神經再生的制作方法

專利名稱：神經再生的制作方法
背景技術：
1.發明領域本發明涉及使用基于細胞的治療方法預防神經退化及促進神經再生。
2.技術背景及現狀針對受損神經的神經再生已經進行了許多的研究工作。通常，針對外周神經創傷的臨床外科治療包括一系列復雜的步驟，這涉及到首先清除創傷局部位置附近的受損組織以及提供有助于外周神經再生的環境(Kline，J Neurosurg，1989，70166-174)。手術過程的方法通常涉及受傷區域頂端和末端的直接連接或融合(Kline和Judice，JNeurosurg，1983，58631-649)。其他的外科手術方法包括諸如外周神經移植(Millesi，Clin Orthop，1988，23736-42)以及更傳統的諸如保持電刺激以產生在等待神經自然再生過程中有助于抑制肌肉-神經連結點退化的肌肉收縮的門診治療(Kim等，KoreanAcademy of Rehabilitation Medicine(韓國)，1999，23893-898；al-Amood等，J Physiol(Lond)，1991，441243-256)。最后，大部分這樣的手術還包括廣泛的包括長期受控的運動治療以防止肌肉弱化和收縮并促進神經的繼發性生長的理療計劃(Pyun等，Korean Academy of Rehabilitation Medicine(韓國)，1999，231063-1075)。
通常，使用機械矯正裝置以保護關節并防止受影響部位周邊肌肉和韌帶的損傷(Gravois，《物理治療及康復》(Physical Medicine and Rehabilitation)，馬薩諸塞州Blackwell Science，2000，pp432-433)。此外，用于神經再生的各種實驗技術還包括使用生物合成管連接神經或與有助于共同降低神經損傷并刺激神經再生的藥物組合使用(al-Amood等，J Physiol(Lond)，1991，441243-256；Dumitru，Dumitru主編的《電反應診斷醫學》(Electrodiagnostic medicine)第1版，PhiladelphiaHanley&Belfus，1995，pp341-384)；Ebara和Nakayama，《脊柱》(Spine)，2002，16SS10-S15；Horowitz，《肌肉神經》(Muscle Nerve)，1989，12314-322；Matzuk等，Nature，1995，374360-363；Mengs，Arch Int Pharmacodyn Therp，1984，271(2)315-323)。
因此，在現有技術中對用于受損神經(尤其是外周神經)的再生或防止其退化的分子治療方法存在需求。
發明概述本發明一方面是針對神經再生的一種方法，該方法包括a)產生包含以可操作方式與啟動子相連的編碼蛋白質轉化生長因子超家族成員之一的DNA序列的重組病毒或質粒載體；b)用所述重組載體體外轉染培養的細胞群體，形成所述培養細胞的群體；以及c)將所述轉染細胞移植到受損神經周圍區域，使得受損神經周圍區域內所述DNA序列的表達引起神經再生。所述轉化生長因子可以是BMP。所述BMP可以是BMP-2或BMP-9。所述細胞可以是結締組織細胞。所述細胞優選地可以是成纖維細胞或神經細胞。此外，所述神經可以是外周神經。所述載體可以是病毒載體。所述載體可以是逆轉錄病毒載體、腺伴隨病毒載體、腺病毒載體或皰疹病毒載體。此外，所述細胞群體在移植前可以在液氮中保存在諸如10％DMSO中。
本發明也針對神經再生的一種方法，該方法包括a)產生包含編碼髓鞘再生蛋白的DNA序列的重組病毒或質粒載體；b)用所述重組載體體外轉染培養的細胞群體，形成所述培養細胞的群體；以及c)將所述轉染細胞移植到受損神經周圍區域，使得受損神經周圍區域內所述DNA序列的表達引起神經再生。所述細胞可以是諸如成纖維細胞的結締組織細胞、或神經細胞、神經膠質細胞或施萬細胞。在所述方法中，所述蛋白質可以是神經調節蛋白(neuregulin)-1。再生的神經可以是外周神經。


以下的詳細描述和附圖有助于對本發明更全面的理解。附圖只是出于說明的目的，因此不是對本發明的限制，其中圖1A-1B顯示了BMP-9組損傷2周后大鼠坐骨神經的顯微鏡檢測，圖中顯示了非常嚴重的神經軸突和髓鞘退化，以及顯著的空泡化改變。圖1A-1B也顯示了神經周軟組織中單核炎性細胞的明顯滲透。(AH&E染色；B改進的三色染色200×)圖2A-2B顯示了BMP-9組損傷4周后大鼠坐骨神經的顯微鏡檢測，圖中顯示約70％的受損區域伴隨有空泡化改變。有些顯著的髓鞘消化腔以及明顯的溫和的神經內纖維化。(AH&E染色；B改進的三色染色200×)圖3A-3C顯示了BMP-9組損傷8周后大鼠坐骨神經的顯微鏡檢測，圖中顯示了約50％神經軸突中的空泡化改變。神經外空間中單核炎性細胞的滲透嚴重。神經束中也存在局灶出血(AH&E染色×200，B和C改進的三色染色，分別為200×和100×)圖4A-4B顯示了BMP-9組損傷8周后大鼠坐骨神經的顯微鏡檢測，圖中顯示了約33％神經軸突中的空泡化改變。神經外空間中殘留著一些單核炎性細胞。(A和B改進的三色染色，200×)圖5A-5B顯示了BMP-2組損傷2周后大鼠坐骨神經的顯微鏡檢測，圖中顯示了大部分神經軸突中的空泡化改變。中心的軸突萎縮和脫髓鞘是顯著的。(A和B改進的三色染色，分別為100×和200×)圖6A-6B顯示了BMP-2組損傷4周后大鼠坐骨神經的顯微鏡檢測，圖中顯示了約半數神經軸突中的空泡化改變。存在明顯的伴隨著溫和神經內纖維化的脫髓鞘作用。(A和B改進的三色染色，分別為100×和200×)圖7A-7B顯示了BMP-2組損傷8周后大鼠坐骨神經的顯微鏡檢測，圖中顯示了約半數神經軸突中的空泡化改變。神經外空間中殘留著一些單核炎性細胞。(A和B改進的三色染色，分別為100×和200×)圖8A-8B顯示了陰性對照組損傷2周后大鼠坐骨神經的顯微鏡檢測，圖中顯示了幾乎所有的神經軸突發生了退化以及軸突外圍中單核炎性細胞的滲透。神經外纖維化也是明顯的。(A和B改進的三色染色，分別為100×和200×)圖9A-9B顯示了陰性對照組損傷4周后大鼠坐骨神經的顯微鏡檢測，圖中顯示了約33％的神經軸突發生退化以及明顯的空泡化改變。(A和B改進的三色染色，分別為100×和200×)圖10A-10B顯示了陰性對照(sham)組損傷8周后大鼠坐骨神經的顯微鏡檢測，圖中顯示了約10-20％的神經軸突發生了退化以及顯著的空泡化改變。(A和B改進的三色染色，分別為100×和200×)優選實施方式的詳細描述在本申請中，“一個”和“一種”用于表示單個和多個對象。
如這里所使用的，術語“結締組織細胞”包括在結締組織中所發現的細胞，諸如成纖維細胞、軟骨細胞和骨細胞(成骨細胞/骨細胞)(它們分泌胞外膠原基質)，以及脂肪細胞和平滑肌細胞。優選地，所述結締組織細胞是成纖維細胞、軟骨細胞和骨細胞。更優選地，所述結締組織細胞是成纖維細胞。結締組織細胞也包括間葉細胞樣細胞(也被認為是未成熟的成纖維細胞)。需要指出的是，本發明可采用結締組織細胞的混合培養物以及單一細胞類型加以實施。
如這里所使用的，在受損神經“附近”注射細胞是指注射部位與受損神經之間足夠近從而在受損部位產生神經再生的有效結果的區域。因此，在受損神經附近注射細胞包括在受損位置或與所述注射細胞足夠近，從而使有效多肽表達并且所述多肽能直接或間接影響神經再生結果的任何位置。
如這里所使用的，“啟動子”可以是具有活性的并控制真核細胞內轉錄的任何DNA序列。所述啟動子可以是在真核和/或原核細胞中具有活性的。優選地，所述啟動子在哺乳動物細胞中具有活性。所述啟動子可以是組成型或誘導型表達的。優選地，所述啟動子誘導型的。優選地，所述啟動子是由外界刺激所誘導的。更優選地，所述啟動子是由激素或金屬所誘導的。進一步更優選地，所述啟動子是由重金屬誘導的。最優選地，所述啟動子是金屬硫因基因啟動子。同樣地，可以將也控制轉錄的“增強子元件”插入所述DNA載體構件并與本發明所述的構件共同使用以增強感興趣的基因的表達。
如這里所使用的，“選擇標記”包括由穩定保持所導入基因的細胞所表達的并使得細胞表現出諸如形態轉化等不同表型或酶活性的基因產物。對表達轉染基因的細胞的分離是通過在相同的細胞中導入編碼選擇標記(諸如具有產生針對抗生素或其他藥物抗性的酶活性)的第二條基因得以實現的。選擇標記的實例包括但不限于胸苷激酶、二氫葉酸還原酶、氨基糖苷磷酸轉移酶(它們產生對氨基糖苷類抗生素(諸如卡那霉素、新霉素和遺傳霉素)的抗性)、潮霉素B磷酸轉移酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶、CAD(具有尿苷全生物合成最初三種酶活性(氨基甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸轉氨甲酰酶和二氫乳清酸酶)的單一蛋白質、腺苷脫氨酶以及天冬酰胺合成酶(Sambrook等，《分子克隆》(Molecular Cloning)，1989，第16章)，這些選擇標記通過參考完整地組合在本申請中。
如這里所使用的，“轉化生長因子-β(TGF-β)超家族”包括一組結構上相關的蛋白質，它們在胚胎發育過程中對廣泛的分化過程產生影響。該家族包括正常的男性性發育所需的副中腎管抑制物質(MIS)(Behringer等，Nature，345167，1990)、背-腹軸形成及成蟲盤形態發生所需的果蠅dpp基因(DPP)基因產物(Padgett等，Nature，32581-84，1987)、位于卵細胞植物極的爪蟾(Xenopus)Vg-1基因產物(Weeks等，Cell，51861-867，1987)、能夠誘導爪蟾胚胎中中胚層和前期結構形成的活化素(Mason等，Biochem，Biophys.Res.Commun.，135957-964，1986)、以及能誘導軟骨和骨重新形成的骨形態發生蛋白(BMP，諸如BMP-2、3、4、5、6和7，成骨素、OP-1)(Sampath等，J.Biol.Chem.，26513198，1990)。TGF-β基因產物能夠影響包括脂肪形成、肌肉發生、軟骨發生、血細胞生成以及上皮細胞分化在內的多種分化過程(參見Massague，Cell 49437，1987，這通過參考完整地組合在本申請中)。
TGF-β家族的蛋白質最初以大的前體蛋白質的形式合成，其隨后在距C末端約110-140個氨基酸的堿性殘基簇的位置進行蛋白酶解。所述蛋白質的C末端區域都具有結構上的相關性，并且在其同源度的基礎上可以將不同的家族成員劃歸不同的亞類。雖然在具體的亞類中同源度在70％到90％氨基酸序列一致之間，亞類之間的同源度明顯較低，通常僅為20％到50％。在每種情況下，活性形式似乎是通過二硫鍵相連的C末端片段二聚體。對于已研究的大部分家族成員來說，已經發現同源二聚體形式具有生物學活性，但對于其他家族成員而言，象抑制素(Ung等，Nature，321779，1986)和TGF-β(Cheifetz等，Cell，48409，1987)，也已觀察到其異源二聚體，并且與其相應的同源二聚體相比可能具有不同的生物學性質。
TGF-β基因超家族成員包括TGF-β3、TGF-β2、TGF-β4(雞)、TGF-β1、TGF-β5(爪蟾)、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、OP-1/BMP-7、BMP-8、BMP-9、果蠅60A、果蠅DPP、Vgr1、GDF-1、爪蟾Vgf、抑制素-βA、抑制素-βB、抑制素-α和MIS。許多這樣的基因在Massague，Ann.Rev.Biochem.67753-791，1998中進行了討論，該文獻通過參考完整地組合在本申請中。
優選地，所述TGF-β基因超家族成員是TGF-β。更優選地，所述成員是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8或BMP-9。
需要理解的是，在通過以上命名描述蛋白質時，所述蛋白質不限于野生型的確切序列。所述蛋白質序列的變異是允許的，因此與所述蛋白質在功能方面具有充分相同活性的另一條多肽序列是包括在內的。
神經組織神經組織源于脊索影響下的胚胎外胚層。外胚層受誘導形成變厚的神經板，其隨后分化并末端最終融合形成神經管，由此產生完整的中樞神經系統。中樞神經系統由腦、顱神經和脊髓構成。外周神經系統源于被稱為神經嵴的神經溝旁細胞。
神經組織以復雜的綜合溝通網絡的形式分布在全身。神經細胞(神經元)以回路形式與其他神經元溝通，神經回路可以是非常簡單的，也可以是非常復雜的更高級別回路。神經元行使實際的信息傳輸和綜合的功能，而被稱為神經膠質細胞的其他神經組織細胞通過支持、保護、防衛及營養神經元幫助神經元行使其功能。在腦部神經膠質細胞比神經元多約10倍以上。神經膠質細胞創建了神經元行使功能所需要的微環境并在有些情況下為神經元的處理與活性提供協助。神經元是可被激發的細胞。這意味著當其被適當刺激時，可以啟動能沿細胞膜傳播從而將信息傳達給遠處細胞的動作電位。神經元是負責對刺激進行接收、傳輸和處理的獨立的功能單位。
通常，神經元由三部分構成其中定位有細胞核與細胞器的細胞體；樹突，它們是從環境或其他神經元接收刺激的由細胞體延伸出的突起；以及軸突，它們是用于向其他神經元傳輸神經沖動的由細胞體延伸出的長的單一突起。軸突通常在其遠端分叉，并且具有球狀末端的每個分枝在另一個細胞上終結。球狀末端與相鄰細胞的相互作用形成被稱為突觸的結構。突觸專門用以接收信號并將其轉化成電位。
人體內發現的大部分神經元是多極性的，這意味著它們具有兩個以上的細胞突起，其中只有一個是軸突，其他突起是樹突。視網膜或嗅黏膜的雙極性神經元具有始于細胞體的一個樹突和一個軸突。在脊髓神經節中發現的假單極性神經元能將由樹突收集的感官沖動不經過細胞體直接傳輸給軸突。神經元也可以按照功能加以分類。感官神經元參與感官刺激的接收和傳輸。運動神經元發送沖動以控制肌肉和腺體。其他神經元，中間神經元，作為功能網絡的一部分以神經元之間中間媒介的方式發揮作用。
突觸是傳播細胞信號的專門化的功能性細胞接點。大部分突觸是化學突觸，其中突觸前末端中的囊泡含有化學信使，當突觸前膜受到刺激時，所述化學信使釋放到突觸間隙中。化學信使擴散通過突觸間隙與突觸后膜上的受體結合。這引起影響細胞作用的突觸后膜極化狀態的改變。神經肌肉接點是一種特殊類型的突觸。已知35種以上的神經遞質，其中大部分是小分子(氧化一氮、乙酰膽堿)、兒茶酚胺(去甲腎上腺素、血清素)、或神經活性肽(內啡肽、后葉加壓素)。神經遞質一旦使用，其通過酶降解、擴散或突觸前細胞的內吞作用得以快速清除。
有些神經元被包裹在稱為髓鞘的絕緣物質中。這一富含脂類的物質是由神經膠質細胞形成的(外周神經系統中的施萬細胞以及中樞神經系統中的少突神經膠質細胞)。通過減少必須去極化的膜表面積，這樣的絕緣有助于更快的神經傳導。在有髓鞘的神經元中，神經沖動沿著軸突的長度從一個無髓鞘片段跳躍至另一個無髓鞘片段。正如在大的外周神經和大腦白質中的情況，髓鞘以及組織中神經元細胞體的缺乏使得有些神經組織顯白色。被稱為星形細胞的另一種神經膠質細胞參與結構完整性、神經元營養以及維持神經組織微環境。星形細胞相互之間通過縫隙連接直接溝通并能通過調節局部環境影響其所負責的神經元的存活。室管膜細胞將脊髓和腦室排成一列并分泌腦脊髓液。另一種被稱為小膠質細胞的小膠質細胞是參與成熟的中樞神經系統中炎癥反應和修復的噬菌細胞。
神經組織是能夠接收和傳輸電沖動的可激發組織。其中心細胞類型被稱為神經元。神經元通常具有細胞體、接收輸入信號的樹突以及傳輸電位的軸突。
神經元可以分成感官神經元、運動神經元、分泌神經元或聯合神經元。通常按照傳導速度、直徑以及是否存在稱為髓鞘的專門化脂蛋白絕緣層對其進行分類。A類纖維是具有髓鞘的并能以12-120米/秒的速度傳導沖動。B類也是具有髓鞘的纖維，但它們只能以3-5米/秒的速度傳輸沖動。C類纖維是無髓鞘的，其直徑小，并且傳輸速度很低(2.5米/秒)。A類纖維的一個例子是支配腓腸肌活動的運動神經元。B類纖維的一個例子是自主節前輸出神經元，低速C類神經元的一個例子是攜帶彌散疼痛感信息的感官神經元。
感官神經元適應于從環境中探測某些類型的信息。這包括感知象壓力或拉力的機械性刺激感受器、溫度感受器、視網膜中的光感受器、以及諸如味蕾或用于嗅覺的化學感受器。聯合神經元或中間神經元通常存在于脊髓和大腦中，它們將感官傳入神經元與傳出運動或分泌神經元相連。
神經元通過被稱為突觸的結構相互溝通。軸突末端是含有大量小囊泡的突觸小體。這些小囊泡中充滿了被稱為神經遞質的化學物質。乙酰膽堿是突觸處最常見的神經遞質，而取決于神經元，可以使用如去甲腎上腺素、血清素和GABA等其他化學物質。當神經沖動沿軸突傳輸并到達突觸小體時，囊泡與神經元細胞膜融合并釋放神經遞質。隨后所述化學物質經狹窄的突觸間隙擴散到達接收神經元突觸后膜上的該化學物質特異的受體。
神經遞質與受體的相互作用引起膜電位的改變，這可以引發新的突觸后神經元沖動。存在于突觸中的乙酰膽堿酯酶降解乙酰膽堿并終止刺激。其他神經遞質或被降解或由突觸前神經元回收以終止刺激。
在中樞神經系統中，多個神經元可能匯聚于單一的神經元上。當每個突觸前神經元將神經遞質釋放到與突觸后神經元組成的突觸中時，產生綜合并疊加的局部膜電位。這些傳入的信號可能是抑制性的或刺激性的。如果最終疊加的膜電位達到該神經元的最小閥值，會引發運動電位。
運動電位通過跳躍式傳導沿一個方向離開細胞體。最快的神經元是包裹在髓鞘中的，髓鞘由被稱為郎飛結的裸露的神經元細胞膜節點分隔成不連續的片段。在跳躍式傳導中，電位在節點之間跳躍，從而降低了參與動作電位傳導的膜面積并加快了傳導。
神經系統中發現的非神經元細胞被稱為神經膠質細胞。星形膠質細胞是數量最多的膠質細胞，它們為神經元提供支持和營養。小膠質細胞是神經組織特異的小噬菌細胞。將腦室與脊髓中央管排成一列并產生腦脊髓液的細胞被稱為室管膜細胞。在中樞神經系統中，少突神經膠質細胞構成多種神經元髓鞘片段。在外周神經系統中，髓鞘的每個片段是由單個施萬細胞構成的。
中樞神經系統中樞神經系統(CNS)由腦和脊髓組成。除了顱骨和椎骨所提供的保護之外，腦脊膜(硬腦脊膜、蛛網膜和軟腦膜)保護并滋養中樞神經系統。在蛛網膜下空間、脊柱中央管以及腦室中發現了腦脊液。軟腦膜是最內部的層并與神經組織粘連。蛛網膜層位于軟腦膜和硬腦脊膜之間。顱骨下就是強韌的纖維狀硬腦脊膜。
腦可以分為前腦、中腦和腦干三個基本區域。前腦包括丘腦、下丘腦、基底神經節和大腦。大腦負責意識思維、感覺的詮釋、所有主動的運動、智能以及情緒。
大腦組織可以分為結構區和功能區。大腦表層盤繞成腦回(突起)和腦溝(凹槽)。皮層感官和運動區可以分別定位于中央后回和中央溝。感官區接收來自身體對側經丘腦處理后投射的感官信息。身體上具有更多感官神經末梢的部位對應于更多的皮層感官區。運動區控制對側軀干的主動肌肉運動，但聯合區對運動的啟動具有重要作用。
大腦是腦的最大部分并被分為具有幾個腦葉的左右兩個半球。前葉包含運動區、Broca語言區、聯合區，并在智能和行為中發揮功能。頂葉包括感官區并在感覺和聽覺中發揮功能。主要的視覺聯合區位于枕葉，而顳葉包含聽覺聯合、嗅覺幾記憶存儲區。
丘腦位于大腦皮層和腦干之間。除嗅覺感知之外的所有感官輸入在投射到腦的其他部位之前都在此進行處理。下丘腦位于丘腦下部并負責處理內部刺激及維持內環境。這里不斷進行著對血壓、溫度、心率、呼吸、水代謝、滲透壓、饑餓以及神經內分泌活性的無意識控制。從垂體后葉釋放后葉催產素和ADH的神經內分泌細胞的核位于下丘腦中。
基底神經節(尾狀核、蒼白球、黑質、丘腦底核、紅核)是嵌入大腦每個半球內的神經元組。它們參與復雜的運動調節、信息處理及無意識的全部意向性運動。
腦干包括延髓和腦橋。腦干包含對呼吸、心臟及血管收縮反射進行調節的重要的功能區和中繼中樞。腦橋包含參與呼吸調控的呼吸調節中樞。
小腦位于腦干上方并使用在其他部位處理的關于身體位置、運動、姿勢和平衡的信息。運動不是在小腦中啟動的，但其對于協調運動是必需的。
外周神經系統外周神經系統包括位于腦和脊髓之外的神經、神經結、脊神經和顱神經。12條顱神經起始于位于腦干中的核并攜帶控制諸如嗅覺、視覺、唾液分泌、心率和膚覺等各種自主功能的沖動通往特定位置。顱神經經常是混合型的，其包含感官和運動組分，但它們可以只具有運動或感官纖維。下表列舉了顱神經及其功能。
表1 顱神經

外周神經系統的感官部分從各種感受器接收輸入信號，對其進行處理并發送給中樞神經系統。感官輸入可以如本體感受(感知關節和肌肉的位置)中來自內部來源或如皮膚對壓力或熱的感受中來自外部來源。分布有特定脊神經的皮膚區域被稱為皮區。傳入纖維收集感官輸入信號并上傳給脊髓，在丘腦中匯聚，并最終結束于大腦的感官皮層。具有更多感官感受器的區域(例如指尖和嘴唇)對應于腦部感官皮層上更大的區域。攜帶本體感受信息的纖維也散布于小腦。幾乎所有的感官系統向丘腦的各個部分傳輸沖動。大腦皮層參與有意識的感知以及對感官刺激的詮釋。
經自主的軀體傳出系統發生通往肌肉和腺體的運動輸入。中樞神經系統對關節、肌腱的神經支配經軀體傳出系統傳輸。有些肌肉反應通過脊髓反射進行。這樣的例子是當手指接觸熱的爐子時所看到的抽回反應。將手指移開的動作經過簡單的脊髓反射發生，這遠在疼痛感到達腦部之前。顯而易見地，這是一種避免進一步受傷的保護機制。通往腺體和平滑肌的運動輸入通常經自主系統發生。
大部分器官從自主神經系統的兩個分支上接收輸入。在某個器官或組織中，一個分支通常是刺激性的，而另一個分支是抑制性的。自主系統的交感神經分支發揮作用以使軀體對生理應激反應有所準備。交感神經分支的刺激就象是踩油門，作為響應，軀體做好了奔跑或戰斗的準備。觀察到諸如心率加快、氣管擴張以及調動糖原儲備向葡萄糖轉化等作用。交感神起始于第1節胸椎到第4節腰椎之間。它們具有短的神經節前神經元，該神經元結束于沿脊柱分布的側神經節之一。乙酰膽堿是具有延伸至目標組織的長神經節后神經元的突觸處的神經遞質，在該組織中在大部分交感神經末梢釋放去甲腎上腺素。有些交感神經節后神經元(如支配汗腺或骨骼肌脈管系統的)釋放乙酰膽堿。
副交感神經分支經起始于中樞神經系統顱骨和骶骨區域的神經元發揮作用以抵消交感分支的作用。例如，副交感神經刺激引起氣管收縮及心率降低。它調節諸如消化、排尿及勃起等靜態活動。長的神經節前神經元在接近目標器官的突觸處釋放乙酰膽堿。短的神經節后神經元在效應組織上也釋放乙酰膽堿。
通過髓鞘生成細胞的受損神經再生在本發明的一個方面，為了實現神經再生，必須有兩個前提。首先，再生因子生成細胞以及從治療中獲益的神經細胞必須是具有生存能力的。第二是必須發生神經元的髓鞘形成。在這一點上，可以使用不同的細胞類型以實現這一表型。例如，細胞生存促進細胞和髓鞘生成細胞的混合物可以共同用于神經再生。
本發明尤其預期神經細胞的髓鞘形成特別適用于通過受損神經再生治療脊髓損傷。在這一點上，可以使用諸如其表達促使髓鞘形成的軸突神經調節蛋白-1(Nrg1)(Michailov等，Science，304，700-703，4/30/2004)等蛋白質，并使其單獨在諸如但不限于施萬細胞的神經細胞中表達，或與諸如包括但不限于成纖維細胞等能表達Nrg1的結締組織細胞等另一種相同或不同類型細胞共同使用。
BMP對神經再生和防止神經退化的作用本發明的一個具體并舉例說明的方面是針對功能蛋白質BMP-2和BMP-9對大鼠中神經損傷后再生的作用的確定。使用了36只Sprague-Dawley大鼠(體重400±10克)，將其分為3組(對照組、BMP-2組和BMP-9組)。這里需要說明的是，BMP-2組或BMP-9組是指在對未經注射的Sprague-Dawley大鼠實施神經損傷后對其注射表達BMP-2或BMP-9的細胞的動物組。使用止血鉗在坐骨神經上制造了碾壓傷。對照組僅注射含未改變的成纖維細胞的緩沖液。BMP-2和BMP-9組注射含基因改造的成纖維細胞的緩沖液(BMP-2BMP-2分泌型成纖維細胞；BMP-9BMP-9分泌型成纖維細胞)。注射完成后，通過以下方法評估再生效果1)腓腸肌-比目魚肌處所記錄的坐骨神經運動原傳導研究，以及2)通過蘇木素-伊紅及改進的三色染色對坐骨神經的組織學研究。
神經傳導研究表明，在一周時，BMP-2和BMP-9組中的潛伏期(latency)與對照組相比明顯縮短，并隨后在4和6周中BMP-9組與其他組相比表現出更大的振幅(p＜0.05)。在第8周，所有組之間沒有明顯的潛伏期差異，但BMP-9組中的振幅更大。
在組織學研究中，第2周之前所有組都表現出嚴重的退化(表現為具有炎性應答、軸突丟失和空泡化改變)。對照組中的退化在第4和8周中得以延續，但在BMP-2組中，炎癥反應和空泡化改變的程度明顯降低，其中只有半數表現出這些現象。BMP-9組中，這些改變進一步降低，只有三分之一表現出軸突丟失和空泡化改變，并且炎癥反應非常溫和。在這些大鼠中，這些功能蛋白質對碾壓傷后的神經再生具有顯著作用。這些結果顯示了包括外周神經損傷在內的神經損傷后的神經再生。
TGF-β、活化素和BMP是參與發育過程中細胞分化、生長和器官形成的蛋白質。BMP與生長/分化因子(GDF)、成骨蛋白(OP)以及副中腎管抑制素/抗副中腎管激素(MIS/AMH)都是TGF-β超家族的成員(Ebara和Nakayama所著《脊柱》(Spine)，2002，16SS10-S15)。歷史上1965年Urist觀察到在嚙齒動物和兔子的肌肉中插入去礦化的骨基質后胚胎骨化和其他類似于軟骨內骨化的過程(Urist MR，《骨，通過自我誘導形成》(Bone，formation by autoinduction)，Science，1965，150(698)893-899)。植入后，間葉細胞通過化學趨化遷移到所插入的骨組織，然后發生有絲分裂和縮合。隨后，源于間葉細胞的成軟骨細胞分泌有助于軟骨模板形成的細胞外基質。這一細胞外基質通過造血細胞和內皮細胞血管化。開始局部出現成骨細胞和破骨細胞并且被吸收的軟骨轉化成骨組織。21天后形成具有骨髓核的小骨(Wang等，Proc Nat Acad Sci USA，1988，859484-9488)。與從去礦化骨基質開始的變化過程相關的組分被描述為骨形態發生蛋白(BMP)。
1988年，Wang等(Wang等，Proc Nat Acad Sci USA，1988，859484-9488)從牛骨中分離出了分子量分別為16kDa、18kDa和30kDa的3種多肽。稍后，Wozney等(Woozney，Mol Rep Dev，1992，32160-167)使用這些多肽作為探針鑒定了人RNA和相應的DNA。隨后的研究表明，存在著至少16種內生的BMP(Wozney和Rosen，Clin Orthop，1998，34626-37)。
除了BMP-1(成骨膠原C-蛋白酶)，它們都是轉化生長因子(TGF)-β基因超家族的成員(Wozney和Rosen，Clin Orthop，1998，34626-37)。在結構上，BMP以巨大的前體形式產生，該前體由15-25個氨基酸的信號肽、50-375個氨基酸的前域和100-125個氨基酸的成熟羧基末端構成。后者具有相當保守的7個半胱氨酸殘基，它們在羧基末端區域通過蛋白水解處理與前體分離后使肽發生二聚化(Croteau等，1999；22686-695)。每個具有活性的成熟的BMP以由相同單體構成的二硫鍵相連的同源二聚體形式或以由兩種不同類型單體構成的二硫鍵相連的異源二聚體形式存在(Sampath等，J Biol Chem，1990，26513198-13250)。有意思的是，該蛋白質的二聚化與其活性相關，例如BMP2和BMP7的異源二聚體已經證明是比相同單體所構成的同源二聚體更強的成形素(Kawabata等，Cytokine Growth Factor Rev，1998，949-61；Sampath等，J Biol Chem，1990，26513198-13250)。
為了評估BMP的生物學活性，需要了解細胞內BMP基因表達與BMP二聚化機制。雖然對BMP的基因表達所知不多，已知的是其可能受到堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)蛋白的調控(Ebara等，Biochem Biophys Res Commun，1997，240136-141)。bHLH蛋白由3個結構域構成，兩端的兩個結構域起正向轉錄激活因子的作用，而中心結構域發揮陰性調控子的作用。在這些結構域中，E單元(E-box，介于246-265個堿基對的DNA序列)可以被USF轉錄因子識別并在調節小鼠中BMP表達中具有重要作用。BMP也可能參與細胞死亡途徑的調控。
不僅在轉錄水平上，BMP的生物學活性在各個時間點上受到嚴格調控，甚至在細胞外受到調控。目前認為在細胞外作為抑制性蛋白的BMP受體易與BMP作用并對提高的BMP活性產生應答，這可以引起最終導致其調控的陰性反饋信號產生的增強(Ebara和Nakayama所著《脊柱》(Spine)，2002，16SS10-S15)。在細胞內，細胞受到信號轉導和抑制性Smad蛋白的調控，這意味著BMP能夠上調抑制性Smad蛋白的表達(Ebara和Nakayama所著《脊柱》(Spine)，2002，16SS10-S15)。
在細胞外水平上，細胞受抑制BMP與細胞受體結合的諸如頭蛋白和軟骨素的BMP結合蛋白調控。扭型原腸胚形成(Tsg)基因增強軟骨素的功能(Ebara和Nakayama所著《脊柱》(Spine)，2002，16SS10-S15)。促濾泡素抑制素(follisatin)與OP-1/BMP-7和BMP-4蛋白結合并抑制BMP(Matzuk等，Nature，1995，374360-363)。
BMP受體BMP與兩種不同類型(I類和II類)的絲氨酸-蘇氨酸激酶受體結合。在哺乳動物中已經確證了兩種I類受體和一種II類受體(Kawabata等，Cytokine Growth Factor Rev，1998，949-61)。在哺乳動物中，I類受體具有異構體A和B，并且雖然其結構類似，它們表現出不同的激活Smad蛋白的行為(Imamura等，Nature，1997，389549-551)。為了進行信號轉導，I類和II類受體需要形成復合物。I類受體被II類受體激活并且信號由I類受體傳導入細胞。該信號在細胞內由Smad蛋白轉導。Smad1、Smad5和Smad8具有相同結構并從BMP傳導信號。Smad2和Smad3從TGF-β和活化素傳導信號。這些Smad蛋白形成異源復合物并轉移入細胞核以激活各種基因。Smad、Tob、Ski和Smurf1參與這些基因的負調控。其中，Smad6抑制BMP的轉錄并也在BMP信號途徑的負反饋中發揮作用(Bai等，J Biol Chem，2000，2758267-8270)。Tob是抗增殖蛋白家族成員并參與BMP/Smad信號負調控(Yoshida等，Cell，2000，1031085-1097)。致癌蛋白Ski抑制BMP信號傳導和BMP應答基因的表達，并通過直接與Smad復合物反應抑制BMP活化，這是BMP的特有性質(Wang等，Proc Natl AcadSci USA，2000，9714394-14399)。Smurf1屬于泛素連接酶的Hect家族并通過選擇性結合受受體調控的Smad抑制BMP的信號轉導(Zuh等，Nature，1999，400687-693)。
對于BMP家族蛋白質功能的進一步研究正在進行，看來其在胚胎發育階段中參與包括神經系統(Farkas等，J Neurosci，1999，92227-235)、眼睛(Mohans等，InvestOphthalmol Vis Sci，1998，392626-2636)、肺、腎、前列腺、生殖器官和毛囊在內的基本軀體形成的規劃。例如，已經報道了手指以及手指間的空間的形成是由于由BMP引起的手指間細胞的凋亡(Zou和Niswander，Science，1996，272738)。
BMP參與胚胎發育過程中骨骼系統的形成、分化與復原。在出生后的骨骼系統中，BMP存在于腦基質膠原、骨膜細胞和充滿血形成元件的基質間葉細胞中。從骨肉瘤和軟骨肉瘤中也已分離到了BMP(Lianjia和Yan，Clin Orthop，1990，257249-256)。骨折后，BMP擴散入所吸收的骨基質，激活骨祖細胞并由此產生更多BMP。BMP的分布取決于治療時間和骨折部位并可能由于交互反應而進一步復雜化。在各種其他組織中也已進行了BMP研究以研究其保護或再生作用，并已證明其對心肌缺血和再灌注中的心肌功能具有保護作用(Lefer等，J Mol Cell Cardiol，1992，24585-593)，在引起大腦缺血的實驗中腹腔內注射BMP后對延伸的神經系統具有保護作用，并對受損腎臟具有再生作用(Ripamonti和Duneas，Plast Reconstr Surg，1998，101227-239)。
本申請說明，參與外周神經分化的BMP與未治療組的康復過程相比有利于受損神經的復原。
體內(in vivo)及先體外后體內(ex vivo)方法本發明不限于使用先體外后體內方法將基因運送到所需部位。也設計了體內方法。也需要說明的是，可以使用任何載體，只要其能在注射部位內表達所需基因。所述載體可以是質粒或任何數量的病毒載體，只要其有效地應用于表達所需基因。
本發明不限于這里所描述的具體實施方式
的范圍。實際上，除了這里所描述的之外，對本發明的各種改進對于精通本領域的人員而言在先前的描述和附圖基礎上是顯而易見的。這樣的改進沒有超越所附屬的權利要求書的范圍。以下所提供的實施例是為了對本發明進行舉例說明，而不是對本發明加以限制。
具體實施例方式
實施例1-材料與方法材料本研究中使用了體重為400±10克的成熟的Sprague-Dawley大鼠(16-18周齡)。使用成熟大鼠是因為與處在生長階段的大鼠相比更易于觀察到由于神經再生和生理變化所引起的改變。
方法將功能性蛋白BMP注射入外周神經在技術上是有難度的。因此，在本研究中將產生BMP2和BMP9的大鼠成纖維細胞直接轉染外周神經使得BMP2和BMP9得以局部分泌。將總計36只大鼠分為3組。每組由12只具有受損神經的大鼠組成。第一組是對照組，其中大鼠的受損神經用沒有轉基因的未經改造的成纖維細胞處理。第二組(BMP2組)由神經損傷的大鼠構成，其用BMP-2轉基因的經過基因改造的成纖維細胞處理，第三組(BMP9組)由用BMP-9轉基因的經過基因改造的成纖維細胞處理的具有神經損傷的大鼠組成。經處理2、4、8周后，每組宰殺2只大鼠并從兩肢收集坐骨神經進行組織的組織學檢測。通過設置實驗前的初始基線值并在手術后8周內隔周檢測神經傳導對肢體的坐骨神經也進行了神經運動原傳導研究。
神經損傷通過以300毫克/千克體重的濃度腹腔注射4％的水合氯醛對大白鼠進行麻醉。在將其以俯臥體位固定之前，去除尾端和右肢股骨區域的毛發。對股骨區用碘酒(potadine)和70％乙醇消毒后，在股骨區中央部位周圍約1-1.5厘米表皮垂直切開并將股二頭肌外拉以暴露坐骨神經。按照DeKoning等(De Koning等，J Neurol Sci，1986，74237-246)所述的方法，通過將股與全膝關節之間的表皮切開長度2-2.5厘米的切口并剝離臀部和全膝關節肌肉以暴露坐骨神經，隨后通過用止血鉗(Crile，15厘米)碾壓30秒對坐股突出處暴露的神經產生損傷從而造成神經損傷。止血鉗可以設定3種不同水平的握力強度，并對固定區域的神經損傷采用相同的握力水平，在距止血鉗末端5厘米處作黑線標記以使得用最強握力水平在固定區域產生碾壓傷。取下止血鉗后，第一組對照組使用超細針頭(30規格)在距神經損傷處2毫米內注射含0.05毫升未經改造的成纖維細胞(單位5×105細胞/50微升)的緩沖液。第2和第3個實驗組在對受傷區域進行縫合消毒之前通過相同的方法分別注射能分泌BMP2和BMP9的基因改造的成纖維細胞。
神經傳導檢測對大鼠用4％水合氯醛麻醉后進行神經傳導檢測。活動記錄電極置于腓腸肌以刺激坐骨切跡，對照電極置于足部，接地電極置于刺激電極和記錄電極之間。塊狀電極用作記錄電極并通過使用針狀電極將接地電極置于皮下。使用KeyPoint(Dantec，丹麥)進行神經傳導檢測。研究中的頻率、記錄打印速度和記錄靈敏度分別設置為2-10000Hz、2毫秒/格、5毫伏/格。每兩周進行神經傳導檢測。檢測在實驗開始時進行，并隨后在2、4、6、8周后進行。檢測過程中的潛伏期和振幅通過基線和負電極點之間的振幅測定。每組選取5只大鼠進行神經傳導研究并每只獲得10個測量數據。實驗室與大鼠的溫度分別保持在25℃和30℃。
病理學/組織學組織檢測通過檢查實驗開始時其受傷前的正常神經對大鼠神經組織進行了檢測以觀察其受傷后的自然恢復。在未經轉基因操作的細胞處理的情況下，使用了4只大鼠(8條神經)以觀察神經再生。2、4、8周后從每組隨機選取2只大鼠(4條神經)并對其組織進行檢測。為了進行組織檢測，從經麻醉大鼠的碾壓傷部位剝離約2厘米的坐骨神經。經甲醛緩沖溶液固定并隨后用蘇木素-伊紅(H&E)及改進的三色(MT)染色后在光學顯微鏡下觀察神經組織的變化。
數據分析通過與參照組比較，對神經損傷2、4、6、8周后來自每組的復合肌動作電位最大振幅及潛伏期的變化進行了分析，并采用SPSS-PC程序進行了統計學分析。每組間的比較通過ANOVA和t-校驗進行并將顯著度水平設為0.05。受傷及再生程度由病理學家對組織學數據的解讀加以確定。
實施例II-重量變化大鼠的最初體重位于400±10克的區間內。表2中顯示了其隨后的重量變化。在第2周沒有觀察到每組之間的差異，但在第4和第6周時，BMP9組與其他組相比表現出一些差異(p＜0.05)。在第8周，組之間沒有具有統計學意義的差異(p＞0.05)(表2)。
表2 實驗組中的體重變化

實施例III-潛伏期變化實驗前由每組隨機測量的基線數據顯示潛伏期為1.44±0.11毫秒。損傷后的潛伏期顯示，在第2和第4周，對照組、BMP2組和BMP9組之間具有差異，但該差異不具有統計學意義(p＞0.05)。在第6周，BMP2和BMP9組的潛伏期與對照組相比明顯縮短(p＜0.05)。然而，在第8周，這三組之間的潛伏期沒有差異(表3)。
表3 組中的潛伏期變化

實施例IV-振幅變化實驗前由每組隨機測量的基線數據顯示振幅為23.9±4.3毫伏。受傷后第2周和第4周，BMP9組的振幅與對照組相比顯著提高(p＜0.05)。在第6周，BMP2組及BMP9組與對照組相比顯示出明顯差異(p＜0.05)，并且在第8周表現出按照BMP9、BMP2和對照組順序排列的顯著差異(p＜0.05)(表4)。
表4 振幅變化

實施例V-組織學及病理學觀察從每組中隨機選取的大鼠的組織學神經組織檢測表現出與圖1到圖10所示神經生理學檢測結果相似的變化。由于神經組織的軸突沒有再生以及留有炎癥反應，對照組表現出最緩慢的恢復速度。用能夠分泌BMP2或BMP9的經過基因改造的成纖維細胞轉染的組與對照組相比在早期沒有表現出任何顯著的差異，所有組在第2周都表現出由神經的碾壓傷所引起的嚴重病理學癥狀，諸如空泡化改變、炎癥單核細胞的滲透以及神經外膜血管出血。對于對照組而言，這些癥狀在8周內得以持續。然而對于BMP2組而言，在第4和第8周，炎癥反應和空泡化改變程度明顯降低，并且只有半數表現出這些癥狀。對于BMP9組而言，在第4和第8周，這些效果更為明顯，只有三分之一表現出軸突丟失和空泡化改變，并進一步表現出非常溫和的炎癥反應。
這里所引用的參考文獻通過參考完整地組合在本申請書中。
精通本領域的人員通過使用常規的實驗方法應當認識到或能夠確定這里所具體描述的本發明具體實施方式
的許多等價物。這樣的等價物確定地包含在權利要求書的范圍以內。
權利要求
1.一種神經再生的方法，其特征在于，所述方法包括a)產生包含以可操作方式與啟動子相連的編碼蛋白質轉化生長因子超家族成員之一的DNA序列的重組病毒或質粒載體；b)用所述重組載體體外轉染培養的細胞群體，形成所述培養細胞的群體；以及c)將所述轉染細胞移植到受損神經周圍區域，使得受損神經周圍區域內所述DNA序列的表達引起神經再生。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉化生長因子是BMP。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述BMP是BMP-2和BMP-9。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞是結締組織細胞。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述細胞是成纖維細胞。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞是神經細胞。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述神經是外周神經。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述載體是病毒載體。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述載體是逆轉錄病毒載體、腺伴隨病毒載體、腺病毒載體、或皰疹病毒載體。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞群體是在移植前保存的。
11.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述轉染的細胞群體是在移植前在液氮中保存在10％DMSO中的。
12.一種神經再生的方法，其特征在于，所述方法包括a)產生包含編碼髓鞘再生蛋白的DNA序列的重組病毒或質粒載體；b)用所述重組載體體外轉染培養的細胞群體，形成所述培養細胞的群體；以及c)將所述轉染細胞移植到受損神經周圍區域，使得受損神經周圍區域內所述DNA序列的表達引起神經再生。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述細胞是結締組織細胞。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述細胞是成纖維細胞。
15.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述細胞是神經細胞。
16.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述細胞是神經膠質細胞。
17.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述細胞是施萬細胞。
18.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述蛋白是神經調節蛋白-1。
19.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述神經是外周神經。
全文摘要
本申請描述了一種神經再生的方法，其步驟包括產生包含以可操作方式與啟動子相連的編碼蛋白質轉化生長因子超家族成員之一的DNA序列的重組病毒或質粒載體；用所述重組載體體外轉染培養的細胞群體，形成所述培養細胞的群體；以及將所述轉染細胞移植到受損神經周圍區域，使得受損神經周圍區域內所述DNA序列的表達引起神經再生。
文檔編號C12N15/12GK101031645SQ200580026516
公開日2007年9月5日 申請日期2005年6月23日 優先權日2004年6月23日
發明者金昌煥, 李寬熙 申請人:組織基因股份有限公司