遺傳工程豬流感病毒及其應用的制作方法

專利名稱：遺傳工程豬流感病毒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明要求于2004年6月1日提交的美國臨時申請第60/576,418號的權益，本發明將其引入作為參考。
1.發明領域本發明一般性地涉及拮抗細胞干擾素(IFN)反應的能力受損的減毒豬流感病毒，以及這種減毒病毒在疫苗和藥物制劑中的用途。本發明特別涉及豬NS1基因被修飾以減弱或消除NS1基因產物對細胞IFN反應的拮抗能力的減毒豬流感病毒。這些病毒在體內復制，但表現出降低的毒力和增強的減毒性，因此適合用于活病毒疫苗和藥物制劑。
2.背景技術2.1流感病毒含包被的反義基因組單鏈RNA的病毒家族可分為具有非分段基因組的組群(副粘病毒科、棒狀病毒科、纖狀病毒科(Filoviridae)和博爾納病病毒(BornaDisease病毒))，或者具有分段基因組的其它組群(正粘病毒科、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)和沙粒樣病毒科(Arenaviridae))。以下詳述并用在本發明實施例之中的正粘病毒科家族包括流感病毒A型、B型和C型，以及索戈托(Thogoto)病毒、多理病毒(Dhori)病毒和傳染性鮭魚貧血病毒。
流感病毒體由內部的含單鏈RNA基因組的核糖核蛋白核心(螺旋形核殼體)和外部的被基質蛋白(M1)內聯的脂蛋白包膜組成。流感病毒A型的分段基因組由8種(C型流感為7種)線形、負極性、單鏈RNA分子組成，單鏈RNA編碼7種多肽，包括RNA依賴性RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和形成核殼體的核蛋白(NP)；基質膜蛋白(M1、M2)；從含脂質的包膜伸出的兩種表面糖蛋白血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)；非結構蛋白(NS1)、核輸出蛋白(NEP)；以及促凋亡因子PB1-F2。基因組的轉錄和復制在核內進行，通過在質膜上出芽裝配。在混合感染中這些病毒可以發生基因重排。
流感病毒通過HA吸附在細胞膜糖蛋白和糖脂的唾(液)酸寡糖上。病毒體內吞后，在細胞內涵體中發生HA分子的構象變化，該內涵體促進膜的融合，由此引發脫殼。核殼體移至核，在核中病毒mRNA被轉錄。病毒mRNA通過獨特的機制來轉錄，其中病毒核酸內切酶從細胞異源mRNA中剪切5′帽狀末端，該帽狀末端隨后作為引物通過病毒轉錄酶轉錄病毒RNA模板。轉錄產物在距離其模板末端15-22堿基處終止，在那里寡(U)序列作為添加多poly(A)結構的信號。在這樣產生的8種病毒RNA分子中，6種為單順反子信使，它們被直接翻譯成代表HA、NA、NP和病毒聚合酶蛋白、PB2、PB1和PA的蛋白質。其它的兩種轉錄子進行剪接，每種產生兩種mRNA，這些mRNA在不同的閱讀框內被翻譯產生M1、M2、NS1和NEP。通過使用可供選擇地ATG，該PB1片段編碼第二種蛋白質非結構性PB1-F2蛋白。換言之，所述8種病毒RNA片段編碼11種蛋白9種結構性蛋白和兩種非結構性蛋白。流感病毒基因和其蛋白產物的總結如下表I所示。
表I流感病毒基因組RNA片段及其編碼分配a
a改寫自R.A.Lamb and P.W.Choppin(1983)，Annual Review of Biochemistry，Volume 52，467-506.
b對于A/PR/8/34株c由生物化學和遺傳方法確定d由核酸序列分析和蛋白測序確定流感病毒的病原性由多重病毒和宿主因素來調節。在對抗病毒感染的宿主因素中，I型干擾素(IFNα/β)系統是有力的抗病毒先天防御機制的代表，其在真核有機體的進化中相對較早地建立(Garcia-Sastre，2002，Microbes Infect 4647-55)。該抗病毒IFNα/β系統涉及三個主要步驟(i)檢測病毒感染和分泌IFNα/β，(ii)IFNα/β與其受體結合并誘導轉錄IFNα/β刺激性基因，及(iii)合成抗病毒酶和蛋白。然而，大多數病毒已經獲得編碼IFNα/β拮抗分子的特異性遺傳信息，其有效地阻斷IFNα/β抗病毒系統的一個或多個步驟。A型流感病毒在感染的細胞中表達非結構性蛋白NS1蛋白(如下文詳述)，該蛋白對抗細胞的IFNα/β反應(Garcia-Sastre等，1998，Virology 252324-30)。
A型流感病毒基因組含有8種負極性單鏈RNA片段，編碼兩種非結構性蛋白質和9種結構性蛋白質。非結構性蛋白NS1富含在被流感病毒感染的細胞中，但在病毒體中沒有檢測到。NS1是在感染早期出現在核中在病毒周期晚期出現在胞漿中的磷酸蛋白(King等，1975，Virology 64378)。對攜帶損傷的NS基因的溫度敏感性(ts)流感病毒突變株的研究表明，NS1蛋白為轉錄和轉錄后調節因子機制，通過該機制病毒可抑制宿主細胞的基因表達和刺激病毒蛋白合成。如同許多其它調節轉錄后過程的蛋白，NS1蛋白與特定的RNA序列和結構相互作用。已報道，NS1蛋白結合不同種類的RNA，包括vRNA、poly-A、U6 snRNA、病毒mRNA的5′未翻譯區域和ds RNA(Qiu等，1995，RNA 1304；Qiu等，1994，J.Virol.682425；Hatada Fukuda 1992，J Gen Virol.733325-9)。在轉染細胞中從cDNA表達NS1蛋白與幾種作用相關抑制mRNA的核-胞漿轉運、抑制前mRNA剪接、抑制宿主mRNA聚腺苷酸化、和刺激病毒mRNA的翻譯(Fortes，等，1994，EMBO J.13704；Enami等，1994，J.Virol.681432；de Ia Luna等，1995，J.Virol.692427；Lu等，1994，Genes Dev.81817；Park等，1995，J.Biol Chem.270，28433；Nemeroff等，1998，Mol.Cell.11991；Chen等，1994，EMBO J.182273-83)。特別是，NS1蛋白具有三個結構域，已報道這些結構域在流感病毒感染中具有一些調節功能。氨基末端的73個氨基酸負責與RNA結合(Qian等，1995，RNA 1948-956)，特別是與雙鏈RNA結合，賦予病毒逃逸干擾素α/β反應的能力(Donelan等，2003，J.Virol.7713257-66)。該蛋白的中央部分與真核細胞的翻譯起始因子4GI互相作用，促進病毒mRNA相對于宿主mRNA優先翻譯(Aragon等，2000，Mol.Cell Biol.206259-6268)。已經證明羧基末端或效應子結構域抑制宿主mRNA的加工，具體地抑制宿主mRNA聚腺苷酸化(Nemeroff等，1998，Mol.Cell 1991-1000)、與mRNA的poly(A)尾結合抑制核輸出(Qiu and Krug，1994，J.Virol.682425-2432)和抑制前mRNA的剪接(Lu等，1994，Genes Dev.81817-1828)。
對缺乏NS1基因的人重組流感病毒(ddNS1)的研究表明該病毒只能在例如STAT1-/-小鼠或Vero細胞的IFN缺陷系統中復制；因此NS1蛋白負責拮抗IFN活性(Garcia-Sastre等，1998，Virology 252324-330)。還表明，NS1蛋白敲除的人流感病毒對小鼠是減毒的(Egorov等，1998，J.Virol.726437-6441)，并且該病毒提供對抗野生型病毒的保護(Talon等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 974309-4314)。
2.2豬流感病毒豬流感(SI)是由A型流感病毒引起的豬急性呼吸疾病。其嚴重性依賴多種因素，包括宿主年齡、病毒株和二次感染(Easterday，1980，Philos Trans R Soc Lond BBiol Sci 288433-7)。A型流感病毒是分段負鏈RNA病毒，并可以從許多其它種類宿主中分離，包括鳥、人、馬、鯨魚和貂。盡管完整的流感病毒很少能跨越種屬障礙，但基因片段可以通過基因重組或基因漂移過程來跨越此障礙。由于豬支持人和鳥的A型流感病毒復制(Kida等，1994，J Gen Virol 752183-8)，因而推定豬作為“混合容器”使得對不同宿主特異的病毒種類之間發生重組從而在種間傳播中發揮重要作用(Scholtissek，1994，Eur J Epidemiol 10455-8)。這可以導致產生能夠跨越種屬障礙傳染人類的新流感病毒。目前有三種SI病毒(SIV)亞型在美國的豬中循環H1N1、H3N2和H1N2(Olsen，2002，Virus Res 85199-210；Karasin等，2002，J Clin Microbiol 401073-9；Karasin等，2000，Virus Res 6871-85；Olsen等，2000，Arch Virol 1451399-419；Webby等，2000，J Virol 748243-51；Webby等，2001，Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 3561817-28；Zhou，2000，Vet Microbiol 7447-58)。1998年之前，主要的“傳統”H1N1 SIV分離自美國的豬(Kida等，1994，J GenVirol 752183-8；Scholtissek，1994，Eur J Epidemiol 10455-8；Olsen等，2000，ArchVirol.1451399-419)。在1998年，SIV的H3N2亞型在美國的多個州被分離。這些病毒由人、鳥和傳統的豬病毒之間重組產生，它們進化迅速并引起比傳統H1N1 SIV更嚴重的疾病。
流感病毒的病原性由多重病毒和宿主因素來調節。在對抗病毒感染的宿主因素中，I型干擾素(IFNα/β)系統是有力的抗病毒先天防御機制的代表，其在真核有機體的進化中相對較早地建立(Garcia-Sastre，2002，Microbes Infect 4647-55)。抗病毒IFNα/β系統涉及三個主要步驟(i)檢測病毒感染的和分泌IFNα/β，(ii)IFNα/β與其受體的結合并誘導轉錄IFNα/β刺激性基因，及(iii)合成抗病毒酶和蛋白。然而，大多數病毒已經獲得編碼IFNα/β拮抗分子的特異性遺傳信息，其有效地阻斷IFNα/β抗病毒系統的一個或多個步驟。A型流感病毒在感染的細胞中表達非結構性蛋白NS1蛋白，該蛋白對抗細胞的IFNα/β反應(Garcia-Sastre等，1998，Virology 252324-30)。
1918年首次報道豬的流感感染并在1930年首次從豬中分離豬流感病毒(Shope，R.E.，1931，J Exp.Med.54373-385)。這些首次分離物是豬A型流感病毒H1N1系的祖先。從1930年至二十世紀九十年代，北美豬的流感幾乎無例外地由H1N1豬病毒的感染引起。豬流感模式的顯著變化發生在1997年左右，當時檢測到未預料到的和實質性增加的H3血清陽性(8％)，并在美國和加拿大從豬中開始分離到了H3N2病毒(Olsen等，2000，Arch.Virol.1341399-1419)。此外，在H3N2病毒和H1N1豬病毒之間的重組導致第二代H1N2重組病毒的檢出(Karasin等，2000，J Clin.Microbiol.382453-2456；Karasin等，2002，J.Clin Microbiol.401073-1079)。此外，從加拿大的豬中分離到了鴨來源的鳥H4N6病毒(Karasin等，2000，J.Virol.749322-9327)。除了所述H1N1豬流感病毒的抗原漂移變體，這些新病毒的產生可引起潛在的獸醫和人類公共健康問題。
在1998年，豬對其幾乎沒有免疫性的新豬流感病毒株使得實驗中的2400頭動物致病。盡管自從1930年僅有一種流感亞型使北美的豬致病，但最近幾年里，新流感病毒的快速演變感染了北美的1億頭豬。穩定數年后，北美的豬流感病毒進入進化的快速軌道，每年都產生變體。這不僅對畜牧業產生不好的影響和引起負面經濟效應，而且專家們擔心這種進化中的豬流感病毒增加了產生在人中傳播的新病毒的可能性。幸運的是，這些在北美出現的新豬病毒株至今顯示不容易感染人。
2.3減毒病毒通過“殺滅”病毒病原性來制備失活的病毒疫苗，例如通過加熱和福爾馬林處理，從而使其不能復制。因失活的疫苗不能提供長期持久的免疫，其使用受到限制，因此僅提供有限的保護。制備病毒疫苗的另外可選擇性途徑涉及使用減毒的活病毒疫苗。減毒病毒能夠復制但沒有致病性，因而提供更長而持久的免疫并產生較強的保護。然而，制備減毒病毒的傳統方法涉及宿主范圍內突變株的機會性分離，這些突變株多數是溫度敏感的；例如，通過非天然宿主對病毒進行傳代，并且選擇有免疫原性而不致病的子代病毒。
用于分離和培養以用作疫苗免疫為目的的流感病毒的常規培養基是雞胚蛋。流感病毒通常于37℃在10-12天齡的胚中生長2-4天。盡管大多數A和B型流感病毒的人原始分離物在胚的羊膜囊生長更好，但2-3代后，病毒變得適應生長在尿囊腔中，該腔可以從雞蛋外部進入(Murphy，B.R.，和R.G.Webster，1996.Orthomyxo Viruses pp.1397-1445.In Fields Virology.Lippincott-Raven P.A.)。
理論上，重組DNA技術和遺傳工程技術應該能提供制備減毒病毒的更好方法，因為可有意將特定的突變工程化到病毒基因組中。然而，病毒減毒所需的基因改變是未知或不能夠預測的。通常，多數利用重組DNA技術來工程化病毒疫苗來制備亞單位疫苗，這種亞單位疫苗僅含有在重組病毒載體(例如在牛痘病毒或桿狀病毒(baculovirus))中表達的參與免疫應答的病原體蛋白質亞單位。最近，重組DNA技術已經用于嘗試制備皰疹病毒缺失突變株或脊髓灰質炎病毒，其模擬天然發現的或已知宿主范圍突變株的減毒病毒。直至1990年，負鏈RNA病毒還不能進行位點特異性操作，因而不能被遺傳工程化。
盡管這些病毒只具有免疫原性而沒有致病性從而是有益的，但它們難以在用于制備疫苗的傳統培養基中繁殖。此外，減毒病毒可能具有過于緩和的毒力特性，以至于不能使宿主產生足以應對后續感染的免疫反應。
由于結合病毒的受體不同，人流感病毒不能在鳥中有效復制，反之亦然。相反，豬對人和鳥病毒的感染格外敏感，因為豬具有在人和鳥流感病毒中都存在的受體型。因而，推測豬是人鳥病毒重組體的“混合容器”宿主，并且有幾個研究支持此理論。參見例如，Shu等，1994，Virology 202825-33；Scholtissek，1990，Med.Principles Pract.265-71；Zhou等，1999 J Virol.738851-6。這種混合有利于新的人流感病毒株的產生，引發流感全面流行。
失活或“殺滅”流感病毒制劑是目前在美國批準的僅有的流感疫苗。將病毒疫苗替代病毒病原體被“殺滅”的失活病毒疫苗的可選擇的途徑涉及利用能夠復制但不致病的減毒活病毒疫苗。鼻內給藥的活疫苗相對其失活的對應疫苗具有優越性。首先，現在認為活疫苗可改善交叉反應性細胞介導的細胞毒作用以及體液抗體反應，提供比失活疫苗更好的保護(Gorse and Belshe，1990，J.Clin.Microbiol.282539-2550；和Gorse等，1995，J.Infect.Dis.1721-10)。其次，活疫苗具有鼻內給藥的優越性，避免了肌肉內注射失活佐劑疫苗偶爾引起的腫脹和肌肉疼痛。這些活疫苗被報道不僅能夠誘導抗同型流感病毒的體液反應而且能夠誘導交叉反應性細胞介導的細胞毒作用。活疫苗的其它優越性包括易于鼻內給藥、誘導粘膜免疫、更長的持久性免疫和成本效率。這些是潛在的豬流感疫苗的重要考慮因素。
因此，亟需由此技術產生用于預防豬流感病毒感染的新的更有效的疫苗和免疫原性制劑。
3.發明概述本發明提供拮抗細胞干擾素(IFN)反應的能力受損的減毒豬流感病毒、制備這種減毒豬流感病毒的方法、以及這種病毒在疫苗和藥物制劑中的應用。這種疫苗能夠產生免疫反應并形成免疫性，但不致病或很少引起和/或較少引起嚴重癥狀，即該病毒具有降低的毒力。因此它們是活疫苗理想的候選。而且，該減毒病毒可誘導具有其它體內生物學后果的有力的IFN反應，提供對抗后續感染性疾病的保護和/或誘導抗腫瘤反應。因此，該減毒病毒可以在藥物中使用來預防和治療其它感染性疾病和/或IFN可治療性疾病。
本發明部分基于申請人的發現，即經工程化在NS1基因中含有或包含缺失的豬流感病毒相對于野生型豬流感病毒具有減弱的復制性，如被感染的豬肺病灶較少、在支氣管肺泡灌洗液(BALF)中病毒滴度降低、鼻擦拭簽檢測的病毒減少。驚奇的是，與小鼠模型中觀察到的人流感病毒的結果相反，NS1蛋白的長度不與豬流感病毒的減毒性相關。申請人發現，對于豬流感病毒，具有最短NS1蛋白的突變株病毒減毒是最少的。換言之，與含有較長缺失的NS1基因的豬流感病毒或野生型豬流感病毒比較，含較短缺失的NS1基因的豬流感病毒表現較高的體內減毒。申請人進一步發現重組豬流感病毒體外抑制IFN產生的能力受損，并且它們在10天的含胚雞蛋、MDCK細胞、PK-15細胞或豬體內模型中不象其親代重組株一樣有效地復制。不意欲受任何豬流感病毒NS1缺失突變株的體內作用機制的理論或結實的限制，推測是由NS1蛋白的表達水平、誘導有力的細胞IFN反應的能力和拮抗這種反應的能力受損引起這種病毒減毒特征。然而，這種病毒的有益特征并不能全歸因于其對細胞干擾素反應的作用。事實上，其它與NS1相關的活性改變，例如，改變前mRNA剪接，對mRNA聚腺苷酸化、含poly(A)mRNA的核-胞漿轉運、和刺激病毒蛋白合成的抑制，都可能有助于通過在豬流感病毒NS1基因中誘導突變來實現所需的減毒表型。
本發明的減毒豬流感病毒包括豬流感病毒NS1基因的突變，該突變減弱NS1基因產物拮抗細胞干擾素反應的能力。在一個實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包括含有豬流感病毒NS1基因突變的基因組，該突變減弱NS1基因產物拮抗細胞干擾素反應的能力，并且允許該減毒病毒以感染復數(MOI)為0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之間，或者MOI為0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在細胞(例如，人細胞(例如，PerC6，來自被腺病毒5的E1區轉化的人胚胎視網膜母細胞的產病毒細胞株)、小鼠細胞、雞細胞(例如，雞胚胎成纖維細胞)、大鼠細胞、鳥細胞或豬細胞(例如，PK(D1)、PK(15)細胞、PK13細胞、NSK細胞、LLC-PK1細胞、LLC-PK1A細胞、ESK-4細胞、ST細胞、PT-K75細胞、PK-2a/CL13或SJPL細胞))中生長到滴度比野生型豬流感病毒低約1至約100倍、約5至約80倍、約20至約80倍或約40至約80倍、約1至約10倍、約1至約5倍、約1至約4倍、約1至約3倍、約1至約2倍、約3至約15倍，或者約1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，這可以在相同增殖條件下，在感染后約2至10天、3至7天、3至5天、或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天測定。減毒的和野生型豬流感病毒的滴度可利用本領域公知和本發明所述的任何技術來測定(例如，血細胞凝集試驗、空斑試驗、組織培養感染劑量50(TCID50)、蛋感染劑量50(EID50)等)，病毒可在本發明所述或本領域公知的條件下增殖(例如，在豬細胞、MDCK細胞(例如，在MEM、10％v/v胎牛血清(FCS)、1％青霉素/鏈霉素中，在37℃、5％CO2的濕化培養箱中)或在含胚胎的雞蛋中(例如，在靜止培養箱中，在37℃、55％相對濕度下))。可供選擇地，可在無血清或低血清含量(例如，TPCK胰蛋白酶)培養基生長的細胞(例如，豬細胞、MDCK細胞等)中增殖病毒。
在具體實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包括包含豬流感病毒NS1基因突變的基因組，該突變減弱了NS1基因產物拮抗細胞干擾素反應的能力，并且允許該減毒病毒以感染復數(MOI)為0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之間，或者MOI為0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在細胞(例如，人細胞(例如，PerC6，來自被腺病毒5的E1區轉化的人胚胎視網膜母細胞的產病毒細胞株)、小鼠細胞、雞細胞(例如，雞胚胎成纖維細胞)、大鼠細胞、鳥細胞或豬細胞(例如，PK(D1)、PK(15)細胞、PK13細胞、NSK細胞、LLC-PK1細胞、LLC-PK1A細胞、ESK-4細胞、ST細胞、PT-K75細胞、PK-2a/CL 13或SJPL細胞))中生長到滴度比野生型豬流感病毒低約1至約100倍、約5至約80倍、約20至約80倍或約40至約80倍、約1至約10倍、約1至約5倍、約1至約4倍、約1至約3倍、約1至約2倍、約3至約15倍，或者約1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，這可以在相同增殖條件下，在感染后約2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天測定。減毒的和野生型豬流感病毒的滴度可利用本領域公知和本發明所述的任何技術來測定(例如，血細胞凝集試驗、空斑試驗等)，病毒可在本發明所述或本領域公知的條件下增殖(例如，在豬細胞、MDCK細胞(例如，在MEM、10％v/v胎牛血清(FCS)、1％青霉素/鏈霉素中，在37℃、5％CO2的濕化培養箱中)或在含胚胎的雞蛋中(例如，在靜止培養箱中，在37℃、55％相對濕度下))。
用于本發明的豬流感病毒可選自具有所需表型(即拮抗細胞IFN反應的能力受損)的天然發生株、變體或突變株；誘導突變的病毒(例如，通過暴露在誘變劑下產生的病毒，反復傳代和/或在非許可宿主中傳代)；重組體；和/或遺傳工程化病毒(例如，利用“反向遺傳學”和基于質粒的無輔助(helper-free)技術)。具有所需干擾素拮抗表型的天然發生株、變體和突變株、重組體和/或遺傳工程化的病毒可以根據在下文所述的其它試驗的細胞(例如，人細胞(例如，PerC6，來自腺病毒5的E1區轉化的人胚胎視網膜母細胞的產病毒細胞株)、小鼠細胞、雞細胞(例如，雞胚胎成纖維細胞)、大鼠細胞、鳥細胞或豬細胞(例如，PK(D1)、PK(15)細胞、PK13細胞、NSK細胞、LLC-PK1細胞、LLC-PK1A細胞、ESK-4細胞、ST細胞、PT-K75細胞、PK-2a/CL 13或SJPL細胞))中的差別生長來選擇。在某些實施方案中，本發明的豬流感病毒為遺傳工程化病毒。在其它的實施方案中，本發明的豬流感病毒是非天然發生株、變體和突變株和/或重組體。
在具體實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包括含豬流感NS1基因突變的基因組，該突變減弱NS1基因產物拮抗細胞干擾素反應的能力，并且允許該減毒病毒以感染復數(MOI)為0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之間，或者MOI為0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在細胞(例如，人細胞(例如，PerC6，來自被腺病毒5的E1區轉化的人胚胎視網膜母細胞的產病毒細胞株)、小鼠細胞、雞細胞(例如，雞胚胎成纖維細胞)、大鼠細胞、鳥細胞或豬細胞(例如，PK(D1)、PK(15)細胞、PK13細胞、NSK細胞、LLC-PK1細胞、LLC-PK1A細胞、ESK-4細胞、ST細胞、PT-K75細胞、PK-2a/CL 13或SJPL細胞))中生長到滴度比野生型豬流感病毒低約1至約100倍、約5至約80倍、約20至約80倍或約40至約80倍、約1至約10倍、約1至約5倍、約1至約4倍、約1至約3倍、約1至約2倍、約3至約15倍，或者約1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，這可以在感染后約2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，或者當病毒在Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞產生蝕斑時，通過對豬BALF或豬細胞上清液進行血細胞凝集試驗測定，。在一個實施方案中，將本發明減毒豬流感病毒的生長與具體標準或參照比較，例如與野生型豬流感病毒A/Swine/Texas/4199-2/98比較。根據這些實施方案，減毒病毒可以被遺傳工程化來含有或表達非豬流感病毒核酸序列，例如，外源病原體或腫瘤抗原的抗原決定簇。優選地，該非豬流感病毒序列不包括改變病毒減毒表型的核酸序列。因此，不將編碼具有干擾素拮抗活性的蛋白、多肽或肽的核酸序列工程化到豬流感病毒中。
本發明提供包括在2、3、4或更多個豬流感病毒基因中含有至少2、至少3或至少4種或更多突變的基因組的減毒豬流感病毒，其中這些突變中的至少1個位于NS1基因，并有助于或導致(直接或間接)病毒的減毒和/或病毒拮抗細胞干擾素反應的能力受損。在一個實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包括在2、3、4或更多個豬流感病毒基因中含有至少2、至少3或至少4種或更多突變的基因組，其中這些突變中的至少1個位于NS1基因并導致NS1基因產物拮抗細胞干擾素反應的能力減弱，并且使得該減毒病毒以MOI為0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之間，或者MOI為0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在細胞(例如，人細胞(例如，PerC6，來自被腺病毒5的E1區轉化的人胚胎視網膜母細胞的產病毒細胞株)、小鼠細胞、雞細胞(例如，雞胚胎成纖維細胞)、大鼠細胞、鳥細胞或豬細胞(例如，PK(D1)、PK(15)細胞、PK13細胞、NSK細胞、LLC-PK1細胞、LLC-PK1A細胞、ESK-4細胞、ST細胞、PT-K75細胞、PK-2a/CL 13或SJPL細胞))中生長到滴度比野生型豬流感病毒低約1至約100倍、約5至約80倍、約20至約80倍或約40至約80倍、約1至約10倍、約1至約5倍、約1至約4倍、約1至約3倍、約1至約2倍、約3至約15倍，或者約1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，這可以在相同增殖條件下，感染后約2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，通過血細胞凝集試驗測定。
在具體的實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包括在2個、3個、4個或更多個豬流感病毒基因中含至少2、至少3、至少4種或更多突變的基因組，其中這些突變中的至少1個位于NS1基因并導致NS1基因產物拮抗細胞干擾素反應的能力減弱，并且使得該減毒病毒以MOI為0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之間，或者MOI為0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在豬細胞中生長到滴度比野生型豬流感病毒低約1至約100倍、約5至約80倍、約20至約80倍或約40至約80倍、約1至約10倍、約1至約5倍、約1至約4倍、約1至約3倍、約1至約2倍、約3至約15倍，或者約1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，這可以在相同增殖條件下時(例如在MDCK細胞中)，在感染后約2至0天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，通過血細胞凝集試驗測定。在另一實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包括在2個、3個、4個或更多個豬流感病毒基因中含至少2、至少3、至少4種或更多突變的基因組，其中這些突變中的至少1個位于NS1基因并導致該病毒的減毒，并且使得該減毒病毒以MOI為0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之間，或者MOI為0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在豬細胞中生長到滴度比野生型豬流感病毒低約1至約100倍、約5至約80倍、約20至約80倍或約40至約80倍、約1至約10倍、約1至約5倍、約1至約4倍、約1至約3倍、約1至約2倍、約3至約15倍，或者約1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，這可以在相同增殖條件下(例如在MDCK細胞中)，感染后約2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，通過血細胞凝集試驗測定。根據這些實施方案，所述減毒病毒具有受損的干擾素拮抗表型并可以被遺傳工程化來含有或表達非豬流感病毒核酸序列，例如，外源病原體的抗原決定簇(例如，豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬巨細胞病毒、豬呼吸道冠狀病毒、豬腦心肌炎病毒、豬流行性腹瀉病毒的抗原決定簇、以及非病毒性豬病原體的抗原決定簇，例如細菌包括但不限于布魯氏菌(Brucella suis)，以及寄生蟲包括但不限于蛔蟲(Ascaris suum)、鞭蟲(Trichuris suis)的抗原決定簇，或腫瘤抗原例如癌胚抗原(CEA)、乳腺癌抗原例如EGFR(上皮生長因子受體)、HER2抗原(p185HER2)、HER2neu抗原決定簇、癌抗原-50(CA-50)、與乳腺癌相關的癌抗原15-3(CA15-3)、癌癥相關抗原(CAA)、黑素瘤抗原以及黑素瘤相關抗原100、25和150)。優選地，所述非豬流感病毒序列(異源序列)不包括改變病毒減毒表型的核酸序列。因此，編碼具有干擾素拮抗活性的蛋白、多肽和肽的核酸序列優選不被工程化到豬流感病毒中。
豬流感病毒NS1基因中的突變包括(或者，由以下組成)任何導致所需表型(即，拮抗細胞干擾素反應的能力受損)的突變。可包括在或引入豬流感病毒NS1基因中的突變類型的實例包括但不限于缺失、替代、插入以及上述的組合。一種或多種突變可位于整個NS1基因的任意處，即，在調控區、非編碼區和/或編碼區(例如，氨基末端和/或羧基末端或之間的某些地方)。在具體實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包括在氨基末端含有突變(例如，缺失或取代)的豬流感病毒NS1基因的基因組。在優選的實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包括在羧基末端含有突變(例如，缺失或取代，優選缺失)的豬流感病毒NS1基因的基因組。在另一實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包括在豬流感病毒NS1基因中含有突變的的基因組，該突變導致自NS1羧基末端缺失5、優選10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、100、105、110、115、119、120、121、125、130、135、140、145、146、147、148、150、155、160、165、170或175個氨基酸殘基，或者自NS1羧基末端缺失5-170、25-170、50-170、100-170、90-160、100-160或105-160、90-150、5-75、5-50或5-25氨基酸殘基。在另一實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包括在豬流感病毒NS1基因中含突變的的基因組，該突變導致除了氨基酸殘基1-126、氨基酸殘基1-120、氨基酸殘基1-115、氨基酸殘基1-110、氨基酸殘基1-100、氨基酸殘基1-99、氨基酸殘基1-95、氨基酸殘基1-85、氨基酸殘基1-80、氨基酸殘基1-75、氨基酸殘基1-73、氨基酸殘基1-70、氨基酸殘基1-65或氨基酸殘基1-60外，其它所有NS1基因產物的氨基酸殘基都缺失，其中氨基末端氨基酸為序號1。根據這些實施方案，減毒豬流感病毒優選是遺傳工程化的。在優選的實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒為TX/98/del 126、TX/98/del 99或TX/98/del 73。
本發明的減毒豬流感病毒可以是表達異源序列的嵌合病毒。優選地，該異源序列不是改變病毒減毒表型的核酸序列。因此，優選地，編碼具有干擾素拮抗活性的蛋白、多肽或肽的核酸序列不被工程化到豬流感病毒中。在某些實施方案中，嵌合病毒表達腫瘤抗原。在其它的實施方案中，嵌合病毒表達外源病原體的抗原決定簇。
具有所需表型的減毒豬流感病毒本身可做為疫苗、藥物制劑或免疫原性制劑的活性成分。可供選擇地，該減毒豬流感病毒可用作重組制備的疫苗或免疫原性制劑的載體或“骨架”。為此，“反向遺傳學”技術或無輔助(helper-free)質粒方法可用于在可作為“親代”株的減毒豬流感病毒中進行工程化突變或引入外源抗原決定簇。以這種方式，疫苗可以被設計成針對株變體進行免疫，或者可選擇地針對完全不同的感染因子或疾病抗原進行免疫(例如，腫瘤抗原)。例如，該減毒豬流感病毒可被工程化以表達其它預先選定株的中和性抗原表位。可選擇地，其它病毒的抗原決定簇可被構建到該減毒豬流感病毒中。可選擇地，非病毒感染病原體(例如，寄生蟲，細菌，真菌)的抗原決定簇抗能夠被構建到該豬流感病毒中。
在特定的實施方案中，重組技術可用于將來自親代的豬流感病毒株減毒表型(天然突變、誘導突變病毒或遺傳工程化病毒)轉移到不同的病毒株(野生型病毒、天然突變株、誘導突變病毒或遺傳工程化病毒)。根據此實施方案，“反向遺傳學技術”或無輔助(helper-free)質粒方法可以被用來在可以用作“親代株”的減毒豬流感病毒中工程化突變或引入外源抗原決定簇。
本發明提供免疫個體的方法，包括給予含有減毒豬流感病毒和生理學上有效的賦形劑的疫苗制劑，該減毒豬流感病毒在豬流感NS1基因中含有減弱NS1基因產物拮抗細胞干擾素反應的能力的突變。在一個實施方案中，本發明提供了包括給予有效量本發明疫苗制劑的方法。在某些實施方案中，所給予的疫苗制劑的劑量為約102至約108pfu、約103至約107pfu或約104至約5×106pfu。在其它實施方案中，所給予的疫苗制劑的劑量為102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107或108pfu。在具體實施方案中，所述個體為驢、斑馬、駱駝、狗、鳥(例如，鴨子)。在優選的實施方案中，所述個體為豬。
本發明提供了包括本發明減毒豬流感病毒的免疫原性制劑和包括給予個體本發明免疫原性制劑用于誘導免疫反應的方法，以治療、控制或預防豬流感病毒感染或與其相關的不適或癥狀、豬流感病毒感染外的其它感染或與其相關的不適或癥狀，或者不適(其中該減毒豬流感病毒可用作載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應)。在一個實施方案中，本發明提供包括給予個體有效量的本發明免疫原性制劑的誘導免疫反應的方法，以治療、控制或預防豬流感病毒感染或與其相關的不適或癥狀、豬流感病毒感染外的其它感染或與其相關的不適或癥狀，或者不適(其中該減毒豬流感病毒可用作載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應)。在某些實施方案中，給予個體的本發明免疫原性制劑的劑量為約102至約108pfu、約103至約107pfu或約104至約5×106pfu，或者約104至約107pfu。在具體實施方案中，給予個體的免疫原性制劑含有減毒豬流感病毒的濃度為約104至約107pfu/ml。在其它實施方案中，給予個體的本發明免疫原性制劑的劑量為102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107或108pfu。在具體實施方案中，所述個體為驢、斑馬、駱駝、狗、鳥(例如，鴨子)。在優選的實施方案中，所述個體為豬。
在個體中誘導有力的IFN反應的減毒豬流感病毒也可用于藥物制劑中，以預防或治療感染和IFN可治療性疾病例如癌癥。在這方面，可以改變該減毒豬流感病毒的趨向性，將病毒在體內施用(in vivo)或體外轉移再回輸(ex vivo)使之靶向所期望的靶器官、組織或細胞。利用此方法，可在靶點局部誘導IFN反應，從而避免系統性IFN治療的副作用或使之最小化。為此目的，可將該減毒豬流感病毒工程化以表達對靶器官、組織或細胞受體特異的配體。
本發明提供包括給予個體本發明的藥物制劑來預防、控制或治療個體(例如，豬)的豬流感病毒感染外的其它感染或者不是由豬流感病毒引起的IFN-可治療性疾病的方法。在一個實施方案中，本發明提供包括給予個體有效量的本發明藥物制劑來預防、控制或治療個體(例如，豬)豬流感病毒感染外的其它感染或者不是由豬流感病毒引起的IFN-可治療性疾病的方法。在某些實施方案中，給予個體的藥物制劑劑量為約102至約1012、約102至約1010、約102至約108、約103至約109、約103至約107、約104至約108、約104至約5×106、約104至約107或約104至約1012pfu。在具體實施方案中，給予個體的藥物制劑含有減毒流感病毒的濃度為約104至約1012pfu/ml。在其它實施方案中，藥物制劑的給藥劑量為102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1012pfu。在具體實施方案中，所述個體為驢、斑馬、駱駝、狗、鳥(例如，鴨子)。在優選的實施方案中，所述個體為豬。
本發明提供包括給予個體本發明藥物制劑來預防、控制或治療個體癌癥的方法。在一個實施方案中，本發明提供包括給予個體有效量的本發明藥物制劑來預防、控制或治療個體癌癥的方法。在某些實施方案中，該藥物制劑包括含有腫瘤抗原的豬流感病毒。在某些實施方案中，給予個體的藥物制劑的劑量為約102至約1012pfu、約102至約1010pfu、約102至約108pfu、約103至約109pfu、約103至約107pfu、約104至約108pfu、約104至約5×106pfu或約104至約1012pfu。在其它實施方案中，該藥物制劑的給藥劑量為102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1012pfu。在具體實施方案中，所述個體為驢、斑馬、駱駝、狗、鳥(例如，鴨子)。在優選的實施方案中，所述個體為豬。
申請人已經證明，干擾素拮抗活性受損的減毒豬流感病毒體內復制產生的滴度低于用野生型豬流感病毒所測的滴度，但該滴度足以誘導免疫和細胞因子反應。因此，減弱但不消除所述豬流感病毒的IFN拮抗活性的突變對于疫苗、免疫學和藥物制劑是優選的。可選擇這樣的病毒在常規和非常規培養基中生長，并具有中等毒力。
本發明提供含有(或者，包含)本發明豬流感病毒的細胞。在具體實施方案中，細胞含有/包含遺傳工程化的豬流感病毒。在某些實施方案中，細胞中含有的減毒豬流感病毒被工程化以編碼來自另一病原體(例如，另一種病毒)的抗原決定簇或腫瘤抗原。根據此實施方案，該減毒豬流感病毒的基因組可以包括至少一種來自不同病毒的片段。任何細胞都可以含有或包括本發明的減毒豬流感病毒，或被該病毒感染，這些細胞包括但不限于MDCK細胞、PK細胞、Vero細胞、原代人臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)、H292人上皮細胞株、HeLa細胞和豬胚胎腎細胞RES。在優選的實施方案中，所述細胞為豬細胞或豬細胞株。在某些實施方案中，所述細胞(例如，豬細胞或豬細胞株)為干擾素缺陷的。
在某些其它實施方案中，本發明的豬流感病毒被包含在10天、6-9天、6-8天、6-7天齡的含胚雞蛋中。在具體實施方案中，該病毒被包含在這樣的蛋的尿囊腔中。在另一具體實施方案中，該病毒被包含在這樣的蛋的羊膜腔中。
本發明包括用培養基例如細胞、細胞株和含胚蛋來增殖本發明的減毒豬流感病毒。在一個實施方案中，本發明提供制備疫苗產品和藥物產品的方法，包括在培養基中增殖本發明的減毒豬流感病毒，并收集子代病毒，其中培養基為細胞、細胞株或含胚蛋。在某些實施方案中，培養基為IFN缺陷系統。示例的IFN缺陷系統包括但不限于早期含胚蛋(例如，6-10天、6-9天、6-8天或6-7天齡的含胚疋)和IFN缺失的細胞株(例如VERO細胞或例如STAT1敲除的遺傳工程化細胞株)。含胚蛋或用抑制IFN系統的化合物(包括藥物、抗體、反義核酸、核酶等)預處理的細胞株也可用作IFN缺陷系統。此外，IFN系統缺陷的蛋，例如，由STAT1陰性的鳥特別是家禽包括但不限于轉基因雞、鴨或火雞生的蛋，可用作IFN缺陷系統。
3.1術語這里所用術語“約”或“大約”當與數字聯用時，指所用數字的1％、5％或10％內的任何數字。
這里所用短語NS1的“氨基末端”指豬流感病毒NS1蛋白的從氨基末端氨基酸殘基(氨基酸殘基1)至氨基酸殘基115、氨基酸殘基1至100、氨基酸殘基1至75、氨基酸殘基1至50、氨基酸殘基1至25或氨基酸殘基1至10。
當豬流感病毒NS1蛋白的氨基末端是氨基酸殘基1至氨基酸殘基115、氨基酸殘基1至100、氨基酸殘基1至75、氨基酸殘基1至50或氨基酸殘基1至25時，這里所用短語NS1的“羧基末端”分別指豬流感病毒NS1蛋白的氨基酸殘基116至羧基末端氨基酸殘基、氨基酸殘基101至羧基末端氨基酸殘基、氨基酸殘基76至羧基末端氨基酸殘基、氨基酸殘基51至羧基末端氨基酸殘基或氨基酸殘基26至羧基末端氨基酸殘基。從羧基末端的缺失可包括自NS1羧基末端的5、優選10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、73、75、80、85、90、95、99、100、105、110、115、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170或175個氨基酸殘基的缺失。
這里所用術語“細胞因子受體調節劑”指調節細胞因子受體磷酸化、與細胞因子受體相關的信號轉導途徑活化和/或特定蛋白例如細胞因子的表達的試劑。這種試劑可直接或間接調節細胞因子受體磷酸化、與細胞因子受體相關的信號轉導途徑活化和/或特定蛋白例如細胞因子的表達。因此，細胞因子受體調節劑的實例包括但不限于細胞因子、細胞因子片段、融合蛋白和與細胞因子受體或其片段免疫特異性結合的抗體。此外，細胞因子受體調節劑的實例包括但不限于肽、多肽(例如，可溶性細胞因子受體)、融合蛋白和與細胞因子受體或其片段免疫特異性結合的抗體。
這里所用術語“有效量”指治療(例如，預防性試劑或治療試劑)的量，該量足以減輕和/或改善不適(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適或癥狀、其它感染(例如，另一種病毒感染)、IFN可治療性疾病或不適(其中該減毒豬流感病毒可用做載體來介導針對與所述不適相關的特定抗原的免疫反應))的嚴重程度和/或持續時間、預防不適(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適或癥狀、其它感染(例如，另一種病毒感染)、IFN可治療性疾病或不適(其中該減毒豬流感病毒可用做載體來介導針對與所述不適相關的特定抗原的免疫反應))的進展、引起不適(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適或癥狀，其它感染(例如，另一種病毒感染)、或IFN可治療性疾病)的康復、防止一種或多種與不適(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適或癥狀、其它感染(例如，另一種病毒感染)、或IFN可治療性疾病)相關的癥狀復發、發展或發生，降低豬流感病毒的滴度，或增強或改善另一種治療性試劑(例如，預防或治療試劑)的預防或治療作用。
這里所用術語“抗原決定簇”指在動物，優選哺乳動物，最優選豬中具有抗原或免疫原活性的多肽或蛋白的位點或片段。具有免疫原活性的抗原決定簇是引發動物抗體反應的多肽或蛋白的位點或片段。具有抗原活性的抗原決定簇是用本領域所屬技術人員熟知的任何方法例如免疫分析所確定的、與抗體免疫特異性結合的多肽或蛋白的位點或片段。
這里在描述蛋白質性試劑的情況下所使用的術語“片段”指包含肽、多肽或蛋白質氨基酸序列的至少2個連續的氨基酸殘基、至少5個連續的氨基酸殘基、至少10個連續的氨基酸殘基、至少15個連續的氨基酸殘基、至少20個連續的氨基酸殘基、至少25個連續的氨基酸殘基、至少40個連續的氨基酸殘基、至少50個連續的氨基酸殘基、至少60個連續的氨基酸殘基、至少70個連續的氨基酸殘基、至少80個連續的氨基酸殘基、至少90個連續的氨基酸殘基、至少100個連續的氨基酸殘基、至少125個連續的氨基酸殘基、至少150個連續的氨基酸殘基、至少175個連續的氨基酸殘基、至少200個連續的氨基酸殘基或至少250個連續的氨基酸殘基的氨基酸序列。在一個實施方案中，全長蛋白質的片段保留了全長蛋白的活性，例如IFN拮抗活性。在另一實施方案中，全長蛋白質的片段不保留全長蛋白質的活性，例如IFN拮抗活性。
這里在描述核酸的情況下所使用的術語“片段”指包含編碼肽、多肽或蛋白的核酸序列的至少2個連續的核苷酸、至少5個連續的核苷酸、至少10個連續的核苷酸、至少15個連續的核苷酸、至少20個連續的核苷酸、至少25個連續的核苷酸、至少30個連續的核苷酸、至少35個連續的核苷酸、至少40個連續的核苷酸、至少50個連續的核苷酸、至少60個連續的核苷酸、至少70個連續的核苷酸、至少80個連續的核苷酸、至少90個連續的核苷酸、至少100個連續的核苷酸、至少125個連續的核苷酸、至少150個連續的核苷酸、至少175個連續的核苷酸、至少200個連續的核苷酸、至少250個連續的核苷酸、至少300個連續的核苷酸、至少350個連續的核苷酸或至少380個連續的核苷酸的核酸。在優選的實施方案中，核酸片段編碼的肽或多肽保留全長蛋白的活性，例如IFN拮抗活性。在另一實施方案中，全長蛋白質的片段不保留全長蛋白質的活性，例如IFN拮抗活性。
這里所用短語“異源序列”指任何通常不是天然存在或與所關注的核酸或蛋白質、多肽或肽序列不天然相關的核酸序列或蛋白質、多肽或肽序列。例如，“異源序列”可指來自不同種屬的序列。
這里所用術語“聯合”(或“組合”)指使用超過一種治療(例如，多于一種預防試劑和/或治療試劑)。術語“聯合”的使用不限制給予有不適(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適或癥狀，另一種感染(例如，另一種病毒感染)或IFN可治療性疾病)的個體治療性試劑(例如，預防性試劑和/或治療試劑)的順序。可以在給予具有不適(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適或癥狀，另一種感染(例如，另一種病毒感染)或IFN可治療性疾病)的個體第二治療性試劑(例如，第二預防或治療試劑)之前(例如，5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周前)、同時或之后(例如，5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周后)給予第一治療(例如，第一預防性試劑或治療試劑)。
這里所用短語“干擾素拮抗活性”指降低或抑制細胞干擾素免疫反應的蛋白質或多肽，或其片段、衍生物或類似物。特別是，具有干擾素拮抗活性的蛋白或多肽，或其片段、衍生物或類似物(例如，豬流感病毒NS1)降低或抑制干擾素表達和/或活性。在具體實施方案中，短語“干擾素拮抗活性”指降低或抑制細胞干擾素免疫反應的豬流感病毒蛋白或多肽，或其片段、衍生物或類似物。具有干擾素拮抗活性的豬流感病毒蛋白或多肽可優選地影響一種或兩種類型干擾素(IFN)的表達和/或活性。在一個實施方案中IFN-α的表達和/或活性被影響。在另一實施方案中，IFN-β的表達和/或活性被影響。在一個實施方案中，IFN-γ的表達和/或活性被影響。在某些實施方案中，在有IFN活性的系統(IFN-competent systems)例如野生型細胞或動物中在相同條件下，與對照(例如，PBS或無干擾素拮抗活性的蛋白質)相比，具有干擾素拮抗活性的蛋白、多肽等使IFN-β和/或IFN-γ的表達和/或活性降低5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或更多。在某些實施方案中，在有IFN活性的系統中，在相同條件下，與對照(例如，PBS或無干擾素拮抗活性的蛋白質)相比，具有干擾素拮抗活性的蛋白、多肽等使IFN-β和/或IFN-γ的表達和/或活性降低約1至約100倍、約5至約80倍、約20至約80倍、約1至約10倍，或約1至約5倍，或約40至約80倍，或者1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。
這里所用短語“IFN缺陷系統”或“IFN缺失培養基”指不產生IFN或產生低水平IFN(即，在相同的條件下與有IFN活性的系統比較，IFN表達減少5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或更多)、對IFN沒有反應或反應效率低、和/或由IFN誘導的一種或多種抗病毒基因的活性缺失的系統，例如細胞、細胞株和動物例如豬、小鼠、雞、火雞、兔子、大鼠等。
這里所用短語“IFN誘導性表型”指這樣的表型，病毒相對于野生型病毒顯示增加的細胞干擾素反應，該表型典型地抑制或減少細胞干擾素介導的反應。
這里所用短語“IFN可治療性病癥”、“IFN可治療性疾病”以及類似短語指可通過給予IFN(IFN-α，β，γ或其任意組合)來預防、治療、控制或改善的不適。如果豬流感病毒感染其它物種，則IFN可治療的病癥不限于豬。豬的IFN可治療病癥的實例包括但不限于口蹄疫、豬嗜血桿菌肺炎(PHP)、以及由例如胸膜肺炎放線桿菌(A.pleuropneumoniae)、溶血巴斯德氏菌(P.haemolytica)、多殺巴斯德氏菌(P.multocida)、睡眠嗜血桿菌(H.somnus)以及A.suis感染所引起其它病癥。
這里就IFN拮抗活性所用的短語“中間”表型指這樣的表型，其可激發較強的免疫反應，但同時是減毒的，因為具有中間表型的病毒不能克服宿主的IFN反應。特別地，與野生型病毒相比，中間表型能夠刺激免疫反應并抑制/降低IFN僅至其允許較少的病毒復制輪次或病毒顆粒數量的程度，這可以用本領域熟知的技術來測定(例如，通過較低的空斑滴度或血細胞凝集試驗來測定)。
這里在描述病毒的情況下所使用的術語“分離的”指來自單一親代病毒的病毒。可利用本領域所屬技術人員公知的常規技術來分離病毒，這些技術包括但不限于基于空斑純化(plaque purification)和限制性稀釋(limiting dilution)的技術。
這里所用術語“控制”指個體從治療(例如，預防性試劑或治療性試劑)中獲得的有益效果，其不能治愈所述疾病。在某些實施方案中，給予個體一種或多種治療(例如，一種或多種預防性試劑或治療性試劑)來“控制”疾病從而防止所述疾病進展或惡化。
這里所用短語“感染復數”或“MOI”指每個被感染細胞的平均病毒數量。MOI由加入的病毒數量(加入的ml×PFU)除以加入的細胞數量(加入的ml×細胞/ml)測得。
這里在描述含有或包含非豬流感病毒序列的豬流感病毒的情況下所用短語“非豬流感病毒”指任何包含與豬流感病毒異源(即未發現與豬流感病毒天然相關)的序列(例如，核酸或氨基酸序列)的流感病毒株或分離株。
這里所用短語“NS1基因”指在流感病毒中編碼非結構性蛋白(NS1)的基因。NS1是由分段的A型流感病毒基因組和其它病毒編碼的8種分子之一。“豬流感病毒NS1基因”是從豬流感病毒分離的NS1基因。代表性的豬NS1基因可在公共序列數據庫例如Genbank中找到，包括但不限于Genbank編號AJ293939(A/swine/Italy/13962/95(H3N2))和Genbank編號AJ344041(A/swine/Cotesd′Armor/1121/00(H1N1))。“NS1基因產物”指由NS1基因編碼的基因產物(例如，RNA或蛋白)。如果是蛋白質，該NS1基因產物是全長的并具有野生型NS1的活性(例如，來自流感病毒A/swine/Texas/4199-2/98的基因產物)。“豬流感病毒NS1基因產物”指由豬流感病毒NS1基因編碼的基因產物(例如，RNA或蛋白)。如果是蛋白質，該豬流感病毒NS1基因產物是全長的并具有野生型豬流感病毒NS1的活性，例如，來自A/swine/Texas/4199-2/98。
這里所用術語“防止”和“預防”指通過給予個體治療(例如，預防性試劑或治療性試劑)或者給予聯合治療性試劑(例如，預防性試劑或治療性試劑的組合)來抑制不適(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適、豬流感病毒感染外的其它感染和與其相關的不適，或者IFN可治療性疾病或不適(其中所述減毒豬流感病毒可作為載體來誘導對與該不適相關的特定抗原的免疫反應))的發展和發生，或者預防不適(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適、豬流感病毒感染外的其它感染和與其相關的不適，或者IFN可治療的不適)的一種或多種癥狀的復發、發生或發展。
這里所用術語“預防性試劑”指任何可用于預防不適或其癥狀(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適或癥狀、豬流感病毒感染外的其它感染或與其相關的不適或癥狀、IFN可治療性疾病或不適(其中所述減毒豬流感病毒可作為載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應))的試劑。優選地，預防性試劑是已知可以用于或已經用于或正在用于預防或阻止豬流感病毒感染或與其相關的不適或癥狀、豬流感病毒感染外的其它感染或與其相關的不適或癥狀、IFN可治療性疾病或不適(其中所述減毒豬流感病毒可作為載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應)的發生、發展、進展和/或嚴重程度的試劑。
這里所用術語“預防有效量”指治療(例如，預防性試劑)的量，該量足以預防不適或其癥狀(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適或癥狀、豬流感病毒感染外的其它感染和與其相關的不適、IFN可治療性疾病或不適(其中所述減毒豬流感病毒可作為載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應))的發展、復發或發生，或者增強或改善另一種療法(例如，預防性試劑)的預防效果。
這里在描述病毒時所用的短語“純化的”指基本上不含細胞材料和培養基(病毒從這些細胞或培養基中分離)的病毒。“基本上不含細胞材料”的描述包括病毒與細胞(該病毒從其中分離或重組產生)的細胞組分分離的病毒制劑。因此，基本上不含細胞材料的病毒包括含有的細胞蛋白質(這里也稱為“雜質蛋白質”)低于約30％、20％、10％或5％(干重)的蛋白制劑。該病毒也基本上不含培養基，即培養基占病毒制劑的體積低于約20％、10％或5％。可利用本領域所屬技術人員公知的常規方法來純化病毒，包括但不限于層析或離心。
這里所用術語“個體”或“患者”可以相互替代使用。這里所用術語“個體”指動物(例如，鳥、爬行動物和哺乳動物)，優選哺乳動物包括非靈長類(例如，駱駝、驢、斑馬、牛、豬、馬、貓、狗、大鼠和小鼠)和靈長類(例如，猴子、黑猩猩和人)。在某些實施方案中，個體或患者被豬流感病毒感染。在某些實施方案中，哺乳動物為0至6月、6至12月、1至5歲、5至10歲、10至15歲、15至20歲、20至25歲、25至30歲、30至35歲、35至40歲、40至45歲、45至50歲、50至55歲、55至60歲、60至65歲、65至70歲、70至75歲、75至80歲、80至85歲、85至90歲、90至95歲或95至100歲。在優選的實施方案中，個體或患者為豬。在某些實施方案中，豬為0至6月、6至12月、1至5歲、5至10歲或10至15歲。豬的自然壽命為10-15年。
這里所用的“豬流感病毒”指引起豬流感的來自正粘病毒家族的A型或C型流感病毒。正粘病毒有三類A型、B型和C型，僅A型和C型流感病毒感染豬。豬流感病毒的亞型包括H1N1、H1N2、H3N2和H3N1。H9N2和H5N1可以在豬中發現。在某些實施方案中，豬流感病毒為分離自豬的流感病毒。在優選的實施方案中，豬流感病毒含有豬NS1基因。可在例如Genbank的公共數據庫中找到代表性的豬NS1基因，其包括但不限于Genbank編號AJ293939(A/swine/Italy/13962/95(H3N2))和Genbank編號AJ344041(A/swine/Cotesd′Armor/1121/00(H1N1))。豬流感病毒變體的實例包括但不限于A/Swine/Colorado/1/77、A/Swine/Colorado/23619/99、A/Swine/Cote d′Armor/3633/84、A/Swine/Cote d′Armor/3633/84、A/Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/Hong Kong/10/98、A/Swine/Hong Kong/9/98、A/Swine/Hong Kong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiana/1726/88、A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiana/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Netherlands/12/85、A/Swine/North Carolina/16497/99、A/Swine/North Carolina/35922/98、A/Swine/North Car-olina/93523/01、A/Swine/North Carolina/98225/01、A/Swine/Oedenrode/7C/96、A/Swine/Ohio/891/01、A/Swine/Oklahoma/18717/99、A/Swine/Oklahoma/18089/99、A/Swine/Ontario/01911-1/99、A/Swine/Ontario/01911-2/99、A/Swine/Ontario/41848/97、A/Swine/Ontario/97、A/Swine/Quebec/192/81、A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tennessee/24/77、A/Swine/Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisconsin/136/97、A/Swine/Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wiscon-sin/166/97、A/Swine/Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/Wisconsin/457/98、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98和A/Swine/Wisconsin/14094/99。
這里所用術語“協同的”指比任何兩種或更多種單獨治療(例如，一種或多種預防性試劑或治療性試劑)的相加作用更有效的治療(例如，預防或劑治療性試劑)組合。治療性試劑組合(例如，預防性試劑或治療性試劑的組合)的協同作用使得可以給予不適的個體(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適、豬流感病毒感染外的其它感染和與其相關的不適、或者IFN可治療性疾病或不適(其中所述減毒豬流感病毒可作為載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應))更少量的一種或多種治療性試劑(例如，一種或多種預防性試劑或治療性試劑)和/或更低頻率地給予所述治療性試劑。使用較低劑量的治療(例如，預防性試劑或治療性試劑)和/或施用治療性試劑的頻率減少能夠降低與給予個體所述治療性試劑相關的毒性，但不降低所述治療性試劑預防或治療不適(例如，豬流感病毒感染或其相關的不適、豬流感病毒感染外的其它感染和與其相關的不適、或者IFN可治療性疾病或不適(其中所述減毒豬流感病毒可作為載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應))的效力。此外，協同作用可提高治療(例如，預防性試劑或治療性試劑)預防或治療不適(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適、豬流感病毒感染外的其它感染和與其相關的不適、或者IFN可治療性疾病或不適(其中所述減毒豬流感病毒可作為載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應))的效力。最后，治療(例如，預防性試劑或治療性試劑)組合的協同作用可避免或減少與使用任何單一治療性試劑相關的不良反應或不期望的副作用。
這里所用術語“T細胞受體調節劑”指調節T細胞受體磷酸化、與T細胞受體相關的信號轉導途徑的活化和/或特定蛋白質例如細胞因子的表達的試劑。這種試劑可直接或間接地調節T細胞受體的磷酸化、與T細胞受體相關的信號轉導途徑的活化和/或特定蛋白質例如細胞因子的表達。T細胞受體調節劑的實例包括但不限于與T細胞受體免疫特異性結合的肽、多肽、蛋白質、融合蛋白和抗體或其片段。此外，T細胞受體調節劑的實例包括但不限于與T細胞受體的配體免疫特異性結合的蛋白質、肽、多肽(例如，可溶性T細胞受體)，融合蛋白和抗體或其片段。
這里所用術語“治療有效量的”指治療的量，該量足以減少不適(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適(例如，流感導致的流產、抑郁、食欲不振、厭食、呼吸困難、肌痛、下頜下淋巴結腫大)、豬流感病毒感染外的其它感染或其相關的不適或癥狀、IFN可治療性疾病或不適(其中所述減毒豬流感病毒可作為載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應))的嚴重程度，縮短不適(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適、豬流感病毒感染外的其它感染或與其相關的不適或癥狀、或者IFN可治療性疾病或不適(其中所述減毒豬流感病毒可作為載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應))的持續時間，降低豬流感病毒或其它病毒的滴度，減少其它病原體的數量，改善不適(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適、豬流感病毒感染外的其它感染或與其相關的不適或癥狀、或者IFN可治療性疾病或不適(其中所述減毒豬流感病毒可作為載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應))的一種或多種癥狀，防止不適(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適，豬流感病毒感染外的其它感染或與其相關的不適或癥狀，或者IFN可治療性疾病或不適(其中所述減毒豬流感病毒可作為載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應))的發展，使不適(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適、豬流感病毒感染外的其它感染或與其相關的不適或癥狀、或者IFN可治療性疾病或不適(其中所述減毒豬流感病毒可作為載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應))康復，或者增強或改善另一種治療性試劑的治療效果。
這里所用術語“治療”可以是任何能夠用于預防、治療、控制或改善不適(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適、豬流感病毒感染外的其它感染或與其相關的不適或癥狀、或者IFN可治療性疾病或不適(其中所述減毒豬流感病毒可作為載體來誘導針對與該不適相關的具體抗原的免疫反應))的方案、方法、組合物、劑型和/或試劑。在某些實施方案中，所用術語“治療”指所屬本領域技術人員公知用于預防、治療、控制或改善豬流感病毒感染或與其相關的不適或癥狀、豬流感病毒感染外的其它感染或與其相關的不適或癥狀、IFN可治療性疾病或不適(其中該減毒豬流感病毒可作為載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應)的生物治療、支持治療和/或其它治療。
這里所用術語“治療”指任何用于預防、治療、控制或改善不適或其癥狀(例如，豬流感病毒感染或與其相關的不適或癥狀、豬流感病毒感染外的其它感染和與其相關的不適或癥狀、IFN可治療性疾病或不適(其中所述減毒豬流感病毒可作為載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應)的試劑。優選地，治療性試劑是已知可以用于、或已被用于或正在用于預防、治療、控制或改善豬流感病毒感染或與其相關的不適或癥狀、豬流感病毒感染外的其它感染或與其相關的不適或癥狀、IFN可治療性疾病或不適(其中該減毒豬流感病毒可作為載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應)的試劑。
這里所用術語“處理”指通過給予一種或多種治療(包括但不限于，給予一種或多種預防性試劑或治療性試劑)根除或控制豬流感病毒的復制或非豬流感病毒病原體(例如，病毒)的復制、降低豬流感病毒或豬流感病毒外其它病毒的復制、降低病原體的數量、降低或改善不適(豬流感病毒感染或與其相關的不適、豬流感病毒感染外的其它感染和與其相關的不適或癥狀、IFN可治療性疾病或不適(其中所述減毒豬流感病毒可作為載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應))的進展、嚴重程度和/或持續時間，或者改善一種或多種癥狀。
這里所用術語“腫瘤抗原”指可被免疫T細胞或抗體識別的腫瘤細胞上的分子。腫瘤抗原包括那些僅在腫瘤細胞上表達的抗原(腫瘤特異性抗原)以及在正常細胞上存在但在腫瘤細胞上優勢或異常表達的的分子(腫瘤相關抗原)。腫瘤抗原的實例包括但不限于肉瘤抗原、前列腺癌抗原、纖維肉瘤抗原、自主分化抗原例如癌胚抗原、或由惡性細胞表達的分化抗原包括但不限于癌胚抗原例如結腸癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白、移行細胞膀胱癌175kDa小鼠抗原的人抗原性對應物或功能等同物、黑素瘤相關抗原p97或GD3，以及人肺癌分化抗原例如L6和L20。
這里所用短語“野生型豬流感病毒”指流行的、天然循環的并引起典型疾病爆發的豬病毒類型。野生型豬流感病毒的實例包括但不限于A/Swine/Colorado/1/77、A/Swine/Colorado/23619/99、A/Swine/Cote d′Armor/3633/84、A/Swine/Cote d′Armor/3633/84、A/Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/Hong Kong/10/98、A/Swine/Hong Kong/9/98、A/Swine/Hong Kong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiana/1726/88、A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiana/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Netherlands/12/85、A/Swine/North Carolina/16497/99、A/Swine/North Carolina/35922/98、A/Swine/NorthCarolina/93523/01、A/Swine/North Carolina/98225/01、A/Swine/Oedenrode/7C/96、A/Swine/Ohio/891/01、A/Swine/Oklahoma/18717/99、A/Swine/Oklahoma/18089/99、A/Swine/Ontario/01911-1/99、A/Swine/Ontario/01911-2/99、A/Swine/Onta-rio/41848/97、A/Swine/Ontario/97、A/Swine/Quebec/192/81、A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tenne-ssee/24/77、A/Swine/Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisc-onsin/136/97、A/Swine/Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wisconsin/166/97、A/Swine/Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/Wisconsin/457/98、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98及A/Swine/Wisconsin/14094/99。
4.


圖1A-1B，含NS1突變蛋白的質粒衍生的Sw/Tx/98流感病毒的生成。圖1A為野生型和突變的NS流感病毒基因片段的示意圖。NS基因片段被修飾從而產生分別編碼73、99和126aa的突變NS1基因。NS1突變不影響NEP蛋白的序列。下劃線序列被引入形成終止密碼子(粗體)。圖1B為rWT和NS1缺失突變病毒的RT-PCR分析。利用對所有8個流感病毒片段非編碼區特異的引物來擴增流感病毒RNA片段。箭頭所指顯示NS片段變短。點顯示由于內部結合正向引物生成的對應于HA基因片段3′末端的產物。
圖2A-2D，組織培養物中質粒衍生的野生型和NS1突變的Sw/TX/98病毒的表征。圖2A顯示在PK-15細胞中野生型和NS1缺失突變株的多周期生長曲線。圖2B顯示在PK-15細胞中野生型和NS1缺失突變株的單周期生長曲線。圖2C顯示感染后3天MDCK細胞中的空斑大小。圖2D顯示病毒蛋白表達的時間過程。在所指示的感染后時間，用rWT和NS1突變的病毒感染(MOI＝2)PK-15細胞并用[35S]Met-Cys標記。將細胞提取物進行SDS-PAGE并通過放射自顯影來分析。
圖3A-3C，在質粒衍生的野生型和NS1突變的Sw/TX/98病毒感染的PK-15細胞中誘導I型IFN。圖3A顯示在熒光分析中感染了病毒的細胞分泌IFN的IFN生物分析水平示意圖。圖3B顯示I型IFN合成的時間過程。新鮮的PK-15細胞用UV-滅活的上清液(在感染后不同時間收集)處理24小時，該上清液來自被病毒感染隨后用VSV-GFP感染的PK-15細胞。感染后16小時，用熒光顯微鏡觀察表達GFP的細胞，IFN和TNF-α的誘導。圖3C顯示病毒感染的PK-15細胞中TNF-α、IFN-β-和β-actin-特異性mRNA的RT-PCR分析。
圖4A-4C，質粒衍生的野生型和NS1突變的Sw/TX/98病毒感染4周齡豬。圖4A顯示被質粒衍生的TX/98缺失病毒感染的豬肺組織病理學評分的條形圖。在感染后第5天，具有肉眼可見損傷的肺表面的平均百分比(±SEM)。圖4B顯示在感染后第5天，中細支氣管的顯微損傷。圖4C顯示在感染后第5天，支氣管肺泡灌洗液的病毒滴度。
圖5A-5D，質粒衍生的野生型和NS1突變的Sw/TX/98病毒感染的豬的肺組織病理學檢驗，200x放大。圖5A顯示非感染對照豬肺的中等大小細支氣管。上皮層完整，周圍的肺泡正常。圖5B顯示由rWT TX/98病毒感染導致的嚴重急性壞死性細支氣管炎和以廣泛病灶為特征的間質性肺炎。圖5C顯示缺失突變株1-99病毒感染早期恢復中的一個正常細支氣管和一個損傷細支氣管，代表由該病毒感染導致的損傷程度較低。圖5D顯示1-126病毒接種的豬的肺正常細支氣管和周圍肺泡。該病毒不導致病灶。
圖6A-D，質粒衍生的野生型和NS1突變的Sw/TX/98病毒感染的豬的肺組織病理學檢驗，200x放大。圖6A顯示未感染的對照豬肺的較大細支氣管上皮層。上皮細胞為高柱狀，具有假復層基底核和突出的表面纖毛。圖6B顯示TX/98 rWT病毒感染豬肺的較大細支氣管上皮層。由于上皮細胞壞死和再生性增生導致上皮層完全混亂。圖6C顯示缺失突變株1-99病毒感染的豬的肺大細支氣管和較小支氣管氣道，表示由該病毒導致的損傷程度較低。圖6D顯示1-126病毒接種的豬的肺正常上皮層。不產生細支氣管損傷。
圖7，TX/98/del 126預防免疫的豬的組織病理學。圖7顯示預防免疫了TX/98/del 126的豬的肺組織病理學評分。對照＝未預防免疫、模擬注射的豬；H3N2＝給每只未預防免疫的豬接種2×105PFU A/Swine/Texas/4199-2/98；H1N1＝給每只未預防免疫的豬接種2×105PFU A/Swine/MN/37866/99；MLV+對照＝用TX/98/del 126預防免疫的，模擬接種的豬；MLV+H3N2＝給每只TX/98/del 126預防免疫的豬接種2×105PFU A/Swine/Texas/4199-2/98；MLV+H1N1＝給每只TX/98/del 126預防免疫的豬接種2×105PFUA/Swine/MN/37866/99。
圖8TX/98/del 126-預防免疫的豬的SIV-抗原免疫組織化學。圖8顯示描述TX/98/del126預防免疫的豬的免疫組織化學評分條形圖。對照＝未預防免疫的、模擬接種的豬；H3N2＝給未預防免疫的每只豬接種2×105PFUA/Swine/Texas/4199-2/98；H1N1＝給未預防免疫的每只豬接種2×105PFUA/Swine/MN/37866/99；MLV+對照＝用TX/98/del 126預防免疫的、模擬接種的豬；MLV+H3N2＝給TX/98/del 126預防免疫的每只豬接種2×105PFU的A/Swine/Texas/4199-2/98；MLV+H1N1＝給TX/98/del 126預防免疫的每只豬接種2×105PFU的A/Swine/MN/37866/99。
圖9用H3N2和H1N1SIV感染TX/98/del 126免疫了的豬的肺灌洗液中病毒滴度。圖9顯示描述TX/98/del 126免疫了的豬的肺灌洗液中病毒滴度的條形圖。對照＝未預防免疫的、假接種的豬；H3N2＝給未預防免疫的每只豬接種2×105PFU的A/Swine/Texas/4199-2/98；H1N1＝給未預防免疫的每只豬接種2×105PFU的A/Swine/MN/37866/99；MLV+對照＝用TX/98/del 126預防免疫的、模擬接種的豬；MLV+H3N2＝給TX/98/del 126預防免疫的每只豬接種2×105PFU的A/Swine/Texas/4199-2/98；MLV+H1N1＝給TX/98/del 126預防免疫的每只豬接種2×105PFU的A/Swine/MN/37866/99。病毒的檢測限度為101.5TCID50/ml。
5.發明詳述本發明提供拮抗細胞干擾素(IFN)反應的能力受損的減毒豬流感病毒、制備這種減毒豬流感病毒的方法，以及這種病毒在疫苗和藥物制劑中的用途。這種疫苗能夠產生免疫反應并產生免疫性，但不引起疾病或引起較少和/或不太嚴重的癥狀，即該病毒的毒力降低。因此它們是活病毒疫苗理想的候選者。此外，該減毒豬流感病毒可誘導有力的IFN反應，這種反應具有其它體內生物學后果，提供對抗后續感染性疾病的保護和/或誘導抗腫瘤反應。因此，該減毒豬流感病毒可以在藥學上使用來預防和治療其它感染性疾病和/或IFN可治療性疾病。
本發明部分基于申請人的以下發現工程化使NS1基因含有缺失的豬流感病毒相對于野生型豬流感病毒其復制受損，例如被感染的豬有較少肺損傷、在支氣管肺泡灌洗液(BALF)中病毒滴度降低、鼻擦拭簽檢測到的病毒減少。驚奇的是，與觀察到的小鼠模型中人流感病毒的結果相反，NS1蛋白的長度不與豬流感病毒的減毒水平相關。申請人發現，對于豬流感病毒，具有最短NS1蛋白的突變病毒減毒最小。換言之，與NS1基因含有較長缺失的豬流感病毒或野生型豬流感病毒相比，NS1基因含較短缺失的豬流感病毒表現較高的體內減毒。申請人進一步發現重組豬流感病毒體外抑制IFN產生的能力受損，并且它們在10天含胚雞蛋、MDCK細胞、PK-15細胞或體內豬模型中不象其親代重組株一樣有效復制。不意欲受任何豬流感病毒NS1缺失突變株的體內作用機制的理論或解釋的限制，推測這種病毒的減毒特征是由其NS1蛋白的表達水平、誘導有力的細胞IFN反應的能力、以及拮抗這種反應的能力受損所引起。然而，這種病毒的有益特征并不能單一地歸因于其對細胞干擾素反應的作用。事實上，其它與NS1相關的活動(例如改變前mRNA剪接、抑制細胞mRNA聚腺苷酸化、抑制含poly(A)mRNA的核-胞漿轉運、刺激病毒蛋白合成)的改變，可有助于通過在豬流感病毒NS1基因中引入突變來實現所需的減毒表型。
本發明減毒豬流感病毒包括豬流感NS1基因的突變，該突變減弱NS1基因產物拮抗細胞干擾素反應的能力。在一個實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包括含有豬流感病毒NS1基因突變的基因組，該突變減弱NS1基因產物拮抗細胞干擾素反應的能力，并且允許該減毒病毒以感染復數(MOI)為0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之間，或者MOI為0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在細胞(例如，人細胞(例如，PerC6，來自被腺病毒5的E1區轉化的人胚胎視網膜母細胞的產病毒細胞株)、小鼠細胞、雞細胞(例如，雞胚胎成纖維細胞)、大鼠細胞、鳥細胞或豬細胞(例如，PK(D1)、PK(15)細胞、PK13細胞、NSK細胞、LLC-PK1細胞、LLC-PK1A細胞、ESK-4細胞、ST細胞、PT-K75細胞、PK-2a/CL13或SJPL細胞))中生長到滴度比野生型豬流感病毒低約1至約100倍、約5至約80倍、約20至約80倍或約40至約80倍、約1至約10倍、約1至約5倍、約1至約4倍、約1至約3倍、約1至約2倍、或者約1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，這可以在相同增殖條件下，在感染后約2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天測定。減毒的和野生型豬流感病毒的滴度可利用本領域公知和本發明所述的任何技術來測定(例如，血細胞凝集試驗、空斑試驗、蛋感染劑量(EID50)、組織培養感染劑量(TCID50)等)，病毒可在本發明所述或本領域公知的條件下增殖(例如，在豬細胞、MDCK細胞(例如，在MEM、10％v/v胎牛血清(FCS)、1％青霉素/鏈霉素中，在37℃、5％CO2的濕化培養箱中)或在含胚胎的雞蛋中(例如，在靜止培養箱中，在37℃、55％相對濕度下))。可選擇地，可在無血清或低血清含量(例如，TPCK胰蛋白酶)培養基生長的細胞(例如，豬細胞、MDCK細胞等)中增殖病毒。在一個實施方案中，將本發明的減毒豬流感病毒的生長與具體的標準或參考比較，例如，與野生型豬流感病毒A/Swine/Texas/4199-2/98比較。
在具體實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包括含豬流感NS1基因突變的基因組，該突變減弱NS1基因產物拮抗細胞干擾素反應的能力，并且允許該減毒病毒以感染復數(MOI)為0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之間，或者MOI為0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、10、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在豬細胞中生長到滴度比野生型豬流感病毒低約1至約100倍、約5至約80倍、約20至約80倍或約40至約80倍、約1至約10倍、約1至約5倍、約1至約4倍、約1至約3倍、約1至約2倍、或者約1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，這可以在相同增殖條件下，在感染后約2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天測定。減毒的和野生型豬流感病毒的滴度可利用本領域公知和本發明所述的任何技術來測定(例如，血細胞凝集試驗、空斑試驗、蛋感染劑量(EID50)、組織培養感染劑量(TCID50)等)，病毒可在本發明所述或本領域公知的條件下增殖(例如，在豬細胞、MDCK細胞(例如，在MEM、10％v/v胎牛血清(FCS)、1％青霉素/鏈霉素中，在37℃、5％CO2的濕化培養箱中)或在含胚胎的雞蛋中(例如，在靜止培養箱中，在37℃、55％相對濕度下))。可選擇地，可在無血清或低血清含量(例如，TPCK胰蛋白酶)培養基生長的細胞(例如，豬細胞、MDCK細胞等)中增殖病毒。
具有所需表型的減毒豬流感病毒本身可做為疫苗、藥物制劑或免疫原性制劑的活性成分。可選擇地，該減毒豬流感病毒可用作重組制備疫苗或免疫原性制劑的載體或“骨架”。為此，“反向遺傳學”可用來在作為“親代”株的減毒豬流感病毒中進行工程化突變或引入外源抗原決定簇。以這種方式，疫苗可以被設計成針對病毒株變體進行免疫，或者可供選擇地針對完全不同的感染因子或疾病抗原(例如，腫瘤抗原)進行免疫。例如，該減毒豬流感病毒可被工程化以表達其它預先選定的病毒株的中和性抗原表位。可選擇地，其它病毒的抗原決定簇可被構建到該減毒豬流感病毒中。可選擇地，非病毒感染病原體(例如，寄生蟲、細菌、真菌)的抗原決定簇抗能夠被構建到該豬流感病毒中。
本發明提供包括給予本發明疫苗制劑以預防免疫個體的方法。在一個實施方案中，本發明提供了包括給予個體有效量的本發明疫苗制劑的方法。在某些實施方案中，給予個體的疫苗制劑劑量為約102至約108pfu、約103至約107pfu或約104至約5×106pfu。在其它實施方案中，所給予的疫苗制劑劑量為102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107或108pfu。在其它實施方案中，給予個體的本發明免疫原性制劑的劑量為約102至約108pfu、約103至約107pfu或約104至約5×106pfu。在另外一些實施方案中，給予個體的本發明免疫原性制劑的劑量為102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107或108pfu。在具體實施方案中，所述個體為驢、斑馬、駱駝、狗、鳥(例如，鴨子)。在優選的實施方案中，所述個體為豬。
本發明提供了包含本發明的減毒豬流感病毒的免疫原性制劑和包括給予個體本發明免疫原性制劑來誘導免疫反應，以治療、控制或預防豬流感病毒感染或與其相關的不適或癥狀、豬流感病毒感染以外的其它感染或與其相關的不適或癥狀、或者下述不適(該減毒豬流感病毒可用作載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應)的方法。在一個實施方案中，本發明提供包括給予個體有效量的本發明免疫原性制劑來誘導免疫反應，以治療、控制或預防豬流感病毒感染或與其相關的不適或癥狀、豬流感病毒感染以外的其它感染或與其相關的不適或癥狀、或者下述不適(該減毒豬流感病毒可用作載體來誘導針對與該不適相關的特定抗原的免疫反應)的方法。在某些實施方案中，給予個體的本發明免疫原性制劑的劑量為約102至約108pfu、約103至約107pfu或約104至約5×106pfu，或者約104至約107pfu。在其它實施方案中，給予個體的本發明免疫原性制劑的劑量為102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107或108pfu。在具體實施方案中，所述個體為驢、斑馬、駱駝、狗、鳥(例如，鴨子)。在優選的實施方案中，所述個體為豬。
在個體中誘導有力的IFN反應的減毒豬流感病毒也可用于藥物制劑中，以預防或治療其它感染或IFN可治療性疾病例如癌癥。在這方面，可以改變該減毒豬流感病毒的趨向性，將病毒在體內施用(in vivo)或體外轉移再回輸(ex vivo)使之靶向所期望的靶器官、組織或細胞。利用此方法，可在靶點局部誘導IFN反應，從而避免系統性IFN治療的副作用或使之最小化。為此目的，可將該減毒豬流感病毒工程化以表達對靶器官、組織或細胞受體特異的配體。
本發明提供包括給予本發明藥物制劑來預防、控制或治療個體的豬流感病毒感染以外的其它感染、或者不是由豬流感病毒引起的IFN-可治療性疾病、或者由豬流感病毒引起的IFN-可治療性疾病的方法。在一個實施方案中，本發明提供包括給予有效量的本發明藥物制劑來預防、控制或治療個體的豬流感病毒感染以外的其它感染、或者不是由豬流感病毒引起的IFN-可治療性疾病、或者由豬流感病毒引起的IFN-可治療性疾病的方法。在某些實施方案中，給予個體的藥物制劑劑量為約102至約108pfu、約103至約107pfu、約104至約5×106pfu、或約104至約1012pfu。在其它實施方案中，給予個體藥物制劑的劑量為102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1012pfu。在具體實施方案中，所述個體為驢、斑馬、駱駝、狗、鳥(例如，鴨子)。在優選的實施方案中，所述個體為豬。
本發明提供包括給予本發明藥物制劑以預防、控制或治療個體癌癥的方法。在一個實施方案中，本發明提供包括給予有效量的本發明藥物制劑以預防、控制或治療個體癌癥的方法。在某些實施方案中，給予個體藥物制劑的劑量為約102至約108pfu、約103至約107pfu、約104至約5×106pfu或約104至約1012pfu。在其它實施方案中，給予個體藥物制劑的劑量為102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1012pfu。
申請人已經證明，干擾素拮抗活性受損的減毒豬流感病毒在體內復制產生的滴度低于用野生型豬流感病毒所測得的滴度，但該滴度足以誘導免疫的和細胞因子反應。因此，減弱但不消除該豬流感病毒的IFN拮抗活性的突變對于疫苗制劑是優選的。可選擇這樣的病毒在常規和非常規培養基中生長，并具有中等毒力。
本發明提供含有(或者，包含)本發明豬流感病毒的細胞。在具體實施方案中，細胞含有/包含遺傳工程化的豬流感病毒。在某些實施方案中，細胞中含有的減毒豬流感病毒被工程化以編碼來自另一病毒的抗原決定簇或腫瘤抗原。根據此實施方案，該減毒豬流感病毒的基因組可以包括至少一個來自不同病毒的片段。任何細胞都可以含有或包含本發明減毒豬流感病毒，或被該病毒感染，這些細胞包括但不限于MDCK細胞、PK細胞、Vero細胞、原代人臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)、H292人上皮細胞株、HeLa細胞和豬胚胎腎細胞RES。在優選的實施方案中，所述細胞為豬細胞或豬細胞株。在某些實施方案中，所述細胞(例如，豬細胞或豬細胞株)為干擾素缺陷的。
本發明包括用培養基例如細胞、細胞株和含胚蛋來增殖本發明的減毒豬流感病毒。在一個實施方案中，本發明提供制備疫苗、免疫原性制劑和藥物制劑的方法，包括在培養基中增殖本發明的減毒豬流感病毒，并收集子代病毒，其中培養基為細胞、細胞株或含胚蛋。在某些實施方案中，培養基為IFN缺陷系統。示例性的IFN缺陷系統包括但不限于早期含胚蛋(例如，6-10天、6-9天、6-8天或6-7天齡的含胚蛋)、IFN缺失的細胞株(例如VERO細胞或遺傳工程化細胞株例如STAT1敲除的細胞)。含胚蛋或用抑制IFN系統的化合物(包括藥物、抗體、反義核酸、核酶等)預處理的細胞株也可用作IFN缺陷系統。此外，IFN系統缺陷的蛋，例如由STAT1陰性的鳥特別是家禽包括但不限于轉基因雞、鴨或火雞生的蛋，可用作IFN缺陷系統。
5.1IFN拮抗活性改變的突變株的產生根據本發明，可選擇并使用任何IFN拮抗活性降低的突變豬流感病毒或病毒株。在一個實施方案中，可選擇拮抗細胞IFN反應的能力受損的天然存在的突變株或變體、或自然發生的豬流感病毒突變株。在另一實施方案中，可以通過將病毒暴露于誘變劑例如紫外線輻射或化學誘變劑、或者通過多次傳代和/或在非許可宿主中傳代產生突變的豬流感病毒。可在差異生長系統中篩選來選擇IFN拮抗劑功能受損的那些突變株。因為A型豬流感病毒具有分段基因組，通過重組可將該減毒表型轉移至具有所需抗原的另一株中(即，通過減毒病毒和所需株的共感染，并選擇表現兩種表型的重組體)。在具體實施方案中，本發明的豬流感病毒并非天然存在的病毒。在另一具體實施方案中，本發明的豬流感病毒為遺傳工程化病毒。在另一具體實施方案中，本發明不包括在NS1基因中具有天然發生的突變的豬流感病毒。在另一實施方案中，本發明不包括在NS1基因中有突變的已知豬流感病毒。在具體實施方案中，本發明的豬流感病毒包含來自人流感病毒的全部和部分NS1基因。
利用“反向遺傳學”方法可將突變工程化到豬流感病毒中。以此方式，賦予減毒表型的天然的或其它突變可被工程化到疫苗株中。例如，可以通過工程化實現豬流感病毒IFN拮抗活性的基因編碼區(即，豬流感病毒的NS1)的缺失、插入和取代。也可考慮豬流感病毒IFN拮抗活性的基因非編碼區的缺失、插入和取代。為此，可工程化使那些負責轉錄、復制、多聚腺苷酸化和/或包裝IFN拮抗活性基因的信號發生突變。這種突變(例如啟動子的突變)可下調豬流感病毒IF拮抗活性基因的表達。可使啟動子發生突變，例如通過啟動子穿梭(promotershuffling)(例如，B型流感病毒啟動子))突變，或在NS1基因的非編碼區發生突變。可調節豬流感病毒IFN拮抗活性基因的表達(即，豬流感病毒NS1基因)的豬流感病毒基因突變也在可用于本發明的病毒范圍內。
本發明還提供包括包含NS1基因片段突變的基因組的豬流感病毒，該突變可以不導致IFN拮抗活性改變或IFN誘導表型，但引起病毒功能改變和減毒表型，例如，改變對含poly(A)的mRNA核輸出的抑制、改變對前mRNA剪接的抑制、通過dsRNA螯合(sequestering)改變對PKR活化的抑制、對病毒RNA翻譯作用的改變、和改變對宿主mRNA多聚腺苷酸化的抑制(例如，參見Krug inTextbook of Influenza，Nicholson等編.1998，82-92，以及其中引用的文獻)。
反向遺傳學技術涉及制備合成的重組病毒RNA，該重組RNA包含豬流感病毒RNA的非編碼區，該非編碼區對病毒聚合酶的識別和產生成熟病毒體所需的包裝信號是必需的。從重組DNA模板合成重組RNA并與純化的病毒聚合酶復合體在體外重建來形成重組核蛋白(RNP)，該核蛋白可用于轉染細胞。如果在轉錄體外或者體內合成的RNA時存在病毒聚合酶蛋白，會實現更有效的轉染。合成的重組RNP可被恢復至感染性病毒顆粒中。上述技術公開在1992年11月24日批準的美國專利第5,166,057號；1998年12月29日批準的美國專利第5,854,037號；1996年2月20日公開的歐洲專利公開EP 0702085A1；美國專利申請系列號09/152,845；1997年4月3日公開的PCT國際專利公開WO97/12032；1996年11月7日公開的WO96/34625；歐洲專利公開EP-A780475；1999年1月21日公開的WO 99/02657；1998年11月26日公開的WO 98/53078；1998年1月22日公開的WO 98/02530；1999年4月1日公開的WO 99/15672；1998年4月2日公開的WO 98/13501；1997年2月20日公開的WO 97/06270；以及1997年6月25日公開的EPO 780 475A1中，本發明將上述每一篇全部引入作為參考。
也可采用無輔助質粒技術來工程化減毒豬流感病毒。對于無輔助質粒技術的描述參見，例如國際專利公開WO 01/04333；美國專利第6,649,372號；Fodor等，1999，J.Virol.739679-9682；Hoffmann等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA976108-6113；及Neumann等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 969345-9350，本發明將這些文獻全部引入作為參考。
反向遺傳學方法或無輔助質粒技術產生的減毒病毒可用于本發明所述的疫苗、免疫原性制劑和藥物制劑。反向遺傳學技術或無輔助質粒技術也可用于將其它突變工程化到對疫苗制劑、免疫原性制劑和藥物制劑重要的其它病毒基因中，即，有用的疫苗株變體的抗原決定簇可被工程化到減毒豬流感病毒中。可選擇地，完全外源的抗原決定簇，包括來自其它病毒或非病毒病原體的抗原可被工程化到減毒株中。例如，非相關病毒的抗原、寄生蟲抗原、細菌或真菌抗原或腫瘤抗原可被工程化到減毒株中，例如豬增殖和呼吸綜合征病毒、豬巨細胞病毒、豬呼吸道冠狀病毒、豬腦心肌炎病毒、豬流行性腹瀉病毒的抗原決定簇；以及非病毒病原體的抗原顯性基因，例如細菌包括但不限于布魯氏菌(Brucella suis)和寄生蟲包括但不限于蛔蟲(Ascaris suum)、鞭蟲(Trichuris suis)的抗原決定簇；或腫瘤抗原例如癌胚抗原(CEA)、乳腺癌抗原例如EGFR(上皮生長因子受體)、HER2抗原(p185HER2)、HER2neu抗原決定簇、癌抗原-50(CA-50)、與乳腺癌相關的癌抗原15-3(CA15-3)、癌癥相關抗原(CAA)、黑素瘤抗原以及黑素瘤相關抗原100、25和150)。可供選擇地，體內改變病毒趨向性(tropism)的抗原決定簇可被工程化到本發明的嵌合減毒病毒中。
在具體實施方案中，可以聯合使用反向遺傳學技術或無輔助質粒技術和重組技術對具有豬流感病毒所需抗原決定簇的減毒病毒進行工程化。例如，減毒豬流感病毒(通過例如反向遺傳學技術、無輔助質粒技術或其組合生成的)和攜帶所需疫苗抗原決定簇的株(通過例如自然選擇、誘導突變、通過反向遺傳學技術、無輔助質粒技術或其組合生成的)可被共轉染至允許分段基因組重組的宿主。可以隨后選擇既表現減毒表型又表現所需抗原決定簇的重組體。在具體實施方案中，可使用重組技術從親代豬流感病毒株(天然突變株、誘導突變的病毒或遺傳工程化病毒)中將減毒表型轉移至不同病毒株(野生型病毒、天然突變株、誘導突變的病毒或遺傳工程化病毒)。
在具體實施方案中，本發明提供包含豬流感病毒NS1基因含有突變的基因組的減毒豬流感病毒，該突變降低NS1基因產物拮抗細胞干擾素反應的能力。根據此實施方案，該減毒豬流感病毒優選被遺傳工程化。
本發明的減毒豬流感病毒可具有以下特征中的一種或多種或以下特征的任意組合通過標準的干擾素分析測定，誘導干擾素活性的能力水平比野生型豬流感病毒(例如A/Swine/Texas/4199-2/98)低例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％；當在相同的條件下生長時(例如，以MOI為0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5或10接種，在PK細胞、PK(D1)細胞、PK(15)細胞、PK13細胞、NSK細胞、LLC-PK1細胞、LLC-PK1A細胞、ESK-4細胞、ST細胞、PT-K75細胞、PK-2a/CL 13細胞或SJPL細胞中生長，并在MDCK細胞中分析)，病毒滴度比野生型豬流感病毒(例如A/Swine/Texas/4199-2/98)低1至50、2至25、2至10或者3至7倍；當從感染的豬BALF中分離、用MDCK細胞進行空斑試驗時，病毒滴度比野生型豬流感病毒(例如，A/Swine/Texas/4199-2/98)低1至10倍、1至5倍、5-10倍、10至500倍、20至250、20至100或40至80倍；或者引起感染的豬肺損傷的能力降低。
在具體實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包含含有豬流感NS1基因的突變的基因組，該突變減弱NS1基因產物拮抗細胞干擾素反應的能力，并且允許該減毒病毒以感染復數(MOI)為0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之間，或者MOI為0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在細胞(例如，人細胞(例如，PerC6，來自被腺病毒5的E1區轉化的人胚胎視網膜母細胞的產病毒細胞株)、小鼠細胞、雞細胞(例如，雞胚胎成纖維細胞)、大鼠細胞、鳥細胞或豬細胞(例如，PK(D1)細胞、PK(15)細胞、PK13細胞、NSK細胞、LLC-PK1細胞、ILC-PK1A細胞、ESK-4細胞、ST細胞、PT-K75細胞、PK-2a/CL 13或SJPL細胞))中生長到滴度比野生型豬流感病毒低約1至約100倍、約5至約80倍、約20至約80倍或約40至約80倍、約1至約10倍、約1至約5倍、約1至約4倍、約1至約3倍、約1至約2倍、或者約1、2、3、4、5、6、7、8、或約1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，這可以在感染后約2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，通過對豬BALF或豬細胞上清液進行血細胞凝集試驗測定，或者病毒在MDCK細胞產生蝕斑測定。在一個實施方案中，將本發明減毒豬流感病毒的生長與具體標準或參照比較，例如與野生型豬流感病毒A/Swine/Texas/4199-2/98比較。根據這些實施方案，減毒病毒可以被遺傳工程化來含有或表達非豬流感病毒核酸序列，例如外源病原體或腫瘤抗原的抗原決定簇。優選地，該非豬流感病毒序列不包括改變病毒減毒表型的核酸序列。因此，不將編碼具有干擾素拮抗活性的蛋白、多肽或肽的核酸序列工程化到豬流感病毒中。
本發明提供了包含在2、3、4或更多個豬流感病毒基因中含有至少2、至少3至少4種或更多突變的基因組的減毒豬流感病毒，其中這些突變中的至少1個位于NS1基因，并有助于或導致(直接或間接)病毒減毒和/或病毒拮抗細胞干擾素反應的能力減弱。在具體實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包含在2、3、4或更多個豬流感病毒基因中含有至少2、至少3、至少4種或更多突變的基因組，其中這些突變中的至少1個位于NS1基因中，并導致NS1基因產物拮抗細胞干擾素反應的能力減弱，并且使得該減毒病毒以MOI為0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之間，或者MOI為0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0時，在豬細胞中生長到滴度比野生型豬流感病毒(A/Swine/Texas/4199-2/98)低約1至約100倍、約5至約80倍、約20至約80倍或約40至約80倍、約1至約10倍、約1至約5倍、約1至約4倍、約1至約3倍、約1至約2倍、或者約1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，這可以在感染后約2至10天、3至7天、3至5天、或者2、3、5、6、7、8、9、10天，在相同增殖條件下，通過血細胞凝集試驗測定。在另一實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包含在2個、3個、4個或更多個豬流感病毒基因中含有至少2、3、4種或更多突變的基因組，其中這些突變中的至少1個位于NS1基因并導致該病毒的減毒，并且使得該減毒病毒以MOI為0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之間，或者MOI為0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在豬細胞中生長到滴度比野生型豬流感病毒(A/Swine/Texas/4199-2/98)低約1至約100倍、約5至約80倍、約20至約80倍或約40至約80倍、約1至約10倍、約1至約5倍、約1至約4倍、約1至約3倍、約1至約2倍、或者約1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，這可以在感染后約2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，在相同增殖條件下(例如在MDCK細胞中)，通過血細胞凝集試驗測定。根據這些實施方案，該減毒病毒具有受損的干擾素拮抗表型并且該病毒可以被遺傳工程化來含有或表達非豬流感病毒核酸序列，例如外源病原體的抗原決定簇(例如，豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬巨細胞病毒、豬呼吸道冠狀病毒、豬腦心肌炎病毒、豬流行性腹瀉病毒的抗原決定簇，以及非病毒豬病原體的抗原決定簇，例如細菌和寄生蟲)，或腫瘤抗原。優選地，所述非豬流感病毒序列(異源序列)不包括改變病毒減毒表型的核酸序列。因此，編碼具有干擾素拮抗活性的蛋白、多肽和肽的核酸序列優選不被工程化到豬流感病毒中。
任何導致所需表型的突變(優選地，拮抗細胞干擾素反應的能力受損)都可以被引入豬流感病毒NS1基因中。可包括在或引入豬流感病毒NS1基因的突變類型的實例包括但不限于缺失、替代、插入以及上述的組合。一種或多種突變可位于整個NS1基因的任意處(例如，氨基末端、羧基末端或之間的某些地方)和/或NS1基因的調控因子。在具體實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包含在氨基末端含有突變(例如，缺失或取代)的豬流感病毒NS1基因的基因組。在優選的實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包含在羧基末端含有突變(例如，缺失或取代，優選缺失)的豬流感病毒NS1基因的基因組。在另一實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包含在豬流感病毒NS1基因中含有突變的基因組，該突變導致自NS1羧基末端缺失5、優選10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、73、75、80、85、90、95、99、100、105、110、115、119、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170或175個氨基酸殘基，或者自NS1羧基末端缺失5-170、25-170、50-170、100-170、100-160或105-160氨基酸殘基。在另一實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒包含在豬流感病毒NS1基因中含突變的基因組，該突變導致除了氨基酸殘基1-126、氨基酸殘基1-120、氨基酸殘基1-115、氨基酸殘基1-110、氨基酸殘基1-100、氨基酸殘基1-99、氨基酸殘基1-95、氨基酸殘基1-85、氨基酸殘基1-80、氨基酸殘基1-75、氨基酸殘基1-73、氨基酸殘基1-70、氨基酸殘基1-65或氨基酸殘基1-60外(其中氨基末端氨基酸為序號1)，其它所有氨基酸殘基都缺失。根據這些實施方案，減毒豬流感病毒優選是遺傳工程化的。在優選的實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒為TX/98/del 126、TX/98/del 99或TX/98/del 73。在更優選的實施方案中，該減毒的豬流感病毒是TX/98/del 126。在更加優選的實施方案中，該減毒的豬流感病毒是TX/98/del 99。
本發明的減毒豬流感病毒可以是表達異源序列例如其它疫苗株的抗原的嵌合病毒(例如，利用反向遺傳學、重組或無輔助質粒技術)。可選擇地，可以利用反向遺傳學、重組或無輔助物質粒技術對該減毒流感病毒進行遺傳工程化，來表達全外源的抗原決定簇，例如其它感染性病原體的抗原、腫瘤抗原或靶向抗原。在某些實施方案中，該減毒豬流感病毒表達來自其它豬感性因子、非豬感染性因子、豬或其它類型的腫瘤抗原(例如，癌胚抗原(CEA)、乳腺癌抗原例如EGFR(上皮生長因子受體)、HER2抗原(p185HER2)、HER2neu抗原決定簇、癌抗原-50(CA-50)、癌抗原15-3(CA15-3)、乳腺癌相關抗原、癌癥相關抗原(CAA)、黑素瘤抗原，以及黑素瘤相關抗原100、25和150)。在其它實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒可包含來自另一種病毒的片段。因為NS RNA片段在所述8種病毒RNA中是最短的，與其它病毒基因相比，NS RNA可能會包容更長異源序列的插入。再者，所述NS RNA片段指導被感染細胞中高水平蛋白的表達，表明其可以是外源抗原插入的理想片段。示例性序列包括豬增殖和呼吸綜合征病毒、豬巨細胞病毒、豬呼吸道冠狀病毒、豬腦心肌炎病毒、豬流行性腹瀉病毒的抗原決定簇以及非病毒豬病原體(例如細菌包括但不限于布魯氏菌，以及寄生蟲包括但不限于蛔蟲(Ascaris suum)、鞭蟲(Trichuris suis))的抗原決定基。
優選地，該異源序列不是改變所述病毒減毒表型的核酸序列。因此，優選地，編碼具有干擾素拮抗活性的蛋白、多肽、肽的核酸序列不被工程化到該豬流感病毒中。在某些實施方案中，該嵌合病毒表達腫瘤抗原。在其它實施方案中，該嵌合病毒表達外源病原體的抗原決定簇。
5.2減毒豬流感病毒的選擇本發明包括選擇具有所需表型的豬流感病毒的方法，該病毒即減毒豬流感病毒或具有低IFN活性的(即，在相同的條件下與野生型豬流感病毒例如A/Swine/Texas/4199-2/98相比，降低5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或更多)或沒有IFN拮抗活性的豬流感病毒，無論該豬流感病毒是否獲自天然變體、自發變體(即，在病毒增殖中進化的變體)、誘導突變的天然變體、重組體和/或遺傳工程化的病毒(參見例如，美國專利第6,635,416號)。在差異生長試驗中可以最好地篩選這種病毒，該試驗比較病毒在IFN缺失和有IFN活性的宿主系統中的生長。選擇在IFN缺失宿主系統中比有IFN活性的宿主系統中生長更好的病毒；優選地，選擇與有IFN活性系統相比，在IFN缺陷系統中生長滴度高出至少1個對數、至少2個對數、至少3個對數、或1至50、1至25、1至20、1至10或1至5對數的病毒。IFN缺陷系統的實例包括但不限于，初期含胚卵(例如，6至10天、6至9天、6至8天或6至7天齡含胚卵)、IFN缺失細胞株(例如VERO細胞或遺傳工程化的細胞株例如STAT1敲除、PKR敲除等)。用抑制IFN系統的化合物(包括藥物、抗體、反義核酸、核酶等)預處理的含胚蛋或細胞株，也可用作IFN缺失的系統。此外，IFN系統缺陷的蛋，例如STAT1陰性的鳥特別是家禽(包括但不限于轉基因雞、鴨或火雞)產的蛋可用作IFN缺陷系統。與6-7、6-8或6-9天齡的蛋相比，對在10天齡蛋中顯示至少1至50、1至25、1至20、1至10或1至5指數滴度降低的減毒豬流感病毒可以認為其抑制IFN反應的能力減弱。
為了篩選的目的，可以用IFN短暫缺失的系統代替遺傳操作系統。例如，可用抑制IFN生成和/或IFN反應組分的化合物(例如，藥物、抗IFN抗體、抗IFN受體抗體、PKR抑制劑、反義分子和核酶等)來處理宿主系統。可在有IFN活性的未處理的對照與IFN缺失處理的系統中比較減毒豬流感病毒的生長。
可以在例如表達IFN和IFN反應組分的多種細胞、細胞株或動物模型系統與IFN或IFN反應組分缺陷的細胞、細胞株或動物模型系統中比較豬流感病毒的生長(通過滴度測定)。可利用本領域公知的用于在細胞株中增殖病毒的技術(參見例如，下述工作實施例)。可以在有IFN活性的細胞株與IFN缺失的遺傳工程化細胞株中比較豬流感病毒的生長。
可以利用IFN試驗體系(例如，其中由IFN反應性啟動子控制報告基因表達的基于轉錄的分析系統)篩選豬流感病毒。可檢測感染細胞和未感染細胞中報告基因的表達來識別有效誘導IFN反應但不拮抗IFN反應的病毒。例如，在干擾素刺激性反應元件(例如，ISG-54K基因的IFN刺激性啟動子)的控制下，可工程化測試細胞以瞬時或組成性地表達報告基因例如熒光素酶報告基因或氯霉素轉移酶(CAT)報告基因(Bluyssen等，1994，Eur.J.Biochem.220395-402)。用待檢測的豬流感病毒感染細胞，并將報告基因的表達水平與未感染細胞或用野生型豬流感病毒感染的細胞比較。報告基因表達水平在待檢測豬流感病毒感染后增加說明該豬流感病毒誘導IFN反應。可選擇地，可以在待檢測的減毒豬流感病毒感染后通過檢測IFN依賴性轉錄的活化來確定對IFN反應的誘導。可以通過本領域公知的技術(例如，Northern印跡、Western印跡、PCR等)分析已知由IFN誘導的基因的表達(例如Mx、PKR、2-5-寡腺苷酸化合成酶、I類主要組織相容性復合體(MHC)等)。IFN反應的誘導也可通過檢測用待檢測豬流感病毒感染后IFN途徑組分的磷酸化狀態來確定(例如，IRF-3，其響應雙鏈RNA而被磷酸化)。在對I型IFN響應中，Jak1激酶和TyK2激酶、IFN受體的亞單位、STAT1和STAT2被快速酪氨酸磷酸化。因此，為確定該豬流感病毒是否誘導IFN反應，用待檢測的突變病毒感染細胞例如293細胞的細胞，感染后裂解該細胞。從該細胞裂解物的中利用特異性多克隆血清或抗體來免疫沉淀IFN途徑組分，例如Jak1激酶或TyK2激酶，而且激酶的酪氨酸磷酸化狀態可通過抗磷酸酪氨酸抗體的免疫印跡分析來確定(例如，參見Krishnan等.1997，Eur.J.Biochem.247298-305)。豬流感病毒感染后，任何IFN途徑組分磷酸化狀態的增強都表明該豬流感病毒誘導IFN反應。
此外，待檢測豬流感病毒感染后對IFN反應的誘導可通過檢測結合特定DNA序列的能力來確定，或檢測病毒感染所誘導的轉錄因子移位，例如，IRF3、STAT1、STAT2等。特別是，響應I型IFN、STAT1和STAT2被磷酸化并從細胞漿中移至細胞核。通過本領域公知的技術例如凝膠電泳遷移率實驗、細胞染色等可檢測結合特定DNA序列的能力或轉錄因子的移位。其它可以使用的試驗參見美國專利申請第09/829,711號，本發明將其全部引入作為參考。然而，在優選的實施方案中，采用差異生長試驗來選擇具有所需表型的病毒，因所用的宿主系統(有IFN活性比較IFN缺失)施加了適當的選擇壓力。
本發明的減毒豬流感病毒任選地在豬細胞(包括原始、次級豬細胞和豬細胞株)中篩選。可采用任何豬流感病毒能夠生長的豬細胞。優選的豬細胞包括豬腎臟細胞株、豬睪丸細胞株和豬肺。代表性豬細胞包括但不限于PK(D1)細胞、PK(15)細胞、PK13細胞、NSK細胞、LLC-PK1細胞、LLC-PK1A細胞、ESK-4細胞、ST細胞、PT-K75細胞、PK-2a/CL 13細胞或SJPL細胞。
在相同生長條件下，通過與例如A/Swine/Texas/4199-2/98的野生型豬流感病毒比較，可在豬細胞中篩選本發明的豬流感病毒。與野生型豬流感病毒比較，根據以下特點來挑選減毒豬流感病毒例如較低的生長率、豬感染后較少的肺損傷、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中降低的病毒滴度、以及鼻擦拭簽減少的檢出。這種減毒豬流感病毒具有降低的毒力，因為與野生型豬流感病毒相比它們在有干擾素活性的系統中復制能力降低，但可產生免疫反應。
可用野生型豬流感病毒例如A/Swine/Texas/4199-2/98和NS1突變株以特定MOI來感染豬細胞，并且在感染后的特定時間測定上清液中的病毒滴度。可以用0.0005和0.001、0.001和0.01、0.01和0.1、0.1和1或1和10的MOI，或者0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5或10的MOI感染豬細胞。在一個實施方案中，采用0.001的MOI。感染后約2至10天、3至7天、3至5天或2、3、4、5、6、7、8、9或10天可測定病毒的滴度。在具體實施方案中，可在感染后5天測定病毒滴度。在豬細胞中培養病毒后，可測定上清液中的病毒滴度。可采用任何檢測流感病毒滴度的系統。代表性系統如5.7節所述。在具體實施方案中，上清液中的病毒滴度可通過在不同時間點MDCK細胞中的空斑來確定。
本發明的選擇系統包括通過確定待測試減毒豬流感病毒感染細胞或蛋的提取物是否能夠提供對抗病毒感染的保護活性來檢測IFN誘導。更具體地，用待檢測的突變豬流感病毒或野生型豬流感病毒感染10天齡含胚雞蛋組。感染后大約15至20小時，收集尿囊液，并通過測定在組織培養細胞中針對豬流感病毒感染的保護活性的最高稀釋來檢測IFN活性。
也可以在豬體內評價本發明突變豬流感病毒的致病性。可以使用的試驗包括利用本領域公知的方法評估肺葉的肺損傷、鼻擦拭簽和測定支氣管肺泡灌洗液(BALF)中病毒滴度。
5.3減毒豬流感病毒的增殖本發明提供了在細胞(例如，豬細胞)、含胚蛋和動物中增殖減毒豬流感病毒的方法。本發明的減毒豬流感病毒可以用允許該病毒生長至一定滴度從而可以根據本發明使用的任何培養基來增殖。在具體實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒可在任何下述培養基中增殖該培養基允許該病毒生長至與野生型豬流感病毒株在有IFN活性培養基中測定的滴度相匹配的滴度。在另一實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒在IFN缺失的培養基中增殖。用于選擇本發明減毒豬流感病毒的培養基不一定用于增殖，反之亦然。
根據本發明的方法，可在細胞(例如，豬細胞)、含胚蛋和動物中生長的減毒豬流感病毒可選自天然存在的株、變體或突變株、誘導突變的病毒、重組體和/或遺傳工程化的病毒。本發明的方法包括培養該減毒豬流感病毒，優選利用適合的生長條件(參見例如，下述第6節描述的生長條件)，收集子代病毒。
在具體實施方案中，本發明的減毒豬流感病毒在豬細胞中增殖。根據此實施方案，豬細胞可以是或可以不是IFN缺失或產生較低水平的IFN。優選的豬細胞包括豬腎臟細胞株、豬睪丸細胞株和肺細胞株。代表性的豬細胞包括但不限于PK(D1)細胞、PK(15)細胞、PK13細胞、SJPL細胞、NSK細胞、LLC-PKl細胞、LLC-PKlA細胞、ESK-4細胞、ST細胞、PT-K75細胞和PK-2a/CL 13細胞。在另一具體實施方案中，該減毒豬流感病毒在雞細胞例如來自6天齡含胚蛋的雞胚纖維母細胞中增殖。
在某些實施方案中，本發明提供在含胚蛋(例如6至14天齡)中增殖本發明減毒豬流感病毒的方法。在其它實施方案中，初期或未成熟的含胚蛋可用來增殖本發明的減毒豬流感病毒。根據本發明，未成熟的含胚蛋包括小于10天齡的蛋，優選6至9天齡的蛋、6至8天齡、6至7天齡或6天齡的蛋。本發明未成熟的含胚蛋還包括人工模擬未成熟的最多或少于10天齡的蛋，這是由生長條件改變導致的，例如改變孵育溫度；用藥物處理；或導致蛋發育阻滯的任何其它改變，從而與10至12天齡的蛋比較IFN系統沒有充分發育。豬流感病毒可在含胚蛋的不同區域增殖，例如，尿囊腔。在某些實施方案中，含胚蛋為雞蛋。
本發明還包括培養和分離本發明減毒豬流感病毒的方法和IFN缺失培養基。參見例如，美國專利第6,573,079號，其被全部引入作為參考。可用于支持減毒豬流感病毒生長的IFN缺失培養基包括但不限于天然存在的細胞、細胞株、含胚蛋、和IFN缺陷系統例如Vero細胞、初期含胚蛋；工程化為IFN缺失的重組細胞或細胞株，例如來自STAT1敲除、IRF3敲除、IRF7敲除、PKR敲除等的IFN缺失細胞株；來自IFN缺失的鳥特別是家禽(例如雞、鴨和火雞)的含胚蛋，這樣的家禽包括喂養成為IFN缺失的鳥或轉基因鳥(例如，STAT1敲除)。在某些實施方案中，IFN缺失培養基不是Vero細胞和/或不是STAT1缺失細胞株。
宿主系統、細胞、細胞株、蛋或動物可被遺傳工程化來表達編碼IFN系統抑制劑的轉基因，例如，顯性-陰性的突變株例如STAT1缺失DNA結合區、反義RNA、核酶、IFN產成抑制劑、IFN信號產生抑制劑和/或由IFN誘導的抗病毒基因的抑制劑。應認識到，喂養或遺傳工程化的IFN缺失的動物會有些免疫損傷，應置于受控制的無疾病環境中。因此，應使用適合的手段(包括使用膳食抗生素)限制轉基因IFN缺失的動物暴露于感染因子的風險，例如小鼠、喂養的母雞、鴨、火雞等禽群。可供選擇地，宿主系統例如細胞、細胞株、蛋或動物可用抑制IFN產生和/或IFN途徑的化合物來處理，例如，靶向STAT1基因和/或由IFN誘導的抗病毒基因的藥物、抗體、反義分子、核酶分子。
本發明包括在IFN拮抗活性改變的細胞和細胞株(天然不具有IFN途徑、或具有缺陷的IFN途徑、或IFN系統系統有缺陷，例如與野生型細胞比較，IFN表達水平低)中培養和分離豬流感病毒的方法。在具體的實施方案中，本發明包括在來自6天齡含胚蛋的雞胚纖維母細胞、或Vero細胞、或IFN受損的含胚蛋(例如，6、7或8天齡的含胚蛋的未成熟含胚疋)中培養本發明減毒豬流感病毒的方法。在另一實施方案中，本發明包括在非Vero細胞中培養本發明的減毒豬流感病毒。
本發明提供在遺傳工程化的IFN缺失培養基中培養和分離本發明豬流感病毒的方法。本發明包括IFN系統所必需的基因(例如STAT1)突變的轉基因豬和鳥類，其可下出IFN缺失的蛋。本發明還包括表達顯性基因陰性的轉錄因子(dominant-negative transcription factors)(例如STAT1缺乏DNA結合區、核酶、反義RNA、IFN生成抑制劑、IFN信號發生抑制劑和IFN誘導的抗病毒基因的抑制劑)的轉基因鳥類。
本發明提供重組細胞株和動物特別是豬和鳥類，其中對于IFN合成、IFN途徑所必需的一種和多種基因和/或由IFN誘導的抗病毒基因，例如，干擾素受體、STAT1、PKR、IRF3、IRF7等已經被突變(例如，阻斷，即“敲除”)。重組動物可以是任何動物(例如小鼠、豬或鳥，例如，雞、火雞、母雞、鴨子等(參見例如，關于轉基因鳥類制備的綜述Sang，1994，Trends Biotechnol.12415；Perry等，1993，Transgenic Res.2125；Stern，CD.，1996，Curr Top Microbiol Immunol212195-206；和Shuman，1991，Experientia 47897，本發明將每一篇文獻全部引入作為參考))。在具體實施方案中，重組動物為豬。這種細胞株和動物可由本領域公知的用于阻斷細胞或動物染色體基因的任何方法來制備。這樣的技術包括但不限于原核顯微注射(Hoppe & Wagner，1989，U.S.專利號4,873,191)；逆轉錄病毒介導的生殖種系基因轉移(Van der Putten等，1985，Proc.Natl.Acad.ScL，USA826148-6152)；胚胎干細胞基因打靶(Thompson等，1989，Cell 56313)；胚胎電穿孔(Lo，1983，Mol Cell.Biol.31803)；和精子介導的基因轉移(Lavitrano等，1989，Cell57717)；等。這類技術的綜述參見Gordon，1989，Transgenic Animals，Intl.Rev.Cytol.115171，本發明將其全部引入作為參考。
特別是，STAT1敲除動物可通過促進染色體中的STAT1基因和已被生物失活的外源性STAT1基因(優選通過插入異源序列，例如，抗生物素抗性基因)之間的同源重組來制備。在小鼠基因組中用來阻斷基因的同源重組方法例如Capecchi(1989，Science 2441288)和Mansour等(1988，Nature 336348-352)所述。
簡言之，從作為基因敲除細胞或動物的同一物種的基因組DNA中分離全部或部分STAT1基因組克隆。可以利用本領域公知的任何用于分離基因組克隆的方法來分離STAT1基因組克隆(例如，用來自STAT1序列例如豬的STAT1(Genbank編號AB116564和NM_213769)和Meraz等1996，Cell 84431-442；Durbin等1996，Cell 84443-450所提供序列的探針來探測基因組文庫，本發明將其引入作為參考)。一旦分離基因組克隆后，將該克隆的全部或部分引入重組載體中。優選地，被引入部分克隆的載體含有部分STAT1基因外顯子，即含有STAT1蛋白編碼序列。不與STAT1序列同源的序列，優選正選擇性標記例如編碼抗生素抗性基因，被隨后引入STAT1基因外顯子。選擇性標志物優選可操作地連接至啟動子，更優選組成型啟動子。非同源性序列被引入STAT1編碼序列的任何將會阻斷STAT1活性的位置，例如，已經證明該位置的點突變或其它突變使STAT1蛋白功能失活的位置。例如但不限于，非同源性序列可插入至含全部或部分激酶結構域的STAT1蛋白部分的編碼序列(例如，編碼該激酶結構域的至少50、100、150、200或250氨基酸的核苷酸序列)。
正選擇性標記優選為新霉素抗性基因(neo基因)或潮霉素抗性基因(hygro基因)。啟動子可以是本領域公知的任何啟動子；例如啟動子可以是磷酸甘油激酶(PGK)啟動子(Adr等，1987，Gene 6065-74)，Pol II啟動子(Soriano等，1991，Cell64693-701)，或MC1啟動子，其為設計用于在胚胎衍生干細胞中表達的合成啟動子(Thomas&Capecchi，1987，Cell 51503-512)。使用選擇性標記例如抗生素抗性基因使得能夠選擇已經整合了打靶載體的細胞(例如，neo基因產物的表達賦予對G418的抗性，而hygro基因產物的表達賦予對潮霉素的抗性)。
在優選的實施方案中，用于與載體同源(與非同源相反)重組的負選擇性標記被插入STAT1基因組克隆插入的外面。例如，這種負選擇性標記為HSV胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tk)，該基因的表達使細胞對ganciclovir(更昔洛韋)敏感。負選擇性標記優選在啟動子(例如但不限于PGK啟動子、Pol II啟動子或MCl啟動子)的控制下。
當同源重組發生時，與STAT1基因同源的載體部分以及STAT1基因序列中的非同源插入被整合入染色體的STAT1基因中，并丟失該載體的剩余部分。因此，由于負選擇性標記在STAT1基因同源區域的外部，發生同源重組的細胞(或其后代)將不含有該負選擇性標記。例如，如果負選擇性標記為HSV-tk基因，那么已發生同源重組的細胞不會表達胸腺嘧啶激酶并在ganciclovir暴露后存活。與非同源重組(很可能該負選擇性標記也與STAT1序列和正選擇性標記一起被整合入基因組)相比，此過程使得能夠選擇已經發生同源重組的細胞。因此，已經發生非同源重組的細胞很可能表達胸腺嘧啶激酶并對ganciclovir敏感。
制備打靶載體后，用在該打靶載體中有唯一位點的限制性內切酶將其線形化，通過本領域公知的任何方法例如電穿孔將該線形化載體引入胚胎干(ES)細胞(Gossler等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 839065-9069)。如果該打靶載體包括正選擇性標記和負選擇性標記，在選擇性培養基中培養來篩選已經發生同源重組的ES細胞。例如，如果選擇性標記為neo抗性基因和HSV-tk基因，將細胞暴露于G418(例如，大約300μg/ml)和ganciclovir(例如，大約2μM)。
用于檢測基因型的本領域公知的任何技術(例如但不限于Southern印跡分析或聚合酶鏈式反應)可用于證明阻斷的STAT1序列已被同源重組到ES細胞基因組的STAT1基因中。因為STAT1基因組克隆的限制性圖譜是公知的，而且STAT1編碼序列也是公知的(參見Meraz等1996，Cell 84431，Durbin等.1996，Cell84443-450，本發明將其引入作為參考)，可以確定阻斷的和非阻斷的等位基因DNA的具體限制性內切片段或PCR擴增產物的大小。因此，通過分析限制性內切片段或PCR產物(它們的大小在阻斷的和阻斷的STAT1基因中不同)，可確定是否發阻斷STAT1基因的同源重組。
具有阻斷的STAT1位點的ES細胞可隨后通過顯微注射被導入胚泡中，然后利用常規技術將該胚泡植入小鼠子宮中。由植入的胚泡發育而來的動物嵌合了阻斷的等位基因。嵌合的雄性可與雌性雜交，而且這種雜交可設計成等位基因的生殖系傳遞與某種皮毛的顏色傳遞相聯系。可通過如上所述的Southern印跡或PCR分析來證實從組織樣品中分離的基因組DNA的等位基因生殖系傳遞。
可使用其產物對干擾素調節重要的任何基因。根據本發明可以使用的其它干擾素途徑突變包括Jak1、TyK2激酶缺陷形式或缺乏DNA結合區域的轉錄因子STAT1和STAT2(參見例如，Krishnan等，1997，Eur.J.Biochem.247298-305)。
為了純化病毒，通過公知的凈化方法例如梯度離心和柱層析，從細胞培養物中去處并從細胞組分中分離減毒豬流感病毒，并可利用本領域所屬技術人員公知的方法進行進一步分離，例如空斑試驗。
5.4減毒病毒的用途本發明所述減毒豬流感病毒可用作病毒載體制備異源蛋白產物，如美國專利第5,820,871號所述的，本發明將其全部引入作為參考。
本發明的減毒豬流感病毒可以在篩選試驗中用于鑒定具有干擾素拮抗功能的病毒蛋白，以鑒定能夠對拮抗細胞干擾素反應的能力受損的減毒病毒的復制進行補充的病毒蛋白，本發明的減毒豬流感病毒還可以在篩選試驗中用于鑒定抑制干擾素拮抗活性和抑制病毒復制的抗病毒試劑，如美國專利第6,635,416號所述，其本發明將其全部引入作為參考。
本發明的減毒豬流感病毒可用于制備用于診斷性免疫試驗、被動免疫治療和抗獨特型的抗體。例如，可將包含含有NS1基因突變和異源序列(例如，腫瘤抗原)的基因組的減毒豬流感病毒施用于個體(例如，豬)以產生抗體，隨后分離該抗體用于診斷性免疫試驗、被動免疫治療和抗獨特型抗體的制備。所制備的抗體可以通過本領域公知的標準技術來分離(例如，免疫親和層析、離心、沉淀等)，并用于診斷性免疫試驗、被動免疫治療和抗獨特型抗體的制備。被分離的抗體在用于被動免疫之前可對其進行修飾，例如，可以嵌合或人源化該抗體。對于嵌合和人源化抗體的綜述參見例如，美國專利第4,444,887號和第4,716,111號；以及國際
發明者彼得·帕雷斯, 阿道夫·加西亞-塞斯特, 理查德·J·威比, 喬根·A·里希特, 羅伯特·韋伯斯特, 凱利·M·萊格 申請人:紐約大學西奈山醫學院, 圣祖德兒童研究醫院, 美國政府(美國農業部代表)