專利名稱：一種豬流感病毒毒株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物病毒領域，涉及病毒新毒種，具體涉及ー種豬流感病毒毒株及其生物學特性。
背景技術：
2010年10月，漯河市某豬場豬群7頭I月齡豬只先后發病，其中一頭小豬在發病兩天后死亡，發病豬臨床癥狀為流鼻涕，發燒和咳嗽。采集發病豬的鼻拭子，并立即保存于含抗生素的DMEM培養液中，置于冰盒中并在24h內送至實驗室。鼻拭子進行漩渦震蕩高速離心處理，取上清接種10日齡雞胚尿囊腔接種。結果分離到ー株有血凝性的疑似流感病毒，經分子鑒定后確定其為H1N2豬流感病毒。
發明內容
本發明本發明的目的是提供ー種豬流感病毒毒株，分類命名豬流感病毒，拉丁文學名swine influenza virus,簡稱SIV,保藏單位中國典型培養物保藏中心,保藏單位簡稱CCTCC，保藏單位地址武漢市武漢大學，保藏日期2012年5月15日，保藏編號CCTCCNO V201223o本發明的技術方案是ー種豬流感病毒毒株，豬流感病毒(swine influenzavirus), CCTCC NO :V201223。所述的豬流感病毒毒株具有下述特點
(1)所述毒株的核酸類型是單股負鏈RNA病毒，由大小不等的8個獨立節段組成，分別是PB2 基因片段長度為 2341 bp，PBl 為 2341 bp，PA 為 2233 bp，HA 為 1777 bp，NP 為 1565bp, NA 為 1466 bp, M 為 1027 bp, NS 為 890 bp。
(2)所述毒株對脂溶劑こ醚、氯仿和酸敏感；屬于熱穩定型毒株；血凝譜較廣，能凝集雞、豬、豚鼠、兔、小鼠、綿羊和牛的紅細胞。(3)對雞胚的致病カ較弱，其中EID5tl為10_5 86 ,ELD50為10_2 43 ;能夠感染MDCK細胞，造成細胞拉網脫落等病變；小鼠感染試驗中未觀察到明顯臨床癥狀，感染后14天能從小鼠血液中檢測到抗體。(4)利用通用引物對所述毒株進行PCR鑒定后，再進行全基因組PCR擴增并克隆測序，用philip3. 64分析軟件結果顯示該毒株為新型四源重組病毒，其中HA、NP和NS片段來源于經典豬流感；NA和PBl片段來源于類人H3N2流感病毒；PB2推測來源于美洲禽流感；M基因來源于歐洲禽流感。所述的豬流感病毒毒株在制備疫苗的生產毒種中的應用。本發明的有益效果是本發明的H1N2豬流感病毒滅活后免疫豬只，可以給豬提供有效的的保護，可應用在制備疫苗的生產毒種。
圖I為SIV通用引物電泳 圖2為亞型引物PCR產物電泳圖；M :DNA質量分子標準；1-3 :SIV通用引物RT-PCR陽性樣品；P :陽性對照；N :陰性對照
圖3為SIV全基因組PCR產物電泳圖；Mark :DNA質量分子標準；1_8 :PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因片段。
具體實施例方式2010年10月，漯河市某豬場7頭I月齡豬只發病，其中一頭小豬在發病兩天后死亡，發病豬臨床癥狀為流鼻涕，發燒和咳嗽，其發病表現與國內報道的其他地區發病的豬流感癥狀大致相似，初歩判斷為豬流感。
采集發病豬的鼻拭子，并立即保存于含抗生素的DMEM培養液中，置于冰盒中并在24 h內送至實驗室。鼻拭子進行漩渦震蕩高速離心處理，取上清接種10日齡雞胚尿囊腔接種。結果分離到ー株有血凝性的疑似流感病毒，血凝試驗排除雞新城疫和禽減蛋綜合征病毒。第3代尿囊液進行有限稀釋克隆后其最高血凝價71og2 ;用特異性引物進行分子鑒定后確定其為H1N2豬流感病毒。理化特性試驗表明所述毒株經過氯仿、こ醚和酸處理后，不能再感染雞胚，判斷其對脂溶劑敏感。病毒屬于熱穩定型毒株；血凝譜較廣，能凝集雞、豬、豚鼠、兔、小鼠、綿羊和牛的紅細胞。該病毒對雞胚的致病カ較弱，其中EID5tl為10_5 86 ,ELD50為10_2 43 ;能夠感染MDCK細胞，造成細胞拉網脫落等病變；小鼠未觀察到明顯臨床癥狀，感染后14天能從小鼠血液中檢測到抗體。對所述毒株進行全基因組PCR擴增并克隆測序，用philip3. 64分析軟件結果顯示該毒株為新型四源重組病毒，其中HA、NP和NS片段來源于經典豬流感；NA和PBl片段來源于類人H3N2流感病毒；PB2推測來源于美洲禽流感；M基因來源于歐洲禽流感。本發明中，毒株定名為A/swine/Henan/YIL/2010 (H1N2)株，簡稱 SWHN/HL/10 株。I、流行病學調查2010年10月，漯河市某豬場7頭I月齡豬只先后發病，其中一頭小豬在發病兩天后死亡，發病豬臨床癥狀為高燒，流鼻涕，咳嗽，呼吸困難，并且具有傳染性，其發病表現與國內外報道的其他地區發病的豬流感癥狀大致相似，初歩判斷為豬流感。采集患病豬的鼻拭子和病死豬的肺臟樣品，將樣品立即保存于含抗生素的DMEM培養液中，置于冰盒中并在24 h內送至實驗室。2、病毒分尚將鼻拭子樣品潤旋震蕩處理15秒,擠出液體,4 °C 5000 r/min尚心4 min，取上清，4°C作用過夜。采集病死豬的肺組織在無菌條件下剪碎并研磨，用PBS液(含鏈霉素和青霉素終濃度為3000 u g /mL，3000 IU/ mL)制成10%的勻漿，4で作用5 h，反復凍融3次，按上述條件離心，取上清。將上清經尿囊腔接種擴10日齡非免疫雞胚，0.2 mL/枚，每個樣品接種2枚，35 °C條件下孵育96 h,并保持一定的濕度，每隔8 h照胚，棄去24h內死亡雞胚。收集24 96 h死亡和未死亡雞胚置4で冷卻過夜，次日無菌收集尿囊液。結果表明無菌檢驗合格的病料接種雞胚后，96 h內無雞胚死亡發生，對照組雞胚也全部健活。經過3代雞胚盲傳以后，發現所收獲尿囊液具有血凝性，并且均與抗ND和EDS-76陽性血清HI試驗為陰性，第3代尿囊液進行具有血凝活性的尿囊液接種的雞胚均表現出不同程度的全身出血變化，死亡胚與存活胚病變顯著，胚胎發育阻滯，胚體頭頸部、背部、大腿、翅膀及腹部出血明顯，嚴重者呈彌漫性出血。第3代尿囊液進行有限稀釋克隆后其最高血凝價71og2。3、病毒PCR鑒定通用引物是根據GenBank數據庫中已有的豬流感病毒的NP基因核苷酸序列用Clustal、DNAstar等生物軟件進行同源性分析后，選出較為保守的核苷酸區域，應用Primer 5. 0設計特異性引物根據NP基因設計合成，亞型引物參照Choi等設計的亞型引物合成。參照Invitrogen Trizol LS Reagent的說明進行,具體操作步驟如下取新鮮的病毒樣品250 U L加入裝有750 V- L Trizol的I. 5 mL RNase-free離心管中混合均勻，室溫靜置5min ;加入200 U L氯仿，渦旋混勻15 S，室溫靜置5 min ；4°C 12, 000 g/min離心15min,轉移上相至新管中，加入等體積異丙醇(約500 ii L),輕緩混勻，室溫放置15 min, 4 V12，000g/min離心10 min,棄上清,RNA在管側和管底形成膠狀沉淀；加入I mL RNase-free 75%こ醇，溫和顛倒混勻，4 V 7，500g/min離心5 min，棄上清，將離心管置于超凈臺風干，加入20 UL DEPC處理過的雙蒸水溶解，最后分裝成小管，可置-70で保存備用。RT反應體系按Takara公司反轉錄試劑盒說明書進行。各成分加入后混勻離心，42で保溫I h，70で保溫15 min后冰上冷卻備用。PCR反應體系
權利要求
1.一種豬流感病毒毒株，其特征在于豬流感病毒(swine influenza virus), CCTCCNO V201223o
2.如權利要求I所述的豬流感病毒毒株在制備疫苗的生產毒種中的應用。
全文摘要
發明公開了一種豬流感病毒毒株，豬流感病毒(swineinfluenzavirus)，CCTCC NOV201223。本發明的豬流感病毒滅活后免疫豬只，可以給豬提供有效的保護，可應用在制備疫苗的生產毒種。
文檔編號C12R1/93GK102766604SQ20121020282
公開日2012年11月7日 申請日期2012年6月19日 優先權日2012年6月19日
發明者寧長申, 岳耀輝, 張云, 張龍現, 胡慧, 菅復春 申請人:河南農業大學