閾值以下的溫度(通常約28℃以下)溫育重組細胞，(c)使重組細胞與測試化合物接觸不同的時間長度，(d)徹底洗除測試化合物，和(e)于變化的時間點測定測試化合物在隨后接觸CMR1活化刺激的作用下降低CMR1活性的程度。
實施例6芥子油活化cCMR1芥子油是一種在施加于皮膚時激發疼痛和炎癥的天然產物。近來，已提議TRP家族的新成員TRPA1為芥子油刺激性作用的細胞和分子靶之一(Jordt等2004，Nature，427260-265)。我們證明，芥子油也活化cCMR1。
以6.7×105細u胞/孔的濃度將cCMR1穩定轉染的HEK293細胞接種在384孔板中，并于37℃/5％CO2溫育過夜。第二天，用鈣染料荷載細胞，并于室溫溫育30分鐘。在給予細胞化合物之前和之后，通過FLIPR檢測鈣介導的熒光強度。如圖3所示，cCMR1不僅對冷感化合物(例如100nM Icilin(實線))敏感，而且被刺激性化合物1mM芥子油(虛線)活化。
實施例7全細胞膜片鉗研究進行膜片鉗實驗，以研究在單個細胞中表達的cCMR1通道的特性。
將用犬cCMR1穩定轉染的HEK293細胞在補加10％胎牛血清、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和1mg/ml G418的DMEM中培養。細胞保持在37℃和5％CO2中。
除非另有說明，否則用于記錄的標準胞外溶液含(單位為mM)NaCl，132；EGTA，1；KCl，5.4；MgCl2，0.8；HEPES，10；葡萄糖，10；pH＝7.4。在其中胞外溶液含Ca2+的實驗中，根據使用的Ca2+濃度，使用的胞外溶液是以下的一種(單位為mM)(1)NaCl，132；CaCl2，0.1或1.8；KCl，5.4；MgCl2，0.8；HEPES，10；葡萄糖，10；pH＝7.4；(2)NaCl，116；CaCl2，10；KCl，5.4；MgCl2，0.8；HEPES，10；葡萄糖，10；pH＝7.4。用于填充記錄電極的胞內溶液包含(單位為mM)CsCl，145；EGTA，5；HEPES，10；葡萄糖，5；pH＝7.4。
在以適于單細胞記錄的密度將細胞接種在玻璃蓋玻片上之后1-2天，使用常規全細胞膜片鉗技術進行記錄。通過膜片鉗放大器放大電流，并以2kHz濾波(Axopatch 200B，Axon Instruments)。通過重力給予式灌注系統以0.5ml/分鐘將薄荷醇(100μM)或Icilin(1μM)施加于細胞。于22℃進行與激動劑刺激相關的記錄。
在其中溫度變化的實驗中，在通過雙極溫控器(型號CL-100，Warner Instruments)控制的雙重線內加熱器/冷卻器(型號SC-20，Warner Instruments，Hamden，CT)中，通過加熱/冷卻灌注液，產生溫度斜坡。用連接監測溫度計(型號TH-8，Physitemp，Clifton，NJ)的定制小型熱-微探針檢測記錄細胞附近的溫度，并使用Digidata 1322A和pClamp 9.0(Axon Instruments，Union City，CA)采樣，以全細胞膜片鉗模式檢測并發的電流。在這些研究中使用兩個電壓方案。第一個方案包括由-100mV至+60mV的600ms電壓斜坡，采樣速率10kHz。這種電壓脈沖每5秒重復1次。在電壓脈沖之間細胞保持在-100mV。在第二個方案中，細胞保持在-80mV，在此保持電位對電流持續采樣(以100Hz)。
圖4表明，cCMR1強外向整流，對陽離子是非選擇性的。使用上述電壓斜坡方案對cCMR1進行全細胞膜片鉗記錄。當應用冷卻劑100μM薄荷醇時，超極化和去極化膜電位的全細胞電流幅度(實線)比對照(虛線)大幅增加。去極化電位的這種增加遠比超極化電位顯著。因此，通道強外向整流。另外薄荷醇活化電流具有接近0mV的逆轉電位，表明通道的相對非選擇性(至少對實驗中使用的陽離子)特性。由另一種冷卻劑Icilin也已獲得性質上相似的結果。
cCMR1的溫度敏感性示于圖5。由于降低了cCMR1表達細胞灌注溶液的溫度，所以在+60mV通過細胞的電流顯著增加，活化閾值約為17℃。cCMR1通道在室溫不開放，但在17℃以下的低溫被活化。
圖6表明，胞外Ca2+脫敏cCMR1通道。在沒有胞外Ca2+(-80mV；灰色軌跡)時，100μM薄荷醇活化非脫敏電流。相反，在其它記錄條件相同的情況下，在1.8mM胞外Ca2+存在下脫敏易于發生(黑色軌跡；對無Ca2+軌跡歸一化以顯示清晰性)。
當通道被薄荷醇(例如1mM)活化時，胞外Ca2+降低了cCMR1的電流幅度。胞外Ca2+的這種明顯抑制是濃度依賴性的(圖7)。胞外Ca2+濃度越高，電流幅度的抑制越強。圖7中的虛線是代表對數據最佳擬合的邏輯函數。由最佳擬合分析獲得1.6mM胞外Ca2+的IC50值。另外，胞外Ca2+的明顯抑制是電壓依賴性的(圖8)。胞外Ca2+(10mM)在超極化電位強烈抑制電流幅度。此抑制在更去極化的電位降低。
權利要求
1.一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含的核苷酸序列編碼能夠檢測和轉導冷刺激并與SEQ ID NO2具有至少96％序列同一性的多肽。
2.權利要求1的分離核酸分子，所述核酸分子編碼與SEQ ID NO2具有至少98％序列同一性的多肽。
3.權利要求1的分離核酸分子，所述核酸分子編碼SEQ ID NO2的多肽。
4.權利要求1的分離核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO1的核苷酸69至3380。
5.一種表達載體，所述載體包含權利要求1的分離核酸序列。
6.一種重組宿主細胞，所述細胞包含權利要求1的分離核酸序列。
7.一種基本純化的多肽，所述多肽能夠檢測和轉導冷刺激，并與SEQ ID NO2具有至少96％的序列同一性。
8.權利要求7的基本純化的多肽，所述多肽與SEQ ID NO2具有至少98％的序列同一性。
9.權利要求7的基本純化的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO2。
10.一種表達權利要求7的多肽的方法，所述方法包括以下步驟(a)將能夠編碼權利要求7的多肽的表達載體導入細胞中；和(b)在允許表達載體表達多肽的條件下培養細胞。
11.一種核酸探針，所述探針在嚴格雜交條件下與權利要求1的核酸分子選擇性雜交。
12.一種抗體，所述抗體選擇性結合權利要求7的多肽。
13.一種試劑盒，所述試劑盒包含權利要求11的核酸探針。
14.一種試劑盒，所述試劑盒包含權利要求12的抗體。
15.一種檢測權利要求1的核酸分子的方法，所述方法包括使所述核酸分子與權利要求11的核酸探針接觸的步驟。
16.一種檢測權利要求7的多肽的方法，所述方法包括使所述多肽與權利要求12的抗體接觸的步驟。
17.一種鑒別增加或降低cCMR1蛋白表達的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)使測試化合物與含cCMR1基因表達調節機制的細胞接觸；和(b)測定測試化合物是否增加或降低由細胞的所述機制控制的基因表達。
18.權利要求17的方法，其中其表達受所述機制控制的基因為報告基因。
19.權利要求17的方法，其中其表達受所述機制控制的基因為cCMR1基因。
20.一種鑒別增加或降低cCMR1離子通道電導率的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)使測試化合物與cCMR1離子通道接觸；和(b)測定測試化合物是否增加或降低所述離子通道的電導率。
21.權利要求20的方法，其中cCMR1離子通道包含具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽。
22.權利要求20的方法，其中cCMR1離子通道與宿主細胞結合。
23.權利要求22的方法，其中宿主細胞為cCMR1離子通道的重組宿主細胞。
24.權利要求22的方法，其中宿主細胞為cCMR1離子通道的內源宿主細胞。
25.權利要求20的方法，其中cCMR1與分離的膜制備物結合。
26.權利要求20的方法，其中步驟(b)包括測定胞內鈣水平的量。
27.權利要求20的方法，所述方法進一步包括在使測試化合物和離子通道接觸的步驟之前增加離子通道電導率的步驟。
28.權利要求27的方法，其中增加離子通道電導率的步驟包括在含能夠增加通道電導率的化合物的緩沖溶液中溫育離子通道。
29.權利要求28的方法，其中能夠增加通道電導率的化合物選自薄荷醇、Icilin和芥子油。
30.權利要求27的方法，其中增加離子通道電導率的步驟包括在cCMR1通道活化溫度溫育離子通道。
31.權利要求30的方法，其中cCMR1通道活化溫度在4-17℃的范圍內。
32.權利要求27的方法，其中增加離子通道電導率的步驟包括去極化離子通道。
33.權利要求20的方法，所述方法進一步包括在使測試化合物和離子通道接觸的步驟之前降低離子通道電導率的步驟。
34.權利要求33的方法，其中降低離子通道電導率的步驟包括在含能夠降低通道電導率的化合物的緩沖溶液中溫育離子通道。
35.權利要求33的方法，其中降低離子通道電導率的步驟包括在cCMR1通道非活化溫度溫育離子通道。
36.權利要求35的方法，其中cCMR1通道非活化溫度為室溫。
37.權利要求33的方法，其中降低離子通道電導率的步驟包括在所含胞外Ca2+濃度足以降低通道電導率的緩沖溶液中溫育離子通道。
38.權利要求33的方法，其中降低離子通道電導率的步驟包括超極化離子通道。
39.一種鑒別增加或降低哺乳動物CMR1離子通道電導率的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)將離子通道在含亞失活量鈣的緩沖溶液中溫育；(b)活化離子通道；(c)使離子通道與測試化合物接觸；(d)增加緩沖溶液中的鈣量；和(e)測定測試化合物是否增加或降低離子通道的電導率。
40.權利要求39的方法，其中活化離子通道的步驟包括在含增加通道電導率的化合物的緩沖溶液中溫育離子通道。
41.權利要求39的方法，其中活化離子通道的步驟包括在哺乳動物CMR1通道活化溫度溫育離子通道。
42.權利要求39的方法，其中活化離子通道的步驟包括去極化離子通道。
43.權利要求39的方法，其中哺乳動物CMR1蛋白為人、大鼠、小鼠或犬來源。
44.權利要求39的方法，其中測定測試化合物是否增加或降低離子通道電導率的步驟包括檢測胞內鈣的量。
45.權利要求44的方法，其中胞內鈣的量使用FLIPR實驗測定。
46.權利要求39的方法，其中測定測試化合物是否增加或降低離子通道電導率的步驟包括測定由離子通道傳導的電流。
47.權利要求46的方法，其中使用膜片鉗技術測定由離子通道傳導的電流。
48.一種鑒別用于治療疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)使測試化合物與由cCMR1組成的離子通道接觸；和(b)測定測試化合物是否增加或降低離子通道的電導率。
49.權利要求48的方法，所述方法進一步包括以下步驟(a)給予動物測試化合物；和(b)測定測試化合物改變動物的傷害感受/傷害防御反應的程度。
全文摘要
本發明提供核酸和多肽序列，其描述了本文稱為犬CMR1 (cCMR1)的新型犬的冷和薄荷醇敏感受體。本發明的分離核酸或多肽分子可用于檢測實驗和篩選實驗。
文檔編號C12Q1/68GK1964988SQ200580018118
公開日2007年5月16日 申請日期2005年4月6日 優先權日2004年4月8日
發明者C·M·弗羅雷斯, Y·劉, M·L·魯賓, N·秦 申請人:詹森藥業有限公司